KR20000067855A - 내피표적용 유전자치료제 전달시스템 - Google Patents

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KR20000067855A
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Abstract

혈관상의 내피세포로 DNA를 전달하기 위한 운반체로 작용하는 생분해성 미소구체로 구성된 조성물에 있어서,
DNA 및 양이온성 치밀화제의 복합체로 구성되고 미소구체보다 더 작은입자인 양전하입자가 부착된 알짜 음전하 미소구체로 구성된 조성물.

Description

내피표적용 유전자치료제 전달시스템 {GENE THERAPY DELIVERY SYSTEM FOR TARGETING TO ENDOTHELIA}
본 발명은 유전자치료제의 전달을 위한 새로운 색전(塞栓)시스템에 관한 것이다.
유전자치료법은 면역(DNA 백신)요법 뿐만 아니라 선천성 그리고 암 및 천식과 같은 질병 치료에 대하여 획기적인 기회를 제공한다.
유전자치료법의 성공에 있어서 중요한 측면은 표적기관 및, 특히 트랜스펙션이 일어나는 표적세포에 유전자구조를 제공하는 적당한 전달(델리버리)시스템(때로는 "벡터"라고도 호칭되는)의 개발일 것이다.
좋은 예로써 폐의 선천성 및 후천성 질병의 치료가 있다(큐리얼 등 (Curiel et al.)(1996) Am. J. Resp. Cell. Mol. Biol. 14, 1-18).
폐치료에 있어서 두가지 약물전달 경로가 있다. 약물은 에어로졸 형태로 입을 통하여 폐기도로 전달될 수 있다.
예를들면, 에어로졸을 이용한 폐기도로의 델리버리용 지질 운반- 핵산 복합체의 조제가 PCT WO93/1275 출원에 기술되어 있다. 이러한 델리버리는 현존의 분말 및 에어로졸 장치를 사용하여서는 매우 비효율적이라고 알려져 있다. 더욱 효율적인 델리버리는 다양한 분무기 시스템을 사용하여 달성될 수 있지만, 이러한 장치는 유전자구조를 분해시킬 수 있고 또한 투약이 투여되려면 상당한 시간 주기가 요구된다.
더욱이 낭성섬유증(Cystic Fibrosis)과 같은 임상조건에서는 폐로의 델리버리시스템의 깊은 침투 및 표적 상피세포로의 유전자 구조의 적절한 출연을 방해하는 폐점액이 있다.
폐로의 델리버리를 위한 대안수단은 순환시스템의 이용 및 유전자 생성물을 폐내피로 전달하는 것이다. 유전자 생성물은 정맥 또는 동맥으로 주사될 수 있으며, 적절한 델리버리기술을 이용하여 내피층으로 직행될 수 있다.
선행기술에서 당 또는 단일클론항체 또는 이들의 단편을 이용한 리간드중재 접근방식(ligand mediated approach)으로 이것이 달성되는 방법을 기술하고 있다{참고, 예를들어 후앙, 호름베르그 등(Huang, Holmberg et al, (1990) J. Liposome Res., 1,393.)의 연구}.
이러한 접근방식은 동물모델에서는 성공적이지만 복잡하고 통상적인 약학공정하에서는 용이하게 스케일-업되어 제조까지 이르지 못한다.
폐로의 델리버리를 위한 다른 접근법은 폐 모세혈관상에 임시적인 차단 또는 색전을 일으킬 수 있는 입자크기를 가진 입자를 이용하는 입자시스템을 이용하는 것이다.
직경이 4∼5㎛이상인 입자들은 폐 모세혈관에 의해 걸러지고 주로 폐포세그먼트로 여과되어 제거될 것이다{참고, 예를들면 칸케 등(Kanke et al, (1980) J. Pharm. Sci. 69,755)}.
인간의 폐는 약 2.8 ×108개의 폐포와 2.8×1011모세혈관 세그먼트를 가지고 있다. 이미 매우 다양한 콜로이드 시스템이 폐주사제(lung scanning agents)로써 실험되었고, 최근의 인간혈청 알부민으로부터 제조된 거대응집제 및 미소구체 뿐 아니라 탄소에 흡착된198Au, 세라믹 물질에 흡착된111Ag 및203Hg,99mTc 수산화철 응집제를 포함한다.
99mTc,111In 또는113mIn 으로 표지된 대사가능한 알부민 미세구체도 선택된시스템이다{참고 하간 등(Hagan et al, (1978) J. Nucl. Med., 19,1055)}. 데이비스(Davis)는 13.5± 1.5㎛ 직경범위의 크기가 이상적일 것이라고 지적하였다; 그러나, 이것은 상업적 생산에는 너무 작은 것이고 따라서 10∼20㎛(15±5㎛)범위를 제안하였다.
투여량(입자수)이 모세혈관 세그먼트수와 비교하여 매우작다면, 이러한 스스템은 크기와 관련된 독성에 상당히 안전하다.
큰 입자들(직경이 90㎛)은 더 작은 입자들보다 더욱 위해하다{데이비스(Davis, in Radiopharmaceuticals, 이디. 서브라마니안등(Ed. Subramanian et al), Soc. Nucl. Med. New York, 1975, p.267 및 데이비스와 타우베(Davis and Taube) (1978) J. Nucl. Med. 19, 1209)}. 알부민 파괴율은(미소응집제 또는 미소구체 형태에서) 조제 및 처리방법(가열온도, 교차결합제 등)에 관련된 소위 시스템의 "경도"에 따라 달라진다.
폐부위로부터의 완전한 제거는 일반적으로 24시간내에 관찰되지만 미소구체의 파괴율 및 표지상실은 반드시 같은 속도로 일어나지 않는다.
알룸 등{Illum et al ((1982) Int. J. Pharm. 12, 135 and (1982) J. Pharm. Pharmacol. Suppl. 34, 89P)}은131I로 표면표지된 폴리스틸렌입자와131I-로즈벵골로 표지된 이온교환(DEAE) 셀룰로오즈 미소구체를 사용하여 입자크기와 형태가 폐축적에 미치는 영향을 연구하였다.
평균직경 15.7㎛의 폴리스틸렌 미소구체와 40 ∼160㎛직경의 DEAE-셀룰로오즈 미소구체 약 108개가 투여될 때, 입자들은 신속하게 폐로 받아들여져 폐모세혈관에 채워진다. 입자들의 폐에 걸림(entrapment) 및 약물 아드리아마이신이 있는 알부민 미소구체의 운명은 윌모트 등(Wilmott et al)이 동물모델로 쥐를 이용하여 연구되었다{윌모트 등(Wilmott et al in Microspheres and Drug Therapy. Pharmaceutical, Immunological and Medical Aspects edited by S S Davis, L Illum, J G McVie and E Tomlinson 1984, Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam, p.205)}. 기본적인 사고는 입자가 차단된 모세혈관에 입자를 채류시키고 따라서 간직된 약물을 입자로부터 방출시키고 조직내로 확산시켜 활성부위에 도달하도록 하는 것이었다.
유사한 색전 개념이 스웨덴회사 팔마시아(Pharmacia)에서 스페렉스(등록상표) 시스템으로 개발되었다.
이 시스템은 통상 암의 화학요법에서 사용되는 약물인 약리제(pharmacological agent)의 투약전에 정맥내 또는 동맥내로 투여되어 기관부위에 도달되어 국부적 색전을 일으키는 분해가능한 녹말미소구체를 기초로 하고 있다.
임시적인 색전은 약물을 주위 조직내로의 흡수를 최대화하기 위하여 지연된 시간동안 표적부위에 약물을 머물게 하기 위한 목적이다{참고 린드베르그 등(Lindberg et al in Microspheres and Drug Therapy. Pharmaceutical, Immunological and Medical Aspects edited by S S Davis, L Illum, J McVie and E Tomlinson 1984, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, p. 153)}. 이 색전 시스템은 폐와 간장에 대하여 기술되어 있다.
합성 올리고뉴클레오티드와 DNA단편에 의해 만들어진 PCR의 젤라틴 미소구체로의 캡슐화는 콜테시 등{Cortesi et al, (1994) Int. J Pharmaceut. 105, 181.}에 의해 기술되었다. 예비형성된 미소구체 표면으로의 DNA부착 또는 이러한 시스템의 폐 맥관구조내 내피세포로의 델리버리를 위한 이용 어느 것도 기술되어 있지 않다.
본 발명자들은 유전자 전달을 위한 새로운 색전시스템을 개발하였다.
폐를 표적으로 하는 종래 기술된 약물델리버리 시스템과는 달리, 본 발명자들은 임시로 혈관상(vascular bed)을 폐색시키는 생분해성 미소구체의 표면에 유전자물질을 머물도록 하였다. 이러한 방법으로, 유전자 생성물이 상당히 효과적인 방법으로 내피표면에 나타나서 결국 유전자 생성물에 대한 향상된 세포의 이용 및 발현에 이르는 것을 관찰하였다.
색전시스템이 폐 이외의 기관에 이용될 수 있음은 쉽게 이해될 수 있다. 기타 기관에 이용되기 위해서는, 색전시스템은 관련 동맥내로 주사되어 투여될 수 있다.
본 발명자들은 또한 운반 미소구체 표면에 충분한 부착을 제공할 뿐 아니라 세포에 적절히 출현되고 이용될 수 있는 형태로 유전자 생성물 자체가 적절히 제제되어야 하는 것이 중요하다는 것을 알았다. 본 발명자들은 응축되지 않은 DNA(uncondensed DNA) 또는 플라스미드 DNA를 물리적 흡착과정, 즉 양전하를 가진 미소구체와 음전하의 DNA와의 강한결합을 통하여 미소구체에 단순히 흡착시키는 것으로는 세포배양모델에서 유리한 발현을 일으키지 않는다는 것을 알았다.
더욱이, 양전하 미소구체 및 기타 입자들은 독성에 관련되기 때문에 운반체로 이용되는 양전하 미소구체는 인체사용에 적합할 것 같지 않다.
반대로, 본 발명자들은 DNA 자체가 처음에 1㎛이하의 작은 입자로 응축된다면 DNA에 의해 암호화된 폴리펩티드의 충분한 발현이 달성될 수 있다는 것을 알았다.
이러한 응축은 양이온성 지질 또는 바람직하게는 양이온성 고분자와 같은 양이온성 치밀화제(compacting agents)를 이용하여 달성될 수 있다.
본 발명의 첫번째 측면은 미소구체보다 더 작은 양전하 입자가 흡착된 알짜 음전하 생분해성 미소구체로 구성된 조성물이며, 양전하 입자는 DNA 및 양이온성 치밀화제로 구성된다.
미소구체의 알짜전하 및 크기와 표면밀도와 흡착되는 입자의 알짜전하에 따라 최종 조성물이 알짜 음전하를 띨것인지 중성이 될것인지 또는 약한 양전하를 띨것인지는 당업자에게 명백할 것이다.
본 발명의 두번째 측면은 상기 조성물 조제방법이며,
1) DNA 및 양이온성 치밀화제의 복합체로 구성된 양전하 입자의 조제, 및
2) 상기 양전하 입자의 알짜 음전하 생분해성 미소구체로의 흡착으로 구성된다.
"흡착"이란 비공유결합 형태를 의미한다.
여기서 "미소구체"용어는 고상매트릭스 미소구체 및 미소캡슐 모두를 포함하는 것으로 사용된다.
적당한 크기 및 표면전하밀도를 가진 생분해성 미소구체는 공유결합된 카르복시기를 가진 용해성 녹말 및 이온화되어 양전하 DNA 복합체 및 생분해성 미소구체와의 상호작용이 가능하도록 하는 작용기를 가진 고분자와 같은 다종의 물질로부터 제제될 수 있다. 이러한 작용기는 바람직하게는 카르복시 또는 황산염기이다.
이러한 고분자물질은 바람직하게는 알긴산염, 헤파린 및 기타 황산화 다당류염(카르복시메틸 덱스트란, 카르복시 덱스트란 및 덱스트란 황산염) 및 폴리락티드 코글리세리드 및 폴리젖산과 같은 생분해성 합성고분자들이다. 유사하게, 미소구체로 변환되는 고분자들의 물리적인 혼합물이 이용될 수 있다.
헤파린/알부민 미소구체는 이미 약물 전달 목적으로 기술된 바 있다{퀀 등(Kwon et al, (1991) J. Colloid Interface Sci. 143, 501 and Cremers et al, (1990) J. Controlled Release 11, 167.)}. 이러한 물질들이 유전자치료에서의 용도 또는 DNA 복합체 운반 용도로 기술된 바는 없다.
따라서, 생분해성 미소구체는 교차결합된 용해성 녹말, 알부민, 젤라틴, 헤파린, 카르복시덱스트란, 덱스트란, 덱스트란 황산염, 알긴산염 폴리락티드, 또는 이들의 혼합물로부터 조제될 수 있다.
생분해성 미소구체가 색전을 제공하기 위하여는 바람직하게는 평균크기(광학현미경으로 측정된, 평균 수 직경)가 5㎛이상이어야 하며, 더 바람직하게는 6∼200㎛, 가장 바람직하게는 10∼100㎛이고, 더더욱 바람직하게는 12∼50㎛이어야 한다. 여기서 기술된 생분해성 미소구체의 크기는 정맥내 투여를 위하여 선택된 부형제중에서 팽창된 입자의 크기를 언급하는 것이다.
운반체 시스템 특성은 상이한 분해율을 제공하도록 따라서 운반 미소구체 및, 예를들면, 폐 내피세포와의 접촉시간을 제어하도록 설계될 수 있다.
상이한 분해율은 미소구체의 교차결합정도 조절과 같은 이 기술분야의 당업자에게 공지된 방법으로 달성될 수 있다; 덜 교차결합된 미소구체는 고도로 교차결합된 미소구체보다 더 빨리 분해된다.
유사하게 일부 고분자 경우에는 빠른 분해를 위하여 저분자량 고분자 사슬을 선택하고 느린 분해를 위하여 고분자량 고분자 사슬을 선택하여 분해율을 조절할 수 있다. 열에 의해 교차결합되는 시스템에 있어서는, 교차결합정도 따라서 분해율은 가열시간과 온도에 의하여 조절될 수 있다.
양전하 입자가 생분해성 운반 미소구체 표면에 흡착되기 위해서는, 운반 미소구체 자체가 미소전기영동법으로 측정될 때 최소한 -1mV, 바람직하게는 최소한 -5mV 및 더 바람직하게는 최소한 -20mV의 알짜 음전하(제타전위)를 가지고 있어야 한다.
본 발명의 조성물을 이용하기 위한 적당한 미소입자들은 상업적으로 입수가능하며 녹말 미소구체(카도사머(Cadoxamer)(Perstorp) 및 스페렉스 (Pharmacia Upjohn)와 같은), 덱스트란 미소구체 (CM 세파덱스 (Pharmacia Upjohn) 및 SP 세파덱스(Pharmacia Upjohn)) 및 아가로즈 미소구체 (CM 세파로즈 (Pharmacia Upjohn) 및 S 세파로즈 (Pharmacia Upjohn))를 포한한다. 알부민 및 젤라틴 미소구체는 이 기술분야의 당업자에게 잘 알려진 방법에 의해 조제될 수 있다.
양이온성 치밀화제의 예로 키토산을 포함한다. "키토산"이라는 용어는 폴리글루코사민 및 분자량과 아세틸화도가 다른 글루코사민 물질들의 올리고머를 의미한다. 특히 폴리에틸렌 글리콜과 복합된, 변형키토산은 상기 정의에 포함된다.
양이온성 치밀화제의 또 다른 예로, 여기에 국한되는 것은 아니지만, 폴리아미도아민(이들의 수지상 유도체 포함), 스테아릴아민, DOTMA (N-[1-(2,3-디오레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸 암모니움 클로라이드), BISHOP (N-[(2,3-디헥사데실옥시)프로프-1-일]-N,N,N, 트리메틸 암모니움 클로라이드), DODAC(B) (N,N-디메틸-N-옥타데실-1-옥타데카 암모니움 클로라이드(또는 브로마이드)), 폴리리신, 리포펙틴, 리포펙트아민, DMRIE(디미리스토일 로센타르 금지제 에테르), DC-콜레스테롤(디메틸아미노에틸 카바밀 콜레스테롤)을 포함한다. 이러한 치밀화제는 최적의 효과를 도출하기 위하여 DOPE(디오레일 포스파티딜 에탄올아민)와 같은 중성적인 양쪽성이온 지질과 혼합될 수 있다.
기타 치밀화제는 CTAB(세틸디메틸에틸 암모니움 브롬), DDAB(디메틸 디옥타데실 암모니움 브롬), 디옥타데실아미도 글리실스펄민 및 디파미토일 포스파티딜 에탄올 아미도 스펄민과 같은 지질폴리아민, 콜레스테롤의 양이온성 유도체, DOSPA(디오레일-N-(2-(스펄민카르복스아미도)에틸)-N,N-디메틸-1-프로파나미니움 트리플루오로아세테이트)를 포함한다. 이러한 양이온성 치밀화제는 별개로 또는 결합하여 이용될 수 있다. 특히 양이온성고분자, 폴리리신을 이용한 선행기술에서 이러한 응축과정은 이미 기술되었다. 예를들면, DNA와 폴리리신간에 형성된 고분자전해질 복합체가 울펄트 및 세이몰(Wolfert and Seymour (1996) Gene Therapy 3,269)에 의해 기술되었다.
본 발명의 바람직한 측면은 양이온성 치밀화제가 키토산인 것이다.
본 발명에 있어서, 치밀화된 DNA 복합체는 알짜 양전하를 가지도록 제조된다. 이들을 "복합체(conjugates)"라고 한다. 이것은 상기 기술된 바와 같은 양이온성 치밀화제를 DNA용액속으로 적정하여 생성된 입자크기 및 더 중요하게는 제타전위를 측정하는 레이저 도플러 풍속법(Laser Doppler Anemometry)과 같은 적절한 기술을 이용하여 표면전하를 측정함으로써 달성될 수 있다.
아래 실시예는 키토산-DNA 복합체 조제방법을 기술한다.
이 방법은 혼합속도, 출발용액의 상대농도, 두 성분의 비율, pH, 이온세기 및 온도를 필요한 입자크기와 전하를 가지도록 두 구성성분을 함께 혼합하는 것으로 구성된다.
혼합속도, 출발용액의 상대농도, pH, 이온세기 및 온도는 입자크기를 조절하기 위한 표준실험설계 부분으로써 변경될 수 있다.
두 성분의 비율 역시 크기와 표면전하를 조절하기 위하여 이용될 수 있다. 핵산과 키토산의 중량비는 1:1∼1:25범위, 바람직하게는 1:2∼1:20 및 가장 바람직하게는 1:5∼1:6 범위일 수 있다.
복합체 크기와 크기분포는 PCS100 분광기가 있는 말번 4700 초미세입자분석기 시스템(Malvern 4700 submicron particle analyser system (Malvern Instruments, UK))을 사용하여 광자 상관 분광법 (PCS)으로 결정될 수 있다.
샘플은 증류수로 희석되고 90℃ 산란각에서 25℃에서 측정된다. 크기분포는 다분산성 지수(PI)로 결정된다.
본 발명자들은 키토산 분자량이 치밀화된 DNA 복합체 크기에 영향을 준다는 것을 알았고, 실지로 복합체크기에 영향을 주도록 키토산 분자량을 선택할 수 있다. 이러한 목적으로 울펄트와 세이몰(Wolfert and Seymour (1996) Gene Theraph 3, 269-273)에 의해 기술된 에티디움 브롬 형광법을 이용하여 연구가 수행될 수 있다.
에티디움 브롬은 DNA와 상호작용하여 강한 형광을 보인다. 복합화시키는 양이온성 고분자가 첨가될 때, 에티디움브롬이 복합체로부터 빠져나오면서 형광이 감소된다. 첨가된 고분자 정량에 대한 형광의 플롯(plot)은 치밀화 과정(형광손실은 치밀화도의 지수)을 평가하는데 이용될 수 있으며, 따라서 복합화제 키토산 종의 적절한 분자량을 선택하는데 이용될 수 있다. 형광도는 펄킨-엘머 3000 형광분광기를 이용하여 측정될 수 있다. 광학방사파장은 591nm로 셋팅되고, 광학여기 파장은 366nm로 셋팅된다.
에티디움브롬(EtBr)이 큐벳(참조)중의 물에 첨가되고 DNA용액과 에티디움 브롬이 두번째 큐벳(테스트)중의 물에 첨가된다. 참조 큐벳의 형광도는 0으로 셋팅된다 테스트규벳서 얻어진 형광도가 측정된다. 그후 매우 적은 양의 키토산 시료를 일정하게 저으면서 테스트큐벳에 첨가하고, 형광측정은 3번 이루어지고, 각 측정간에 키토산 시료를 빈셀로 되돌린다. 3번의 평균값이 기록된다.
키토산 분자량은 바람직하게는 500-500,000달톤(Dalton)이고, 더 바람직하게는 700-250,000달톤이고 가장 바람직하게는 1,000-150,000달톤이다.
다른 저분자량의 키토산은 키토산나제(chitosanase)를 이용한 키토산의 효소분해로 얻어질 수 있고 또는 아질산을 첨가하여 얻어질 수도 있다. 두 절차 모두는 이 분야의 당업자에게 잘 알려져 있으며, 최근 간행물에 기술되어 있다{리 등(Li et al, (1995) Plant Physiol. Biochem. 33, 599-603); 알란 및 페이론(Allan and Peyron, (1995) Carbohydrate Research 277, 257-272); 다마드 및 칼티어(Damard and Cartier, (1989) Int. J. Biol. Macromol 11, 297-302)}.
DNA 복합체의 양전하(제타전위)는 최소한 +5mV이고, 바람직하게는 최소한 +10mV이고 더 바람직하게는 최소한 +20mV이지만, 바람직하게는 +100mV이하이다.
복합체의 표면전하는 제타전위로 표현된다.
이것은 pH 7.4 와 0.001 M 이온세기에서 결정된다. 제타전위는 예를 들면 말번 제타 시이저 Ⅳ(Malvern Zeta Sizer Ⅳ), (Malvern, UK)을 이용한 레이저 도플러 풍속법(LDA)으로 측정된다. 레이저 도플러 풍속법은 인가된 전기장에서 움직이고 있는 입자들로부터의 산란레이저 빛을 검출한다. 사용될 수 있는 장비는 예를들면 말번 제타시이저Ⅱ(Malvern Zetasiser Ⅱ)(Malvern Instruments)일 수 있다.
전기영동 이동도 측정은 복합체를 일정이온세기 0.001M인 100㎍-1mg 인산염 또는 맥일베인(McIlvaine) 완충용액 10ml중에 분사시켜 이루어진다.
100볼트전압, 전극간극 50mm 및 유전상수 78.54에서 PC4 와이드 모세셀을 이용하여 4번 측정된다.
크기가 10-1000nm인 양전하 복합체는 당업자에게 친숙한 절차를 이용하여 잉여 복합화제로부터 분리될 수 있다.
컬럼분리법은 키토산 및 유사한 양이온성 고분자 연구에는 적합하지 않다는 것은 공지된 사실이다. 대신 직교류 프로세스(cross-flow process)를 이용한 장흐름분획법(FF Fractionation, Salt Lake City, Utah; Ratanathanawongs and Giddings, (1993) ACT Symp. Ser. 521, 13) 또는 연속 분할흐름 박(SPLITT) 셀법이 레빈 및 지딩(Levin and Giddings,(1991) J. Chem. Biotechnol. 50, 43) ; 윌리암 등(Williams et al(1992) Ind. Eng. Chem. Res. 31, 2172.)에 의해 기술된 바와 같이 적용될 수 있다. 연구단계에서는 필터원심분리관 시스템이 이용될 수 있다.
DNA 복합체가 DNA에 의해 암호화된 폴리펩티드를 충분히 발현시키기 위해서는, 복합체가 바람직하게는 1㎛이하의 크기, 더 바람직하게는 500nm이하의 크기, 가장 바람직하게는 200nm이하의 크기이어야 함을 알 수 있었다. 복합체는 바람직하게는 최소한 10nm의 크기(유체동력학적 직경, 광자 상관 분광법에 의해 측정)를 가져야 한다.
DNA란 용어는 나선 또는 나선되지 않은, 길이가 100염기쌍 이상의 핵산(RNA 포함) 및 올리고 뉴클레오티드 또는 플라스미드 또는 코스미드를 의미한다.
DNA는 폐에 국한된 선천성 및 후천성 질병 치료에 유용한 폴리펩티드 및 단백질 약물을 발현할 수 있는 모든 DNA일 수 있다.
이들은 낭성섬유중(낭성섬유중 막횡단 조절인자), 알파 1-안티트립신 결핍증 및 폐암(면역을 유도하는 유전자 또는 살(殺) 종양성(tumoricidal)과 직접 관련된 유전자)을 포함한다. 면역유도 유전자는 MHC (주요 조직화합성 복합체)분자, 공동-자극분자 및 시토킨을 암호화한 것을 포함한다. 독성 시스템은 종양발현유전자(p53) 또는 비독성 전구약물을 독성으로 변경시키는 효소를 포함한다. 헤르페스 티미딘 키나아제가 예이다.
폐렴, 표면활성물질 결핍증, 폐고혈압증, 악성중피종은 본 발명에 의한 조성물이 적용될 수 있는 다른 질병들이다. 그러나, 폐가 폴립페티드 및 단백질을 위한 생반응실로 이용되고 이들 폴리펩티드 및 단백질의 활성 주부위가 신체의 그 외의 장소인 경우(예를들어, 혈액인자 Ⅷ, Ⅸ)에도, 본 발명에 의한 조성물은 폐에 DNA를 전달하기 위하여 이용될 수도 있다. 이것은 DNA가 폐조직에서 발현되고, 발현된 폴리펩티드가 세포로부터 분비되고, 폴리펩티드가 신체의 기타부위에 분배되는 결과를 가져오기 위해 순환계로 들어가는 것을 의미한다.
본 발명은 또한 유전자 치료제를 관절, 비강, 질, 직장, 눈, 위장관, 귀 또는 구강막과 같은 피험체의 기타부위 내로 전달하기 위하여 이용될 수도 있다.
조성물은 이러한 부위에서의 질병치료에 유용한 폴리펩티드 및 단백질 약물을 발현하는 모든 DNA로 구성될 수 있다.
예로는 항감염제, 항염제, 예방제 및 체액 및 세포중재 응답을 일으키는 항원, 즉 백신으로 예정된 항원물질이 포함된다. DNA는 바이러스성 세균성 또는 기생체 단백질을 암호화하고 따라서 파상풍, 디프테리아, 백일해 및 인플루엔자와 같은 질병에 대한 예방접종에 유용할 수 있다. 유전자생성물은, 이에 국한되는 것은 아니지만, 알파 1-안티트립신, 성장호르몬 생성효소, 인자 Ⅷ, 인자 Ⅸ, TNF, 시토킨, 항원유전자(헤파티티스 B, 인플루엔자, 콜레라), 낭성섬유증 막황단 전도도 조절인자(CTFR), 암유전자(p53, K-ras, HS-Ek), 수크로제-이소말타제, 락타아제-플로리진 히드로라제 및 말타아제-글루코아밀라제를 포함한다.
종래 제제방법을 이용하여 복합체를 더 큰 생분해성 운반 미소구체에 물리적으로 부착시킬 수 있다.
당업자에게 공지된 방법에 의해 DNA 복합체를 미소구체에 흡착시킬 수 있다. 예를 들면, 물 또는 저이온세기의 완충용액과 같은 용매에 미소구체를 현탁 시킨다. DNA복합체를 현탁액에 첨가하고 혼합물을 온화하게 흔들면서 흡착이 일어나도록 충분한 시간, 전형적으로 1∼3시간동안 실온에서 방치한다. 잉여 DNA복합체는 약3∼5분 동안 저속(약 6000rpm)으로 원심분리 하여 미소구체로부터 분리한다.
하나의 미소구체가 표면에 수 많은 작은 입자들을 가지기 위한 프로세스는 콜로이드 과학분야에서 기술되어있고“헤테로 응고”라고 알려져 있다{참고 예를 들면, 부스칼 등(Buscall et al, Polymer Colloids, Elsevier, London, 1985, p. 167)}. 이러한 응고 과정에서, 운반 미소구체가 젤쇄교 또는 가교되는 것보다는 균일하게 작은 나노입자들로 코팅되었는지를 확인하는 것이 중요하다(도1). 이것은 표준기술(예를 들면, 현미경 또는 레오로지 기술)로 확인할 수 있다.
본 발명에 따른 다른 측면은 약제에 있어서 본 발명의 조성물 용도이다. 인축에 투여된 미소구체 투약량은 필요한 기관, 예를 들면 폐, 모세혈관들의 적은 부분만이 막히도록 선택되는 것이 중요할 것이다. 진단이미지 분야의 문헌에는 진단이미지에 있어서 이러한 목적으로 안전하게 투여될 수 있는 투약량을 상세히 제공한다{참고 데이비스 및 타우베 (Davis and Taube (1978) J. Nucl. Med. 19, 1209)}. 실제로, 폐 모세혈관 10% 이하가 차단되어야 한다. 미소구체들의 적당한 수는 10×1010개 이하이고, 바람직하게는 106∼108개 이하이고 더 바람직하게는 107이하이다. 500㎎이하의 미소구체 및 바람직하게는 1∼100㎎의 투여량이 적당하다. 하딩 등{Harding et al((1973) J. Nucl. Med. 14, 579)}은 직경이 15㎛인 알부민 미소구체 1㎎ 투여량(5.7×105입자들과 같은)은 폐동맥순환의 0.14%만을 차단할 것이라는 것을 산출하였다.
도2는 미소구체가 모세혈관상을 막아서 입자표면과 폐 모세혈관의 내피세포와의 뛰어난 접촉을 제공하는 방법을 보여주는 현미경 사진이다. 폐 모세혈관에 이러한 미소구체의 소투여량은 병리적 영향없이 장기간 체류하는 것으로 보인다{데이비스 및 킹(Davis and King, (1974) J. Nucl. Med. 15, 436)}. 분해 미소구체는 모세혈관을 막기에 너무나 작아서 순환시스템 내에 계속 돌아다니다가 입자인식 및 그후의 포식작용의 통상과정을 통해 간에 의해 제거된다. 여기서, 미소구체 및 그 내용물은 간의 쿠퍼세포에 의해 리소좀 부위로 들어가서 미소구체가 더 분해되고 특히 DNA물질이 부착된 표면의 분해가 일어난다. 따라서, 간에까지 도달된 어떠한 DNA물질은 효과적으로 분해되어 발현을 제공할 수 없으므로 폐에 이용될 새로운 전달 시스템은 폐에서 유전자의 부위 특이 발현을 제공할 수 있어야 한다.
본 발명에 의한 조성물은 정맥 내로 또는 동맥 내로 포유동물에게 투여될 수 있다. 조성물은 정액 내로 또는 동맥 내로 포유동물의 폐 내피에 전달될 수 있다. 또한 동맥 내로 관절, 비강, 질, 직장, 눈, 위장관, 귀 또는 구강막에 전달될 수도 있다. DNA가 관절, 비강, 질, 직장, 눈, 위장관, 귀 또는 구강막으로 전달되도록 투여될 수 있다. 예를 들면, 조성물은 소망 부위로 혈액을 공급하는 혈관 내로 투여될 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 유전자치료법에서의 본 발명의 조성물 용도이다.
본 발명의 다른 측면은 유전자치료가 요구되는 포유동물의 치료용 약제제조에서의 본 발명의 조성물용도이다.
본 발명의 다른 측면은 본 발명의 조성물과 무균 운반성분으로 구성된, 포유동물로의 본 발명의 조성물 델리버리용 부품키트 이다. 예를 들면, 본 발명의 폐델리버리 시스템은 무균성분을 이용하여 투여직전에 제조되거나 예비형성된 헤테로 응고 입자 시스템은 무균성분을 이용하여 제조되고 그후의 재현탁 및 투여를 위하여 냉동건조 될 수 있다.
본 발명은 실시예 로써 기술될 것이며, 더 상세하게는 도면과 실시예를 참조하여 기술 될 것이다.
도1 : 생분해성 미소입자에 흡착된 DNA-키토산 나노 입자 복합체
도2 : 폐모세혈관상에서의 미소구체를 보여주는 현미경사진
도3 : 음전하 녹말미소구체상의 DNA-키토산 복합체의 흡착. 1.5㎖ 증류수중의 약 50㎍ DNA
도4 : 복합체가 흡착된 그리고 흡착되지 않은 미소구체
실시예1 : DNA-키토산 복합체 조제, 및 이들의 음전하 녹말 미소구체로의 흡착
아래 실시예는 키토산과 복합된 CMV-CAT 플라스미드를 수반하는 녹말 미소구체조제를 기술한다
A. DNA-CTS(키토산)복합체 조제
26.4㎎ 키토산 염산염을 18㎖ 물에 용해하였다. 용액을 0.2㎛ 막필터에 통과시켰다(CTS용액). CTS용액 15㎖를 50㎖ DNA용액(2.2㎎ pCAT-DNA를 함유)에 자석교반 하면서 용액이 흐려지기 시작할 때까지(약2㎖) 한 방울씩 떨어뜨렸다. 남은 CTS용액은 현탁액 내로 재빨리 넣었다(㎖단위로). 생성된 현탁액(33.8㎍/㎖ DNA와 338㎍/㎖ CTS를 함유)은 사용할 때까지 4℃에서 저장하였다. 입자들은 약 200㎚크기와 ＋35㎷표면전하(제타전위)를 가졌다.
B. DNA-CTS 복합체의 정제
0.4㎖의 DNA/CTS복합체 현탁액을 막원심분리 튜브(100㎚ 컷오프(cutoff))에 넣고, 6500rpm으로 10분간 원심분리 하였다. 복합체는 0.3㎖물중에서 재현탁되어 수집되었다. 15㎖샘플을 처리하여 생성된 정제 복합체를 약 10㎖물중에 담았다.
C. DNA-CTS 복합체 분석을 위한 정량방법 (분광광도법)
350-600㎚범위의 복합체 현탁액 탁도는 너무 낮아서 정량측정에 이용할 수 없다.
그러나, 259㎚(DNA의)에서의 흡광도는 복합체 측정을 위한 다른 파라미터로 이용될 수 있다. 260㎚에서의 UV흡광도와 0.2 B 1.0(약10-50㎍/㎖ DNA)범위 현탁액중에서의 DNA-CTS복합체 농도와의 훌륭한 선형관계가 얻어졌다.
D. 녹말 미소구체상으로의 복합체의 흡착
제제B 0.1㎖와 카르복시화된 약 50㎛크기의 미소구체로 구성된 4%(w/v) 녹말 미소구체 0.5㎖(스웨덴, 펠스톨프(Perstorp)의 카도사머(Cadoxamer from Perstorp, Sweden))를 DNA/CTS 복합체 현탁액 1.0㎖에 첨가하였다. DNA-CTS 복합체 없는 녹말 미소구체 0.5㎖를 바탕대조로 이용하였고, 녹말 미소구체 없는 DNA-CTS 복합체 현탁액 1.0㎖를 표준대조로 이용하였다. 샘플 최종부피는 적당한 양의 물을 넣어 1.5㎖로 맞추었다. 샘플을 실온중 2시간동안 진동 진탕기에서 흔들어 주었고, 3분동안 6500rpm에서 원심분리 하였다. 녹말미소구체로부터의 상징액이 260㎚에서의 DNA측정치에 약간 영향을 미치는 것을 알았다. 상징액을 취해서 260㎚에서 측정하였다. 복합체 흡착도는 샘플의 UV흡광도 감소와 DNA-CTS복합체 표준 대소의 흡광도 감소를 비교하여 산출되었다(도3). DNA-CTS 복합체의 표면흡착에 있어서 선형증가가 관찰되었다. 20㎎의 녹말미소구체를 첨가하면 복합체 80%이상이 흡착되었다. 녹말미소구체상에 흡착된 DNA-CTS복합체를 보여주는 전자현미경사진을 도4에 나타낸다
실시예2 : 실시예1에서 기술된 바와 같이 조제된 조성물을 토끼에게 투여.실시예1에서 기술된 조성물이 조제되었고, DNA-복합체를 수반한 미소구체를 원심분리로 분리하여 주사용 무균수에 분산시켰다. 한 그룹당 3마리의 뉴질랜드 화이트 토끼암컷들에게 주변 귀정맥(marginal ear Vein)을 통하여 0.5㎖의 106입자들을 정맥내 주사하였다. 동물들을 3시간후에 죽여서 간장 및 비장과 함께 폐를 제거하였다. 조직검사결과 미소구체가 폐에 상당히 들어 받혀 있었다. 미소구체는 폐의 모세혈관상 내에 깊이 축적되어 있음을 관찰하였다.
실시예 3 : 유전자 발현 분석 - CAT 분석
재료
CMV프로모터에 의해 추진되는 리포터 유전자 pCAT-DNA는 진메디신, 휴스톤, 미국(GeneMedicine, Houston, USA)에서 입수되었다. pCAT-DOTMA (N[1-(2,3-디오레일옥시)-프로필] -N,N,N-트리메틸암모니움클로라이드) 복합체는 대조 물질로 이용되었다. 이것은 펠그너 등(Felgner et al, (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. (UA)84, 7415-7417)이 제시한 가이드에 의해서 조제되었다.
방법
대조 pCAT DNA 용액은 pCAT-DNA원액(0.811㎎/㎖)을 가압멸균된 PBS에서 희석하여 조제되었다. pCAT-DNA원액 0.863㎖에 가압멸균된 PBS 13.137㎖를 첨가하였다. 이것은 14.0㎖의 대조 pCAT-DNA용액(0.05㎎/㎖)를 만들고, 2㎖ 부피의 100㎍ pCAT-DNA를 여섯마리 토끼에게 투여하기에 충분하다. 용액은 4℃에서 보관되었고 토끼에게 투여 15분전에 실온으로 가온되었다.
동결건조된 분말 형태로 제공된 pCAT-DNA DOTMA는 무균수를 이용하여 연구가 진행되는 날 중에 원래대로 하였다. 생성된 액제제는 2㎖부피의 100㎍ pCAT-DNA를 투여량으로 하여 투여하기에 충분한 플라스미드 DNA농도를 함유하였다. 제제는 4℃에 저장되었고 토끼에게 투여 15분전에 실온으로 가온되었다.
CAT ELISA
동물조직에서의 CAT분석을 위한 CAT ELISA절차는 키트 제조업자{베링거 만하임(Boerhinger Mannheim)}가 제공한 지침에 따라 설정되었다.
분석은 샌드위치 ELISA원리에 기초하여 이루어지고, 이것은 안티-CAT 항체가 미량정량플레이트 모듈에 예비결합되고, 조직추출물에서의 CAT효소가 고정된 안티-CAT 항체에 특이결합하고 CAT에 디곡소제닌 표지된 항체(안티-CAT-DIG)가 CAT 효소에 결합하는 것이다. 검출 항체, 페록시다제 복합된 안티-디곡시제닌 항체(안티-DIG-POD)는 디곡시제닌에 결합한다. 최종단계에서 페록시다제 기질 (ABTS; 2,2'-아지노비스[3-에틸벤즈티아조린 설포닌산])이 페록시다제에의해 촉매화되어 기질향상제 사용에의해 향상될 수 있는 색채반응생성물을 생성한다. 이색채의 흡광도는 표준물 및 추출물에 존재하는 CAT 효소량에 직접 상관된다.
CAT ELISA 검증
테스트샘플을 분석하기전에, CAT ELISA절차가 검증되었다. CAT를 함유한 적당한 정성대조조직샘플을 입수할 수 없었으므로, 하루의(intra-day) 그리고 날마다의(inter-day) 변이 모두는 곡선을 이용하여 측정되었다. 이러한 곡선들은 CAT ELISA키트에서 제공되는 CAT농도 0.0, 15.6, 31.25, 62.5, 125, 250 및 500에서의 CAT표준물을 이용하여 만들어졌다. 하루의 변이는 3번 표준곡선을 만들어 결정되었다. 하루의 그리고 날마다의 변이 모두에 대하여 표준농도에서의 변이계수(%CV)가 산출되었다.
조직 추출 절차의 검증
조직 추출 절차는 초기에“생”("naked") 플라스미드DNA가 투여된 2마리의 대조 토끼들로부터의 다양한 샘플을 취해서 -80℃에서 각각 저장 함으로써 설정되었다. 얼음냉각된 조직 추출 완충액 0.5㎖(10 mM Tris pH7 -8; 150 mM NaCl, 1mM EDTA, 0.5% Triton X-100, 100 μM 루펜틴, 1.0 μM 펩스타틴 그리고 0.25 mM PMSF)을 조직샘플을 함유한 튜브에 넣고 미니비드 비터(Mini-Bead Beater)를 이용하여 4℃에서 다른 주기동안 4번(0.6, 1.2 또는 2.4분)균질화 하였다. 균질물을 살균된 마이크로퓨게 튜브{microfuge tube (1.5㎖)}에 옮기고 MSE 마이크로퓨게 에서 4℃에서 13,000 rpm으로 20분동안 원심분리하였다. 상징액(즉, 조직추출물)은 살균된 마이크로퓨게 튜브(1.5㎖)로 옮기고 얼음상에 방치하였다. 조직추출물의 부분표본은 PBS로 희석되었고(20 대 1) BCA 단백질분석을 이용하여 단백질농도를 분석하였다. 각 샘플은 2번 분석되고 조직 추출물에서의 전 단백질농도(㎎/㎖)를 얻기 위하여 희석에 대한 보정을 하였다.
CAT ELISA절차는 위장 조직추출물에서의 CAT분석을 위하여 검증되었다. 처음에, CAT ELISA절차를 이용한 다양한 조직추출물에서의 CAT농도에 대한 단백질농도의 영향이 평가되었다. 대조 토끼들로 부터의 조직샘플들이 상기한 바와 같은 얼음냉각 조직 추출용액(0.5㎖)에서 추출되었고 1.5분 동안(30초 3번 균질화 및 30초방치) 균질화 되었다. 단백질농도를 결정한 후, 조직추출 물을 샘플버퍼{Sample Buffer(CAT ELISA 키트)}로 희석하여 약 0.5, 1.0 및 2.0㎎/㎖단백질농도의 추출용액을 만들었다. 이들 희석추출물 각각을 CAT 표준물(CAT ELISA 키트)로 스파이크 하여(Spiked) 최종 CAT농도를 25 및 100pg/㎖로 하였다. 스파이크된 샘플들은 그후 CAT농도를 위하여 2번 분석되었고 각 샘플에서의 CAT회복(recovery)비율이 산출되었다.
두 번째로, 다양한 조직에서의 CAT안정도에 대한 추출절차의 영향이 평가되었다. 이것은 상기 대조 토끼들로부터의 조직샘플을 50 또는 200pg/㎖의 CAT 농도를 가진 추출완충액으로 추출함으로써 수행되었다. 단백질농도를 결정한 후에, 각 샘플 추출물은 샘플버퍼로 희석되었다(2대 1 또는 4대1) 희석된 각 샘플은 CAT농도를 위하여 2번 분석되었다. 희석에 대한 보정후 각 조직추출물에서의 CAT회복 비율이 산출되었다.
실시예 4 : 피험체로의 투여
DNA : 키토산 복합체는 DNA플라스미드가 낭성섬유증 막횡단 전도도 조절인자 를 발현하는 DNA라는 점을 제외하고는 상기 실시예1에 제시한 방법에 따라 조제되었다.
복합체조제는 100∼300㎚범위의 입자들을 얻도록 조절된다. 입자들은 2.5∼5% 만니톨 첨가후 냉동건조된다.
피험체에 투여 직전, DNA가 100㎍인 것과 균등한 DNA : 키토산 복합체 정량이 20㎎의 녹말 미소구체{카도소머(Cadoxomer, Perstorp, Sweden)}와 함께 주사용 1.0㎖ 물(USP)중에 분산된다. 현탁액은 피험체 정맥내로 주사된다.
또한 재료는 냉동건조된 녹말 미소구체의 필요량과 DNA; 키토산 복합체의 혼합물,주사용 1㎖물을 함유한 바이알과 주사용 주사기로 구성된 키트로써 입수될 수 있다.

Claims (21)

  1. 미소구체보다 더 작은 양전하 입자가 흡착된 알짜 음전하 생분해성 미소구체로 구성된 조성물에 있어서, 상기 양전하 입자가 DNA와 양이온성 치밀화제로 구성된 조성물
  2. 제 1 항에 있어서, 생분해성 미소구체가 교차결합된 용해성 녹말, 알부민, 젤라틴, 헤파린, 카르복시덱스트란, 덱스트란, 덱스트란 황산염 , 알긴산염, 폴리락티드 또는 이들의 혼합물로부터 조제되는, 조성물
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 양이온성 치밀화제는 키토산인, 조성물
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중에 어느 하나의 항에 있어서, 생분해성 미소구체는 5㎛이하의 평균 크기를 가지는, 조성물
  5. 제 1 항 내지 제 4 항중 어느 하나의 항에 있어서, 생분해성 미소구체는 DNA복합체 흡착전 최소한 -5㎷의 제타전위를 가지는, 조성물
  6. 제 1 항 내지 제 5 항중 어느 하나의 항에 있어서, DNA복합체 입자는 10-500㎚범위의 평균크기를 가지는, 조성물
  7. 제 1 항 내지 제 6 항중 어느 하나의 항에 있어서, DNA복합체는 5-100㎷범위의 양성표면전하(제타전위)를 가지는, 조성물
  8. 1) DNA 및 양이온성 치밀화제의 복합체로 구성된 양전하 입자의 조제, 및 2) 상기 양전하입자의 알짜 음전하 생분해성 미소구체로의 흡착을 포함하여 이루어진 조성물 조제 방법
  9. 제 8 항에 의한 방법에 의해 얻어질 수 있는 조성물
  10. 제 1 항 내지 제 7 항중 어느 하나의 항 또는 제 9항에 있어서, 미소구체가 혈관상의 내피세포로 DNA를 전달하기 위한 운반체로 작용하는, 조성물
  11. 제 1 항 내지 제 7 항중 어느 하나의 항 또는 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서, 약제 용도의 조성물
  12. 제 11 항에 있어서, 투약된 미소구체의 투약량이 10×1010개 또는 500㎎이하의 정량인, 조성물
  13. 제 1 항 내지 제 7 항중 어느 하나의 항 또는 제 9 항 또는 제 10 항에 의한 조성물을 정맥내 또는 동맥내로 포유동물에게 투약하는, 포유동물로의 DNA전달방법
  14. 제 13 항에 있어서, 조성물이 정맥내 또는 동맥내로 포유동물의 폐 내피로 전달되는, 포유동물로의 DNA조달방법
  15. 제 1 항 내지 제 7 항중 어느 하나의 항 또는 제 9 항 또는 제 10 항에 의한 조성물이 관절, 비강, 질, 직장, 눈, 위장관, 귀 또는 구강막에 전달되는, 치료방법
  16. 관절, 비강, 질, 직장, 눈, 위장관, 귀 또는 구강막에 전달되도록 제 1 항내지 제 7 항중 어느 하나의 항 또는 제 9 항 또는 제 10 항에 의한 조성물이 투약되는, 치료방법
  17. 제 13 항에 있어서, DNA가 포유동물의 폐 내피에 전달되는, 포유동물로의 DNA전달방법
  18. 유전자 치료가 요구되는 포유동물의 치료용 약제 제조에 있어서, 제 1 항 내지 제 7 항중 어느 하나의 항 또는 제 9항 또는 제 10 항에 의한 조성물의 용도
  19. 유전자 치료법에 있어서, 제 1 항 내지 제 7 항중 어느 하나의 항 또는 제9 항 또는 제 10 항에 의한 조성물의 용도
  20. 제 1 항 내지 제 7 항중 어느 하나의 항 또는 제 9 항 또는 제 10 항에 의한 조성물을 전달하기 위한, 상기 조성물 및 무균운반성분으로 구성된 부품키트
  21. 제 1 항 내지 제 7 항중 어느 하나의 항 또는 제 9 항 또는 제 10 항에 의한 조성물을 전달하기 위한, 알짜 음전하의 생분해성 미소구체; DNA 및 양이온성 치밀화제로 구성된 더 작은 양전하 입자; 및 무균운반 성분으로 구성된 부품키트
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