JP2000514086A

JP2000514086A - 内皮への標的のための遺伝子治療送達系

Info

Publication number: JP2000514086A
Application number: JP10504954A
Authority: JP
Inventors: リズベス、イルーム
Original assignee: ダンバイオシスト、ユーケー、リミテッド
Priority date: 1996-07-10
Filing date: 1997-07-10
Publication date: 2000-10-24
Also published as: NO990002L; WO1998001160A3; AU726518C; WO1998001161A2; NO990003D0; PT994726E; JP2001500109A; GB9900054D0; ES2175433T3; GB2330534B; AU726518B2; WO1998001160A2; AU720989B2; NO990003L; DE69712108D1; DE69712110T2; KR20000023716A; EP0986404A2; CA2257300A1; ATE216265T1

Abstract

(57)【要約】ＤＮＡを脈管床の内皮細胞に送達するためのキャリヤーとして作用する生物分解性マイクロスフェアを含んでなる組成物であって、マイクロスフェアが正味の負電荷を有し、かつこれに粒度がより小さな正に帯電した粒子が吸着し、このような正に帯電した粒子が、ＤＮＡとカチオン性圧縮剤とのコンジュゲートを含んでなる、組成物。

Description

【発明の詳細な説明】内皮への標的のための遺伝子治療送達系本発明は、遺伝子治療の送達のための新規な塞栓系に関する。遺伝子治療は、遺伝的疾患および癌や喘息のような症状などの各種の疾患の治療、並びに免疫化（ＤＮＡワクチン）の興味深い機会を提供する。遺伝子治療の成功における重要な側面は、標的器官、更に詳細には、トランスフェクションが起こる標的細胞へ接近する遺伝子構築物を提供する適当な送達系（「ベクター」と呼ばれることが多い）の開発であろう。良好な例は、肺の先天的および後天的疾患の治療である(Curiel et al.，(1996)，Am．J．Resp．Ce1l．Mol．Bio1.，1 4，1-18)。２つの薬剤送達経路が、肺の治療に利用できる。薬剤は、エアゾールの形態で口を介して肺気道へ送達することができる。例えば、エアゾールによる肺気道への送達のための脂質キャリヤー核酸複合体の調製は、ＰＣＴＷＯ９３／１２７５号明細書に記載されている。このような送達は、現在存在している粉末およびエアゾール装置を用いて極めて非効率的であることが知られている。更に効率的な送達は、様々な噴霧装置を用いて行うことができるが、これらの装置は遺伝子構築物を分解することがあり、投与を行う用量にはかなりの時間を要することもある。更に、嚢胞性線維症のような多くの臨床症状では、肺が粘液を含み、送達系が肺および標的上皮細胞に対する遺伝子構築物の適当な提示に深く浸透することを妨げる。肺への送達のもう一つの手段は、循環系を利用し、遺伝子生成物を肺内皮に送達することである。遺伝子生成物は、静脈または動脈供給へ注射し、適当な送達技術を用いて内皮層へ向けることができる。先行技術では、これを、糖またはモノクローナル抗体、またはそれらの断片を用いるリガンド介在法の幾つかの形態を用いて行うことができる方法が記載されている（例えば、Huang，Holmberg et al.，(1990)，J．Liposome Res.，1，393の研究を参照されたい）。この方法は、動物モデルでは成功しているが、複雑であり、それ自身は、通常の薬学処理下では容易にスケールアップや製造ができない。肺へ送達する別法は、粒子が、肺の毛細血管床の一時的遮断または塞栓症を生じる粒度を有する粒子系を用いることである。直径が４〜５μｍより大きい粒子は、肺毛細血管によって濾過されて除かれ、主として肺胞区へ高度に抽出される（例えば、Kanke et al.，(1980)， J．Pharm．Sci.，69，755を参照されたい）。ヒトの肺は、約２．８×１０⁸個の肺胞および２．８×１０¹¹個の毛細血管区分を有すると考えられる。以前は、炭素に吸着した¹⁹⁸Ａｕ、セラミック材料に吸着した¹¹¹Ａｇおよび²⁰³Ｈｇ、^99mＴｃ-水酸化第二鉄凝集体、並びに更に最近は、ヒト血清アルブミンから作成したマクロ凝集体およびマイクロスフェアなどの多種多様なコロイド系が肺スキャニング剤として検討されてきた。^99mＴｃ、¹¹¹Ｉｎまたは^113mＩｎで標識した代謝可能なアルブミンマイクロスフェアが、選択される系である（Hagan et al.，(1 978)，J．Nucl．Med.，19，1055を参照されたい）。Davisは、粒度が１３．５± １．５μｍ直径の範囲のものが理想的であることを示したが、これは、商業的生産には狭すぎ、彼は、１０〜２０μｍ（１５±５μｍ）の範囲を提案した。このような系は、安全性の限界が大きいが、但し、投与される用量（粒子数）が毛細血管区の数と比較して極めて小さく、毒性が粒度に関係しており、大きな粒子（直径９０μｍ）は小さなものより毒性が大きい（Davis，放射性医薬品(Radiopha rmaceuticals),Subramanian et al.監修，Soc.Nucl.Med.New York,１９７５年，２６７頁、およびDavis and Taube(1978)，J．Nucl．Med.，19，1209）。（ミクロ凝集体またはマイクロスフェアの形態での）アルブミンの分解速度は、いわゆる系の「硬度」によって変化し、これは、調製および治療の方法（加熱温度、架橋剤など）に関係している。肺の領域からの全クリアランスは、通常は２４時間以内に見られるが、マイクロスフェアの分解速度および標識の喪失は必ずしも同じ速度では起こらない。 Illum et al．（(1982)，Int．J．Pharm.，12，135および(1982)，J．Pharm． Pharmacol．Suppl.，34，89P）は、¹³¹Ｉを標識したポリスチレン粒子表面とＩ −ローズベンガルを標識したイオン交換（ＤＥＡＥ）セルロースマイクロスフェアを用いて、肺に付着する粒度および粒子形状の効果を検討した。用量が約１０⁸ 個の粒子での平均直径が１５．７μｍのポリスチレンマイクロスフェアおよび直径が４０〜１６０μｍのＤＥＡＥ−セルロースマイクロスフェアは、肺に速やかに吸収され、粒子は肺毛細血管に停滞した。薬剤であるアドリアマイシンを負荷したアルブミンマイクロスフェアの肺での捕捉および運命を、Wilmott et al. が動物モデルとしてラットを用いて検討した（Wilmott et al.，マイクロスフェアおよび薬剤療法。薬学、免疫学および医学的側面(Micropheres and Drug Ther apy．Pharmaceutical，Immunological and Medical Aspects)，S.S．Davis，L． Illum，J.G．McVie and E．Tomlinson監修，１９８４年，Elsevier Science Pub lishers B.V.，アムステルダム，２０５頁）。このアイディアは粒子が、遮断された毛細血管に存在することにより、保持された薬剤が粒子から放出され、組織中に拡散し、作用部位に到達するというものであった。同様な塞栓形成の概念は、スウェーデンの会社であるPharmaciaにより、そのS pherex（登録商標）系を用いて開発された。この系は、静脈内または動脈内に投与され、器官部位に到達し、薬理学的化合物、通常は癌の化学療法に用いられる薬剤を投与する前に局所的塞栓形成を生じる分解性澱粉マイクロスフェアを基剤としている。また、一時的塞栓症は、薬剤を標的部位に長時間保持して、薬剤の周囲の組織への吸収を最大にしようとするものである（Lindberg et al.，マイクロスフェアおよび薬剤療法。薬学、免疫学および医学的側面(Micropheres and Drug Therapy．Pharmaceutical，Immunological and Medical Aspects)，S. S．Davis,L．Illum，J．McVie and E．Tomlinson監修，１９８４年，Elsevier S cience Publishers，アムステルダム，１５３頁を参照されたい）。この塞栓系は、肺および肝臓について記載されている。合成オリゴヌクレオチドおよびＰＣＲによって生成したＤＮＡ断片のゼラチンマイクロスフェアへのカプセル封入は、Cortesi et al.，(1994)，Int．J．Phar maceut.，105，181によって記載されている。予備成形マイクロスフェアの表面へのＤＮＡの付着も、肺血管系の内皮細胞への送達のためのこれらの系の使用も、記載されていない。本発明者らは、遺伝子の送達を目的とする新規な塞栓系（embolism system）を発明した。肺標的のための以前に報告された薬剤送達系とは異なり、本発明者らは、一時的に脈管床を閉塞する生物分解性マイクロスフェアの表面に存在するように遺伝子材料を慎重に準備した。この方法において、本発明者らは、遺伝子生成物が極めて効率的に内皮表面に提供され、遺伝子生成物の細胞吸収および発現が向上することを見出だした。この塞栓系は、肺以外の器官にも用いることができることが理解されるであろう。他の器官については、塞栓系は、関連動脈に注入することによって投与することができる。本発明者らは、遺伝子生成物がそれ自身、キャリヤーマイクロスフェアの表面に良好に付着するだけでなく適当な細胞表現および取り込みができる形態で、適当に処方されることが重要であることも見出だした。本発明者らは、マイクロスフェアが、負に帯電したＤＮＡを強力に結合することができる正電荷を有する物理吸着の工程による未濃縮合ＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡのマイクロスフェアへの単なる吸着では、細胞培養モデル内では効果的な発現を生じないことを見出だした。更に、キャリヤーとして用いられる正に帯電したマイクロスフェアと他の粒子は、注入時の毒性効果と関係することがあるので、このような正に帯電したマイクロスフェアは、ヒトでの使用が許可されるとは思われない。対照的に、本発明者らは、ＤＮＡ自身が最初に濃縮して粒度が１μｍ未満の小粒子となると、このＤＮＡによってコードされたポリペプチドを良好に発現することができることを見出だした。このような濃縮（condensation）は、カチオン性脂質のようなカチオン性圧縮剤(compacting agent)の使用により、または好ましくはカチオン性ポリマーによってもたらすことができる。本発明の第一の局面は、生物分解性マイクロスフェアを含んでなる組成物であって、マイクロスフェアが正味の負電荷を有し、かつこれに粒度がより小さな正に帯電した粒子が吸着し、このような正に帯電した粒子が、ＤＮＡとカチオン性圧縮剤とのコンジュゲートを含んでなるものである。最終的な組成物は、マイクロスフェアの正味の電荷と粒度、および吸着した粒子の表面密度と正味の電荷によって、正味の負電荷を有し、中性となり、または小さな正電荷を有することは、当業者には明らかであろう。本発明の第二の局面は、上記組成物の製造法であって、1)ＤＮＡとカチオン性圧縮剤とのコンジュゲートを含んでなる正に帯電した粒子の調製、および2)この正に帯電した粒子を、正味の負電荷を有する生物分解性マイクロスフェアへの吸着を含む方法である。「吸着」とは、任意の形態の非共有結合を意味する。「マイクロスフェア」という用語は、本明細書では、固形のマトリックスマイクロスフェアおよびマイクロカプセルの両方を包含するのに用いられる。適当な粒度と表面電荷密度を有する生物分解性マイクロスフェアは、カルボキシル基が澱粉に共有結合している可溶性澱粉、およびイオン化して、正に帯電したＤＮＡコンジュゲートと生物分解性マイクロスフェアとの間に静電的相互作用を行うことができる基を含むポリマーのような多数の様々な材料から処方することができる。このような基は、好ましくはカルボキシルまたはスルフェート基である。このようなポリマー性材料としては、アルギネート、ヘパリンおよび他の硫酸化多糖類（カルボキシメチルデキストラン、カルボキシデキストラン、およびデキストランスルフェート）、およびポリラクチドコグリセリドおよびポリ乳酸のような生物分解性の合成ポリマー等が挙げられる。同様に、次にマイクロスフェアに転換されるポリマーの物理的混合物を用いることもできる。例えば、ヘパリン／アルブミンマイクロスフェアは、薬剤送達の目的で以前に記載されている（Kwon et al.，(1991)，J．Colloid Interface Sci.，143，501およびCremers et al. ,(1990)，J．Controlled Release，11，167）。このような材料は、遺伝子治療における使用についても、またはＤＮＡコンジュゲートの輸送についても報告されていない。従って、生物分解性マイクロスフェアは、架橋した可溶性澱粉、アルブミン、ゼラチン、ヘパリン、カルボキシデキストラン、デキストラン、デキストランスルフェート、アルギンネート、ポリラクチド、またはそれらの混合物から調製することができる。塞栓を引き起こす生物分解性マイクロスフェアは、好ましくは平均粒度（数平均直径、光学顕微鏡法によって測定）が５μｍを上回り、更に好ましくは６〜２００μｍであり、最も好ましくは１０〜１００μｍであり、更に一層好ましくは１２〜５０μｍである。本明細書に記載の生物分解性マイクロスフェアの粒度は、静脈内投与に選択されたビヒクル（vehicle）中で膨潤した粒子の粒度を表す。キャリヤー系の特性は、様々な分解速度を生じ、それによってキャリヤーマイクロスフェアと例えば肺内皮細胞との接触時間が制御されるように設計することができる。様々な分解速度は、マイクロスフェアの架橋度を調節するなどの当業者に知られている方法によって行うことができ、架橋の少ないマイクロスフェアは、高度に架橋したマイクロスフェアより速やかに分解する。同様に、幾つかのポリマーについては、より速やかな分解については低分子量ポリマー鎖を、またより遅い分解については高分子量ポリマー鎖を選択することによって分解速度を制御することが可能である。加熱によって架橋した系については、架橋度、従って分解速度を、加熱時間および温度によって制御することができる。正に帯電した粒子を生物分解性キャリヤーマイクロスフェアの表面に吸着させるには、キャリヤーマイクロスフェア自身が、正味の負電荷（ゼータ電位）がミクロ電気泳動を用いて測定するとき、少なくとも−１ｍＶであり、好ましくは少なくとも−５ｍＶであり、更に好ましくは少なくとも−２０ｍＶとすべきである。本発明の組成物に適当な微粒子は市販されており、澱粉マイクロスフェア（例えば、Cadoxamer(Perstorp)およびSpherex(Pharmacia Upjohn)）、デキストランマイクロスフェア（CM Sephadex(Pharmacia Upjohn)およびSP Sephadex(Pharmac ia Upjohn)）、およびアガロースマイクロスフェア（CM Sepharose(Pharmacia U pjohn)およびS Sepharose(Pharmacia Upjohn)）が挙げられる。アルブミンおよびゼラチンマイクロスフェアは、当業者に周知の方法によって調製することができる。カチオン性圧縮剤の例としては、キトサンが挙げられる。「キトサン」という用語は、様々な分子量およびアセチル化度のポリグルコサミンおよびグルコサミン材料のオリゴマーを意味する。修飾キトサン、特にポリエチレングリコールに結合したものは、この定義に含まれる。カチオン性圧縮剤の他の例としては、ポリアミドアミン（それらの樹枝状（dendritic）誘導体を含む）、ステアリルアミン、ＤＯＴＭＡ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）、ＢＩＳＨＯＰ（Ｎ−［（２，３ −ジヘキサデシルオキシ）プロプ−１−イル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）、ＤＯＤＡＣ（Ｂ）（Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−オクタデシル− １−オクタデカアンモニウムクロリド（またはブロミド））、ポリリシン、リポフェクチン、リポフェクタミン、ＤＭＲＩＥ（ジミリストイル・ローゼンタール・インヒビター・エーテル）、ＤＣ−コレステロール（ジメチルアミノエチルカルバミルコレステロール）が挙げられるが、これらに限定されない。これらの圧縮剤は、ＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）のような中性の双性イオン性脂質と混合して、最適効果を誘導することができる。他の圧縮剤としては、ＣＴＡＢ（セチルジメチルエチルアンモニウムブロミド）、ＤＤＡＢ（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド）、リポポリアミン類、例えばジオクタデシルアミドグリシルスペルミン、およびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミドスペルミン、コレステロールのカチオン性誘導体、ＤＯＳＰＡ（ジオレオイル−Ｎ−（２−（スペルミンカルボキサミド）エチル−Ｎ，Ｎ− ジメチル-１−プロパンアミニウム(propanaminium)トリフルオロアセテート）が挙げられる。このようなカチオン性圧縮剤は、個別にまたは任意の組み合わせで用いることもできる。このような濃縮工程は、先行技術において、特にカチオン性ポリマーであるポリリシンに重点を置いて以前に記載されている。例えば、ＤＮＡとポリリシンとの間に形成されたポリ電解質複合体は、Wolfert and Seymou r，(1996)，Gene Therapy，3，269によって記載されている。本発明の好ましい態様は、カチオン性圧縮剤がキトサンであることである。本発明において、ＤＮＡの圧縮複合体は、それらが正味の正電荷を有するように生成される。これらを「コンジュゲート」と呼ぶ。これは、上記のようなカチオン性圧縮剤を用いて、このカチオン性圧縮剤をＤＮＡの溶液に滴定した後、生成する粒子の粒度、更に重要なことであるが、表面電荷を、Laser Doppler Anem ometryのようなゼータ電位の尺度を提供する適当な手法を用いて測定することによって行うことができる。下記の例により、キトサン−ＤＮＡ複合体の製造法を説明する。この方法は、２つの成分を互いに混合し、混合の速度、出発溶液の相対濃度、２成分の比率、ｐＨ、イオン強度、および温度を、必要な粒度および電荷が得られるようにすることを特徴とする。混合速度、出発溶液の相対濃度、ｐＨ、イオン強度、および温度は、粒度を制御するための標準的な実験デザインの一部として変更することができる。２成分の様々な比率を用いて、粒度および表面電荷を制御することもできる。核酸とキトサンの重量対重量比は１：１〜１：２５、好ましくは１：２〜１：２０、最も好ましくは１：５〜１：６とすることができる。複合体の粒度および粒度分布は、PCS 100分光計を備えたMalvern 4700サブミクロン粒子分析装置（Malvern Instruments，英国）を用いて光子相関分光光度法（ＰＣＳ）によって決定することができる。試料を蒸留水で希釈し、散乱角９０°で２５℃で測定する。粒度分布は、多分散インデックス（ＰＩ）により特徴付される。本発明者らは、キトサンの分子量が、緻密化したＤＮＡ複合体の粒度に影響し、実際に複合体の粒度に影響するように選択することができることを見出だした。この目的のため、Wolfert and Seymour（1996）Gene Therapy，3，269-273によって記載されたエチジウムブロミド蛍光を用いて、検討を行うことができる。エチジウムブロミドは、ＤＮＡと相互作用を行って、強い蛍光を生じる。複合体形成性のカチオン性ポリマーを加えると、エチジウムブロミドは複合体から押し出されて、蛍光が減少する。蛍光を添加したポリマーの量に対してプロットしたものを用いて、圧縮工程（蛍光の損失は、圧縮度を表す）、およびそれによる複合体形成性キトサン種の適当な分子量の選択を評価することができる。蛍光は、例えばPerkin-Elmer 3000蛍光分光計などを用いて測定することができる。光学的発光波長を５９１ｎｍに設定し、光学的励起波長を３６６ｎｍに設定する。エチジウムブロミド（ＥｔＢｒ）をキュベット（対照）中の水に加え、ＤＮＡ溶液とエチジウムブロミドを第二のキュベット（試験）中の水に加える。対照キュベットの蛍光を、ゼロに設定する。試験キュベットについて得られた蛍光を測定する。次に、キトサン試料を極めて少量ずつ試験キュベットに定常攪拌を行いながら導入し、それぞれの読みの間にゼロセルに戻しながら蛍光を３回読取る。次に、３回の平均を記録する。キトサンの分子量は、好ましくは５００ダルトン〜５００，０００ダルトンであり、更に好ましくは７００ダルトン〜２５０，０００ダルトンであり、最も好ましくは１，０００ダルトン〜１５０，０００ダルトンである。異なる低分子量のキトサンを、キトサナーゼ（chitosanase）を用いるキトサンの酵素分解によって、または亜硝酸の添加により、調製することができる。いずれの方法も当業者には周知であり、最近の公表物に記載されている（Li et al .，(1995)，Plant Physiol．Biochem.，33，599-603;Allan and Peyron，(1995) ，Carbohydrate Research，277，257-272;Damard and Cartier，(1989)，Int．J ．Biol．Macromol.，11，297-302）。ＤＮＡコンジュゲートの正電荷（ゼータ電位）は、少なくとも＋５ｍＶであり、好ましくは少なくとも＋１０ｍＶであり、最も好ましくは少なくとも＋２０ｍＶであるが、＋１００ｍＶ未満であるのが好ましい。コンジュゲートの表面電荷は、ゼータ電位として表される。これは、ｐＨ７．４および０．００１Ｍイオン強度で測定される。ゼータ電位は、例えばMalvern Zeta Sizer IV（Malvern，英国）を用いてLaser Doppler Anemometry（ＬＤＡ）によって測定される。Laser Doppler Anemometryは、適用電場中を移動している粒子からの散乱レーザー光の検出を伴う。用いる装置は、例えばMalvern Zetasi ser II(MalvernInstruments)であることができる。電気泳動による移動度は、リン酸塩またはMcIlvaine緩衝剤、１００μｇ〜１ｍｇで、一定のイオン強度０．００１Ｍを有するような緩衝液１０ｍｌにコンジュゲートを分散することによって測定される。電圧１００ボルト、電極間隔５０ｍｍ、および誘電率７８．５４でＰＣ４ワイドキャピラリーセルを用いて、４回読取りを行う。粒度が１０〜１０００ｎｍのこれらの正に帯電したコンジュゲートは、当業者によく知られている手続きを用いて過剰の複合体形成剤から分離することができる。カラム分離法は、キトサンおよび同様なカチオン性ポリマーを用いる検討には理想的であるとは言えないことが知られている。代わりに、Levin and Giddin gs,(1991)，J．Chem．Biotechnol.，50，43;Williamsetal.，(1992)，Ind．Eng ．Chem．Res.，31，2172によって記載されているように、クロスーフロー法(FF Fractionation，ソルトレイクシティー、ユタ州；Ratanathanawongs and Giddin gs，(1993)，ACT Symp．Ser.，521，13）、または連続スプリット−フロースィン（contiuous split-flow thin）（ＳＰＬＩＴＴ）セルを用いるフィールド・フロ一分画(field flow fractionation)のような方法を用いることができる。検討段階では、フィルター遠沈管装置を用いることができる。ＤＮＡコンジュゲートが、ＤＮＡによってコードされたポリペプチドを良好に発現するようにするためには、本発明者らは、このコンジュゲートの粒度が好ましくは１μｍを下回り、更に好ましくは５００ｎｍを下回り、最も好ましくは２００ｎｍを下回るべきであることを見出だした。コンジュゲートは、粒度が少なくとも１０ｎｍ（流体力学的直径、光子相関分光分析法によって測定）であるのが好ましい。ＤＮＡとは、長さが１００塩基対を上回る核酸（ＲＮＡを含む）およびオリゴヌクレオチド、またはコイル状または非コイル状のプラスミドまたはコスミドを意味する。ＤＮＡは、肺に局在する先天的および後天的疾患の治療に有用なポリペプチドおよびタンパク質薬剤を発現する任意のＤＮＡであることができる。これらとしては、嚢胞性線維症（嚢胞性線維症トランスメンブランレギュレーター）、α１ −アンチトリプシン欠損症および肺癌（免疫を誘発する遺伝子、または直接的殺腫瘍性（tumoricidal）を有するもの）等が挙げられる。免疫誘発遺伝子としては、ＭＨＣ（主要組織適合性複合体）分子、補助刺激分子、およびサイトカインをコードするもの等が挙げられる。毒性系としては、腫瘍発現遺伝子（ｐ５３）、または非毒性プロドラッグを毒性のものに転換する酵素等が挙げられる。ヘルペスチミジンキナーゼが、一例である。肺炎、界面活性剤欠損症、肺高血圧、および悪性中皮腫は、本発明の組成物を適用することができる他の病気である。しかしながら、これらの組成物は、ＤＮＡを肺へ送達し、肺を、主要な作用部位が体内の他の場所にあるポリペプチドおよびタンパク質（例えば、血液因子XIII、IX）のバイオリアクターとして用いられることもできる。これは、ＤＮＡが肺組織で発現され、発現したポリペプチドが細胞から分泌されて、循環に入り、ポリペプチドが体内の他の部分に分布されるという効果を有することを意味している。本発明を用いて、関節、鼻腔、腟、直腸、目、胃腸管、耳、または頬膜のような体内の他の区画に遺伝子治療を送達することもできる。組成物は、これらの区画の疾患の治療に有用なポリペプチドおよびタンパク質薬剤を発現する任意のＤＮＡを含んでなることができる。例としては、抗感染剤、抗炎症剤、予防薬、および体液性および細胞媒介性応答、すなわちワクチンとして用いられる抗原性材料を生じる抗原等が挙げられる。ＤＮＡは、ウイルス、細菌または寄生生物タンパク質をコードすることができ、従って破傷風、ジフテリア、百日咳、およびインフルエンザのような疾患に対するワクチン接種（vaccination）に用いることができる。遺伝子生成物としては、α１−アンチトリプシン、成長ホルモンシンターゼ、第VIII因子、第IX因子、ＴＮＦ、サイトカイン、抗原遺伝子（Ｂ型肝炎、インフルエンザ、コレラ）、嚢胞性線維症トランスメンブランコンダクタンスレギュレータ−ＣＴＦＲ、癌遺伝子（ｐ５３、Ｋ−ｒａｓ、ＨＳ−Ｅｋ）、スクロースーイソマルターゼ、ラクターゼーフロリジンヒドロラーゼ、およびマルターゼーグルコアミラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。コンジュゲートの、より大きな生物分解性キャリヤーマイクロスフェアへの物理的付着は、通常の処方法を用いて行うことができる。ＤＮＡコンジュゲートのマイクロスフェアへの吸着は、当業者に知られている方法によって行うことができる。例えば、マイクロスフェアを水または低イオン強度の緩衝液のような溶媒に懸濁させることができる。ＤＮＡコンジュゲートをこの懸濁液に加え、混合物を、吸着を起こすのに十分な時間、典型的には１〜３時間室温で緩やかに振盪する。過剰のＤＮＡコンジュゲートを、低速（約６０００ｒｐｍ）で約３〜５分間遠心分離することによって、マイクロスフェアから分離する。一つの大きなマイクロスフェアが多数の小粒子を表面上に有する工程は、コロイド科学の分野で記載されており、「ヘテロ凝析（heterocoagulation）」として知られている（例えば、Buscall et al.，ポリマーコロイド(PolymerColloids)，Elsevier，ロンドン，１９８５年，１６７頁を参照されたい）。このような凝析工程では、キャリヤーマイクロスフェアが、ゲル・インターリンクまたは架橋系で生じるよりも小さなナノ粒子（nanoparticles）が均一にコーティングされるようにすることが重要である（図１）。これは、標準的な手法（例えば、顕微鏡法またはレオロジー法）によってチェックすることができる。本発明のもう一つの局面は、本発明の組成物の医薬での使用である。ヒトまたは哺乳動物に投与されるマイクロスフェアの用量は、利用可能な器官、例えば肺、毛細血管は、一度にごく小さな割合で遮断されるように選択することが重要である。診断用画像の分野における文献には、診断用画像においてこのような目的で安全に投与することができる用量の詳細が記載されている（Davis and Taube ，(1978)，J．Nucl．Med.，19，1209を参照されたい）。実際には、肺毛細血管の１０％以下が遮断されるようにすべきである。マイクロスフェアの個数の適当な範囲は、１０×１０¹⁰未満であり、好ましくは１０⁶〜１０⁸であり、更に好ましくは１０⁷である。マイクロスフェアの用量は、５００ｍｇ未満であり、好ましくは１〜１００ｍｇが適当である。Harding et al．（(1973)J．Nucl．Med.， 14，579）は、直径が１５μｍのアルブミンマイクロスフェア１ｍｇの用量（５．７×１０⁵個の粒子と同等）は、肺動脈循環の０．１４％しか遮断しないと計算した。これらのマイクロスフェアがどのようにして毛細血管床を遮断し、粒子表面と肺毛細血管の内皮細胞との間に良好な接触を生じるかを示す顕微鏡写真を、図２に示す。低用量のこれらのマイクロスフェアが肺毛細血管に長時間滞留しても、病理学的影響はないと思われる（Davis and King，(1974)，J．Nucl．Med.，15 ，436）。分解したマイクロスフェアは、小さくなり過ぎて毛細血管を遮断しなくなれば、循環系に存在し続け、正常な粒子認識および引き続く食作用の工程により肝臓により除去される。本発明では、マイクロスフェアとその内容物は、肝臓のクッパー細胞によってリソソーム区画に吸収され、マイクロスフェアが更に分解され、特に表面に付着したＤＮＡ材料が分解される。従って、肝臓へ送られる任意のＤＮＡ材料は、効果的に分解され、発現を生じることはできないと思われるので、肺の新規な送達系は、肺における遺伝子の部位特異的発現を生じることができるものであるべきである。本発明の組成物は、哺乳動物に静脈内または動脈内投与することができる。これは、哺乳動物の肺内皮に静脈内または動脈内送達することができる。これは、関節、鼻腔、腟、直腸、目、胃腸管、耳、または頬膜のような体内の区画に動脈内送達することもできる。これは、ＤＮＡが関節、鼻腔、腟、直腸、目、胃腸管、耳、または頬膜へ送達されるように投与することができる。例えば、所望な区画に血液を供給している血管に、組成物を投与することができる。本発明のもう一つの局面は、遺伝子治療の方法における本発明の組成物の使用である。本発明のもう一つの局面は、遺伝子治療を必要としている哺乳動物の治療用の医薬の製造における本発明の組成物の使用である。本発明のもう一つの局面は、本発明の組成物を哺乳動物に送達するための部品（pars）のキットであって、本発明の組成物と滅菌したキャリヤー成分とを含んでなるものである。例えば、本発明の肺送達系は、滅菌成分を用いる投与の直前に生成させることができ、または予備成形したヘテロ凝析粒状系を滅菌成分を用いて生成させた後、次に再懸濁および投与のために凍結乾燥することができる。本発明を、例として、下記の図および例に関して更に詳細に説明する。図１：生物分解性微粒子に吸着したＤＮＡ−キトサンナノ粒子コンジュゲート。図２：肺毛細血管床におけるマイクロスフェアを示す顕微鏡写真。図３：負に帯電した澱粉マイクロスフェア上のＤＮＡ−キトサン複合体の吸着。約５０μｇＤＮＡ／１．５ｍｌ蒸留水。図４：吸着した複合体を有するおよび持たないマイクロスフェア。例１：ＤＮＡ−キトサンコンジュゲートの調製、および負に帯電した澱粉マイクロスフェア上でのそれらの吸着下記の例は、キトサンと複合体形成したＣＭＶ−ＣＡＴプラスミドを有する澱粉マイクロスフェア粒子の調製を説明する。Ａ．ＤＮＡ−ＣＴＳ（キトサン）複合体の調製キトサン塩酸塩２６．４ｍｇを、水１８ｍｌに溶解した。溶液を、０．２μｍのメンブランフィルターを通過させた（ＣＴＳ溶液）。ＣＴＳ溶液１５ｍｌを、マグネティックスターラー攪拌下でＤＮＡ溶液（ｐＣＡＴ−ＤＮＡ２．２ｍｇを含む）５０ｍｌに、溶液が濁り始めるまで（約２ｍｌ）滴加した。次に、残りのＣＴＳ溶液を、懸濁液に速やかに加えた（１ｍlずつ）。生成する懸濁液（ＤＮＡ３３．８μｇ／ｍｌとＣＴＳ３３８μｇ／ｍｌを含む）を、使用するまで４℃ で保管した。粒子の粒度は約２００ｎｍであり、表面電荷（ゼータ電位）は＋３５ｍＶであった。Ｂ．ＤＮＡ−ＣＴＳ複合体の精製ＤＮＡ／ＣＴＳ複合体懸濁液０．４ｍｌをフィルター遠沈管（１００ｎｍカットオフ）(Amicon)に加えて、６５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。複合体を水０．３ｍｌに再懸濁し、回収した。試料１５ｍｌを処理し、生成する透明な複合体を水約１０ｍｌに含ませた。Ｃ．ＤＮＡ−ＣＴＳ複合体の定量分析法（分光光度法）３５０〜６００ｎｍの範囲の複合体懸濁液の濁度は低過ぎて、定量的測定には使用できない。しかしながら、２５９ｎｍ（ＤＮＡのλ_max）における最大吸光度を、複合体の測定のための代替パラメーターとして用いることができる。２６０ｎｍにおけるＵＶ吸光度と懸濁液画分中のＤＮＡ−ＣＴＳ複合体の濃度との間の良好な直線関係０．２Ｂ１．０（約１０〜５０μｇ／ｍｌＤＮＡ）を得た。Ｄ．澱粉マイクロスフェア上の複合体の吸着処方物Ｂ０．１ｍｌと、粒度が約５０μｍのカルボキシル化マイクロスフェアを含んでなる４％（重量／容量）澱粉マイクロスフェア懸濁液０．５ｍｌを、ＤＮＡ／ＣＴＳ複合体懸濁液１．０ｍｌに加えた。ＤＮＡ−ＣＴＳ複合体を含まない澱粉マイクロスフェア懸濁液０．５ｍｌをブランク対照として用い、澱粉マイクロスフェアを含まないＤＮＡ−ＣＴＳ複合体懸濁液１．０ｍｌを標準対照として用いた。試料の最終容積を、適量の水を加えて、１．５ｍｌに調整した。試料を、室温で振動式振盪器で２時間振盪した後、６５００ｒｐｍで３分間遠心分離した。２６０ｎｍでのＤＮＡ測定については、澱粉マイクロスフェアからの上清のごく僅かな影響が見られた。上清を採取して、２６０ｎｍで測定した。複合体の吸着は、試料のＵＶ吸光度の減少をＤＮＡ−ＣＴＳ複合体標準対照と比較することによって計算した（図３）。ＤＮＡ−ＣＴＳ複合体の表面吸着に直線的増加が見られた。澱粉マイクロスフェア２０ｍｇを添加すると、複合体の８０％を上回る吸着が見られた。澱粉マイクロスフェア上で吸着したＤＮＡ−ＣＴＳ複合体を示す電子顕微鏡写真を、図４に示す。例２：例１に記載の方法で調製した組成物のウサギへの投与例１に記載の組成物を調製し、ＤＮＡ−コンジュゲートを有するマイクロスフェアを遠心分離によって分離し、注射用滅菌水に分散した。ニュージーランド・ホワイト雌ウサギ１群３匹に耳縁静脈に１０⁶個の粒子／０．５ｍｌを静脈内注射した。動物を３時間後に屠殺し、肺を肝臓および牌臓と共に取り出した。組織学的検討の結果、マイクロスフェアは、大半が肺に隔離されていた。マイクロスフェアは、肺の毛細血管床中に深く沈着していた。例２：遺伝子発現−ＣＡＴ分析のアッセイ材料ＣＭＶプロモーターによって誘導されたレポーター遺伝子ｐＣＡＴ−ＤＮＡは、GeneMedicine，ヒューストン、米国から入手した。ｐＣＡＴ−ＤＯＴＭＡ（Ｎ［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）−プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）複合体を、対照材料として用いた。これは、Felgner et al.，(1987)，Proc．Natl．Acad．Sci．(UA)，84，7415-7417に記載の方法で調製した。方法対照ｐＣＡＴ−ＤＮＡ溶液を、ｐＣＡＴ−ＤＮＡ原液（０．８１１ｍｇ／ｍｌ）をオートクレーブ処理したＰＢＳで希釈することによって調製した。ｐＣＡＴ −ＤＮＡ原液０．８６３ｍｌに、オートクレーブ処理したＰＢＳ１３．１３７ｍｌを加えた。これにより、６匹のウサギにｐＣＡＴ−ＤＮＡ１００μｇ／２ｍｌ容積で投与するのに十分な対照ｐＣＡＴ−ＤＮA溶液（０．０５ｍｇ／ｍｌ）１４．０ｍｌが得られた。溶液を４℃で保管し、ウサギに投与する１５分前に室温まで加温した。凍結乾燥粉末の形態で供給されたｐＣＡＴ−ＤＮＡＤＯＴＭＡ処方物を、適当な検討日に滅菌水を用いて再構成した。生成する液体処方物は、ｐＣＡＴ−ＤＮＡ１００μｇ／２ｍｌ容積の投与量を投与するのに十分な濃度のプラスミドＤＮＡを含んでいた。処方物を４℃で保管し、ウサギに投与する１５分前に室温まで加温した。ＣＡＴＥＬＩＳＡ動物組織のＣＡＴの分析のためのＣＡＴＥＬＩＳＡ手順を、キットの製造業者(BoehringerMarmheim)から得たプロトコールに従って設定した。アッセイは、サンドイッチＥＬＩＳＡ法において、抗−ＣＡＴ抗体を、マイクロタイタープレートモジュールの表面に予備結合させ、組織の抽出物中のＣＡＴ酵素が、固定化抗−ＣＡＴ抗体に特異的に結合し、ＣＡＴに対するジゴキソゲニン標識した抗体（抗−ＣＡＴ−ＤＩＧ）がＣＡＴ酵素に結合することに基づいている。検出抗体である、ペルオキシダーゼ抱合抗−ジゴキシゲニン抗体（抗−ＤＩＧ−ＰＯＤ）は、ジゴキシゲニンに結合する。最終段階において、ペルオキシダーゼ基質（ＡＢＴＳ；２，２'−アジノビス［3−エチルベンズチアゾリンスルホン酸］）をペルオキシダーゼに触媒させて、基質エンハンサーの使用によって増強される着色反応生成物を得る。次に、この色の吸光度を、標準および抽出物中に含まれるＣＡＴ酵素の量に直接相関させる。ＣＡＴＥＬＩＳＡの有効性確認試験試料を分析する前に、ＣＡＴＥＬＩＳＡ法の有効性を確認した。ＣＡＴを含む適性の対照組織試料は得られなかったので、標準曲線を用いて日内および日間変動を決定した。これらの曲線は、０．０、１５．６、３１．２５、６２．５、１２５，２５０および５００ｐｇ／ｍｌのＣＡＴ濃度でＣＡＴＥＬＩＳＡキットで供給されたＣＡＴ標準を用いて調製した。日内変動は、標準曲線を３回調製することによって決定した。日内および日間変動のいずれについても、それぞれの標準濃度での変動係数（％ＣＶ）を計算した。組織抽出法の有効性確認組織抽出手順は、「裸の(naked)」プラスミドＤＮＡを投与した２匹の対照ウサギから様々な組織試料を採取し、個別に−８０℃で保管することによって最初に設定した。氷冷組織抽出緩衝液（１０ｍＭトリスｐＨ７〜８、１５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、０．５％Triton X-100、１００μMLeupeptin、１．０μＭペプスタチン、および０．２５ｍＭＰＭＳＦ）０．５ｍｌを組織試料を含む試験管に加え、４℃でMini-Bead Beaterを用いて様々な時間（０．６、１．２または２．４分）ホモジナイズした。ホモジネートを滅菌した微量遠沈管（１．５ｍｌ）に移し、MSE Microfugeで１３，０００ｒｐｍで、４℃にて２０分間遠心分離した。上清（すなわち、組織抽出物）を滅菌した微量遠沈管（１．５ｍｌ）に移し、氷上に置いた。組織抽出物のアリコットをＰＢＳで希釈し（１／２０）、ＢＣＡタンパク質分析法を用いてタンパク質濃度を分析した。それぞれの試料を２回測定し、希釈度を補正して、組織抽出物中の総タンパク質濃度（ｍｇ／ｍｌ）を得た。ＣＡＴＥＬＩＳＡ法を、胃腸管組織抽出物中のＣＡＴの分析について有効性を確認した。最初に、ＣＡＴＥＬＩＳＡ法を用いる各種の組織抽出物でのＣＡＴ濃度の測定に対するタンパク質濃度の効果を評価した。対照ウサギからの組織試料を、１．５分間ホモジナイズする（３０秒間ホモジナイズおよび３０秒間静止の３サイクル）こと以外は上記の方法で、氷冷組織抽出緩衝液（０．５ｍｌ）中で抽出した。タンパク質濃度を決定した後、組織抽出物を試料緩衝液（ＣＡＴＥＬＩＳＡキット）で希釈して、約０．５、１．０および２．０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度を有する抽出物溶液を得た。これらの希釈した抽出物のそれぞれに、ＣＡＴ標準（ＣＡＴＥＬＩＳＡキット）を所定の最終ＣＡＴ濃度２５および１００ｐｇ／ｍｌとなるまで加えた。次に、添加試料をＣＡＴ濃度について２回分析し、それぞれの試料におけるＣＡＴ回収率を計算した。第二に、様々な試料中のＣＡＴの安定性に対する抽出法の効果を確立した。これは、上記の対照ウサギからの組織試料を、５０または２００ｐｇ／ｍｌのＣＡＴ濃度を有する抽出緩衝液で抽出することによって行った。タンパク質濃度を決定した後に、それぞれの試料抽出物を、試料緩衝液で希釈した（１／２または１／４）。それぞれの希釈試料を、ＣＡＴ濃度について２回分析した。希釈を補正した後、それぞれの組織抽出物中のＣＡＴの回収率を計算した。例４：患者への投与ＤＮＡ：キトサン複合体を、ＤＮＡプラスミドが嚢胞性線維症トランスメンブランコンダクタンスレギュレーターを発現するＤＮＡプラスミドであることを除き上記の例１に記載の方法によって調製する。複合体調製を制御して、１００〜３００ｎｍの範囲の粒子を得る。粒子を、２．５〜５％マンニトールを添加した後、凍結乾燥する。患者に投与する直前に、１００ｐｇＤＮＡに相当するＤＮＡ：キトサン複合体の量を、澱粉マイクロスフェア（Cardoxomer，ペルストルプ，スウェーデン）２０ｍｇと共に注射用水（米国薬局方）１．０ｍｌに分散する。懸濁液は、患者の静脈への注射である。この材料は、必要量の凍結乾燥澱粉マイクロスフェアとＤＮＡ：キトサン複合体との混合物、注射用水１ｍｌを含むバイアル、および注射用の注射器からなるキットとしても利用可能である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＧＢ，ＪＰ，ＫＲ，ＮＯ，ＵＳ

Claims

【特許請求の範囲】１．生物分解性マイクロスフェアを含んでなる組成物であって、マイクロスフェアが正味の負電荷を有し、かつこれに粒度がより小さな正に帯電した粒子が吸着し、このような正に帯電した粒子が、ＤＮＡとカチオン性圧縮剤とのコンジュゲートを含んでなる、組成物。２．生物分解性マイクロスフェアを、架橋した可溶性澱粉、アルブミン、ゼラチン、ヘパリン、カルボキシデキストラン、デキストラン、デキストランスルフェート、アルギネート、ポリラクチド、またはそれらの混合物から調製する、請求項１に記載の組成物。３．カチオン性圧縮剤がキトサンである、請求項１または２に記載の組成物。４．生物分解性マイクロスフェアの平均粒度が５μｍを上回る、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。５．生物分解性マイクロスフェアのゼータ電位が、ＤＮＡコンジュゲートが吸着する前は少なくとも−５ｍＶである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。６．ＤＮＡコンジュゲート粒子の平均粒度が、１０〜５００ｎｍである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。７．ＤＮＡコンジュゲートの正の表面電荷（ゼータ電位）が５〜１００ｍＶである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。８． 1) ＤＮＡとカチオン性圧縮剤とのコンジュゲートを含んでなる正に帯電した粒子を調製し、2)前記の正に帯電した粒子を正味の負電荷を有する生物分解性マイクロスフェアに吸着することを含む、組成物の製造法。９．請求項８に記載の方法によって得られる組成物。１０．マイクロスフェアが、ＤＮＡを脈管床の内皮細胞に送達するためのキャリヤーとして作用する、請求項１〜７または９のいずれか１項に記載の組成物。１１．医薬に使用するための、請求項１〜７、９または１０のいずれか１項に記載の組成物。１２．投与されるマイクロスフェアの用量が、１０×１０¹⁰個未満であるか、または５００ｍｇ未満の量である、請求項１１に記載の組成物。１３．請求項１〜７、９または１０のいずれか１項に記載の組成物を、哺乳動物に静脈内または動脈内投与することを特徴とする、ＤＮＡを哺乳動物へ送達する方法。１４．組成物を哺乳動物の肺内皮に静脈内または動脈内送達する、請求項１３に記載の方法。１５．請求項１〜７、９または１０のいずれか１項に記載の組成物を、関節、鼻腔、腟、直腸、目、胃腸管、耳、または頬膜に送達することを特徴とする、治療法。１６．請求項１〜７、９または１０のいずれか１項に記載の組成物を、ＤＮＡが関節、鼻腔、腟、直腸、目、胃腸管、耳、または頬膜に送達されるように投与することを特徴とする、治療法。１７．ＤＮＡが哺乳動物の肺内皮に送達される、請求項１３に記載の方法。１８．遺伝子治療を必要とする哺乳動物の治療のための医薬の製造における、請求項１〜７、９または１０のいずれか１項に記載の組成物の使用。１９．遺伝子治療の方法における、請求項１〜７、９または１０のいずれか１項に記載の組成物の使用。２０．請求項１〜７、９または１０のいずれか１項に記載の組成物と、滅菌キャリヤー成分を含んでなる、上記組成物を哺乳動物に送達するための部品のキット。２１．請求項１〜７、９または１０のいずれか１項に記載の組成物を哺乳動物に送達するための部品のキットであって、正味の負電荷を有する生物分解性マイクロスフェアと、より小さな粒度の正に帯電した粒子であってＤＮＡとカチオン性圧縮剤とのコンジュゲートを含んでなる正に帯電した粒子と、滅菌キャリヤー成分とを含んでなる、キット。