JP2000514086A - Gene therapy delivery system for targeting to the endothelium - Google Patents

Gene therapy delivery system for targeting to the endothelium

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JP2000514086A JP10504954A JP50495498A JP2000514086A JP 2000514086 A JP2000514086 A JP 2000514086A JP 10504954 A JP10504954 A JP 10504954A JP 50495498 A JP50495498 A JP 50495498A JP 2000514086 A JP2000514086 A JP 2000514086A
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Abstract

A composition comprising biodegradable microspheres that act as carriers for the delivery of DNA to the endothelial cells of a vascular bed, wherein the microspheres carry a net negative charge and to which is adsorbed positively charged particles of a smaller size, wherein such positively charged particles comprise a conjugate of DNA and a cationic compacting agent.

Description

【発明の詳細な説明】 内皮への標的のための遺伝子治療送達系 本発明は、遺伝子治療の送達のための新規な塞栓系に関する。 遺伝子治療は、遺伝的疾患および癌や喘息のような症状などの各種の疾患の治 療、並びに免疫化（ＤＮＡワクチン）の興味深い機会を提供する。遺伝子治療の 成功における重要な側面は、標的器官、更に詳細には、トランスフェクションが 起こる標的細胞へ接近する遺伝子構築物を提供する適当な送達系（「ベクター」 と呼ばれることが多い）の開発であろう。良好な例は、肺の先天的および後天的 疾患の治療である(Curiel et al.，(1996)，Am．J．Resp．Ce1l．Mol．Bio1.，1 4，1-18)。 ２つの薬剤送達経路が、肺の治療に利用できる。薬剤は、エアゾールの形態で 口を介して肺気道へ送達することができる。例えば、エアゾールによる肺気道へ の送達のための脂質キャリヤー核酸複合体の調製は、ＰＣＴ ＷＯ９３／１２７ ５号明細書に記載されている。このような送達は、現在存在している粉末および エアゾール装置を用いて極めて非効率的であることが知られている。更に効率的 な送達は、様々な噴霧装置を用いて行うことができるが、これらの装置は遺伝子 構築物を分解することがあり、投与を行う用量にはかなりの時間を要することも ある。更に、嚢胞性線維症のような多くの臨床症状では、肺が粘液を含み、送達 系が肺および標的上皮細胞に対する遺伝子構築物の適当な提示に深く浸透するこ とを妨げる。 肺への送達のもう一つの手段は、循環系を利用し、遺伝子生成物を肺内皮に送 達することである。遺伝子生成物は、静脈または動脈供給へ注射し、適当な送達 技術を用いて内皮層へ向けることができる。先行技術では、これを、糖またはモ ノクローナル抗体、またはそれらの断片を用いるリガンド介在法の幾つかの形態 を用いて行うことができる方法が記載されている（例えば、Huang，Holmberg et al.，(1990)，J．Liposome Res.，1，393の研究を参照されたい）。この方法は 、動物モデルでは成功しているが、複雑であり、それ自身は、通常の薬学処理下 では容易にスケールアップや製造ができない。肺へ送達する別法は、粒子が、肺 の毛細血管床の一時的遮断または塞栓症を生じる粒度を有する粒子系を用いるこ とである。直径が４〜５μｍより大きい粒子は、肺毛細血管によって濾過されて 除かれ、主として肺胞区へ高度に抽出される（例えば、Kanke et al.，(1980)， J．Pharm．Sci.，69，755を参照されたい）。ヒトの肺は、約２．８×１０8個の 肺胞および２．８×１０11個の毛細血管区分を有すると考えられる。以前は、炭 素に吸着した198Ａｕ、セラミック材料に吸着した111Ａｇおよび203Ｈｇ、99mＴ ｃ-水酸化第二鉄凝集体、並びに更に最近は、ヒト血清アルブミンから作成した マクロ凝集体およびマイクロスフェアなどの多種多様なコロイド系が肺スキャニ ング剤として検討されてきた。99mＴｃ、111Ｉｎまたは113mＩｎで標識した代謝 可能なアルブミンマイクロスフェアが、選択される系である（Hagan et al.，(1 978)，J．Nucl．Med.，19，1055を参照されたい）。Davisは、粒度が１３．５± １．５μｍ直径の範囲のものが理想的であることを示したが、これは、商業的生 産には狭すぎ、彼は、１０〜２０μｍ（１５±５μｍ）の範囲を提案した。この ような系は、安全性の限界が大きいが、但し、投与される用量（粒子数）が毛細 血管区の数と比較して極めて小さく、毒性が粒度に関係しており、大きな粒子（ 直径９０μｍ）は小さなものより毒性が大きい（Davis，放射性医薬品(Radiopha rmaceuticals),Subramanian et al.監修，Soc.Nucl.Med.New York,１９７５年， ２６７頁、およびDavis and Taube(1978)，J．Nucl．Med.，19，1209）。（ミク ロ凝集体またはマイクロスフェアの形態での）アルブミンの分解速度は、いわゆ る系の「硬度」によって変化し、これは、調製および治療の方法 （加熱温度、架橋剤など）に関係している。肺の領域からの全クリアランスは、 通常は２４時間以内に見られるが、マイクロスフェアの分解速度および標識の喪 失は必ずしも同じ速度では起こらない。 Illum et al．（(1982)，Int．J．Pharm.，12，135および(1982)，J．Pharm． Pharmacol．Suppl.，34，89P）は、131Ｉを標識したポリスチレン粒子表面とＩ −ローズベンガルを標識したイオン交換（ＤＥＡＥ）セルロースマイクロスフェ アを用いて、肺に付着する粒度および粒子形状の効果を検討した。用量が約１０8 個の粒子での平均直径が１５．７μｍのポリスチレンマイクロスフェアおよび 直径が４０〜１６０μｍのＤＥＡＥ−セルロースマイクロスフェアは、肺に速や かに吸収され、粒子は肺毛細血管に停滞した。薬剤であるアドリアマイシンを負 荷したアルブミンマイクロスフェアの肺での捕捉および運命を、Wilmott et al. が動物モデルとしてラットを用いて検討した（Wilmott et al.，マイクロスフェ アおよび薬剤療法。薬学、免疫学および医学的側面(Micropheres and Drug Ther apy．Pharmaceutical，Immunological and Medical Aspects)，S.S．Davis，L． Illum，J.G．McVie and E．Tomlinson監修，１９８４年，Elsevier Science Pub lishers B.V.，アムステルダム，２０５頁）。このアイディアは粒子が、遮断さ れた毛細血管に存在することにより、保持された薬剤が粒子から放出され、組織 中に拡散し、作用部位に到達するというものであった。 同様な塞栓形成の概念は、スウェーデンの会社であるPharmaciaにより、そのS pherex（登録商標）系を用いて開発された。この系は、静脈内または動脈内に投 与され、器官部位に到達し、薬理学的化合物、通常は癌の化学療法に用いられる 薬剤を投与する前に局所的塞栓形成を生じる分解性澱粉マイクロスフェアを基剤 としている。また、一時的塞栓症は、薬剤を標的部位に長時間保持して、薬剤の 周囲の組織への吸収を最大にしようとするものである（Lindberg et al.，マイ クロスフェアおよび薬剤療法。薬学、免疫学および医学的側面(Micropheres and Drug Therapy．Pharmaceutical，Immunological and Medical Aspects)，S. S．Davis,L．Illum，J．McVie and E．Tomlinson監修，１９８４年，Elsevier S cience Publishers，アムステルダム，１５３頁を参照されたい）。この塞栓系 は、肺および肝臓について記載されている。 合成オリゴヌクレオチドおよびＰＣＲによって生成したＤＮＡ断片のゼラチン マイクロスフェアへのカプセル封入は、Cortesi et al.，(1994)，Int．J．Phar maceut.，105，181によって記載されている。予備成形マイクロスフェアの表面 へのＤＮＡの付着も、肺血管系の内皮細胞への送達のためのこれらの系の使用も 、記載されていない。 本発明者らは、遺伝子の送達を目的とする新規な塞栓系（embolism system） を発明した。肺標的のための以前に報告された薬剤送達系とは異なり、本発明者 らは、一時的に脈管床を閉塞する生物分解性マイクロスフェアの表面に存在する ように遺伝子材料を慎重に準備した。この方法において、本発明者らは、遺伝子 生成物が極めて効率的に内皮表面に提供され、遺伝子生成物の細胞吸収および発 現が向上することを見出だした。この塞栓系は、肺以外の器官にも用いることが できることが理解されるであろう。他の器官については、塞栓系は、関連動脈に 注入することによって投与することができる。 本発明者らは、遺伝子生成物がそれ自身、キャリヤーマイクロスフェアの表面 に良好に付着するだけでなく適当な細胞表現および取り込みができる形態で、適 当に処方されることが重要であることも見出だした。本発明者らは、マイクロス フェアが、負に帯電したＤＮＡを強力に結合することができる正電荷を有する物 理吸着の工程による未濃縮合ＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡのマイクロスフェア への単なる吸着では、細胞培養モデル内では効果的な発現を生じないことを見出 だした。更に、キャリヤーとして用いられる正に帯電したマイクロスフェアと他 の粒子は、注入時の毒性効果と関係することがあるので、このような正に帯電し たマイクロスフェアは、ヒトでの使用が許可されるとは思われない。 対照的に、本発明者らは、ＤＮＡ自身が最初に濃縮して粒度が１μｍ未満の小 粒子となると、このＤＮＡによってコードされたポリペプチドを良好に発現する ことができることを見出だした。このような濃縮（condensation）は、カチオン 性脂質のようなカチオン性圧縮剤(compacting agent)の使用により、または好ま しくはカチオン性ポリマーによってもたらすことができる。 本発明の第一の局面は、生物分解性マイクロスフェアを含んでなる組成物であ って、マイクロスフェアが正味の負電荷を有し、かつこれに粒度がより小さな正 に帯電した粒子が吸着し、このような正に帯電した粒子が、ＤＮＡとカチオン性 圧縮剤とのコンジュゲートを含んでなるものである。 最終的な組成物は、マイクロスフェアの正味の電荷と粒度、および吸着した粒 子の表面密度と正味の電荷によって、正味の負電荷を有し、中性となり、または 小さな正電荷を有することは、当業者には明らかであろう。 本発明の第二の局面は、上記組成物の製造法であって、1)ＤＮＡとカチオン性 圧縮剤とのコンジュゲートを含んでなる正に帯電した粒子の調製、および2)この 正に帯電した粒子を、正味の負電荷を有する生物分解性マイクロスフェアへの吸 着を含む方法である。「吸着」とは、任意の形態の非共有結合を意味する。 「マイクロスフェア」という用語は、本明細書では、固形のマトリックスマイ クロスフェアおよびマイクロカプセルの両方を包含するのに用いられる。適当な 粒度と表面電荷密度を有する生物分解性マイクロスフェアは、カルボキシル基が 澱粉に共有結合している可溶性澱粉、およびイオン化して、正に帯電したＤＮＡ コンジュゲートと生物分解性マイクロスフェアとの間に静電的相互作用を行うこ とができる基を含むポリマーのような多数の様々な材料から処方することができ る。このような基は、好ましくはカルボキシルまたはスルフェート基である。こ のようなポリマー性材料としては、アルギネート、ヘパリンおよび他の硫酸化多 糖類（カルボキシメチルデキストラン、カルボキシデキストラン、およびデキス トランスルフェート）、およびポリラクチドコグリセリドおよびポリ乳酸のよう な生物分解性の合成ポリマー等が挙げられる。同様に、次にマイクロスフェアに 転換されるポリマーの物理的混合物を用いることもできる。例えば、ヘパリン／ アルブミンマイクロスフェアは、薬剤送達の目的で以前に記載されている（Kwon et al.，(1991)，J．Colloid Interface Sci.，143，501およびCremers et al. ,(1990)，J．Controlled Release，11，167）。このような材料は、遺伝子治療 における使用についても、またはＤＮＡコンジュゲートの輸送についても報告さ れていない。 従って、生物分解性マイクロスフェアは、架橋した可溶性澱粉、アルブミン、 ゼラチン、ヘパリン、カルボキシデキストラン、デキストラン、デキストランス ルフェート、アルギンネート、ポリラクチド、またはそれらの混合物から調製す ることができる。 塞栓を引き起こす生物分解性マイクロスフェアは、好ましくは平均粒度（数平 均直径、光学顕微鏡法によって測定）が５μｍを上回り、更に好ましくは６〜２ ００μｍであり、最も好ましくは１０〜１００μｍであり、更に一層好ましくは １２〜５０μｍである。本明細書に記載の生物分解性マイクロスフェアの粒度は 、静脈内投与に選択されたビヒクル（vehicle）中で膨潤した粒子の粒度を表す 。 キャリヤー系の特性は、様々な分解速度を生じ、それによってキャリヤーマイ クロスフェアと例えば肺内皮細胞との接触時間が制御されるように設計すること ができる。様々な分解速度は、マイクロスフェアの架橋度を調節するなどの当業 者に知られている方法によって行うことができ、架橋の少ないマイクロスフェア は、高度に架橋したマイクロスフェアより速やかに分解する。同様に、幾つかの ポリマーについては、より速やかな分解については低分子量ポリマー鎖を、また より遅い分解については高分子量ポリマー鎖を選択することによって分解速度を 制御することが可能である。加熱によって架橋した系については、架橋度、従っ て分解速度を、加熱時間および温度によって制御することができる。 正に帯電した粒子を生物分解性キャリヤーマイクロスフェアの表面に吸着させ るには、キャリヤーマイクロスフェア自身が、正味の負電荷（ゼータ電位）がミ クロ電気泳動を用いて測定するとき、少なくとも−１ｍＶであり、好ましくは少 なくとも−５ｍＶであり、更に好ましくは少なくとも−２０ｍＶとすべきである 。 本発明の組成物に適当な微粒子は市販されており、澱粉マイクロスフェア（例 えば、Cadoxamer(Perstorp)およびSpherex(Pharmacia Upjohn)）、デキストラン マイクロスフェア（CM Sephadex(Pharmacia Upjohn)およびSP Sephadex(Pharmac ia Upjohn)）、およびアガロースマイクロスフェア（CM Sepharose(Pharmacia U pjohn)およびS Sepharose(Pharmacia Upjohn)）が挙げられる。アルブミンおよ びゼラチンマイクロスフェアは、当業者に周知の方法によって調製することがで きる。 カチオン性圧縮剤の例としては、キトサンが挙げられる。「キトサン」という 用語は、様々な分子量およびアセチル化度のポリグルコサミンおよびグルコサミ ン材料のオリゴマーを意味する。修飾キトサン、特にポリエチレングリコールに 結合したものは、この定義に含まれる。カチオン性圧縮剤の他の例としては、ポ リアミドアミン（それらの樹枝状（dendritic）誘導体を含む）、ステアリルア ミン、ＤＯＴＭＡ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）、ＢＩＳＨＯＰ（Ｎ−［（２，３ −ジヘキサデシルオキシ）プロプ−１−イル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモ ニウムクロリド）、ＤＯＤＡＣ（Ｂ）（Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−オクタデシル− １−オクタデカアンモニウムクロリド（またはブロミド））、ポリリシン、リポ フェクチン、リポフェクタミン、ＤＭＲＩＥ（ジミリストイル・ローゼンタール ・インヒビター・エーテル）、ＤＣ−コレステロール（ジメチルアミノエチルカ ル バミルコレステロール）が挙げられるが、これらに限定されない。これらの圧縮 剤は、ＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）のような中性 の双性イオン性脂質と混合して、最適効果を誘導することができる。他の圧縮剤 としては、ＣＴＡＢ（セチルジメチルエチルアンモニウムブロミド）、ＤＤＡＢ （ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド）、リポポリアミン類、例えば ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン、およびジパルミトイルホスファチジ ルエタノールアミドスペルミン、コレステロールのカチオン性誘導体、ＤＯＳＰ Ａ（ジオレオイル−Ｎ−（２−（スペルミンカルボキサミド）エチル−Ｎ，Ｎ− ジメチル-１−プロパンアミニウム(propanaminium)トリフルオロアセテート）が 挙げられる。このようなカチオン性圧縮剤は、個別にまたは任意の組み合わせで 用いることもできる。このような濃縮工程は、先行技術において、特にカチオン 性ポリマーであるポリリシンに重点を置いて以前に記載されている。例えば、Ｄ ＮＡとポリリシンとの間に形成されたポリ電解質複合体は、Wolfert and Seymou r，(1996)，Gene Therapy，3，269によって記載されている。 本発明の好ましい態様は、カチオン性圧縮剤がキトサンであることである。 本発明において、ＤＮＡの圧縮複合体は、それらが正味の正電荷を有するよう に生成される。これらを「コンジュゲート」と呼ぶ。これは、上記のようなカチ オン性圧縮剤を用いて、このカチオン性圧縮剤をＤＮＡの溶液に滴定した後、生 成する粒子の粒度、更に重要なことであるが、表面電荷を、Laser Doppler Anem ometryのようなゼータ電位の尺度を提供する適当な手法を用いて測定することに よって行うことができる。 下記の例により、キトサン−ＤＮＡ複合体の製造法を説明する。この方法は、 ２つの成分を互いに混合し、混合の速度、出発溶液の相対濃度、２成分の比率、 ｐＨ、イオン強度、および温度を、必要な粒度および電荷が得られるようにする ことを特徴とする。混合速度、出発溶液の相対濃度、ｐＨ、イオン強度、および 温度は、粒度を制御するための標準的な実験デザインの一部として変更すること ができる。２成分の様々な比率を用いて、粒度および表面電荷を制御することも できる。核酸とキトサンの重量対重量比は１：１〜１：２５、好ましくは１：２ 〜１：２０、最も好ましくは１：５〜１：６とすることができる。 複合体の粒度および粒度分布は、PCS 100分光計を備えたMalvern 4700サブミ クロン粒子分析装置（Malvern Instruments，英国）を用いて光子相関分光光度 法（ＰＣＳ）によって決定することができる。試料を蒸留水で希釈し、散乱角９ ０°で２５℃で測定する。粒度分布は、多分散インデックス（ＰＩ）により特徴 付される。 本発明者らは、キトサンの分子量が、緻密化したＤＮＡ複合体の粒度に影響し 、実際に複合体の粒度に影響するように選択することができることを見出だした 。この目的のため、Wolfert and Seymour（1996）Gene Therapy，3，269-273に よって記載されたエチジウムブロミド蛍光を用いて、検討を行うことができる。 エチジウムブロミドは、ＤＮＡと相互作用を行って、強い蛍光を生じる。複合体 形成性のカチオン性ポリマーを加えると、エチジウムブロミドは複合体から押し 出されて、蛍光が減少する。蛍光を添加したポリマーの量に対してプロットした ものを用いて、圧縮工程（蛍光の損失は、圧縮度を表す）、およびそれによる複 合体形成性キトサン種の適当な分子量の選択を評価することができる。蛍光は、 例えばPerkin-Elmer 3000蛍光分光計などを用いて測定することができる。光学 的発光波長を５９１ｎｍに設定し、光学的励起波長を３６６ｎｍに設定する。エ チジウムブロミド（ＥｔＢｒ）をキュベット（対照）中の水に加え、ＤＮＡ溶液 とエチジウムブロミドを第二のキュベット（試験）中の水に加える。対照キュベ ットの蛍光を、ゼロに設定する。試験キュベットについて得られた蛍光を測定す る。次に、キトサン試料を極めて少量ずつ試験キュベットに定常攪拌を行いなが ら導入し、それぞれの読みの間にゼロセルに戻しながら蛍光を３回読取る。次に 、３ 回の平均を記録する。 キトサンの分子量は、好ましくは５００ダルトン〜５００，０００ダルトンで あり、更に好ましくは７００ダルトン〜２５０，０００ダルトンであり、最も好 ましくは１，０００ダルトン〜１５０，０００ダルトンである。 異なる低分子量のキトサンを、キトサナーゼ（chitosanase）を用いるキトサ ンの酵素分解によって、または亜硝酸の添加により、調製することができる。い ずれの方法も当業者には周知であり、最近の公表物に記載されている（Li et al .，(1995)，Plant Physiol．Biochem.，33，599-603;Allan and Peyron，(1995) ，Carbohydrate Research，277，257-272;Damard and Cartier，(1989)，Int．J ．Biol．Macromol.，11，297-302）。 ＤＮＡコンジュゲートの正電荷（ゼータ電位）は、少なくとも＋５ｍＶであり 、好ましくは少なくとも＋１０ｍＶであり、最も好ましくは少なくとも＋２０ｍ Ｖであるが、＋１００ｍＶ未満であるのが好ましい。 コンジュゲートの表面電荷は、ゼータ電位として表される。これは、ｐＨ７． ４および０．００１Ｍイオン強度で測定される。ゼータ電位は、例えばMalvern Zeta Sizer IV（Malvern，英国）を用いてLaser Doppler Anemometry（ＬＤＡ） によって測定される。Laser Doppler Anemometryは、適用電場中を移動している 粒子からの散乱レーザー光の検出を伴う。用いる装置は、例えばMalvern Zetasi ser II(MalvernInstruments)であることができる。 電気泳動による移動度は、リン酸塩またはMcIlvaine緩衝剤、１００μｇ〜１ ｍｇで、一定のイオン強度０．００１Ｍを有するような緩衝液１０ｍｌにコンジ ュゲートを分散することによって測定される。電圧１００ボルト、電極間隔５０ ｍｍ、および誘電率７８．５４でＰＣ４ワイドキャピラリーセルを用いて、４回 読取りを行う。 粒度が１０〜１０００ｎｍのこれらの正に帯電したコンジュゲートは、当業者 によく知られている手続きを用いて過剰の複合体形成剤から分離することができ る。カラム分離法は、キトサンおよび同様なカチオン性ポリマーを用いる検討に は理想的であるとは言えないことが知られている。代わりに、Levin and Giddin gs,(1991)，J．Chem．Biotechnol.，50，43;Williamsetal.，(1992)，Ind．Eng ．Chem．Res.，31，2172によって記載されているように、クロスーフロー法(FF Fractionation，ソルトレイクシティー、ユタ州；Ratanathanawongs and Giddin gs，(1993)，ACT Symp．Ser.，521，13）、または連続スプリット−フロースィ ン（contiuous split-flow thin）（ＳＰＬＩＴＴ）セルを用いるフィールド・ フロ一分画(field flow fractionation)のような方法を用いることができる。検 討段階では、フィルター遠沈管装置を用いることができる。 ＤＮＡコンジュゲートが、ＤＮＡによってコードされたポリペプチドを良好に 発現するようにするためには、本発明者らは、このコンジュゲートの粒度が好ま しくは１μｍを下回り、更に好ましくは５００ｎｍを下回り、最も好ましくは２ ００ｎｍを下回るべきであることを見出だした。コンジュゲートは、粒度が少な くとも１０ｎｍ（流体力学的直径、光子相関分光分析法によって測定）であるの が好ましい。 ＤＮＡとは、長さが１００塩基対を上回る核酸（ＲＮＡを含む）およびオリゴ ヌクレオチド、またはコイル状または非コイル状のプラスミドまたはコスミドを 意味する。 ＤＮＡは、肺に局在する先天的および後天的疾患の治療に有用なポリペプチド およびタンパク質薬剤を発現する任意のＤＮＡであることができる。これらとし ては、嚢胞性線維症（嚢胞性線維症トランスメンブランレギュレーター）、α１ −アンチトリプシン欠損症および肺癌（免疫を誘発する遺伝子、または直接的殺 腫瘍性（tumoricidal）を有するもの）等が挙げられる。免疫誘発遺伝子として は、ＭＨＣ（主要組織適合性複合体）分子、補助刺激分子、およびサイトカイン をコードするもの等が挙げられる。毒性系としては、腫瘍発現遺伝子（ｐ５３） 、または非毒性プロドラッグを毒性のものに転換する酵素等が挙げられる。ヘル ペスチミジンキナーゼが、一例である。 肺炎、界面活性剤欠損症、肺高血圧、および悪性中皮腫は、本発明の組成物を 適用することができる他の病気である。しかしながら、これらの組成物は、ＤＮ Ａを肺へ送達し、肺を、主要な作用部位が体内の他の場所にあるポリペプチドお よびタンパク質（例えば、血液因子XIII、IX）のバイオリアクターとして用いら れることもできる。これは、ＤＮＡが肺組織で発現され、発現したポリペプチド が細胞から分泌されて、循環に入り、ポリペプチドが体内の他の部分に分布され るという効果を有することを意味している。 本発明を用いて、関節、鼻腔、腟、直腸、目、胃腸管、耳、または頬膜のよう な体内の他の区画に遺伝子治療を送達することもできる。組成物は、これらの区 画の疾患の治療に有用なポリペプチドおよびタンパク質薬剤を発現する任意のＤ ＮＡを含んでなることができる。例としては、抗感染剤、抗炎症剤、予防薬、お よび体液性および細胞媒介性応答、すなわちワクチンとして用いられる抗原性材 料を生じる抗原等が挙げられる。ＤＮＡは、ウイルス、細菌または寄生生物タン パク質をコードすることができ、従って破傷風、ジフテリア、百日咳、およびイ ンフルエンザのような疾患に対するワクチン接種（vaccination）に用いること ができる。遺伝子生成物としては、α１−アンチトリプシン、成長ホルモンシン ターゼ、第VIII因子、第IX因子、ＴＮＦ、サイトカイン、抗原遺伝子（Ｂ型肝炎 、インフルエンザ、コレラ）、嚢胞性線維症トランスメンブランコンダクタンス レギュレータ−ＣＴＦＲ、癌遺伝子（ｐ５３、Ｋ−ｒａｓ、ＨＳ−Ｅｋ）、スク ロースーイソマルターゼ、ラクターゼーフロリジンヒドロラーゼ、およびマルタ ーゼーグルコアミラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。 コンジュゲートの、より大きな生物分解性キャリヤーマイクロスフェアへの物 理的付着は、通常の処方法を用いて行うことができる。ＤＮＡコンジュゲートの マイクロスフェアへの吸着は、当業者に知られている方法によって行うことがで きる。例えば、マイクロスフェアを水または低イオン強度の緩衝液のような溶媒 に懸濁させることができる。ＤＮＡコンジュゲートをこの懸濁液に加え、混合物 を、吸着を起こすのに十分な時間、典型的には１〜３時間室温で緩やかに振盪す る。過剰のＤＮＡコンジュゲートを、低速（約６０００ｒｐｍ）で約３〜５分間 遠心分離することによって、マイクロスフェアから分離する。一つの大きなマイ クロスフェアが多数の小粒子を表面上に有する工程は、コロイド科学の分野で記 載されており、「ヘテロ凝析（heterocoagulation）」として知られている（例 えば、Buscall et al.，ポリマーコロイド(PolymerColloids)，Elsevier，ロン ドン，１９８５年，１６７頁を参照されたい）。このような凝析工程では、キャ リヤーマイクロスフェアが、ゲル・インターリンクまたは架橋系で生じるよりも 小さなナノ粒子（nanoparticles）が均一にコーティングされるようにすること が重要である（図１）。これは、標準的な手法（例えば、顕微鏡法またはレオロ ジー法）によってチェックすることができる。 本発明のもう一つの局面は、本発明の組成物の医薬での使用である。ヒトまた は哺乳動物に投与されるマイクロスフェアの用量は、利用可能な器官、例えば肺 、毛細血管は、一度にごく小さな割合で遮断されるように選択することが重要で ある。診断用画像の分野における文献には、診断用画像においてこのような目的 で安全に投与することができる用量の詳細が記載されている（Davis and Taube ，(1978)，J．Nucl．Med.，19，1209を参照されたい）。実際には、肺毛細血管 の１０％以下が遮断されるようにすべきである。マイクロスフェアの個数の適当 な範囲は、１０×１０10未満であり、好ましくは１０6〜１０8であり、更に好ま しくは１０7である。マイクロスフェアの用量は、５００ｍｇ未満であり、好ま しくは１〜１００ｍｇが適当である。Harding et al．（(1973)J．Nucl．Med.， 14，579）は、直径が１５μｍのアルブミンマイクロスフェア１ｍｇの用量（５ ．７×１０5個の粒子と同等）は、肺動脈循環の０．１４％しか遮断しないと計 算した。 これらのマイクロスフェアがどのようにして毛細血管床を遮断し、粒子表面と 肺毛細血管の内皮細胞との間に良好な接触を生じるかを示す顕微鏡写真を、図２ に示す。低用量のこれらのマイクロスフェアが肺毛細血管に長時間滞留しても、 病理学的影響はないと思われる（Davis and King，(1974)，J．Nucl．Med.，15 ，436）。分解したマイクロスフェアは、小さくなり過ぎて毛細血管を遮断しな くなれば、循環系に存在し続け、正常な粒子認識および引き続く食作用の工程に より肝臓により除去される。本発明では、マイクロスフェアとその内容物は、肝 臓のクッパー細胞によってリソソーム区画に吸収され、マイクロスフェアが更に 分解され、特に表面に付着したＤＮＡ材料が分解される。従って、肝臓へ送られ る任意のＤＮＡ材料は、効果的に分解され、発現を生じることはできないと思わ れるので、肺の新規な送達系は、肺における遺伝子の部位特異的発現を生じるこ とができるものであるべきである。 本発明の組成物は、哺乳動物に静脈内または動脈内投与することができる。こ れは、哺乳動物の肺内皮に静脈内または動脈内送達することができる。これは、 関節、鼻腔、腟、直腸、目、胃腸管、耳、または頬膜のような体内の区画に動脈 内送達することもできる。これは、ＤＮＡが関節、鼻腔、腟、直腸、目、胃腸管 、耳、または頬膜へ送達されるように投与することができる。例えば、所望な区 画に血液を供給している血管に、組成物を投与することができる。 本発明のもう一つの局面は、遺伝子治療の方法における本発明の組成物の使用 である。 本発明のもう一つの局面は、遺伝子治療を必要としている哺乳動物の治療用の 医薬の製造における本発明の組成物の使用である。 本発明のもう一つの局面は、本発明の組成物を哺乳動物に送達するための部品 （pars）のキットであって、本発明の組成物と滅菌したキャリヤー成分とを含ん でなるものである。例えば、本発明の肺送達系は、滅菌成分を用いる投与の直前 に生成させることができ、または予備成形したヘテロ凝析粒状系を滅菌成分を用 いて生成させた後、次に再懸濁および投与のために凍結乾燥することができる。 本発明を、例として、下記の図および例に関して更に詳細に説明する。 図１： 生物分解性微粒子に吸着したＤＮＡ−キトサンナノ粒子コンジュゲー ト。 図２： 肺毛細血管床におけるマイクロスフェアを示す顕微鏡写真。 図３： 負に帯電した澱粉マイクロスフェア上のＤＮＡ−キトサン複合体の吸 着。約５０μｇＤＮＡ／１．５ｍｌ蒸留水。 図４： 吸着した複合体を有するおよび持たないマイクロスフェア。 例１： ＤＮＡ−キトサンコンジュゲートの調製、および負に帯電した澱粉マイ クロスフェア上でのそれらの吸着 下記の例は、キトサンと複合体形成したＣＭＶ−ＣＡＴプラスミドを有する澱 粉マイクロスフェア粒子の調製を説明する。 Ａ． ＤＮＡ−ＣＴＳ（キトサン）複合体の調製 キトサン塩酸塩２６．４ｍｇを、水１８ｍｌに溶解した。溶液を、０．２μｍ のメンブランフィルターを通過させた（ＣＴＳ溶液）。ＣＴＳ溶液１５ｍｌを、 マグネティックスターラー攪拌下でＤＮＡ溶液（ｐＣＡＴ−ＤＮＡ２．２ｍｇを 含む）５０ｍｌに、溶液が濁り始めるまで（約２ｍｌ）滴加した。次に、残りの ＣＴＳ溶液を、懸濁液に速やかに加えた（１ｍlずつ）。生成する懸濁液（ＤＮ Ａ３３．８μｇ／ｍｌとＣＴＳ３３８μｇ／ｍｌを含む）を、使用するまで４℃ で保管した。粒子の粒度は約２００ｎｍであり、表面電荷（ゼータ電位）は ＋３５ｍＶであった。 Ｂ． ＤＮＡ−ＣＴＳ複合体の精製 ＤＮＡ／ＣＴＳ複合体懸濁液０．４ｍｌをフィルター遠沈管（１００ｎｍカッ トオフ）(Amicon)に加えて、６５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。複合体を 水０．３ｍｌに再懸濁し、回収した。試料１５ｍｌを処理し、生成する透明な複 合体を水約１０ｍｌに含ませた。 Ｃ． ＤＮＡ−ＣＴＳ複合体の定量分析法（分光光度法） ３５０〜６００ｎｍの範囲の複合体懸濁液の濁度は低過ぎて、定量的測定には使 用できない。しかしながら、２５９ｎｍ（ＤＮＡのλmax）における最大吸光度 を、複合体の測定のための代替パラメーターとして用いることができる。２６０ ｎｍにおけるＵＶ吸光度と懸濁液画分中のＤＮＡ−ＣＴＳ複合体の濃度との間の 良好な直線関係０．２Ｂ１．０（約１０〜５０μｇ／ｍｌＤＮＡ）を得た。 Ｄ． 澱粉マイクロスフェア上の複合体の吸着 処方物Ｂ ０．１ｍｌと、粒度が約５０μｍのカルボキシル化マイクロスフェ アを含んでなる４％（重量／容量）澱粉マイクロスフェア懸濁液０．５ｍｌを、 ＤＮＡ／ＣＴＳ複合体懸濁液１．０ｍｌに加えた。ＤＮＡ−ＣＴＳ複合体を含ま ない澱粉マイクロスフェア懸濁液０．５ｍｌをブランク対照として用い、澱粉マ イクロスフェアを含まないＤＮＡ−ＣＴＳ複合体懸濁液１．０ｍｌを標準対照と して用いた。試料の最終容積を、適量の水を加えて、１．５ｍｌに調整した。試 料を、室温で振動式振盪器で２時間振盪した後、６５００ｒｐｍで３分間遠心分 離した。２６０ｎｍでのＤＮＡ測定については、澱粉マイクロスフェアからの上 清のごく僅かな影響が見られた。上清を採取して、２６０ｎｍで測定した。複合 体の吸着は、試料のＵＶ吸光度の減少をＤＮＡ−ＣＴＳ複合体標準対照と比較す ることによって計算した（図３）。ＤＮＡ−ＣＴＳ複合体の表面吸着に直線的増 加が見られた。澱粉マイクロスフェア２０ｍｇを添加すると、複合体の８０％を 上回る吸着が見られた。澱粉マイクロスフェア上で吸着したＤＮＡ−ＣＴＳ複合 体を示す電子顕微鏡写真を、図４に示す。 例２： 例１に記載の方法で調製した組成物のウサギへの投与 例１に記載の組成物を調製し、ＤＮＡ−コンジュゲートを有するマイクロスフ ェアを遠心分離によって分離し、注射用滅菌水に分散した。ニュージーランド・ ホワイト雌ウサギ１群３匹に耳縁静脈に１０6個の粒子／０．５ｍｌを静脈内注 射した。動物を３時間後に屠殺し、肺を肝臓および牌臓と共に取り出した。組織 学的検討の結果、マイクロスフェアは、大半が肺に隔離されていた。マイクロス フェアは、肺の毛細血管床中に深く沈着していた。 例２： 遺伝子発現−ＣＡＴ分析のアッセイ 材料 ＣＭＶプロモーターによって誘導されたレポーター遺伝子ｐＣＡＴ−ＤＮＡは 、GeneMedicine，ヒューストン、米国から入手した。ｐＣＡＴ−ＤＯＴＭＡ（Ｎ ［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）−プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル アンモニウムクロリド）複合体を、対照材料として用いた。これは、Felgner et al.，(1987)，Proc．Natl．Acad．Sci．(UA)，84，7415-7417に記載の方法で調 製した。 方法 対照ｐＣＡＴ−ＤＮＡ溶液を、ｐＣＡＴ−ＤＮＡ原液（０．８１１ｍｇ／ｍｌ ）をオートクレーブ処理したＰＢＳで希釈することによって調製した。ｐＣＡＴ −ＤＮＡ原液０．８６３ｍｌに、オートクレーブ処理したＰＢＳ１３．１３７ｍ ｌを加えた。これにより、６匹のウサギにｐＣＡＴ−ＤＮＡ１００μｇ／２ｍｌ 容積で投与するのに十分な対照ｐＣＡＴ−ＤＮA溶液（０．０５ｍｇ／ｍｌ）１ ４． ０ｍｌが得られた。溶液を４℃で保管し、ウサギに投与する１５分前に室温まで 加温した。 凍結乾燥粉末の形態で供給されたｐＣＡＴ−ＤＮＡ ＤＯＴＭＡ処方物を、適 当な検討日に滅菌水を用いて再構成した。生成する液体処方物は、ｐＣＡＴ−Ｄ ＮＡ１００μｇ／２ｍｌ容積の投与量を投与するのに十分な濃度のプラスミドＤ ＮＡを含んでいた。処方物を４℃で保管し、ウサギに投与する１５分前に室温ま で加温した。 ＣＡＴ ＥＬＩＳＡ 動物組織のＣＡＴの分析のためのＣＡＴ ＥＬＩＳＡ手順を、キットの製造業 者(BoehringerMarmheim)から得たプロトコールに従って設定した。アッセイは、 サンドイッチＥＬＩＳＡ法において、抗−ＣＡＴ抗体を、マイクロタイタープレ ートモジュールの表面に予備結合させ、組織の抽出物中のＣＡＴ酵素が、固定化 抗−ＣＡＴ抗体に特異的に結合し、ＣＡＴに対するジゴキソゲニン標識した抗体 （抗−ＣＡＴ−ＤＩＧ）がＣＡＴ酵素に結合することに基づいている。検出抗体 である、ペルオキシダーゼ抱合抗−ジゴキシゲニン抗体（抗−ＤＩＧ−ＰＯＤ） は、ジゴキシゲニンに結合する。最終段階において、ペルオキシダーゼ基質（Ａ ＢＴＳ；２，２'−アジノビス［3−エチルベンズチアゾリンスルホン酸］）をペ ルオキシダーゼに触媒させて、基質エンハンサーの使用によって増強される着色 反応生成物を得る。次に、この色の吸光度を、標準および抽出物中に含まれるＣ ＡＴ酵素の量に直接相関させる。 ＣＡＴ ＥＬＩＳＡの有効性確認 試験試料を分析する前に、ＣＡＴ ＥＬＩＳＡ法の有効性を確認した。ＣＡＴ を含む適性の対照組織試料は得られなかったので、標準曲線を用いて日内および 日間変動を決定した。これらの曲線は、０．０、１５．６、３１．２５、６２． ５、１２５，２５０および５００ｐｇ／ｍｌのＣＡＴ濃度でＣＡＴ ＥＬＩＳＡ キットで供給されたＣＡＴ標準を用いて調製した。日内変動は、標準曲線を３回 調製することによって決定した。日内および日間変動のいずれについても、それ ぞれの標準濃度での変動係数（％ＣＶ）を計算した。 組織抽出法の有効性確認 組織抽出手順は、「裸の(naked)」プラスミドＤＮＡを投与した２匹の対照ウ サギから様々な組織試料を採取し、個別に−８０℃で保管することによって最初 に設定した。氷冷組織抽出緩衝液（１０ｍＭ トリスｐＨ７〜８、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％Triton X-100、１００μMLeupeptin、１ ．０μＭペプスタチン、および０．２５ｍＭ ＰＭＳＦ）０．５ｍｌを組織試料 を含む試験管に加え、４℃でMini-Bead Beaterを用いて様々な時間（０．６、１ ．２または２．４分）ホモジナイズした。ホモジネートを滅菌した微量遠沈管（ １．５ｍｌ）に移し、MSE Microfugeで１３，０００ｒｐｍで、４℃にて２０分 間遠心分離した。上清（すなわち、組織抽出物）を滅菌した微量遠沈管（１．５ ｍｌ）に移し、氷上に置いた。組織抽出物のアリコットをＰＢＳで希釈し（１／ ２０）、ＢＣＡタンパク質分析法を用いてタンパク質濃度を分析した。それぞれ の試料を２回測定し、希釈度を補正して、組織抽出物中の総タンパク質濃度（ｍ ｇ／ｍｌ）を得た。 ＣＡＴ ＥＬＩＳＡ法を、胃腸管組織抽出物中のＣＡＴの分析について有効性 を確認した。最初に、ＣＡＴ ＥＬＩＳＡ法を用いる各種の組織抽出物でのＣＡ Ｔ濃度の測定に対するタンパク質濃度の効果を評価した。対照ウサギからの組織 試料を、１．５分間ホモジナイズする（３０秒間ホモジナイズおよび３０秒間静 止の３サイクル）こと以外は上記の方法で、氷冷組織抽出緩衝液（０．５ｍｌ） 中で抽出した。タンパク質濃度を決定した後、組織抽出物を試料緩衝液（ＣＡＴ ＥＬＩＳＡキット）で希釈して、約０．５、１．０および２．０ｍｇ／ｍｌの タンパク質濃度を有する抽出物溶液を得た。これらの希釈した抽出物のそれぞれ に、ＣＡＴ標準（ＣＡＴ ＥＬＩＳＡキット）を所定の最終ＣＡＴ濃度２５およ び１００ｐｇ／ｍｌとなるまで加えた。次に、添加試料をＣＡＴ濃度について２ 回分析し、それぞれの試料におけるＣＡＴ回収率を計算した。 第二に、様々な試料中のＣＡＴの安定性に対する抽出法の効果を確立した。こ れは、上記の対照ウサギからの組織試料を、５０または２００ｐｇ／ｍｌのＣＡ Ｔ濃度を有する抽出緩衝液で抽出することによって行った。タンパク質濃度を決 定した後に、それぞれの試料抽出物を、試料緩衝液で希釈した（１／２または１ ／４）。それぞれの希釈試料を、ＣＡＴ濃度について２回分析した。希釈を補正 した後、それぞれの組織抽出物中のＣＡＴの回収率を計算した。 例４： 患者への投与 ＤＮＡ：キトサン複合体を、ＤＮＡプラスミドが嚢胞性線維症トランスメンブ ランコンダクタンスレギュレーターを発現するＤＮＡプラスミドであることを除 き上記の例１に記載の方法によって調製する。 複合体調製を制御して、１００〜３００ｎｍの範囲の粒子を得る。粒子を、２ ．５〜５％マンニトールを添加した後、凍結乾燥する。 患者に投与する直前に、１００ｐｇＤＮＡに相当するＤＮＡ：キトサン複合体 の量を、澱粉マイクロスフェア（Cardoxomer，ペルストルプ，スウェーデン）２ ０ｍｇと共に注射用水（米国薬局方）１．０ｍｌに分散する。懸濁液は、患者の 静脈への注射である。 この材料は、必要量の凍結乾燥澱粉マイクロスフェアとＤＮＡ：キトサン複合 体との混合物、注射用水１ｍｌを含むバイアル、および注射用の注射器からなる キットとしても利用可能である。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Gene Therapy Delivery System for Targeting the Endothelium The present invention relates to a novel embolic system for the delivery of gene therapy. Gene therapy offers an interesting opportunity for the treatment of genetic diseases and various diseases, such as cancer and asthma, as well as for immunization (DNA vaccines). An important aspect of the success of gene therapy is the development of suitable delivery systems (often referred to as "vectors") that provide the gene construct with access to the target organ, and more particularly, the target cell where transfection occurs. Would. A good example is the treatment of congenital and acquired diseases of the lung (Curiel et al., (1996), Am. J. Resp. Ce11. Mol. Biol. 1, 14, 1-18). Two drug delivery routes are available for pulmonary treatment. The drug can be delivered to the pulmonary airways via the mouth in the form of an aerosol. For example, the preparation of a lipid carrier nucleic acid complex for delivery to the pulmonary airways by aerosol is described in PCT WO 93/12775. Such delivery is known to be extremely inefficient using currently existing powder and aerosol devices. More efficient delivery can be achieved using a variety of nebulizing devices, but these devices can degrade the genetic construct and the dose administered can take a significant amount of time. In addition, in many clinical conditions, such as cystic fibrosis, the lungs contain mucus, preventing the delivery system from penetrating deeply into the lungs and proper presentation of the gene construct to target epithelial cells. Another means of pulmonary delivery is to utilize the circulatory system to deliver gene products to the lung endothelium. The gene product can be injected into the venous or arterial supply and directed to the endothelial layer using a suitable delivery technique. The prior art describes how this can be done using some form of ligand-mediated method using sugars or monoclonal antibodies, or fragments thereof (see, for example, Huang, Holmberg et al., ( 1990), J. Liposome Res., 1, 393). This method has been successful in animal models, but is complex and as such cannot be easily scaled up or manufactured under normal pharmaceutical processing. An alternative method of delivering to the lung is to use a particle system in which the particles have a particle size that causes temporary blockage or embolism of the capillary bed of the lung. Particles larger than 4-5 μm in diameter are filtered out by the pulmonary capillaries and are highly extracted primarily into the alveolar compartment (eg, Kanke et al., (1980), J. Pharm. Sci., 69). , 755). The human lung is about 2.8 × 10 8 Alveoli and 2.8 x 10 11 It is believed to have individual capillary segments. Previously adsorbed on carbon 198 Au adsorbed on ceramic material 111 Ag and 203 Hg, 99m A wide variety of colloid systems, such as Tc-ferric hydroxide aggregates, and more recently, macroaggregates and microspheres made from human serum albumin, have been investigated as lung scanning agents. 99m Tc, 111 In or 113m In labeled metabolizable albumin microspheres are the system of choice (see Hagan et al., (1978), J. Nucl. Med., 19, 1055). Davis has shown that particle sizes in the range of 13.5 ± 1.5 μm diameter are ideal, but this is too narrow for commercial production, he says that 10-20 μm (15 ± 5 μm) Proposed range. Such systems have large safety limitations, except that the dose administered (number of particles) is very small compared to the number of capillaries, toxicity is related to particle size, and large particles (diameter 90 μm) are more toxic than small ones (Davis, Radiopharmaceuticals, supervised by Subramanian et al., Soc. Nucl. Med. New York, 1975, p. 267, and Davis and Taube (1978), J. Am. Nucl. Med., 19, 1209). The rate of degradation of albumin (in the form of microaggregates or microspheres) depends on the so-called "hardness" of the system, which is related to the method of preparation and treatment (heating temperature, crosslinking agent, etc.). Although total clearance from the lung area is usually seen within 24 hours, the rate of microsphere degradation and label loss does not always occur at the same rate. Illum et al. ((1982), Int. J. Pharm., 12, 135 and (1982), J. Pharm. Pharmacol. Suppl., 34, 89P) 131 Using the surface of polystyrene particles labeled with I and the ion-exchanged (DEAE) cellulose microspheres labeled with I-rose bengal, the effect of particle size and particle shape adhering to the lung was examined. About 10 doses 8 Polystyrene microspheres with an average diameter of 15.7 μm and DEAE-cellulose microspheres with a diameter of 40-160 μm in individual particles were rapidly absorbed into the lungs, and the particles remained in the lung capillaries. The capture and fate of pulmonary albumin microspheres loaded with the drug adriamycin in the lungs was studied by Wilmott et al. In rats as an animal model (Wilmott et al., Microspheres and Drug Therapy. Pharmacology, Immunology and Medical Aspects (Micropheres and Drug Therapy. Pharmaceutical, Immunological and Medical Aspects), SS. Davis, L. Illum, JG. McVie and E. Tomlinson, 1984, Elsevier Science Publishers BV, Amsterdam, p. 205). The idea was that the presence of the particles in the occluded capillaries would release the retained drug from the particles, diffuse into the tissue, and reach the site of action. A similar embolization concept was developed by the Swedish company Pharmacia using its S pherex® system. This system is a degradable starch microsphere that is administered intravenously or intraarterially, reaches an organ site, and causes local embolization before administering a pharmacological compound, usually a drug used for cancer chemotherapy. Based. Transient embolism also seeks to retain the drug at the target site for an extended period of time to maximize the absorption of the drug into surrounding tissues (Lindberg et al., Microspheres and Drug Therapy. Immunology and Medical Aspects (Micropheres and Drug Therapy. Pharmaceutical, Immunological and Medical Aspects), SS Davis, L. Illum, J. McVie and E. Tomlinson, 1984, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 153. See page.) This embolic system has been described for lung and liver. Encapsulation of synthetic oligonucleotides and DNA fragments generated by PCR in gelatin microspheres is described in Cortesi et al., (1994), Int. J. Phar maceut., 105, 181. Neither the attachment of DNA to the surface of preformed microspheres nor the use of these systems for delivery to endothelial cells of the pulmonary vasculature is described. The present inventors have invented a novel embolism system for gene delivery. Unlike previously reported drug delivery systems for lung targets, we carefully prepared the genetic material to be on the surface of biodegradable microspheres that temporarily occlude the vascular bed did. In this way, the inventors have found that the gene product is provided to the endothelial surface very efficiently, improving the cellular uptake and expression of the gene product. It will be appreciated that the embolic system can be used for organs other than the lung. For other organs, the embolic system can be administered by injection into the relevant artery. The inventors have also found that it is important that the gene product be properly formulated in a form that not only adheres well to the surface of the carrier microspheres, but also allows for proper cell expression and uptake. I started. We believe that simple sorption of unconcentrated combined DNA or plasmid DNA to microspheres by a process of physisorption, in which the microspheres have a positive charge capable of strongly binding negatively charged DNA, can be used for cell culture. It was found that no effective expression occurred in the model. In addition, positively charged microspheres and other particles used as carriers may be associated with toxic effects upon injection, so such positively charged microspheres are approved for use in humans I don't think In contrast, the present inventors have found that when the DNA itself is first concentrated to small particles with a particle size of less than 1 μm, the polypeptide encoded by the DNA can be well expressed. Such condensation can be provided by the use of a cationic compacting agent, such as a cationic lipid, or preferably by a cationic polymer. A first aspect of the present invention is a composition comprising a biodegradable microsphere, wherein the microsphere has a net negative charge, on which positively charged particles of smaller size are adsorbed. Such positively charged particles comprise a conjugate of DNA and a cationic compress. Depending on the net charge and particle size of the microspheres, and the surface density and net charge of the adsorbed particles, the final composition may have a net negative charge, be neutral, or have a small positive charge: It will be clear to those skilled in the art. A second aspect of the present invention is a method of making the above composition, comprising: 1) preparing a positively charged particle comprising a conjugate of DNA and a cationic compress; and 2) preparing the positively charged particle. The method involves adsorption of the resulting particles onto biodegradable microspheres having a net negative charge. "Adsorption" means any form of non-covalent bond. The term "microsphere" is used herein to encompass both solid matrix microspheres and microcapsules. Biodegradable microspheres of appropriate particle size and surface charge density are soluble starch in which carboxyl groups are covalently bonded to starch, and between ionized, positively charged DNA conjugate and biodegradable microspheres. Can be formulated from a number of different materials, such as polymers that contain groups capable of performing electrostatic interactions with the same. Such a group is preferably a carboxyl or sulfate group. Such polymeric materials include alginate, heparin and other sulfated polysaccharides (carboxymethyl dextran, carboxydextran, and dextran sulfate), and biodegradable synthetic polymers such as polylactide coglycerides and polylactic acid. Is mentioned. Similarly, physical mixtures of polymers that are then converted to microspheres can be used. For example, heparin / albumin microspheres have been described previously for the purpose of drug delivery (Kwon et al., (1991), J. Colloid Interface Sci., 143, 501 and Cremers et al., (1990), J. Controlled Release, 11, 167). Such materials have not been reported for use in gene therapy or for transporting DNA conjugates. Thus, biodegradable microspheres can be prepared from crosslinked soluble starch, albumin, gelatin, heparin, carboxydextran, dextran, dextran sulfate, alginate, polylactide, or mixtures thereof. The biodegradable microspheres that cause emboli preferably have an average particle size (number average diameter, measured by light microscopy) of more than 5 μm, more preferably 6-200 μm, most preferably 10-100 μm, More preferably, it is 12 to 50 μm. The particle size of the biodegradable microspheres described herein refers to the particle size of the particles swollen in the vehicle chosen for intravenous administration. The properties of the carrier system can be designed such that it results in various degradation rates, thereby controlling the contact time between the carrier microspheres and, for example, lung endothelial cells. Various degradation rates can be achieved by methods known to those skilled in the art, such as adjusting the degree of crosslinking of the microspheres, with less crosslinked microspheres degrading faster than highly crosslinked microspheres. Similarly, for some polymers, the rate of degradation can be controlled by selecting low molecular weight polymer chains for faster degradation and high molecular weight polymer chains for slower degradation. For systems that have been crosslinked by heating, the degree of crosslinking, and thus the rate of degradation, can be controlled by heating time and temperature. To adsorb positively charged particles onto the surface of the biodegradable carrier microsphere, the carrier microsphere itself must have a net negative charge (zeta potential) of at least -1 mV when measured using microelectrophoresis. , Preferably at least -5 mV, more preferably at least -20 mV. Microparticles suitable for the compositions of the present invention are commercially available and include starch microspheres (eg, Cadoxamer (Perstorp) and Spherex (Pharmacia Upjohn)), dextran microspheres (CM Sephadex (Pharmacia Upjohn) and SP Sephadex (Pharmacia Upjohn)). )), And agarose microspheres (CM Sepharose (Pharmacia Upjohn) and S Sepharose (Pharmacia Upjohn)). Albumin and gelatin microspheres can be prepared by methods well known to those skilled in the art. Examples of cationic compression agents include chitosan. The term "chitosan" refers to oligomers of polyglucosamine and glucosamine materials of various molecular weights and degrees of acetylation. Modified chitosan, especially those linked to polyethylene glycol, are included in this definition. Other examples of cationic compresses include polyamidoamines (including their dendritic derivatives), stearylamine, DOTMA (N- [1- (2,3-dioleoyloxy) propyl] -N , N, N-trimethylammonium chloride), BISHOP (N-[(2,3-dihexadecyloxy) prop-1-yl] -N, N, N-trimethylammonium chloride), DODAC (B) (N, N-dimethyl-N-octadecyl-1-octadecaammonium chloride (or bromide)), polylysine, lipofectin, lipofectamine, DMRIE (dimyristoyl rosental inhibitor ether), DC-cholesterol (dimethylaminoethylcarbamyl cholesterol) But are limited to these There. These compresses can be mixed with neutral zwitterionic lipids such as DOPE (dioleoylphosphatidylethanolamine) to induce optimal effects. Other compressing agents include CTAB (cetyldimethylethylammonium bromide), DDAB (dimethyldioctadecylammonium bromide), lipopolyamines such as dioctadecylamidoglycylspermine, and dipalmitoylphosphatidylethanolamide spermine, cationic derivatives of cholesterol DOSP A (dioleoyl-N- (2- (sperminecarboxamido) ethyl-N, N-dimethyl-1-propanaminium trifluoroacetate). Such cationic compresses are individually Such enrichment steps have been previously described in the prior art, with particular emphasis on the cationic polymer polylysine, for example, DNA and poly. The polyelectrolyte complex formed with syn is described by Wolfert and Seymour, (1996), Gene Therapy, 3, 269. In a preferred embodiment of the present invention, the cationic compressive agent is chitosan. In the present invention, compressed complexes of DNA are created such that they have a net positive charge, these are referred to as "conjugates." The titer of this cationic compress is used to titrate the solution of DNA and the size of the resulting particles, and more importantly, the surface charge, is a suitable measure that provides a measure of zeta potential, such as the Laser Doppler Anemometry. The following example illustrates a method for producing a chitosan-DNA complex, which comprises mixing two components together, the rate of mixing, and the starting solution. It is characterized in that the concentration, the ratio of the two components, the pH, the ionic strength and the temperature are such that the required particle size and charge are obtained: mixing speed, relative concentration of the starting solution, pH, ionic strength and temperature. Can be modified as part of a standard experimental design to control particle size.Various ratios of the two components can also be used to control particle size and surface charge. The weight ratio can be from 1: 1 to 1:25, preferably from 1: 2 to 1:20, most preferably from 1: 5 to 1: 6.The particle size and particle size distribution of the composite are determined by PCS 100 spectrometer. Can be determined by photon correlation spectroscopy (PCS) using a Malvern 4700 submicron particle analyzer (Malvern Instruments, UK) equipped with The sample is diluted with distilled water and measured at 25 ° C. with a scattering angle of 90 °. The particle size distribution is characterized by a polydispersity index (PI). The inventors have found that the molecular weight of chitosan affects the size of the densified DNA complex and can be selected to actually affect the size of the complex. For this purpose, studies can be performed using ethidium bromide fluorescence as described by Wolfert and Seymour (1996) Gene Therapy, 3, 269-273. Ethidium bromide interacts with DNA to produce strong fluorescence. When a complexing cationic polymer is added, ethidium bromide is extruded from the complex, reducing fluorescence. Using a plot of the amount of polymer added fluorescence to evaluate the compression step (loss of fluorescence indicates the degree of compression) and thereby the selection of the appropriate molecular weight of the complexing chitosan species Can be. Fluorescence can be measured using, for example, a Perkin-Elmer 3000 fluorescence spectrometer. The optical emission wavelength is set at 591 nm and the optical excitation wavelength is set at 366 nm. Add ethidium bromide (EtBr) to water in cuvette (control) and add DNA solution and ethidium bromide to water in second cuvette (test). The fluorescence of the control cuvette is set to zero. The fluorescence obtained for the test cuvette is measured. Next, the chitosan sample is introduced into the test cuvette in very small amounts with constant stirring, and the fluorescence is read three times while returning to zero cell between each reading. Then record the average of the three. The molecular weight of chitosan is preferably between 500 and 500,000 daltons, more preferably between 700 and 250,000 daltons, and most preferably between 1,000 and 150,000 daltons. Different low molecular weight chitosans can be prepared by enzymatic degradation of chitosan using chitosanase or by addition of nitrous acid. Both methods are well known to those skilled in the art and are described in recent publications (Li et al., (1995), Plant Physiol. Biochem., 33, 599-603; Allan and Peyron, (1995). , Carbohydrate Research, 277, 257-272; Damard and Cartier, (1989), Int. J. Biol. Macromol., 11, 297-302). The positive charge (zeta potential) of the DNA conjugate is at least +5 mV, preferably at least +10 mV, most preferably at least +20 mV, but is preferably less than +100 mV. The surface charge of the conjugate is expressed as zeta potential. It has a pH of 7. Measured at 4 and 0.001 M ionic strength. Zeta potential is measured by Laser Doppler Anemometry (LDA) using, for example, Malvern Zeta Sizer IV (Malvern, UK). Laser Doppler Anemometry involves the detection of scattered laser light from particles moving in an applied electric field. The equipment used can be, for example, Malvern Zetasiser II (Malvern Instruments). Electrophoretic mobility is measured by dispersing the conjugate in 10 ml of phosphate or McIlvaine buffer, 100 μg to 1 mg, having a constant ionic strength of 0.001 M. Four readings are taken using a PC4 wide capillary cell at a voltage of 100 volts, electrode spacing of 50 mm, and a dielectric constant of 78.54. These positively charged conjugates, having a particle size of 10-1000 nm, can be separated from excess complexing agent using procedures well known to those skilled in the art. It is known that column separation techniques are not ideal for studies using chitosan and similar cationic polymers. Instead, Levin and Giddin gs, (1991), J.M. Chem. Biotechnol., 50, 43; Williamsetal., (1992), Ind. Eng. Chem. Res., 31, 2172, the cross-flow method (FF Fractionation, Salt Lake City, UT; Ratanathanawongs and Giddin gs, (1993), ACT Symp. Ser., 521, 13), or continuous split. -A method such as field flow fractionation using a continuous split-flow thin (SPLITT) cell can be used. At the examination stage, a filter centrifuge device can be used. In order for the DNA conjugate to express the polypeptide encoded by the DNA well, we consider that the particle size of the conjugate is preferably below 1 μm, more preferably below 500 nm, It has been found that it should preferably be below 200 nm. Preferably, the conjugate has a particle size of at least 10 nm (hydrodynamic diameter, measured by photon correlation spectroscopy). DNA means nucleic acids (including RNA) and oligonucleotides greater than 100 base pairs in length, or coiled or uncoiled plasmids or cosmids. The DNA can be any DNA that expresses a polypeptide and protein agent useful in the treatment of congenital and acquired diseases located in the lung. These include cystic fibrosis (cystic fibrosis transmembrane regulator), α1-antitrypsin deficiency, and lung cancer (with immunity-inducing genes or direct tumoricidal (tumoricidal)) and the like. . Immune-inducing genes include those encoding MHC (major histocompatibility complex) molecules, costimulatory molecules, and cytokines. Toxic systems include tumor-expressing genes (p53) or enzymes that convert non-toxic prodrugs into toxic ones. Herpes thymidine kinase is one example. Pneumonia, surfactant deficiency, pulmonary hypertension, and malignant mesothelioma are other diseases to which the compositions of the present invention can be applied. However, these compositions deliver DNA to the lung, which is used as a bioreactor for polypeptides and proteins (eg, blood factors XIII, IX) whose primary site of action is elsewhere in the body. You can also. This means that DNA is expressed in lung tissue, and the expressed polypeptide is secreted from cells, enters the circulation, and has the effect of distributing the polypeptide to other parts of the body. The invention can also be used to deliver gene therapy to other parts of the body, such as the joints, nasal cavity, vagina, rectum, eyes, gastrointestinal tract, ears, or buccal membrane. The composition can comprise any DNA expressing polypeptides and protein agents useful in treating diseases of these compartments. Examples include anti-infectives, anti-inflammatory agents, prophylactics, and antigens that produce humoral and cell-mediated responses, ie, antigenic material used as vaccines. The DNA can encode viral, bacterial or parasite proteins and can therefore be used for vaccination against diseases such as tetanus, diphtheria, pertussis, and influenza. Gene products include α1-antitrypsin, growth hormone synthase, factor VIII, factor IX, TNF, cytokine, antigen gene (hepatitis B, influenza, cholera), cystic fibrosis transmembrane conductance regulator-CTFR, Examples include, but are not limited to, oncogenes (p53, K-ras, HS-Ek), sucrose-isomaltase, lactase-phlorizin hydrolase, and maltase-glucoamylase. Physical attachment of the conjugate to the larger biodegradable carrier microsphere can be accomplished using conventional procedures. The adsorption of the DNA conjugate to the microsphere can be performed by a method known to those skilled in the art. For example, the microspheres can be suspended in a solvent such as water or a low ionic strength buffer. The DNA conjugate is added to the suspension and the mixture is gently shaken at room temperature for a period of time sufficient to cause adsorption, typically 1-3 hours. Excess DNA conjugate is separated from the microspheres by centrifugation at low speed (about 6000 rpm) for about 3-5 minutes. The process of one large microsphere having many small particles on its surface has been described in the field of colloid science and is known as "heterocoagulation" (eg, Buscall et al., Polymer See Colloids, Elsevier, London, 1985, p. 167). In such a coagulation process, it is important that the carrier microspheres be uniformly coated with smaller nanoparticles than would occur in a gel interlink or cross-linking system (FIG. 1). This can be checked by standard techniques (eg, microscopy or rheology). Another aspect of the present invention is the use of the composition of the present invention in medicine. It is important that the dose of microspheres administered to a human or mammal be selected so that available organs, such as the lungs and capillaries, are blocked at only a small percentage at a time. Literature in the field of diagnostic imaging describes details of doses that can be safely administered for such purposes in diagnostic imaging (Davis and Taube, (1978), J. Nucl. Med., 19, 1209). In practice, less than 10% of the pulmonary capillaries should be blocked. A suitable range for the number of microspheres is 10 × 10 Ten Less than 10, preferably 10 6 -10 8 And more preferably 10 7 It is. The dose of microspheres is less than 500 mg, preferably 1-100 mg. Harding et al. ((1973) J. Nucl. Med., 14, 579) provides a dose of 5.7 × 10 5 mg of albumin microspheres 15 μm in diameter. Five Was calculated to block only 0.14% of the pulmonary artery circulation. Micrographs showing how these microspheres block the capillary bed and produce good contact between the particle surface and the endothelial cells of the pulmonary capillaries are shown in FIG. Long-term retention of low doses of these microspheres in pulmonary capillaries does not appear to have pathological effects (Davis and King, (1974), J. Nucl. Med., 15, 436). If the degraded microspheres become too small to block the capillaries, they will remain in the circulatory system and be cleared by the liver through normal particle recognition and subsequent phagocytic processes. In the present invention, microspheres and their contents are absorbed by lysosomal compartments by Kupffer cells of the liver, and the microspheres are further degraded, particularly the DNA material attached to the surface. Thus, the novel delivery system in the lungs can result in site-specific expression of genes in the lung, as any DNA material sent to the liver would not be able to be effectively degraded and cause expression. Should be something. The compositions of the present invention can be administered to a mammal intravenously or intraarterially. It can be delivered intravenously or intraarterially to the mammalian lung endothelium. It can also be delivered intraarterially to a body compartment such as a joint, nasal cavity, vagina, rectum, eye, gastrointestinal tract, ear, or buccal membrane. It can be administered such that the DNA is delivered to the joints, nasal cavity, vagina, rectum, eye, gastrointestinal tract, ear, or buccal membrane. For example, the composition can be administered to a blood vessel supplying blood to a desired compartment. Another aspect of the invention is the use of a composition of the invention in a method of gene therapy. Another aspect of the present invention is the use of a composition of the present invention in the manufacture of a medicament for treating a mammal in need of gene therapy. Another aspect of the invention is a kit of pars for delivering a composition of the invention to a mammal, comprising a composition of the invention and a sterile carrier component. . For example, a pulmonary delivery system of the invention can be generated immediately prior to administration with a sterile component, or a preformed heterocoagulated particulate system can be generated with a sterile component, followed by resuspension and It can be lyophilized for administration. The invention will be described in more detail, by way of example, with reference to the following figures and examples. Figure 1: DNA-chitosan nanoparticle conjugate adsorbed on biodegradable microparticles. FIG. 2: Photomicrograph showing microspheres in the lung capillary bed. Figure 3: Adsorption of DNA-chitosan complex on negatively charged starch microspheres. About 50 μg DNA / 1.5 ml distilled water. Figure 4: Microspheres with and without adsorbed complex. Example 1 Preparation of DNA-Chitosan Conjugates and Their Adsorption on Negatively Charged Starch Microspheres The following example illustrates the preparation of starch microsphere particles with a CMV-CAT plasmid complexed with chitosan. I do. A. Preparation of DNA-CTS (chitosan) complex 26.4 mg of chitosan hydrochloride was dissolved in 18 ml of water. The solution was passed through a 0.2 μm membrane filter (CTS solution). 15 ml of the CTS solution was added dropwise to 50 ml of the DNA solution (containing 2.2 mg of pCAT-DNA) under magnetic stirring until the solution became cloudy (about 2 ml). Next, the remaining CTS solution was quickly added to the suspension (1 ml each). The resulting suspension (containing 33.8 μg / ml DNA and 338 μg / ml CTS) was stored at 4 ° C. until use. The particle size was about 200 nm and the surface charge (zeta potential) was +35 mV. B. Purification of DNA-CTS complex 0.4 ml of the DNA / CTS complex suspension was added to a filter centrifuge tube (100 nm cutoff) (Amicon), and centrifuged at 6,500 rpm for 10 minutes. The complex was resuspended in 0.3 ml of water and collected. A 15 ml sample was processed and the resulting clear complex was included in about 10 ml of water. C. Quantitative analysis of DNA-CTS complex (spectrophotometric method) The turbidity of the complex suspension in the range of 350-600 nm is too low to be used for quantitative measurement. However, 259 nm (λ of DNA max ) Can be used as an alternative parameter for the measurement of the complex. A good linear relationship between the UV absorbance at 260 nm and the concentration of the DNA-CTS complex in the suspension fraction was obtained, 0.2B1.0 (about 10-50 μg / ml DNA). D. Adsorption of Complex on Starch Microspheres 0.1 ml of Formulation B and 0.5 ml of a 4% (weight / volume) starch microsphere suspension comprising carboxylated microspheres having a particle size of about 50 μm were prepared using DNA / Added to 1.0 ml of CTS complex suspension. 0.5 ml of the starch microsphere suspension without DNA-CTS complex was used as a blank control and 1.0 ml of the DNA-CTS complex suspension without starch microsphere was used as a standard control. The final volume of the sample was adjusted to 1.5 ml by adding an appropriate amount of water. The sample was shaken for 2 hours on a vibrating shaker at room temperature and then centrifuged at 6500 rpm for 3 minutes. For DNA measurement at 260 nm, only slight effects of the supernatant from the starch microspheres were seen. The supernatant was collected and measured at 260 nm. Complex adsorption was calculated by comparing the decrease in UV absorbance of the sample with a DNA-CTS complex standard control (FIG. 3). There was a linear increase in DNA-CTS complex surface adsorption. When 20 mg of starch microspheres were added, more than 80% of the complex was adsorbed. An electron micrograph showing the DNA-CTS complex adsorbed on the starch microspheres is shown in FIG. Example 2: Administration of the composition prepared according to the method described in Example 1 to rabbits The composition described in Example 1 is prepared and the microspheres with DNA-conjugate are separated by centrifugation and added to sterile water for injection. Dispersed. New Zealand White female rabbits 3 per group, 10 in ear margin vein 6 Individual particles / 0.5 ml were injected intravenously. Animals were sacrificed after 3 hours and lungs were removed with liver and spleen. Histological examination revealed that most of the microspheres were isolated in the lungs. Microspheres were deeply deposited in the capillary bed of the lung. Example 2: Assay material for gene expression-CAT analysis The reporter gene pCAT-DNA driven by the CMV promoter was obtained from GeneMedicine, Houston, USA. pCAT-DOTMA (N [1- (2,3-dioleoyloxy) -propyl] -N, N, N-trimethylammonium chloride) complex was used as a control material. This is described in Felgner et al., (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. (UA), 84, 7415-7417. Methods A control pCAT-DNA solution was prepared by diluting a pCAT-DNA stock solution (0.811 mg / ml) with autoclaved PBS. 13.137 ml of autoclaved PBS was added to 0.863 ml of the pCAT-DNA stock solution. This provided enough control pCAT-DNA solution (0.05 mg / ml) 14 to administer 6 rabbits at a volume of 100 μg / 2 ml of pCAT-DNA. 0 ml was obtained. The solution was stored at 4 ° C. and warmed to room temperature 15 minutes before administration to rabbits. The pCAT-DNA DOTMA formulation supplied in the form of a lyophilized powder was reconstituted with sterile water on the appropriate study day. The resulting liquid formulation contained plasmid DNA at a concentration sufficient to administer a dose of 100 μg pCAT-DNA / 2 ml volume. The formulation was stored at 4 ° C. and warmed to room temperature 15 minutes before administration to rabbits. CAT ELISA The CAT ELISA procedure for the analysis of CAT in animal tissues was set up according to the protocol obtained from the kit manufacturer (Boehringer Marmheim). The assay involves pre-binding the anti-CAT antibody to the surface of a microtiter plate module in a sandwich ELISA method, and the CAT enzyme in the tissue extract specifically binds to the immobilized anti-CAT antibody and binds to the CAT. It is based on the binding of a digoxogenin-labeled antibody (anti-CAT-DIG) to the CAT enzyme. The detection antibody, a peroxidase-conjugated anti-digoxigenin antibody (anti-DIG-POD), binds to digoxigenin. In the final step, the peroxidase substrate (ABTS; 2,2'-azinobis [3-ethylbenzthiazolinesulfonic acid]) is catalyzed by peroxidase to give a colored reaction product that is enhanced by the use of a substrate enhancer. The absorbance of this color is then directly correlated to the amount of CAT enzyme contained in the standards and extracts. Confirmation of effectiveness of CAT ELISA Before analyzing test samples, the effectiveness of the CAT ELISA method was confirmed. Since no suitable control tissue samples containing CAT were obtained, intra- and inter-day variability was determined using a standard curve. These curves are 0.0, 15.6, 31.25, 62. Prepared using CAT standards supplied with the CAT ELISA kit at CAT concentrations of 5, 125, 250 and 500 pg / ml. Diurnal variation was determined by preparing a standard curve three times. The coefficient of variation (% CV) at each standard concentration was calculated for both intra-day and inter-day variation. Validation of the Tissue Extraction Procedure The tissue extraction procedure was initially performed by taking various tissue samples from two control rabbits that had received "naked" plasmid DNA and storing them separately at -80 ° C. Set. Test containing 0.5 ml of ice-cold tissue extraction buffer (10 mM Tris pH 7-8, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5% Triton X-100, 100 μM leupeptin, 1.0 μM pepstatin, and 0.25 mM PMSF) containing tissue samples The tubes were added and homogenized at 4 ° C. for various times (0.6, 1.2 or 2.4 minutes) using a Mini-Bead Beater. The homogenate was transferred to a sterile microcentrifuge tube (1.5 ml) and centrifuged at 13,000 rpm in a MSE Microfuge at 4 ° C. for 20 minutes. The supernatant (ie, tissue extract) was transferred to a sterile microcentrifuge tube (1.5 ml) and placed on ice. Aliquots of the tissue extracts were diluted in PBS (1/20) and analyzed for protein concentration using BCA protein assay. Each sample was measured twice and the dilution was corrected to obtain the total protein concentration (mg / ml) in the tissue extract. The CAT ELISA method was validated for the analysis of CAT in gastrointestinal tract tissue extracts. First, the effect of protein concentration on measuring CAT concentration in various tissue extracts using the CAT ELISA method was evaluated. Tissue samples from control rabbits were extracted in ice-cold tissue extraction buffer (0.5 ml) as described above except that they were homogenized for 1.5 minutes (3 cycles of homogenization for 30 seconds and rest for 30 seconds). After determining the protein concentration, the tissue extract was diluted with sample buffer (CAT ELISA kit) to obtain an extract solution having a protein concentration of about 0.5, 1.0 and 2.0 mg / ml. To each of these diluted extracts, a CAT standard (CAT ELISA kit) was added to a predetermined final CAT concentration of 25 and 100 pg / ml. Next, the added sample was analyzed twice for the CAT concentration, and the CAT recovery in each sample was calculated. Second, the effect of the extraction method on the stability of CAT in various samples was established. This was done by extracting tissue samples from the control rabbits above with extraction buffer having a CAT concentration of 50 or 200 pg / ml. After determining the protein concentration, each sample extract was diluted (1/2 or 1/4) with sample buffer. Each diluted sample was analyzed twice for CAT concentration. After correcting for dilution, the recovery of CAT in each tissue extract was calculated. Example 4: Administration to a patient A DNA: chitosan complex is prepared by the method described in Example 1 above, except that the DNA plasmid is a DNA plasmid expressing a cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Control complex preparation to obtain particles in the range of 100-300 nm. Particles, 2. After adding 5-5% mannitol, freeze-dry. Immediately prior to administration to a patient, an amount of DNA: chitosan complex corresponding to 100 pg DNA is dispersed in 1.0 ml of water for injection (USP) with 20 mg of starch microspheres (Cardoxomer, Perstorp, Sweden). The suspension is an injection into the patient's vein. This material is also available as a kit consisting of the required amount of a mixture of lyophilized starch microspheres and DNA: chitosan complex, a vial containing 1 ml of water for injection, and a syringe for injection.

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Claims (1)

【特許請求の範囲】 １． 生物分解性マイクロスフェアを含んでなる組成物であって、マイクロス フェアが正味の負電荷を有し、かつこれに粒度がより小さな正に帯電した粒子が 吸着し、このような正に帯電した粒子が、ＤＮＡとカチオン性圧縮剤とのコンジ ュゲートを含んでなる、組成物。 ２． 生物分解性マイクロスフェアを、架橋した可溶性澱粉、アルブミン、ゼ ラチン、ヘパリン、カルボキシデキストラン、デキストラン、デキストランスル フェート、アルギネート、ポリラクチド、またはそれらの混合物から調製する、 請求項１に記載の組成物。 ３． カチオン性圧縮剤がキトサンである、請求項１または２に記載の組成物 。 ４． 生物分解性マイクロスフェアの平均粒度が５μｍを上回る、請求項１〜 ３のいずれか１項に記載の組成物。 ５． 生物分解性マイクロスフェアのゼータ電位が、ＤＮＡコンジュゲートが 吸着する前は少なくとも−５ｍＶである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の 組成物。 ６． ＤＮＡコンジュゲート粒子の平均粒度が、１０〜５００ｎｍである、請 求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。 ７． ＤＮＡコンジュゲートの正の表面電荷（ゼータ電位）が５〜１００ｍＶ である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。 ８． 1) ＤＮＡとカチオン性圧縮剤とのコンジュゲートを含んでなる正に帯 電した粒子を調製し、2)前記の正に帯電した粒子を正味の負電荷を有する生物分 解性マイクロスフェアに吸着することを含む、組成物の製造法。 ９． 請求項８に記載の方法によって得られる組成物。 １０． マイクロスフェアが、ＤＮＡを脈管床の内皮細胞に送達するためのキ ャリヤーとして作用する、請求項１〜７または９のいずれか１項に記載の組成物 。 １１． 医薬に使用するための、請求項１〜７、９または１０のいずれか１項 に記載の組成物。 １２． 投与されるマイクロスフェアの用量が、１０×１０10個未満であるか 、または５００ｍｇ未満の量である、請求項１１に記載の組成物。 １３． 請求項１〜７、９または１０のいずれか１項に記載の組成物を、哺乳 動物に静脈内または動脈内投与することを特徴とする、ＤＮＡを哺乳動物へ送達 する方法。 １４． 組成物を哺乳動物の肺内皮に静脈内または動脈内送達する、請求項１ ３に記載の方法。 １５． 請求項１〜７、９または１０のいずれか１項に記載の組成物を、関節 、鼻腔、腟、直腸、目、胃腸管、耳、または頬膜に送達することを特徴とする、 治療法。 １６． 請求項１〜７、９または１０のいずれか１項に記載の組成物を、ＤＮ Ａが関節、鼻腔、腟、直腸、目、胃腸管、耳、または頬膜に送達されるように投 与することを特徴とする、治療法。 １７． ＤＮＡが哺乳動物の肺内皮に送達される、請求項１３に記載の方法。 １８． 遺伝子治療を必要とする哺乳動物の治療のための医薬の製造における 、請求項１〜７、９または１０のいずれか１項に記載の組成物の使用。 １９． 遺伝子治療の方法における、請求項１〜７、９または１０のいずれか １項に記載の組成物の使用。 ２０． 請求項１〜７、９または１０のいずれか１項に記載の組成物と、滅菌 キャリヤー成分を含んでなる、上記組成物を哺乳動物に送達するための部品のキ ット。 ２１． 請求項１〜７、９または１０のいずれか１項に記載の組成物を哺乳動 物に送達するための部品のキットであって、正味の負電荷を有する生物分解性マ イクロスフェアと、より小さな粒度の正に帯電した粒子であってＤＮＡとカチオ ン性圧縮剤とのコンジュゲートを含んでなる正に帯電した粒子と、滅菌キャリヤ ー成分とを含んでなる、キット。[Claims] 1. A composition comprising biodegradable microspheres, wherein the microspheres have a net negative charge, on which positively charged particles of smaller size are adsorbed, such positively charged particles Comprises a conjugate of DNA and a cationic compression agent. 2. The composition of claim 1, wherein the biodegradable microspheres are prepared from cross-linked soluble starch, albumin, gelatin, heparin, carboxydextran, dextran, dextran sulfate, alginate, polylactide, or mixtures thereof. 3. 3. The composition according to claim 1, wherein the cationic compression agent is chitosan. 4. The composition according to any one of claims 1 to 3, wherein the average particle size of the biodegradable microsphere is greater than 5 μm. 5. The composition according to any one of claims 1 to 4, wherein the zeta potential of the biodegradable microsphere is at least -5 mV before the DNA conjugate is adsorbed. 6. The composition according to any one of claims 1 to 5, wherein the average particle size of the DNA conjugate particles is 10 to 500 nm. 7. The composition according to any one of claims 1 to 6, wherein the DNA conjugate has a positive surface charge (zeta potential) of 5 to 100 mV. 8. 1) preparing positively charged particles comprising a conjugate of DNA and a cationic compress, and 2) adsorbing the positively charged particles to a biodegradable microsphere having a net negative charge. A method for producing a composition, comprising: 9. A composition obtained by the method according to claim 8. 10. 10. The composition of any one of claims 1-7 or 9, wherein the microspheres act as a carrier for delivering DNA to endothelial cells of the vascular bed. 11. A composition according to any one of claims 1 to 7, 9 or 10 for use in medicine. 12. Dose of the microspheres to be administered, 10 × 10 10 fewer than or where an amount of less than 500mg, composition according to claim 11. 13. A method for delivering DNA to a mammal, comprising administering the composition according to any one of claims 1 to 7, 9 or 10 to a mammal intravenously or intraarterially. 14． 14. The method of claim 13, wherein the composition is delivered intravenously or intraarterially to the lung endothelium of a mammal. 15. Therapeutic method characterized in that the composition according to any one of claims 1 to 7, 9 or 10 is delivered to a joint, a nasal cavity, a vagina, a rectum, an eye, a gastrointestinal tract, an ear or a buccal membrane. . 16. The composition according to any one of claims 1 to 7, 9 or 10, is administered such that the DNA is delivered to the joint, nasal cavity, vagina, rectum, eye, gastrointestinal tract, ear, or buccal membrane. A method of treatment, characterized in that: 17． 14. The method of claim 13, wherein the DNA is delivered to the mammalian lung endothelium. 18. Use of a composition according to any one of claims 1 to 7, 9 or 10 in the manufacture of a medicament for the treatment of a mammal in need of gene therapy. 19. Use of a composition according to any one of claims 1 to 7, 9 or 10 in a method of gene therapy. 20. A kit of parts for delivering the composition to a mammal, comprising a composition according to any one of claims 1 to 7, 9 or 10, and a sterile carrier component. 21. A kit of parts for delivering a composition according to any one of claims 1 to 7, 9 or 10 to a mammal, comprising a biodegradable microsphere having a net negative charge and a smaller particle size. A kit comprising: positively charged particles of claim 1 comprising a conjugate of DNA and a cationic compress; and a sterile carrier component.
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