CN101869704A - 单剂免疫破伤风类毒素阳离子葡聚糖微球及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及药物制剂领域，具体涉及一种单剂免疫破伤风类毒素阳离子葡聚糖微球及其制备方法。其特征是：由破伤风类毒素通过静电作用后载在阳离子甲基丙烯酸羟乙酯葡聚糖微球上制得。本发明的破伤风类毒素控释微球减少破伤风疫苗注射次数，提高接种覆盖率，降低辍种率，有效地预防破伤风，提供具有长效作用的单剂破伤风类毒素控释疫苗制剂，实现一次注射全程免疫。
Description
技术领域
本发明涉及药物制剂领域，具体涉及一种载有破伤风类毒素的甲基丙烯酸羟乙酯阳离子葡聚糖微球制剂及其制备方法。
背景技术
由世界卫生组织等5个国际组织倡议的全球儿童疫苗计划(CVI)主要宗旨是促进开发及引入、改进现有疫苗及新创制的疫苗，以加强保护全球儿童免遭传染病的侵害。研究改进破伤风类毒素的释放系统是CVI的主要目标之一。破伤风能否被控制和消除有赖于高的接种，但目前破伤风的基础免疫需要三个月内连续3次注射疫苗，接种次数多和接种周期长使得辍种率高达70％，免疫效果差。
微球技术已广泛用于药物、多肽和蛋白疫苗的研究与开发。长周期的可注射单次免疫微球对辅料性质提出了很高要求，即一个月甚至数月的持续有效释药，且所使用辅料应兼具功能性和生物可降解、生物相容性。对这类控制释放体系的载体材料，国内外曾采用明胶、淀粉、白蛋白、脂质体、海藻酸钠等作为载体材料，但存在生物降解周期短的问题；目前，国内外较常应用的微球材料多聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA，简称聚乳酸)，PLGA在体内首先被降解为乳酸和羟基乙酸，又经过三羧酸循环最终被完全降解为二氧化碳和水。如国外的Pal Johansen等(Pharm Res，1998，15：1103～1110)，GFA Kersten等(Vaccine，1996，14(17-18)：1627～1632)，以及RK Gupta等(Vaccine，1997，15(6-7)：672～678)，国内的何应等(北京医科大学学报，2000，32(3)：239～243)，郝国荣等(中国生物制品学杂志，2002，15(6)：346～349)，王继麟等(中国药学杂志，2001，36(5)：318～322)，分别采用上述载体复乳法制备了破伤风类毒素微球，并具有较高的包封率，通过控制丙交酯和乙交酯的分子量调节降解时间达到缓释目的，体内免疫的初步实验证明了单剂量免疫微球的可行性。
但国内外文献报道的用聚乳酸及其共聚物制备的微球主要存在以下不足：(1)作为药物载体的的聚乳酸及其共聚物是疏水性材料，对亲水性的疫苗或药物亲和性不强，导致包裹量和包封效率低；(2)制备中常采用复乳法所用有机溶剂易引起蛋白凝聚及沉淀，使疫苗活性丧失；(3)释药初期突释量较大，可达30％～40％；(4)聚乳酸及其共聚物在降解过程中产生酸性环境致蛋白或疫苗的天然构想发生变化，抗原性降低。因此，对于蛋白和疫苗类微球，制药界迫切需要解决载体材料和药物的亲和性、制备工艺和释放过程中药物活性保持等重要问题。
利用水凝胶作为药物载体系统具有载药量大、释药与降解可控、生物相容性好等特点，是目前控释释药领域的研究热点。近年来，引入功能基的葡聚糖水凝胶被广泛作为蛋白疫苗类药物载体进行研究。我们合成了生物降解葡聚糖衍生物-甲基丙烯酸羟乙基酯葡聚糖(Dextran-hydroxyethyl methacrylate，dex-HEMA)，近期研究资料显示由这种化合物聚合而来的水凝胶生理条件下的降解是通过存在于交联处的可变形的碳酸酯酯团的水解而产生的。而且这些水凝胶具有很好的生物相容性，因为它的降解产物是葡聚糖(用做血浆增容药)以及2-聚羟乙基甲基丙烯酸(一种广泛用于生化产品药用的聚合物)。HEMA-dex凝胶的降解进程可以通过改变交联密度进行调整，降解所需时间可从几天到几个月，其良好生物可降解性和降解时间可调性，成为长周期单次免疫微球的最适载体材料。
目前葡聚糖微球的载药方式多采用制备时加入药物的前载法，如牛血清白蛋白、生长因子等。因微球制备的双水相工艺和蛋白水溶性较好，其包封率不高，载药量低，如Vlugt-Wensink等(European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutic，2007，67：589-596)，包封率为50％-70％，载药量4.16％-5.67％；而且乳化交联法中所使用的交联剂往往会使蛋白或疫苗的结构破坏。因此如何寻找能够保持蛋白活性和高包封率的载药方式成为蛋白药物葡聚糖微球制剂成功与否的重要内容。
发明内容
本发明公开了一种单剂免疫破伤风类毒素控释微球的制备方法，以甲基丙烯酸羟乙基酯葡聚糖(dex-HEMA)为载体材料，并加入甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(DMAEMA)，应用乳化交联法在双水相中制备空白阳离子葡聚糖微球，最终采用后载法制备高包封率、高抗原活性和长周期控制释放的破伤风类毒素(Tetanus Toxiod，简称TT)微球，提供一种给药方便、安全，接种一次就能奏效的长效控释破伤风类毒素疫苗微球剂型。
本发明的破伤风类毒素控释微球减少破伤风疫苗注射次数，提高接种覆盖率，降低辍种率，有效地预防破伤风，提供具有长效作用的单剂破伤风类毒素控释疫苗制剂，实现一次注射全程免疫。
本发明基于两种聚合物互不相容原理制备选用一种完全在水中乳化的技术制备凝胶微球。很多水溶性聚合物(如：葡聚糖、PEG、PVA、PVP、明胶胶、可溶性淀粉等)混合时常产生互不溶现象，当超过一定浓度时聚合物仍存在与水相中，但整个体系分为两相，将其乳化后，分散相中的聚合物可以交联形成具有凝胶性质的微球。由于这种工艺中不使用有机溶剂，降低生产过程中防护和安全措施费用。
本发明从充分保持蛋白或疫苗药物的生物活性和提高药物包封率考虑，选用后载法进行载药。即首先制备阳离子空白葡聚糖凝胶微球，破伤风类毒素的等电点为4.7，在生理条件下一般带负电；利用静电吸附原理载药，载药量在3.84％-11.5％范围内，包封率几乎达100％，显著高于前载法，图1为DMAEMA加入对微球电荷的影响，图2为两种载药方式下阳离子葡聚糖微球的包封率。由于药物在乳化交联工艺完成后加入，因此工艺对蛋白的活性几乎无影响。
本发明的目的是通过如下方案实现的：
本发明的破伤风类毒素制剂，由甲基丙烯酸羟乙酯葡聚糖微球和吸附在微球表面或内部的破伤风类毒素组成，它由破伤风类毒素通过静电作用后载在阳离子甲基丙烯酸羟乙酯葡聚糖微球上制备。
微球平均粒径优选为5～100微米。
本发明的微球制剂中，破伤风类毒素重量占微球总重量的0.5～15％。
破伤风类毒素重量占微球总重量的3-10％。
本发明的破伤风类毒素制剂的制备方法，依次包括：
a.甲基丙烯酸羟乙酯葡聚糖溶于水，搅拌下加入甲基丙烯酸二甲氨基乙酯，得甲基丙烯酸羟乙酯葡聚糖相；
b.聚乙二醇(PEG)溶于水中，得聚乙二醇相；
c.搅拌下将甲基丙烯酸羟乙酯葡聚糖相加入到聚乙二醇相中；
d.搅拌下，分别将四甲基乙二胺和过硫酸钾加入到上述溶液中，停止搅拌后交联；
e.用水在离心条件下洗去上清液，冷冻干燥得空白微球粉末；
f.将空白微球粉末加入破伤风类毒素溶液中孵化，离心清洗，即得。
上述制备方法，其中聚乙二醇的分子量优选为6kDa～20kDa，聚乙二醇相中聚乙二醇的浓度优选为20～40％，为重量百分比。
甲基丙烯酸羟乙酯葡聚糖相中甲基丙烯酸二甲氨基乙酯的浓度优选为0.2～3‰(w/w)。
上述搅拌速度优选为200rpm～3000rpm。
其中交联时间优选为0.5～12小时。交联温度室温即可，一般在交联温度为25℃～40℃之间。
甲基丙烯酸羟乙酯葡聚糖优选如下结构式葡聚糖的分子量为10kDa-70kDa，取代度为2-20。
所述的dex-HEMA相和PEG相的体积比优选为1∶10～1∶100。
本发明制备的甲基丙烯酸羟乙酯葡聚糖微球外观规整、光滑，见图3，粒径大小和分布可控，微球平均粒径在5-100微米范围内，见图4，载药量可达15％，按常规的用药量，其载药量可以控制在3.84％-11.5％范围内，包封率可达75％～100％。
附图说明
图1是不同量DMAEMA葡聚糖微球的ζ电位
图2是葡聚糖阳离子微球两种载药方式的包封率
图3是采用本发明所制备的破伤风类毒素甲基丙烯酸羟乙酯葡聚糖微球的扫描电镜照片。
图4是采用本发明所制备的破伤风类毒素甲基丙烯酸羟乙酯葡聚糖微球的粒径分布图。
图5是采用本发明所制备的不同取代度葡聚糖微球的释放曲线(葡聚糖分子量2万)。
具体实施方式
实施例1
(1)甲基丙烯酸羟乙基酯葡聚糖(分子量2万，DS＝3)71mg溶于1.577g水中，搅拌下加入35μl甲基丙烯酸二甲氨基乙酯，得甲基丙烯酸羟乙基酯葡聚糖相；
(2)聚乙二醇2万1g溶于3.34ml水中，得聚乙二醇相；
(3)在搅拌下(1000rpm)，将甲基丙烯酸羟乙基酯葡聚糖相加入到聚乙二醇相中；
(4)在搅拌下(500rpm)，分别将0.1ml四甲基乙二胺(20％，V/V，4M盐酸调中性)和0.18m1过硫酸钾(50mg/ml)加入到上溶液中，停止搅拌后交联1h(37度)；
(5)用水在离心条件下洗去上清液，冷冻干燥得空白微球粉末。
(6)称取70mg空白微球粉末，加入1mg/ml破伤风类毒素溶液5ml，孵化24h(4℃)，离心清洗，得破伤风类毒素阳离子葡聚糖微球。
所得微球包封率99.87％，载药量7.1％，粒径10-20μm.
实施例2
(1)甲基丙烯酸羟乙基酯葡聚糖(分子量2万，DS＝3)71mg溶于1.577g水中，搅拌下加入35μl甲基丙烯酸二甲氨基乙酯，形成甲基丙烯酸羟乙基酯葡聚糖相；
(2)聚乙二醇2万1g溶于5ml水中，形成聚乙二醇相；
(3)在搅拌下(2000rpm)，将甲基丙烯酸羟乙基酯葡聚糖相加入到聚乙二醇相中；
(4)在搅拌下(500rpm)，分别将0.1ml四甲基乙二胺(20％，V/V，4M盐酸调中性)和0.18ml过硫酸钾(50mg/ml)加入到上溶液中，停止搅拌后交联1h(37度)；
(5)用水在离心条件下洗去上清液，冷冻干燥得空白微球粉末。
(6)称取70mg空白微球粉末，加入0.5mg/ml破伤风类毒素溶液5ml，孵化24h(4℃)，离心清洗，得破伤风类毒素阳离子葡聚糖微球。
所得微球包封率99.97％，载药量3.6％，粒径5-10μm。
实施例3
(1)甲基丙烯酸羟乙基酯葡聚糖(分子量2万，DS＝3)71mg溶于1.577g水中，搅拌下加入35μl甲基丙烯酸二甲氨基乙酯，形成甲基丙烯酸羟乙基酯葡聚糖相；
(2)聚乙二醇60001g溶于5ml水中，形成聚乙二醇相；
(3)在搅拌下(500rpm)，将甲基丙烯酸羟乙基酯葡聚糖相加入到聚乙二醇相中；
(4)在搅拌下(500rpm)，分别将0.1ml四甲基乙二胺(20％，V/V，4M盐酸调中性)和0.18ml过硫酸钾(50mg/ml)加入到上溶液中，停止搅拌后交联1h(37度)；
(5)用水在离心条件下洗去上清液，冷冻干燥得空白微球粉末。
(6)称取70mg空白微球粉末，加入1.5mg/ml破伤风类毒素溶液5ml，孵化24h(4℃)，离心清洗，得破伤风类毒素阳离子葡聚糖微球。
所得微球包封率99.61％，载药量10.1％，粒径30-80μm。
Claims (9)
1.一种破伤风类毒素制剂，其特征是：由甲基丙烯酸羟乙酯葡聚糖微球和吸附在微球表面或内部的破伤风类毒素组成。
2.权利要求1的破伤风类毒素制剂，其中微球平均粒径为5～100微米。
3.权利要求1的破伤风类毒素制剂，其中破伤风类毒素重量占微球总重量的0.5～15％。
4.权利要求3的破伤风类毒素制剂，其中破伤风类毒素重量占微球总重量的3～10％。
5.权利要求1的破伤风类毒素制剂的制备方法，依次包括：
a.甲基丙烯酸羟乙酯葡聚糖溶于水，搅拌下加入甲基丙烯酸二甲氨基乙酯，得甲基丙烯酸羟乙酯葡聚糖相；
b.聚乙二醇溶于水中，得聚乙二醇相；
c.搅拌下将甲基丙烯酸羟乙酯葡聚糖相加入到聚乙二醇相中；
d.搅拌下，分别将四甲基乙二胺和过硫酸钾加入到上述溶液中，停止搅拌后交联；
e.用水在离心条件下洗去上清液，冷冻干燥得空白微球粉末；
f.将空白微球粉末加入破伤风类毒素溶液中孵化，离心清洗，即得。
6.权利要求5的制备方法，其中聚乙二醇的分子量为6kDa～20kDa，聚乙二醇相中聚乙二醇的浓度为20～40％，为重量百分比。
7.权利要求5的制备方法，其中甲基丙烯酸羟乙酯葡聚糖相中甲基丙烯酸二甲氨基乙酯的浓度为0.2～3‰w/w。
8.权利要求5的制备方法，其中搅拌速度为200rpm～3000rpm。
9.权利要求5的制备方法，其中交联时间为0.5～12小时。
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