CN117229992A - 一种用于干细胞3d培养用微载体及其制备方法与应用 - Google Patents
一种用于干细胞3d培养用微载体及其制备方法与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117229992A CN117229992A CN202310661503.2A CN202310661503A CN117229992A CN 117229992 A CN117229992 A CN 117229992A CN 202310661503 A CN202310661503 A CN 202310661503A CN 117229992 A CN117229992 A CN 117229992A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- culture
- microcarrier
- stem cells
- dextran
- preparation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 42
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 40
- 238000012136 culture method Methods 0.000 title description 2
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 claims abstract description 66
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims abstract description 43
- QNILTEGFHQSKFF-UHFFFAOYSA-N n-propan-2-ylprop-2-enamide Chemical compound CC(C)NC(=O)C=C QNILTEGFHQSKFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 21
- 229920001503 Glucan Polymers 0.000 claims description 58
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 49
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 40
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 39
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 30
- 238000004945 emulsification Methods 0.000 claims description 22
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 19
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 17
- KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine Chemical compound CN(C)CCN(C)C KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 14
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 14
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 14
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 14
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 14
- USHAGKDGDHPEEY-UHFFFAOYSA-L potassium persulfate Chemical compound [K+].[K+].[O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O USHAGKDGDHPEEY-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 14
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 14
- SHKUUQIDMUMQQK-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(oxiran-2-ylmethoxy)butoxymethyl]oxirane Chemical compound C1OC1COCCCCOCC1CO1 SHKUUQIDMUMQQK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 238000010025 steaming Methods 0.000 claims description 11
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 10
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 10
- 244000211187 Lepidium sativum Species 0.000 claims description 9
- 235000007849 Lepidium sativum Nutrition 0.000 claims description 9
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 9
- 238000005086 pumping Methods 0.000 claims description 9
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 6
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims description 6
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 6
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 5
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 claims description 3
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 claims description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 33
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 abstract description 9
- 238000003795 desorption Methods 0.000 abstract description 5
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 abstract description 5
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 abstract description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 8
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 8
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 241000938542 Oenanthe aquatica Species 0.000 description 2
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 2
- 238000011072 cell harvest Methods 0.000 description 2
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000000635 electron micrograph Methods 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 2
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- WOBHKFSMXKNTIM-UHFFFAOYSA-N Hydroxyethyl methacrylate Chemical compound CC(=C)C(=O)OCCO WOBHKFSMXKNTIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 229920005830 Polyurethane Foam Polymers 0.000 description 1
- 230000006035 T cell-directed cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000012832 cell culture technique Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 230000008611 intercellular interaction Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011325 microbead Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 235000015816 nutrient absorption Nutrition 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 229920002338 polyhydroxyethylmethacrylate Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000011496 polyurethane foam Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000011514 reflex Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 1
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 1
Landscapes
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种用于干细胞3D培养用微载体及其制备方法与应用，先对葡聚糖进行改性后再制成微球，然后再枝接聚N‑异丙基丙烯酰胺，从而有效改善了现有技术中直接在葡聚糖微球表面枝接聚N‑异丙基丙烯酰胺导致细胞吸附能力差的问题，提高了细胞在微载体表面的贴壁率和增殖速率，同时提高了细胞的脱附收获速率。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，尤其是涉及一种用于干细胞3D培养用微载体，并进一步涉及该微载体的制备方法与应用。
背景技术
细胞培养(cell culture)是指在体外模拟体内环境(无菌、适宜温度、酸碱度和一定营养条件等)，使之生存、生长、繁殖并维持主要结构和功能的一种方法。动物细胞系的大规模培养是生产病毒疫苗和其他生物技术产品的基础；人干细胞的培养可以用于扩大细胞数量，并将细胞分化为各种体细胞类型以进行移植；同时还可以用于收获干细胞释放的和外来体，以达到治疗发展的目的。
三维细胞培养技术(three-dimensionalcell culture,TDCC)是指将具有三维结构不同材料的载体与各种不同种类的细胞在体外共同培养,使细胞能够在载体的三维立体空间结构中迁移、生长,构成三维的细胞-载体复合物；与传统的细胞培养不同，三维(3D)细胞培养重现了细胞的体内环境，三能够更好地模拟生物体内细胞存活的自然环境，其自然条件可保持细胞间相互作用和更逼真的生化和生理反应；在3D环境中，细胞对内源性和外源性刺激(如温度、pH、营养吸收、转运和分化等方面的改变)应答更接近于它们在体内的反应。
微载体是指在60-250μm，能适用于贴壁细胞生长的微珠；一般是由天然葡聚糖或者各种合成的聚合物组成；其以微小颗粒作为细胞贴附的载体，可提供相当大的贴附面积，由于载体体积很小，比重较轻，在轻度搅拌下即可使得细胞悬浮在培养液内，最终能够使细胞在载体表面繁殖成单层的一种。目前国际市场上出售的微型载体商品的类型已经达十几种以上，包括液体微载体、大孔明胶微载体、聚苯乙烯微载体、PHEMA微载体、甲壳质微载体、聚氨酯泡沫微载体、藻酸盐凝胶微载体以及磁性微载体等。
葡聚糖微球是微载体的一种，聚N-异丙基丙烯酰胺是一种温敏材料，将聚N-异丙基丙烯酰胺其枝接微载体表面即可通过改变温度实现细胞在微载体上的贴附和脱附，进而实现细胞的无损收获；但是葡聚糖微球在枝接聚N-异丙基丙烯酰胺后，其对于细胞的吸附能力差，从而导致细胞贴附困难，会出现细胞大量悬浮的情况，进而导致最终培养的细胞形态发生改变，无法使用。
因此，需要提供一种解决上述技术问题的技术方案。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可有效解决上述技术问题的用于干细胞3D培养用微载体及其制备方法与应用，通过对葡聚糖进行改性制成微球后再枝接聚N-异丙基丙烯酰胺，从而有效改善了现有技术中直接在葡聚糖微球表面枝接聚N-异丙基丙烯酰胺导致细胞吸附能力差的问题，提高了细胞在微载体表面的贴附和增殖能力以及温敏脱附能力，同时提高了细胞的脱附收获速率。
为达到本发明之目的，采用如下技术方案：
一种用于干细胞3D培养用微载体的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：制备改性葡聚糖；
步骤2：制备葡聚糖微球；
以及，步骤3：在葡聚糖微球表面枝接聚N-异丙基丙烯酰胺，得到微载体。
优选的，所述步骤1中，改性葡聚糖的制备方法为：取葡聚糖溶解到NaOH溶液中，在搅拌条件下将上述溶液经注射泵缓慢加入到1，4一丁二醇二缩水甘油醚溶液中，而后在37℃下搅拌反应，并在搅拌过程中缓慢泵入水芹根部提取液；12h后将反应混合液转入透析袋中，室温透析3d，所得透析液经冷冻干燥后即得到改性葡聚糖。
优选的，所述改性葡聚糖的制备方法中，NaOH溶液的浓度为0.6mol/L。
优选的，所述改性葡聚糖的制备方法中，葡聚糖与1，4一丁二醇二缩水甘油醚溶液、水芹根部提取液的质量比为1:30:0.5。
优选的，所述步骤2中，葡聚糖微球的制备方法如下：取改性葡聚糖溶解于去离子水中，而后加入聚乙二醇水溶液进行乳化，在乳化过程中加入四甲基乙二胺和过硫酸钾，在37度条件下反应，1h后将所得的微球用重蒸水；洗3-5遍，即得到葡聚糖微球。
优选的，所述葡聚糖微球的制备方法中，各组分的用量为：改性葡聚糖65-75mg；去离子水1.5-2.5mL；聚乙二醇水溶液3-4mL；四甲基乙二胺90-110μL；过硫酸钾170-180μL。
优选的，所述步骤3中，在葡聚糖微球表面枝接聚N-异丙基丙烯酰胺的步骤如下：
将聚N-异丙基丙烯酰胺单体和葡聚糖微球置于玻璃管中,通过依次抽真空和通入N2,重复3次,使其被N2包围；而后将玻璃管在室温条件下超声处理；24h后,离心收集聚合物，并用甲醇纯化处理3-5次后，再将微球在50mmol/LEDTA溶液中震荡12h,,最后用超纯水清洗后抽滤收集，即得微载体。
优选的，所述聚N-异丙基丙烯酰胺单体和葡聚糖微球的质量比为1：(80-100)。
进一步的，本发明还提供一种微载体，该微载体采用如上述所述的方法制备得到；此外，本发明还提供了一种如上所述的微载体在干细胞3D培养中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明的方法通过先对葡聚糖进行改性后再制成微球，然后再枝接聚N-异丙基丙烯酰胺，从而有效改善了现有技术中直接在葡聚糖微球表面枝接聚N-异丙基丙烯酰胺导致细胞吸附能力差的问题，提高了细胞在微载体表面的贴壁率和增殖速率，同时提高了细胞的脱附收获速率。
附图说明
图1为采用本发明实施例1的方法制备的微载体培养干细胞24h后的电镜图；
图2为采用本发明实施例2的方法制备的微载体培养干细胞24h后的电镜图；
图3为采用本发明实施例3的方法制备的微载体培养干细胞24h后的电镜图；
图4为采用本发明实施例4的方法制备的微载体培养干细胞24h后的电镜图；
图5为采用本发明实施例5的方法制备的微载体培养干细胞24h后的电镜图；
图6为采用本发明实施例6的方法制备的微载体培养干细胞24h后的电镜图；
图7为采用对比例1的方法制备的微载体培养干细胞24h后的电镜图；
图8为采用对比例2的方法制备的微载体培养干细胞24h后的电镜图。
具体实施方式
为了使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的部分实施例，而不是全部实施例。
下面将结合附图对本发明一种用于干细胞3D培养用微载体及其制备方法与应用做出清楚完整的说明。
本发明提供的一种用于干细胞3D培养用微载体的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：制备改性葡聚糖；
步骤2：制备葡聚糖微球；
以及，步骤3：在葡聚糖微球表面枝接聚N-异丙基丙烯酰胺，得到微载体。
其中，所述步骤1中，改性葡聚糖的制备方法为：取葡聚糖溶解到NaOH溶液中，在搅拌条件下将上述溶液经注射泵缓慢加入到1，4一丁二醇二缩水甘油醚溶液中，而后在37℃下搅拌反应，并在搅拌过程中缓慢泵入水芹根部提取液；12h后将反应混合液转入透析袋中，室温透析3d，所得透析液经冷冻干燥后即得到改性葡聚糖。
所述改性葡聚糖的制备方法中，NaOH溶液的浓度为0.6mol/L。
所述改性葡聚糖的制备方法中，葡聚糖与1，4一丁二醇二缩水甘油醚溶液的质量比为1:0.3:0.1。
所述改性葡聚糖的制备方法中，水芹根部提取液的步骤如下：取水芹根100g清洗干净，而后加入1000mL蒸馏水，煮沸提取1h，然后过滤，保留滤液；同时在滤渣中加入500mL蒸馏水重提2次，过滤得到滤液，而后将滤液合并，于沸水中水浴浓缩至60-70mL，然后冷却定容至100mL，即得到水芹根部提取液。
所述步骤2中，葡聚糖微球的制备方法如下：取改性葡聚糖溶解于去离子水中，而后加入聚乙二醇水溶液进行乳化，在乳化过程中加入四甲基乙二胺和过硫酸钾，在37度条件下反应，1h后将所得的微球用重蒸水；洗3-5遍，即得到葡聚糖微球。
所述葡聚糖微球的制备方法中，各组分的用量为：改性葡聚糖65-75mg；去离子水1.5-2.5mL；聚乙二醇水溶液3-4mL；四甲基乙二胺90-110μL；过硫酸钾170-180μL。
所述步骤3中，在葡聚糖微球表面枝接聚N-异丙基丙烯酰胺的步骤如下：
将聚N-异丙基丙烯酰胺单体和葡聚糖微球置于玻璃管中,通过依次抽真空和通入N2,重复3次,使其被N2包围；而后将玻璃管在室温条件下超声处理；24h后,离心收集聚合物，并用甲醇纯化处理3-5次后，再将微球在50mmol/LEDTA溶液中震荡12h,,最后用超纯水清洗后抽滤收集，即得微载体。
所述聚N-异丙基丙烯酰胺单体和葡聚糖微球的质量比为1:(80-100)。
进一步的，本发明还提供一种微载体，该微载体采用如上述所述的方法制备得到；此外，本发明还提供了一种如上所述的微载体在干细胞3D培养中的应用。
实施例1制备用于干细胞3D培养用微载体样品1
步骤1：制备改性葡聚糖：取10g葡聚糖溶解到5mL 0.6mol/L的NaOH溶液中，在搅拌条件下将上述溶液经注射泵缓慢加入到盛有30mL的1，4一丁二醇二缩水甘油醚溶液中，而后在37℃下搅拌反应，并在搅拌过程中缓慢泵入10mL水芹根部提取液；12h后将反应混合液转入透析袋中，室温透析3d，所得透析液经冷冻干燥后即得到改性葡聚糖；
步骤2：制备葡聚糖微球：取65mg改性葡聚糖溶解于1.5mL去离子水中，而后加入3mL聚乙二醇水溶液进行乳化，在乳化过程中加入90μL四甲基乙二胺和170μL过硫酸钾，在37度条件下反应，1h后将所得的微球用重蒸水；洗3-5遍，即得到葡聚糖微球。
实施例2制备用于干细胞3D培养用微载体样品2
步骤1：制备改性葡聚糖：取10g葡聚糖溶解到5mL 0.6mol/L的NaOH溶液中，在搅拌条件下将上述溶液经注射泵缓慢加入到盛有30mL的1，4一丁二醇二缩水甘油醚溶液中，而后在37℃下搅拌反应，并在搅拌过程中缓慢泵入10mL水芹根部提取液；12h后将反应混合液转入透析袋中，室温透析3d，所得透析液经冷冻干燥后即得到改性葡聚糖；
步骤2：制备葡聚糖微球：取65mg改性葡聚糖溶解于1.5mL去离子水中，而后加入4mL聚乙二醇水溶液进行乳化，在乳化过程中加入90μL四甲基乙二胺和170μL过硫酸钾，在37度条件下反应，1h后将所得的微球用重蒸水；洗3-5遍，即得到葡聚糖微球。
实施例3制备用于干细胞3D培养用微载体样品3
步骤1：制备改性葡聚糖：取10g葡聚糖溶解到5mL 0.6mol/L的NaOH溶液中，在搅拌条件下将上述溶液经注射泵缓慢加入到盛有30mL的1，4一丁二醇二缩水甘油醚溶液中，而后在37℃下搅拌反应，并在搅拌过程中缓慢泵入10mL水芹根部提取液；12h后将反应混合液转入透析袋中，室温透析3d，所得透析液经冷冻干燥后即得到改性葡聚糖；
步骤2：制备葡聚糖微球：取70mg改性葡聚糖溶解于2.0mL去离子水中，而后加入3mL聚乙二醇水溶液进行乳化，在乳化过程中加入100μL四甲基乙二胺和175μL过硫酸钾，在37度条件下反应，1h后将所得的微球用重蒸水；洗3-5遍，即得到葡聚糖微球。
实施例4制备用于干细胞3D培养用微载体样品4
步骤1：制备改性葡聚糖：取10g葡聚糖溶解到5mL 0.6mol/L的NaOH溶液中，在搅拌条件下将上述溶液经注射泵缓慢加入到盛有30mL的1，4一丁二醇二缩水甘油醚溶液中，而后在37℃下搅拌反应，并在搅拌过程中缓慢泵入10mL水芹根部提取液；12h后将反应混合液转入透析袋中，室温透析3d，所得透析液经冷冻干燥后即得到改性葡聚糖；
步骤2：制备葡聚糖微球：取70mg改性葡聚糖溶解于2.0mL去离子水中，而后加入4mL聚乙二醇水溶液进行乳化，在乳化过程中加入100μL四甲基乙二胺和175μL过硫酸钾，在37度条件下反应，1h后将所得的微球用重蒸水；洗3-5遍，即得到葡聚糖微球。
实施例5制备用于干细胞3D培养用微载体样品5
步骤1：制备改性葡聚糖：取10g葡聚糖溶解到5mL 0.6mol/L的NaOH溶液中，在搅拌条件下将上述溶液经注射泵缓慢加入到盛有30mL的1，4一丁二醇二缩水甘油醚溶液中，而后在37℃下搅拌反应，并在搅拌过程中缓慢泵入10mL水芹根部提取液；12h后将反应混合液转入透析袋中，室温透析3d，所得透析液经冷冻干燥后即得到改性葡聚糖；
步骤2：制备葡聚糖微球：取75mg改性葡聚糖溶解于2.0mL去离子水中，而后加入3mL聚乙二醇水溶液进行乳化，在乳化过程中加入110μL四甲基乙二胺和180μL过硫酸钾，在37度条件下反应，1h后将所得的微球用重蒸水；洗3-5遍，即得到葡聚糖微球。
实施例6制备用于干细胞3D培养用微载体样品6
步骤1：制备改性葡聚糖：取10g葡聚糖溶解到5mL 0.6mol/L的NaOH溶液中，在搅拌条件下将上述溶液经注射泵缓慢加入到盛有30mL的1，4一丁二醇二缩水甘油醚溶液中，而后在37℃下搅拌反应，并在搅拌过程中缓慢泵入10mL水芹根部提取液；12h后将反应混合液转入透析袋中，室温透析3d，所得透析液经冷冻干燥后即得到改性葡聚糖；
步骤2：制备葡聚糖微球：取75mg改性葡聚糖溶解于2.0mL去离子水中，而后加入4mL聚乙二醇水溶液进行乳化，在乳化过程中加入110μL四甲基乙二胺和180μL过硫酸钾，在37度条件下反应，1h后将所得的微球用重蒸水；洗3-5遍，即得到葡聚糖微球。
对比例1制备用于干细胞3D培养用微载体对照样品1
步骤1：制备改性葡聚糖：取10g葡聚糖溶解到5mL 0.6mol/L的NaOH溶液中，在搅拌条件下将上述溶液经注射泵缓慢加入到盛有30mL的1，4一丁二醇二缩水甘油醚溶液中，而后在37℃下搅拌反应，12h后将反应混合液转入透析袋中，室温透析3d，所得透析液经冷冻干燥后即得到改性葡聚糖；
步骤2：制备葡聚糖微球：取70mg改性葡聚糖溶解于2.0mL去离子水中，而后加入3mL聚乙二醇水溶液进行乳化，在乳化过程中加入100μL四甲基乙二胺和175μL过硫酸钾，在37度条件下反应，1h后将所得的微球用重蒸水；洗3-5遍，即得到葡聚糖微球。
对比例2制备用于干细胞3D培养用微载体对照样品2
制备葡聚糖微球：取70mg葡聚糖溶解于2.0mL去离子水中，而后加入3mL聚乙二醇水溶液进行乳化，在乳化过程中加入100μL四甲基乙二胺和175μL过硫酸钾，在37度条件下反应，1h后将所得的微球用重蒸水；洗3-5遍，即得到葡聚糖微球。
细胞在微载体上的贴壁率试验
试验方法：在无菌条件下，分别取实施例1-6和对照例1-2制得的微载体各1g，用200mlPBS缓冲液溶胀24min，去除多余的PBS缓冲液，与干细胞一起接种至细胞培养液中进行细胞培养，细胞培养液为含有质量百分浓度为10％的胎牛血清和质量浓度为10ug/L的EGF的DMEM/F12培养基干细胞的接种密度为3×105cells/ml，培养温度为37℃、CO2浓度为5％；每过3天半量换液一次，培养7d后用收获液收获；溶胀后微载体占微载体和培养液总体积的1/5；收获液为含浓度为8mM的EDTA的PBS缓冲液；细胞培养液为DMEM/F-12培养基；分别在2、6、12、18、24小时取样测定各组脐带间充质干细胞的贴壁率。
贴壁率计算公式为：贴壁率＝(贴壁的细胞数/总细胞数)*100％；试验结果如表1及图1-8所示。
表1.采用实施例1-6及对照例1-2制得的微载体培养的细胞贴壁率试验结果
由表1的结果可知，采用实施例1-6制得的微载体在培养干细胞时其贴壁率明显高于对比例1-2，由此可知，采用本发明的方法制备的微载体有效的提高了细胞吸附能力。
细胞在微载体上培养后的收获速率测试
试验方法：在无菌条件下，分别取实施例1-6和对照例1-2制得的微载体各1g，用200mlPBS缓冲液溶胀24min，去除多余的PBS缓冲液，与干细胞一起接种至细胞培养液中进行细胞培养，细胞培养液为含有质量百分浓度为10％的胎牛血清和质量浓度为10ug/L的EGF的DMEM/F12培养基干细胞的接种密度为3×105cells/ml，培养温度为37℃、CO2浓度为5％；每过3天半量换液一次，培养7d后，将培养液转移至室温下降低培养温度进行细胞收获，并记录收获所需的时间，结果如表2所示。
由表2的结果可知，采用本发明的方法制备的微载体可以有效的缩短细胞收获时长。
所述对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。
Claims (10)
1.一种用于干细胞3D培养用微载体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤1：制备改性葡聚糖；
步骤2：制备葡聚糖微球；
以及，步骤3：在葡聚糖微球表面枝接聚N-异丙基丙烯酰胺，得到微载体。
2.根据权利要求1所述的一种用于干细胞3D培养用微载体的制备方法，其特征在于：所述步骤1中，改性葡聚糖的制备方法为：取葡聚糖溶解到NaOH溶液中，在搅拌条件下将上述溶液经注射泵缓慢加入到1，4一丁二醇二缩水甘油醚溶液中，而后在37℃下搅拌反应，并在搅拌过程中缓慢泵入水芹根部提取液；12h后将反应混合液转入透析袋中，室温透析3d，所得透析液经冷冻干燥后即得到改性葡聚糖。
3.根据权利要求2所述的一种用于干细胞3D培养用微载体的制备方法，其特征在于：所述改性葡聚糖的制备方法中，NaOH溶液的浓度为0.6mol/L。
4.根据权利要求3所述的一种用于干细胞3D培养用微载体的制备方法，其特征在于：所述改性葡聚糖的制备方法中，葡聚糖与1，4一丁二醇二缩水甘油醚溶液、水芹根部提取液的质量比为1:30:0.5。
5.根据权利要求4所述的一种用于干细胞3D培养用微载体的制备方法，其特征在于：所述步骤2中，葡聚糖微球的制备方法如下：取改性葡聚糖溶解于去离子水中，而后加入聚乙二醇水溶液进行乳化，在乳化过程中加入四甲基乙二胺和过硫酸钾，在37度条件下反应，1h后将所得的微球用重蒸水；洗3-5遍，即得到葡聚糖微球。
6.根据权利要求5所述的一种用于干细胞3D培养用微载体的制备方法，其特征在于：所述葡聚糖微球的制备方法中，各组分的用量为：改性葡聚糖65-75mg；去离子水1.5-2.5mL；聚乙二醇水溶液3-4mL；四甲基乙二胺90-110μL；过硫酸钾170-180μL。
7.根据权利要求6所述的一种用于干细胞3D培养用微载体的制备方法，其特征在于：所述步骤3中，在葡聚糖微球表面枝接聚N-异丙基丙烯酰胺的步骤如下：
将聚N-异丙基丙烯酰胺单体和葡聚糖微球置于玻璃管中,通过依次抽真空和通入N2,重复3次,使其被N2包围；而后将玻璃管在室温条件下超声处理；24h后,离心收集聚合物，并用甲醇纯化处理3-5次后，再将微球在50mmol/LEDTA溶液中震荡12h,,最后用超纯水清洗后抽滤收集，即得微载体。
8.根据权利要求7所述的一种用于干细胞3D培养用微载体的制备方法，其特征在于：所述聚N-异丙基丙烯酰胺单体和葡聚糖微球的质量比为1：(80-100)。
9.一种微载体，其特征在于：该微载体采用如上述权利要求1-8任意一项所述的方法制备得到。
10.一种如权利要求9所述的微载体在干细胞3D培养中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310661503.2A CN117229992A (zh) | 2023-06-06 | 2023-06-06 | 一种用于干细胞3d培养用微载体及其制备方法与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310661503.2A CN117229992A (zh) | 2023-06-06 | 2023-06-06 | 一种用于干细胞3d培养用微载体及其制备方法与应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117229992A true CN117229992A (zh) | 2023-12-15 |
Family
ID=89093637
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310661503.2A Pending CN117229992A (zh) | 2023-06-06 | 2023-06-06 | 一种用于干细胞3d培养用微载体及其制备方法与应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117229992A (zh) |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101045033A (zh) * | 2007-04-30 | 2007-10-03 | 中国人民解放军第四军医大学 | 一种多糖基修饰的酸敏纳米凝胶 |
| US20080009064A1 (en) * | 2006-07-06 | 2008-01-10 | Vincent Ronfard | Temperature-Responsive Microcarrier |
| KR100871652B1 (ko) * | 2007-07-30 | 2008-12-02 | 한양대학교 산학협력단 | 세포 배양용 3차원 마이크로 캐리어, 이의 제조방법 및이를 이용한 세포의 3차원 부유 배양법 |
| CN101869704A (zh) * | 2010-06-08 | 2010-10-27 | 中国药科大学 | 单剂免疫破伤风类毒素阳离子葡聚糖微球及其制备方法 |
| CN103409361A (zh) * | 2013-06-24 | 2013-11-27 | 上海瀚正生物技术服务有限公司 | 温敏微载体及其制备工艺和使用方法 |
| CN107629142A (zh) * | 2017-09-20 | 2018-01-26 | 常州药物研究所有限公司 | 修饰的交联葡聚糖微球及其制备方法以及含此微球的医用组合物 |
| CN110484486A (zh) * | 2019-08-05 | 2019-11-22 | 嘉兴千纯生物科技有限公司 | 一种复合功能型微载体及其制备方法 |
-
2023
- 2023-06-06 CN CN202310661503.2A patent/CN117229992A/zh active Pending
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20080009064A1 (en) * | 2006-07-06 | 2008-01-10 | Vincent Ronfard | Temperature-Responsive Microcarrier |
| CN101045033A (zh) * | 2007-04-30 | 2007-10-03 | 中国人民解放军第四军医大学 | 一种多糖基修饰的酸敏纳米凝胶 |
| KR100871652B1 (ko) * | 2007-07-30 | 2008-12-02 | 한양대학교 산학협력단 | 세포 배양용 3차원 마이크로 캐리어, 이의 제조방법 및이를 이용한 세포의 3차원 부유 배양법 |
| CN101869704A (zh) * | 2010-06-08 | 2010-10-27 | 中国药科大学 | 单剂免疫破伤风类毒素阳离子葡聚糖微球及其制备方法 |
| CN103409361A (zh) * | 2013-06-24 | 2013-11-27 | 上海瀚正生物技术服务有限公司 | 温敏微载体及其制备工艺和使用方法 |
| CN107629142A (zh) * | 2017-09-20 | 2018-01-26 | 常州药物研究所有限公司 | 修饰的交联葡聚糖微球及其制备方法以及含此微球的医用组合物 |
| CN110484486A (zh) * | 2019-08-05 | 2019-11-22 | 嘉兴千纯生物科技有限公司 | 一种复合功能型微载体及其制备方法 |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| HAILE F. DARGE等: "Preparation of thermosensitive PNIPAm‐based copolymer coated cytodex 3 microcarriers for efficient nonenzymatic cell harvesting during 3D culturing", 《BIOTECHNOL BIOENG.》, vol. 118, no. 10, 18 July 2021 (2021-07-18), pages 4076 - 4091 * |
| JINNAN ZHANG等: "Thermo-responsive microcarriers based on poly(N-isopropylacrylamide", 《EUROPEAN POLYMER JOURNA》, vol. 67, 17 April 2015 (2015-04-17), pages 346, XP029230518, DOI: 10.1016/j.eurpolymj.2015.04.013 * |
| V. HENDRICK等: "Adhesion, growth and detachment of cells on modified polystyrene surface", 《CYTOTECHNOLOGY》, vol. 36, 31 July 2001 (2001-07-31), pages 49 - 53, XP019236698, DOI: 10.1023/A:1014041003617 * |
| 唐小康等: "葡聚糖微球的制备及应用进展", 《精细化工中间体》, vol. 47, no. 1, 28 February 2017 (2017-02-28), pages 1 - 4 * |
| 张健等: "葡聚糖微球在生物医药领域中的应用", 《西北民族大学学报（自然科学版）》, vol. 36, no. 3, 30 September 2015 (2015-09-30), pages 27 - 32 * |
| 董晶等: "温度敏感的葡聚糖凝胶的制备及性能研究", 《南开大学学报（自然科学版）》, vol. 38, no. 1, 28 February 2005 (2005-02-28), pages 37 - 42 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| TWI719468B (zh) | 培養基組成物、其用途、細胞或組織之培養方法及細胞或組織培養物 | |
| US20080009064A1 (en) | Temperature-Responsive Microcarrier | |
| TW202006135A (zh) | 液體組成物 | |
| JPWO2015111685A1 (ja) | 培地組成物の製造方法 | |
| CN111394314A (zh) | 一种肠癌类器官的培养基及培养方法 | |
| CN1320162A (zh) | 三维细胞培养物质及使用它培养细胞的方法 | |
| WO2014171486A1 (ja) | 培地組成物及び当該培地組成物を用いた赤血球の製造方法 | |
| CN111334469A (zh) | Pbmc体外3d甲基纤维素琼脂糖水凝胶培养基及其制备方法 | |
| CN108728356A (zh) | 用于不同三维细胞团配对的装置及共培养方法 | |
| JP6642439B2 (ja) | 細胞回収に関する方法 | |
| CN105441390A (zh) | Nk细胞的体外三维扩增培养方法 | |
| CN105746493A (zh) | 微囊化免疫细胞冻存与复苏方法 | |
| CN117229992A (zh) | 一种用于干细胞3d培养用微载体及其制备方法与应用 | |
| CN108102129B (zh) | 一种纤维素海绵的制备方法 | |
| US20080213869A1 (en) | Hydrogel for separating cell and method of separating cell | |
| KR20180117186A (ko) | 세포 회수가 용이한 부유 배양용 배양 배지 조성물 및 세포 회수 방법 | |
| CN116478925A (zh) | 一种体外快速制备肿瘤细胞球的方法 | |
| JP2016539652A (ja) | 血液形成能がある細胞を含有するカプセル | |
| CN116121174A (zh) | 一种鸡胚胎成纤维细胞体外三维培养和分离的方法 | |
| WO2021149661A1 (ja) | 立体的細胞構造体の製造方法 | |
| CN113293137B (zh) | 一种基于细胞膜表面改性技术的树突状细胞的改性方法及其应用 | |
| CN105296458B (zh) | 一种制备高效水解活力施氏假单胞菌的细胞固定化方法 | |
| CN114774359A (zh) | 一种宫颈鳞癌类器官培养基及其构建方法 | |
| JP6226545B2 (ja) | ヒアルロン酸を利用したスフェロイド培養法 | |
| CN112813029A (zh) | 一种髓母细胞瘤细胞的3d培养方法及其在药物筛选中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |