CN105746493A - 微囊化免疫细胞冻存与复苏方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种微囊化免疫细胞冻存和复苏方法，包括以下步骤：获取免疫细胞；将所述免疫细胞与用于制作微囊的囊材混合进行微囊化处理，获得微囊化免疫细胞；将所述微囊化细胞置于细胞冻存液中进行冻存。在进行免疫细胞冻存之前，将免疫细胞进行微囊化处理，为免疫细胞提供给一个良好的三维附着空间，且由于微囊能够允许营养物质自由出入，因此能够提高免疫细胞的复苏成活率，并保持其细胞活性，除此之外，能够起到免疫隔离屏障的作用，并能够降低免疫细胞移植引起的免疫排斥反应。

Description

微囊化免疫细胞冻存与复苏方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种微囊化免疫细胞冻存与复苏方法。

背景技术

细胞免疫治疗是一种新兴的、具有显著疗效的全新的抗肿瘤治疗方法，弥补了传统的手术、放疗、化疗的弊端，已经被公认为二十一世纪肿瘤综合治疗模式中最活跃、最有发展前途的一种治疗手段,也是世界目前唯一有希望完全消灭肿瘤细胞的治疗手段。

免疫细胞是指参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞，包括淋巴细胞、树突状细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞等。免疫细胞可以分为多种，在人体中各种免疫细胞担任着重要的角色。从血液中分离出来的单个核细胞包括：T细胞、B细胞、NK细胞和DC细胞等，是免疫细胞治疗中的初始细胞来源，经各类细胞因子诱导扩增培养，得到一群具有高效杀伤活性的免疫细胞群。

常见的免疫细胞治疗种类包括NK细胞、CIK细胞、DC-CIK细胞、TIL细胞、LAK细胞、CART细胞等。所有这些经诱导和扩增培养的免疫细胞的初始细胞来源都是外周血或脐血的单个核细胞，而且是直接分离培养。随着年龄的增长，免疫细胞在体内的活性也会随之降低，所以在年轻时期冻存具有较高活性的免疫细胞，对于未来罹患肿瘤相关疾病的治疗可以起到很好的保障，因此免疫细胞冻存及冻存后的复苏培养具有非常大的意义。除此之外，随着免疫细胞治疗项目的逐步推广，免疫细胞的远程运输，长期保存问题就凸显出来，也是细胞制备区域化进程中必须解决的问题。

目前，细胞冻存主要是采取-196℃超低温条件下的保存方案，在超低温条件下，细胞的代谢功能停滞，但并未死亡。而细胞复苏则主要采用冻存细胞在37℃快速解冻的方法，以恢复细胞的活性和功能。但是现有的免疫细胞冻存方法适用于冻存干细胞和肿瘤细胞，对于免疫细胞，在冻存过程中则易形成冰晶损伤细胞，复苏后细胞活率低、细胞增殖数量不足、细胞易老化，存在效率低下，冻存质量不高、细胞复苏后活性差以及成活率不高等问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术中免疫细胞冻存方法存在冻存效率差，且免疫细胞复苏成活率低等缺陷，提供一种能够提高免疫细胞冻存效率并提高免疫细胞复苏成活率的微囊化免疫细胞冻存方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种微囊化免疫细胞冻存方法，包括以下步骤：获取免疫细胞；

将所述免疫细胞与用于制作微囊的囊材混合进行微囊化处理，获得微囊化免疫细胞；

将所述微囊化细胞置于细胞冻存液中进行冻存。

在本发明提供的微囊化免疫细胞冻存方法中，所述囊材为壳聚糖或海藻酸-聚赖氨酸。

在本发明提供的微囊化免疫细胞冻存方法中，所述囊材为海藻酸-聚赖氨酸，且所述微囊化处理的过程包括以下步骤：

将所述免疫细胞和海藻酸溶液混合搅拌至免疫细胞浓度为(0.5～2)×10⁷个/ml，逐滴加入氯化钙溶液中，形成凝胶球后，加入聚赖氨酸包埋。

在本发明提供的微囊化免疫细胞冻存方法中，所述聚赖氨酸包埋的时间为1～12分钟。

在本发明提供的微囊化免疫细胞冻存方法中，所述聚赖氨酸包埋后，还包括采用有机酸溶液液化微囊的步骤。

在本发明提供的微囊化免疫细胞冻存方法中，所述细胞冻存液包括二甲基亚砜、人血清和AIM-V培养基。

在本发明提供的微囊化免疫细胞冻存方法中，；所述AIM-V培养基中，二甲基亚砜的体积分数为5～15％，人血清的体积分数为5～15％。

在本发明提供的微囊化免疫细胞冻存方法中，所述冻存过程，还包括以下步骤：

将置于所述细胞冻存液中的微囊化免疫细胞温度降至-60～-100℃后，置于-170～-200℃温度下冻存。

本发明进一步保护一种微囊化免疫细胞冻存后的复苏方法，其特征在于，将权利要求1～8任一项所述的冻存后微囊化免疫细胞进行复苏的过程，包括以下步骤：

将冻存后的微囊化免疫细胞以20～40℃/min的速度升温至-100℃，然后置于含有体积分数为20％～40％二甲基亚砜的水溶液中迅速升温至融化。

在本发明提供的微囊化免疫细胞冻存后的复苏方法中，微囊化免疫细胞解冻之后，于室温下将微囊化免疫细胞放入磷酸盐缓冲液中稀释，逐步透出二甲基亚砜，离心弃上清，洗涤，加入无血清培养基进行培养。

实施本发明提供的微囊化免疫细胞冻存和复苏方法，可以达到以下有益效果：在进行免疫细胞冻存之前，将免疫细胞进行微囊化处理，为免疫细胞提供给一个良好的三维附着空间，且由于微囊能够允许营养物质自由出入，因此能够提高免疫细胞的复苏成活率，并保持其细胞活性，除此之外，能够起到免疫隔离屏障的作用，并能够降低免疫细胞移植引起的免疫排斥反应。

具体实施方式

本发明提供的微囊化免疫细胞冻存方法，包括以下步骤：

S1、获取免疫细胞；

S2、将免疫细胞与用于制作微囊的囊材混合进行微囊化处理，获得微囊化免疫细胞；

S3、将步骤S2中获得的微囊化免疫细胞置于细胞冻存液中进行冻存。

具体地，步骤S1中，免疫细胞可以是NK细胞(NaturalKillerCells，自然杀伤细胞)、CIK细胞(Cytokine-InducedKiller，细胞因子诱导的杀伤细胞)、DC-CIK细胞(DendriticCell-Cytokine-InducedKiller,与DC细胞共培养的CIK细胞)、TIL细胞(TumorInfiltratingLymphocyte，肿瘤浸润淋巴细胞)、LAK细胞(LymphokineActivatedKillerCells，淋巴因子激活的杀伤细胞)或CAR-T细胞(嵌合抗原受体T细胞，ChimericAntigenReceptorT-CellImmunotherapy)等，来源于外周血、脐血或骨髓等，下以NK细胞和CIK细胞为例说明其获取过程。

本发明中，NK细胞的获取过程包括以下步骤：

从人外周血中分离出单个核细胞，通过磁珠分选出CD34+造血干细胞单个核细胞，并将CD34+造血干细胞单个核细胞于含有造血干细胞生长因子的干细胞培养基中进行刺激分化成NK细胞。

本发明中，CIK细胞的获取过程包括以下步骤：

从人外周血中分离出单个核细胞，将单个核细胞与纤维蛋白凝胶混合，再加入含PPP(PoorPlateletPlasma，低血小板血浆)和IFN-γ(Interferon-γ，γ干扰素)的培养基培养，再添加生长因子IL-1α和IL-2至单个核细胞诱导转化成CIK细胞。

步骤2中，用于制作微囊的囊材包括海藻酸盐、多聚赖氨酸、壳聚糖、2-甲基丙烯酸、羟乙基甲基丙烯酸酯、甲基丙二酸盐、琼脂糖，聚丙烯胺及羟甲基纤维素等；在本发明中，优先采用壳聚糖或海藻酸盐-聚赖氨酸制作微囊，这两种材料不仅来源方便，而且无生物毒性及免疫原性，制作而成的微囊的膜具有良好的生物相容性、通透性，以及较强的机械稳定性，为免疫细胞提供一个稳定的三维附着空间，此外，在细胞经冻存-复苏后，可起到免疫隔离屏障的作用，能够降低免疫细胞移植引起的免疫排斥反应。

本发明将免疫细胞包裹于囊材中形成直径数十微米至数百微米的微囊，由于免疫细胞的贴壁性，因此微囊为免疫细胞提供了一个良好的附着基质，使免疫细胞相互接触形成一种三维结构；此外，该微囊能够防止生物大分子和细胞从微囊中逸出，而小分子物质、培养基的营养物质、细胞冻存液及代谢物可以自由出入微囊，达到培养和冻存的目的等。

进一步地，步骤S2中，将免疫细胞与囊材混合之前，还包括添加免疫细胞培养基静置20～40分钟的步骤，优选地，该免疫细胞培养基为无血清培养基；该步骤使得免疫细胞与囊材混合时以及囊材形成过程中保持免疫细胞正常的生长，并保持细胞活性。

具体地，采用海藻酸盐-聚赖氨酸为囊材制作微囊的过程，还包括以下步骤：

将浸润在免疫细胞培养基中的免疫细胞和质量分数为0.5％～2.5％的海藻酸溶液混合搅拌均匀，使得免疫细胞浓度为(0.5～2)×10⁷个/ml，逐滴加入1.0～2.0％氯化钙溶液中；海藻酸盐遇到钙离子可迅速发生离子交换，生成凝胶球，然后，再用浓度为0.1～1.0g/L的聚赖氨酸包埋1～12分钟，使凝胶球表面成膜；聚赖氨酸包埋时间优选为6分钟，以增加微囊膜的厚度，提高微囊的稳定性。最后用35～75mM的有机酸溶液处理去除凝胶球内的钙离子，以使凝胶球内的海藻酸呈液态，免疫细胞得以悬浮其中。海藻酸盐与钙离子形成的凝胶具有热不可逆性，凝胶性能不受温度影响，机械性能较好；优选地，海藻酸盐为海藻酸钠。

采用壳聚糖为囊材制作微囊的过程，包括以下步骤：

称取一定量的壳聚糖，充分溶解于体积分数为1％～3％稀醋酸中，配成质量分数为0.1％～0.5％的壳聚糖醋酸溶液，加入5-氟尿嘧啶，使其完全溶解，加入表面活性剂，保持温度为40～60℃，搅拌均匀，加入NaOH溶液调pH为5～6；

再加入浸润在免疫细胞培养基中的免疫细胞，混合搅拌均匀，使免疫细胞浓度为(0.5～2)×10⁷个/ml，加入凝聚剂，再次搅拌均匀后，10～30分钟后加入体积分数为2％～8％的戊二醛溶液，开始固化形成微囊，生理盐水清洗即可。

步骤S3中所采用的细胞冻存液，包括二甲基亚砜、人血清和无血清培养基，其中，无血清培养基中，二甲基亚砜的体积分数为5～15％和人血清的体积分数为5～15％；本发明优先采用AIM-V培养基，购于美国Invitrogen公司。

其中，AIM-V培养基购于美国Invitrogen公司，其中主要含有L-谷氨酰胺、硫酸链霉素和硫酸庆大霉素等，用以保持免疫细胞活性，使得免疫细胞复苏后能够维持其细胞活性，并延长免疫细胞存活期。

二甲基亚砜为小分子有机化合物，渗透性保护剂，能够降低细胞冰点，减少冰晶的形成对免疫细胞的损害。

人血清为营养保护剂，其中包括血清蛋白、葡萄糖、无机盐离子、胰岛素、肾上腺皮质激素，类固醇激素等，不仅能够为免疫细胞提供所需的营养物质，而且血清蛋白形成了血清的粘度，可以保护细胞免受机械损伤。

进一步地，步骤S3中向微囊化免疫细胞中加入细胞冻存液之后，需静置30～90分钟，以利于冻存液充分渗透。

静置后，将微囊化免疫细胞的温度降至-60～-100℃后，转移至冻液氮或气氮冻存，冻存温度为-170～-200℃。

进一步地，经本发明冻存后的免疫细胞复苏的过程，包括以下步骤：

取步骤S3中获得的冻存后微囊化免疫细胞以20～40℃/min的速度将冻存温度升温至-100℃，然后置于含有20％～40％二甲基亚砜的水溶液中迅速升温至融化。

解冻之后，于室温下将微囊化免疫细胞放入磷酸盐缓冲液中稀释，逐步透出二甲基亚砜，离心弃上清，洗涤，加入无血清培养基进行培养；本发明优先采用AIM-V培养基。

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

本发明提供的微囊化免疫细胞冻存方法，包括以下步骤：

S1a、获取免疫细胞—CIK细胞；

S11a、从血液中将单个核细胞分离出来；

S12a、将单个核细胞悬液与1000mm³/个未凝固的纤维蛋白凝胶以1×10⁴：1的比例混合后，置于37℃恒温箱内至纤维蛋白凝胶完全凝固，然后将凝固且带有单个核细胞的纤维蛋白凝胶置于50ng/ml的CD3McAb和10g/ml的RetroNectin预包被的培养瓶中，并加入含1％体积分数的PPP和1000IU/ml浓度的IFN-γ的GTT551培养基；

S13a、第2天，添加IL-1α和IL-2，并使其在步骤S12a中GTT551培养基中的终浓度分别为100IU/ml、300IU/ml；

S14a、第3天，补充步骤S12a中的GTT551培养基至体积为100ml，同时添加IL-2，维持其在培养基中的浓度300IU/ml不变；

S15a、每隔2-3天重复步骤S14a对CIK进行扩增；

S16a、第21天收获扩增后的CIK。

其中，步骤S12a中纤维蛋白凝胶的制备方法为：

1)配制2000KIU/ml抑肽酶，取配制好的抑肽酶1ml溶解多肽偶联的冻干纤维蛋白原,配制出纤维蛋白原终浓度为2.0g/L的溶液A；

2)将凝血酶加入40mmol/LCaCl₂溶液中，配制出凝血酶浓度为300U/ml的溶液B；

3)将溶液A和溶液B混合，在底面积为100mm²模具中制作成为圆柱体的复合物，即得到未凝固的纤维蛋白凝胶，4℃冰箱保存备用。

S2a、获取微囊化免疫细胞；

取步骤S16a获得的CIK细胞培养于含有10％胎牛血清的高糖DMEN中，隔天换液，冷冻前一天换液一次；胰酶消化，离心，加入1.5％海藻酸钠溶液至细胞浓度为1×10⁷个/ml，用高压脉冲景点液滴发生器形成液滴逐滴滴入1.5％氯化钙溶液中，浸泡10分钟，最终形成凝胶球；将凝胶球放入生理盐水中清洗，然后加入浓度为0.5g/L的聚赖氨酸包埋，反应6分钟，生理盐水清洗后，再加入55mM的柠檬酸钠溶液，液化微囊；

然后，将微囊化的CIK细胞置于DMEM培养基中；其中，DMEM培养基中含有质量分数为1％青霉素和1％链霉素，25mmol/L的HEPES，质量分数为10％胎牛血清，在CO₂培养箱中37℃培养。

S3a、微囊化免疫细胞的冻存；

过夜培养后，调整培养基中的微囊数量为100个/ml，将微囊化CIK细胞移入无菌冻存管中，添加1.5ml细胞冻存液，封口，放入4℃冰箱内静置平衡60分钟，以利于细胞冻存液的充分渗透；然后，采用微机控制程序降温仪将微囊化CIK细胞的温度降至-80℃后，最后转移至液氮中保存24小时至1个月，冻存温度为-185℃。

其中，细胞冻存液包括AIM-V培养基，以及体积分数为10％的二甲基亚砜和10％的人血清。

S4a、复苏冻存后的微囊化免疫细胞；

取冻存于-185℃程序降温仪中的微囊CIK细胞，以30℃/min的速度从-185℃升温至-100℃，然后在具有室温含体积分数为30％二甲基亚砜的水溶液中迅速升温至融化。

解冻之后，在室温下把微囊化CIK细胞放入磷酸盐缓冲液中做倍比稀释，逐步透出二甲基亚砜，离心弃上清液，洗涤3次后，加入AIM-V培养基，置于37℃，含有5％体积分数的CO₂的培养箱中培养。

实施例2

与实施例1的不同之处在于，该实施例中，获取微囊化免疫细胞的具体过程为：

称取一定量的壳聚糖，充分溶解于体积分数为2％的稀醋酸中，配成质量分数为0.25％的壳聚糖醋酸溶液，量取20ml于烧杯中，加入100mg的5-氟尿嘧啶，使其完全溶解，加入表面活性剂1ml于恒温磁力搅拌器中，保持温度为50℃，开始搅拌30分钟，加入NaOH溶液调pH为5.5；

再加入浸润在免疫细胞培养基中的CIK细胞，混合搅拌均匀，使CIK细胞浓度为1×10⁷个/ml，加入凝聚剂，搅拌中再加入稀释剂，20分钟后加入体积分数为5％的戊二醛溶液0.5ml，开始固化2小时后形成微囊，生理盐水洗涤；然后，将微囊化的CIK细胞置于DMEM培养基中；其中，DMEM培养基中含有质量分数为1％青霉素和1％链霉素，25mmol/L的HEPES，质量分数为10％胎牛血清，在CO₂培养箱中37℃培养。

实施例3

与实施例1的不同之处在于，该实施例中所采用的免疫细胞为NK细胞，其获取过程包括以下步骤：

S11c、单个核细胞的分离；

采集100ml人外周血的血样，或80mL新生儿脐带血的血样，用1-2倍体积的PBS溶液稀释血样，充分混匀后，得到PBS血样混合液，然后在每个50ml离心管中先加入15ml的Ficoll分离液，Ficoll分离液的密度为1.077g/mL；再缓慢加入20-30ml的PBS血样混合液，室温离心，离心机升降速均调为0，于20℃、400g，离心30min，中间层为单个核细胞；用巴斯德吸管小心吸取，之后用1×PBS加满离心管，充分离心洗涤单个核细胞(400g，离心l0min)，重悬细胞，备用。

S12c、CD34⁺造血干细胞的分选；

将步骤S11c中获得的单个核细胞以台盼蓝染色计数活细胞后调为2×10⁸个/m1的细胞悬液，按每毫升细胞悬液加入100μL抗体的比例，加入CD34抗体混合物，用移液器上下吹打充分混匀，室温孵育15分钟；然后按每毫升细胞悬液加入50μL磁珠的比例，加入CD34⁺磁珠充分吹打混匀，室温孵育10分钟后，将细胞转入聚苯乙烯试管(12×75rnm)，加PBS洗涤液(含2％FBS、0.01％EDTA)至2.5ml，在试管内用移液器上下轻轻吹打2～3次，混匀细胞。再将试管插入磁极中，静置五分钟；然后将磁极连试管一起拿起，以连续缓慢的动作倾倒磁极至倒置状态，倒出上清部分。磁性标记的细胞由于磁极磁场的吸引，仍然留在试管内。保持磁极及试管倒置2～3秒，然后使试管口恢复向上的位置。从磁极中取出试管，加入2.5ml洗涤液，用移液器轻轻吹打细胞悬液2～3次，混匀细胞，再将试管放回磁极中，静置五分钟。重复洗涤4次后，试管中保留的为CD34⁺造血干细胞，备用。

S2c、将CD34⁺造血干细胞接种于含有造血干细胞生长因子及IGF-1的干细胞培养基中刺激分化成NK细胞；

调整CD34⁺造血干细胞的细胞悬液密度为1×10⁵个/ml，并接种于含有SCGM干细胞培养基(购自于德国CellGenix公司)的24孔板中，接种前做流式分析检测接种前CD34⁺造血干细胞含量，并保证CD34⁺造血干细胞在95％以上；再分别添加干细胞因子、FLT-3L和白介素-15以及IGF-1，并使得干细胞培养基中，干细胞因子的浓度为30ng/ml、FLT-3L的浓度为50ng/ml和白介素-15的浓度为50ng/mL以及IGF-1的浓度为100ng/mL；于37℃、5％CO₂孵箱培养28天。

为进一步验证本发明提供的微囊化免疫细胞冻存和复苏方法具有显著的有益效果，设置以下实验进行验证。

检测组1～3—分别对应本发明实施例1～3解冻复苏后的免疫细胞；

对照组—未用微囊包被的免疫细胞经冻存复苏后获得的细胞。

1、MTT法检测细胞活性

向培养有复苏后的微囊化细胞中加入20微升5mg/ml的MTT，37℃培养4h，生理盐水洗两次，加入400微升的二甲基亚矾，37℃培养2.5h。570nm波长测量吸光度值，630nm波长为参考值，检测结果见下表1。

表1

检测结果：OD值越大，代表溶液中甲簪的含量越高，同时也说明，促使MTT酶解为甲簪的琥珀酸脱氢酶越多，分泌琥珀酸脱氢酶活细胞的数量较多。由此说明，本发明将免疫细胞微囊化后冻存复苏后，免疫细胞成活率有所提高。

2、体外功能测定

分别取检测组1～3和对照组各8组，分别测基础儿茶酚胺分泌量与高钾和乙酰胆碱刺激下儿茶酚胺的分泌量，检测结果见下表2。

表2

检测结果：由表2数据可知，对照组冻存复苏后免疫细胞基础与高钾和乙酰胆碱刺激下分泌量分别约为冻存钱微囊免疫细胞分泌量的60％；

检测组1～3冻存复苏后微囊免疫细胞保留了儿茶酚胺的分泌功能，约为冻存前微囊免疫细胞分泌量的80％，且高于对照组免疫细胞分泌量；由此说明，通过本发明将免疫细胞微囊化后冻存复苏后还能够维持免疫细胞功能较好。

以上对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。

Claims (10)

1.一种微囊化免疫细胞冻存方法，其特征在于，包括以下步骤：

获取免疫细胞；

将所述免疫细胞与用于制作微囊的囊材混合进行微囊化处理，获得微囊化免疫细胞；

将所述微囊化细胞置于细胞冻存液中进行冻存。

2.根据权利要求1所述的微囊化免疫细胞冻存方法，其特征在于，所述囊材为壳聚糖或海藻酸-聚赖氨酸。

3.根据权利要求2所述的微囊化免疫细胞冻存方法，其特征在于，所述囊材为海藻酸-聚赖氨酸，且所述微囊化处理的过程包括以下步骤：

将所述免疫细胞和海藻酸溶液混合搅拌至免疫细胞浓度为(0.5～2)×10⁷个/ml，逐滴加入氯化钙溶液中，形成凝胶球后，加入聚赖氨酸包埋。

4.根据权利要求3所述的微囊化免疫细胞冻存方法，其特征在于，所述聚赖氨酸包埋的时间为1～12分钟。

5.根据权利要求4所述的微囊化免疫细胞冻存方法，其特征在于，所述聚赖氨酸包埋后，还包括采用有机酸溶液液化微囊的步骤。

6.根据权利要求1所述的微囊化免疫细胞冻存方法，其特征在于，所述细胞冻存液包括二甲基亚砜、人血清和AIM-V培养基。

7.根据权利要求6所述的微囊化免疫细胞冻存方法，其特征在于，所述AIM-V培养基中，二甲基亚砜的体积分数为5～15％，人血清的体积分数为5～15％。

8.根据权利要求1所述的微囊化免疫细胞冻存方法，其特征在于，所述冻存过程，还包括以下步骤：

将置于所述细胞冻存液中的微囊化免疫细胞温度降至-60～-100℃后，置于-170～-200℃温度下冻存。

9.一种微囊化免疫细胞冻存后的复苏方法，其特征在于，将权利要求1～8任一项所述的冻存后微囊化免疫细胞进行复苏的过程，包括以下步骤：

将冻存后的微囊化免疫细胞以20～40℃/min的速度升温至-100℃，然后置于含有体积分数为20％～40％二甲基亚砜的水溶液中迅速升温至融化。

10.根据权利要求9所述的微囊化免疫细胞冻存后的复苏方法，其特征在于，微囊化免疫细胞解冻之后，于室温下将微囊化免疫细胞放入磷酸盐缓冲液中稀释，逐步透出二甲基亚砜，离心弃上清，洗涤，加入无血清培养基进行培养。