JP2016539652A - 血液形成能がある細胞を含有するカプセル - Google Patents

血液形成能がある細胞を含有するカプセル Download PDF

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Abstract

本発明は、液体コア及び液体コアの周囲を完全に被包する少なくとも1個のゲル状殻で形成された、血液形成能がある少なくとも1個の細胞を含むカプセルと、脱核赤血球細胞をex vivoで生成するための、このようなカプセルの使用と、前記カプセルを使用して脱核赤血球細胞を生成するためのex vivo法とに関する。

Description

本発明は、液体コア及び液体コアの周囲を完全に被包する少なくとも1個のゲル状殻で形成された、造血能がある少なくとも1個の細胞を含むカプセルと、脱核赤血球細胞をex vivoで生成するための、このようなカプセルの使用と、前記カプセルを使用して脱核赤血球細胞を生成するためのex vivo法とに関する。
特に輸血目的での、化学変化を起こしやすい血液製剤に対する大きな需要が依然として存在し、この需要は現在の天然ヒト血液の供給によって十分満たされているわけではない。したがって、天然血液の血液代替品が数多く研究されている。
しかしながら、組換え又は安定化ヘモグロビンは期待外れの性能を示しており、人工酸素担体の適応は限られており、酵素処理又は抗原遮断によりABO系及び/又はRhD抗原に適合した「共通の」赤血球小体の開発は遅れている。
したがって、これらの方法の代替に関する必要性が存在する。この点において、in vitroで幹細胞から赤血球小体等の赤血球細胞を生成するための試みが特に推奨されている。
しかしながら、自然がin vivoにおいて構築に数ヶ月を要するものをin vivoで再現することは相当な難題である。ヒトにおけるその発生中、赤血球生成は中胚葉から二波型に変化する。初期赤血球生成は妊娠第3週直後に卵黄嚢(胚外組織)において始まり、GowerタイプI(ζ2ε2)及びGowerタイプII(α2ε2)の胎児性ヘモグロビンを合成する巨大赤芽球性脱核初期赤血球を生ずる。最終赤血球生成は、胎児の肝臓及び骨髄へと移動する前に、中腎大動脈-生殖腺(AGA)の領域において妊娠第5週中に始まる。成熟赤血球細胞が徐々に生成して、正赤血球性脱核赤血球小体(RBC)が生成し、胎児性ヘモグロビン(α2γ2)、次いで成人性ヘモグロビン(α2β2)が含有されるようになる。
今日まで、Ma.ら(2008)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、105: 13087〜13092頁によって記載されたように、ヒト胚性幹細胞から赤血球小体を生成するための幾つかの試みが報告されている。しかしながら、一般にこれらの実験は間質細胞の存在下での同時培養工程に基づくものであり、このためプロセスの強化が困難となる。
例えば、脱核赤血球を大量かつ選択的に生成するためのin vitro法を記載する特許出願WO2005118780に言及することができる。この方法によれば、少なくとも1個の造血性成長因子を含む培養培地中で造血幹細胞を培養し、次いでこのようにして得た細胞の培養物を担体細胞と接触させる。
特許出願WO2011101468の場合、間質細胞のエコ培養(eco-culture)を必要としない、造血系統の細胞の増殖及び/又は分化用の、インスリン、トランスフェリン及び血漿又は血清を含む細胞培養培地を記載している。
今日産業規模で選択される生成法は、例えばワクチン又はモノクローナル抗体の産生に使用される、リアクターで攪拌を行うことであり、細胞は溶液中で、又は接着細胞の場合は微粒子上で増殖する。
それにもかかわらず、この生成法は、工業生産に必要とされるかなりの細胞密度で培養を行うと直ちに問題に直面する。実際、細胞の密度が高くなるほど、流量を増大させ、したがって攪拌しなければならない。しかしながら、酵母及び細菌とは異なり、哺乳動物細胞、特に幹細胞は壊れやすく、機械処理に対する耐性が低く、予想よりはるかに低い収率をもたらす。
アルギン酸塩を充填したビーズが、細胞培養において接着細胞の担体として使用される。この場合、したがって、細胞はビーズの外に位置する。
その後、アルギン酸塩を充填したビーズ内に細胞を被包する案が試みられた。すると、第1の毒性問題が被包プロセス中に浮上しため、多くの材料開発及びゲル化プロセスが、アルギン酸塩マトリックス中にこのように配置された細胞の生存率を改善するため提案された(A method for the large-scale cultivation of animal cells wherein animal cells are embedded in a collagen gel which is covered by a protective coating., The protective coating supports and protects the collagen matrix., Junpei Enami, Naohito Kondo, Toshikazu Takano, Kaneo Suzuki.、米国特許第5,264,359号、1989)。
第2の問題は、ゲル内には、細胞を増殖させるための空間が不足していることにある。したがって、異なる戦略がカプセルの形成に関して試験された(Encapsulation of biological material, Franklin Lim, 米国特許第4,352,883号、1982、Tissue culture and production in permeable gels., Elizabeth Maureen Frye, Mark Maurice Lynch, John Paul Vasington., EP0185701、1984)。
特許出願WO2010/063937は、液体コア及びコアを完全に被包するわずかな厚さのゲル状殻を有するカプセルの調製法を記載している。これらのカプセルは、ジャケットの流出口における小滴の同時押出によって形成される。前記カプセルは、細胞を含有することができると記載されている。しかし、この方法が細胞被包に適していると思われるのだとしても、これらのカプセルが、被包細胞培養時に細胞増殖をサポートする可能性、又は特に造血能がある細胞、詳細には造血幹細胞又は赤血球前駆細胞の増幅と分化をサポートする可能性をもたらすとは示されていない。
本発明者らは、本発明による造血能がある細胞を含有するカプセルはこれら全ての問題を解決する可能性を与え、したがって初めて、造血能がある細胞の大規模な細胞培養への適用を想定する可能性を与えることを実証した。
特許出願WO2005118780 特許出願WO2011101468 A method for the large-scale cultivation of animal cells wherein animal cells are embedded in a collagen gel which is covered by a protective coating., The protective coating supports and protects the collagen matrix., Junpei Enami, Naohito Kondo, Toshikazu Takano, Kaneo Suzuki., 米国特許第5,264,359号、1989 Encapsulation of biological material, Franklin Lim, 米国特許第4,352,883号、1982 Tissue culture and production in permeable gels., Elizabeth Maureen Frye, Mark Maurice Lynch, John Paul Vasington., EP0185701、1984 特許出願WO2010/063937 FR2012/2964017
Ma.ら、(2008)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 105: 13087〜13092頁 「Formation of liquid-core capsules having a thin hydrogel membrane: liquid pearls」、Bremondら、Soft Matter、2010年、2484〜2488頁
したがって本発明の目的は、バイオリアクター内で脱核赤血球細胞を生成するため、造血能がある細胞の細胞培養の収率を改善することである。課題は、造血能がある細胞の十分な増殖に必要な栄養素を与え、異化代謝産物を除去することである。
本発明によるカプセルは、均一な増殖条件を保証しながら、溶液中のせん断又は酸素気泡から前記細胞を保護する可能性を与える。
壁が小分子にとって多孔質であり、大きさが1ミリメートル未満であるため、拡散は実際にカプセル内の濃度の均一性を保証するのに十分である。壁が細胞を保護するので、バイオリアクター内で大規模に高濃度のカプセルを効率よく攪拌することが可能である。被包には、造血能がある細胞の大規模な培養にとっての利点が他にもある。カプセルは(沈殿、フィルターを介した捕捉による)取り扱いが容易であり、例えば従来のリアクターとは異なり、細胞にストレスを加えずに培養培地を容易に交換する可能性を与える。
したがって本発明は、液体コア、液体コアの周囲を完全に被包するゲル状殻を含むカプセルであって、カプセルを気体に曝した場合にゲル状殻が液体コアを保持することができ、ゲル状殻が少なくとも1個のゲル状多価電解質及び少なくとも1個の界面活性剤を含み、造血能がある少なくとも1個の細胞を液体コアが含むカプセルに関する。
「造血能がある細胞」とは、血液細胞の起源である1つ又は複数の系統に分化することができる細胞を意味する。
より詳細には、本発明による「造血能がある細胞」は、その分化中に赤血球小体を生成することができる赤血球系統の細胞である。本発明による造血能がある細胞は特に、幹細胞、詳細には胚性幹細胞(ESC)、造血幹細胞(BSC)のような成体幹細胞、人工多能性幹細胞(iPS)、不死化細胞、赤血球前駆細胞又は赤血球前駆体に由来し得る。本発明の「造血能がある細胞」はヒト細胞であることが好ましい。
造血能がある細胞は、造血幹細胞及び/又は赤血球前駆細胞及び/又は赤血球前駆体であることが好ましい。
造血能がある細胞が造血幹細胞である場合、造血幹細胞は臍帯血から、又は末梢血から、白血球除去により得ることができるヒト造血幹細胞、詳細にはCD34+細胞であることが好ましい。それらは優先的には網状赤血球及び/又は赤血球に分化する。
赤血球又はヘマティア(hematia)は、より一般的には赤血球(red corpuscle)と呼ばれる。
網状赤血球は、赤血球生成における赤血球段階前の細胞である。それらは互いにある程度類似している。網状赤血球は、リボソームとミトコンドリアを依然有するが、如何なるペルオキシソームも含まない若い赤血球小体である。
「赤血球前駆細胞」とは、赤血球系統の細胞、詳細には網状赤血球及び/又は赤血球に増殖及び分化することができる、造血幹細胞の分化に由来する細胞を意味する。それらはヒト赤血球前駆細胞であることが好ましい。
「赤血球前駆体」とは、細胞学上確認可能な赤血球系統由来の、すなわち前赤芽球から好酸性赤芽球までの範囲の細胞型を確認するための従来の基準に見合う任意の細胞を意味する。それらはヒト赤血球前駆体であることが好ましい。
本発明の範囲内で、カプセルの液体コアは、カプセル当たり1個と10,000個の間の細胞、好ましくはカプセル当たり10個と1,000個の間の細胞に含まれる量の、造血能がある細胞を被包時に含むことができる。
本発明によるカプセルの液体コアは、好ましくは、生理食塩水溶液、バッファー溶液、生理的に許容される粘着剤等の生理的に許容される液体、並びに/又は造血能がある細胞の増殖及び分化のための、その組成を後の記載中に詳述する培養培地からなる。
液体コアは、増粘剤、又はレオロジー調節剤等の生理的に許容される賦形剤も含むことができる。これらの増粘剤は、例えばポリマー、架橋構造ポリマー、マイクロゲル、ガム、又は多糖、セルロース、ポリオシドを含めたタンパク質、シリコーン、コロイド粒子をベースとするポリマー及びコポリマー(シリカ、クレー、ラテックス等)である。
本発明によるカプセルのゲル状殻は、水及び多価イオンに反応性がある少なくとも1個の多価電解質を含有するゲルを含む。本発明によれば、殻は後に記載するその製造法から生じる界面活性剤を更に含有する。
詳細には、本発明によるカプセルは以下の工程、
a)造血能がある少なくとも1個の細胞を含有する第1の液体溶液と、ゲル化し得る液体多価電解質を含有する第2の液体溶液とをジャケット内で別々に移動させる工程、
b)ジャケットの流出口において一連の小滴を形成する工程であって、それぞれの小滴が前記第1の溶液で形成される中心コアと、前記第2の溶液で形成され中心コアを完全に覆う周縁フィルムとを含む、工程、
c)フィルムの多価電解質と反応可能な試薬を含有するゲル溶液中にそれぞれの小滴を浸して、小滴を液体状態からゲル状態に移行させゲル状殻を形成させ、中心コアが液体コアを形成する、工程、
d)形成されたカプセルを回収する工程
を含む方法であって、第2の溶液が第1の溶液との接触前に少なくとも1個の界面活性剤を含有する、方法から得られる。
この方法の一態様によれば、ジャケットの流出口における第1の溶液の流量の第2の溶液の流量に対する比は1と200の間、有利には10と200の間に含まれ、形成されたカプセルの回収後、ゲル状殻は、カプセル直径の0.1%と10%の間、有利には0.1%と2%の間に含まれる厚さを有する。
この方法の別の態様によれば、第1の生理的に許容される液体溶液は、生理食塩水溶液、バッファー溶液、生理的に許容される粘性溶液、生理的に許容される賦形剤、有利には増粘剤又はレオロジー調節剤、及び/又は培養培地を含む。
この方法の別の態様によれば、ジャケット内での同時押出によって形成された小滴が、一定体積の空気中を通ってゲル溶液中に自由落下する。
本明細書の範囲内では、「界面活性剤」とは、一方が親油性かつ無極性であり他方が親水性かつ極性である、異なる極性を伴う2つの部分を有する両親媒性分子を意味する。界面活性剤はイオン型(カチオン性又はアニオン性)、双極性又は非イオン型であってよい。
界面活性剤は、アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤又はこれらの混合物であることが有利である。界面活性剤の分子量は150g/molと10,000g/molの間、有利には250g/molと1,500g/molの間に含まれる。
界面活性剤がアニオン性界面活性剤である場合、それは例えば、アルキルサルフェート、アルキルスルホネート、アルキルアリールスルホネート、アルカリアルキルホスフェート、ジアルキルスルホスクシネート、飽和脂肪酸又はそれ以外のアルカリ土類金属塩の中から選択される。これらの界面活性剤は、5、又は更に10を超える数の炭素原子、及び疎水性鎖の一端と結合したサルフェート、スルホネート又はカルボキシレート基等の少なくとも1個の親水性アニオン基を有する、少なくとも1個の疎水性炭化水素鎖を有することが有利である。
界面活性剤がカチオン性界面活性剤である場合、それは例えば、n-エチルドデシルアンモニウムクロリド又はブロミド、セチルアンモニウムクロリド又はブロミド(CTAB)のような、アルキルピリジウム又はアルキルアンモニウムのハロゲン化物塩の中から選択される。これらの界面活性剤は、5、又は更に10を超える数の炭素原子、及び第四級アンモニウムカチオン等の少なくとも1個の親水性カチオン基を有する、少なくとも1個の疎水性炭化水素鎖を有することが有利である。
界面活性剤が非イオン性界面活性剤である場合、それは例えば、脂肪族アルコール、脂肪酸のポリオキシエチレン及び/若しくはポリオキシプロピレン誘導体、又はアルキルフェノール、アリルフェノールから、或いはアルキルグルコシド、ポリソルベート、コカミドの中から選択される。
詳細には、界面活性剤は以下の一覧、アルキルサルフェート、アルキルスルホネート、アルキルアリールスルホネート、アルカリアルキルホスフェート、ジアルキルスルホスクシネート、飽和脂肪酸又はそれ以外のアルカリ土類金属塩、n-エチルドデシルアンモニウムクロリド又はブロミド、セチルアンモニウムクロリド又はブロミドのようなアルキルピリジウム又はアルキルアンモニウムのハロゲン化物塩、脂肪族アルコール、脂肪酸のポリオキシエチレン及び/又はポリオキシプロピレン誘導体、若しくはアルキルフェノールから、又はアリルフェノール、アルキルグルコシド、ポリソルベート、コカミド若しくはこれらの混合物の中から選択される。
より詳細には、第2の溶液中の界面活性剤の合計質量%は0.01質量%を超え、0.01質量%と0.5質量%の間に含まれることが有利である。
「多価イオンに反応性がある多価電解質」とは、本発明の意義では、例えばカルシウムイオン、バリウムイオン、マグネシウムイオンの中から選択されるアルカリ土類金属イオン等の多価イオンを含有するゲル溶液と接触した影響下で、水溶液中で液体状態からゲル状態に移行し得る多価電解質を意味する。
液体状態において、個々の多価電解質鎖は比較的ほぼ自由に互いに流動する。したがって2質量%の多価電解質の水溶液は、造形法の特徴的なせん断勾配で純粋に粘性の挙動を有する。せん断応力ゼロでのこの溶液の粘度は50mPa.sと10,000mPa.sの間、有利には3,000mPa.sと7,000mPa.sの間である。
液体状態での個々の多価電解質鎖は65,000g/molを超える分子量を有することが有利である。
ゲル状態において、個々の多価電解質鎖は、多価イオンと共に、液体コアを保持しその流動を妨げる凝集性三次元ネットワーク構造を形成する。個々の鎖は比較的互いに保持され、互いに比較的自由に流動することはできない。この状態で、形成されるゲルの粘度は無限である。更に、ゲルには流動応力閾値があり、この応力閾値は0.05Paを超える。ゲルはゼロではなく35kPaを超える弾性率も有する。
殻中に含有される多価電解質の三次元ゲルは水と界面活性剤を封入する。
多価電解質はヒトの身体に無害な生体適合性ポリマーであることが好ましい。例えばそれは生物学的に生成される。
それは、多糖、アクリレートベースの合成多価電解質(ポリアクリル酸ナトリウム、ポリアクリル酸リチウム、ポリアクリル酸カリウム又はポリアクリル酸アンモニウム、又はポリアクリルアミド)、スルホネートベースの合成多価電解質(例えばポリスチレンスルホン酸ナトリウム)の中から選択されることが有利である。より詳細には、多価電解質はアルギン酸ナトリウム若しくはアルギン酸カリウム等のアルカリ土類金属アルギン酸塩、ゲラン又はペクチンから選択される。
アルギン酸塩は<<海草>>の用語によって示され<<発光体>>と呼ばれる茶色い藻類から生成される。
このようなアルギン酸塩は、約50%を超える、好ましくは55%を超える、又は更に60%を超えるα-L-グルクロネート含量を有することが有利である。
詳細には、前記又は各多価電解質は、多価イオンに反応性がある多価電解質、特に多価イオンに反応性がある多糖、例えば、アルカリ性アルギン酸塩、ゲラン又はペクチン等、好ましくは50%を超える、特に55%を超えるブロックα-L-グルクロネート含量を有利に有するアルカリ性アルギン酸塩である。
より詳細には、第2の溶液中の多価電解質の質量%は5質量%未満であってよく、0.5質量%と3質量%の間に含まれることが有利である。
本発明の一態様によれば、カプセルは、液体コアの周囲を完全に被包する中間殻を更に含むことができ、前記中間殻自体はゲル状殻によって周囲を完全に被包されている。
この中間液体殻は、バッファー又は細胞培養培地、及び/又は粘着剤を含む中間体組成物で形成される。詳細には、粘着剤はPEG、デキストラン等の水溶性ポリマー、又は外殻中より希釈された溶液中のアルギン酸塩である。
中間殻はコア及び外殻と接触し、外殻との接触範囲外でコアを維持する。
中間相は、例えば外側相のゲル化を時期尚早に誘導し得るカルシウムを液体コアが含有する場合、中間相の形成中にカプセルを安定化するのに有用である。実際、その組成に応じて、細胞培養培地が重合に干渉する可能性がある。したがってそれは、ゲル化する外側相から液体コアを分離する可能性をもたらす。それは、まだ重合していない外側層のアルギン酸塩の小滴の形成中に、細胞含有液体コアを保護する可能性ももたらす。
特に、液体コアと中間相は両方共に液体なので、それらはやがて混ざり合いカプセルの液体コアを形成する。
このような中間殻の存在は科学文献「Formation of liquid-core capsules having a thin hydrogel membrane: liquid pearls」、Bremondら、Soft Matter、2010年、2484〜2488頁中に顕著に記載されている。
小滴の生成
前述した本発明による方法に従った小滴の生成は、WO2010/063937中に記載されたように、造血能がある細胞を含有する第1の液体溶液と、ゲル化し得る液体多価電解質及び少なくとも1個の界面活性剤を含有する第2の液体溶液とをジャケット内で別々に移動させることによって実施する。
中間殻が追加で存在する場合、別個の移動が三重殻において実施され、第3の溶液は中間溶液を含む。
二重(又は三重)殻の流出口において、所望カプセルの大きさに応じて、流体力学モデル、いわゆる<<滴下>>方式(一滴ずつ、WO2010/063937中に顕著に記載)、又はいわゆる<<ジェッティング>>方式(蛇行不安定性による、FR2012/2964017中に顕著に記載)に従い、異なる流れが接触し次いで多成分小滴を形成する。
第1の流れは液体コアを形成し、第2の流れは液体外殻を形成する。中間殻が存在する場合、第2の流れが液体中間殻を形成し、第3の流れが液体外殻を形成する。
生成方式に従い、それぞれの多成分小滴が二重(又は三重)殻から分離し、一定体積の空気に落下した後、本発明によるカプセルのゲル状外殻を形成するために、液体外殻の多価電解質をゲル化することができる試薬を含有するゲル溶液中に浸される。
特定の代替法によれば、多成分小滴は、外殻と液体コアの間に中間殻以外の追加層を含むことができる。このタイプの小滴は、多重殻を有するデバイス内で多数の組成物を別々に移動させることによって調製することができる。
ゲル化工程
多成分小滴がゲル溶液と接触したら、ゲル溶液中に存在する多価電解質をゲル化することができる試薬は、液体外殻中に存在する異なる多価電解質鎖と結合を形成し、次いでゲル状態に移行し、それによって液体外殻のゲル化を引き起こす。
特定の理論に拘束されることを意図するものではないが、ゲル状態の多価電解質への移行中、液体外殻中に存在する個々の多価電解質鎖は互いに結合して、ハイドロゲルとも呼ばれる架橋ネットワーク構造を形成する。
本明細書の範囲内で、ゲル状外殻中に存在する多価電解質はゲル状態であり、ゲル状態の多価電解質又は更にゲル状多価電解質とも呼ばれる。
コア又はコアと中間殻によって形成される構造を保持することができるゲル状外殻が、それによって形成される。このゲル状外殻は特異的機械強度を有する、すなわちそれは液体コアを保持することができ、中間殻が存在する場合、中間殻を完全に被包することができる。これは液体コア、及び必要な場合中間殻の内部構造を維持する効果がある。
本発明によるカプセルは、好ましくは30分を超えない、更により優先的には5分を超えない一定時間ゲル溶液中に留まり、その間に外殻は完全にゲル化する。
次に場合によってはゲル溶液を除去することが可能であり、次いでゲル状カプセルを場合によっては回収することができ、一般に水、詳細には生理食塩水から実質的になる洗浄水溶液に浸して、形成されたゲル状カプセルを洗浄することができる。この洗浄工程によって、第2の液体溶液中に当初含有されていた、過剰な可能性がある、ゲル溶液をゲル化し得る試薬、及び界面活性剤(又は他種)の全部又は一部をゲル状外殻から抽出することができる。
前に記載した方法によれば、第2の液体溶液中の界面活性剤の存在は、多成分小滴の形成及びゲル化を改善する可能性をもたらす。
ゲル状カプセルの特徴
カプセルは球状形であり、5mm未満、及び特に0.3mmと3mmの間に含まれる外径を有することが有利である。
本発明によるカプセルのゲル状外殻は、10μm〜500μm、好ましくは20μm〜200μm、及び有利には50μm〜100μmに含まれる厚さを有することが好ましい。
ゲル状外殻の繊細な厚さは一般に、この外殻を透明にする可能性をもたらす。
本発明によるカプセルは一般に、コアと中間及び外殻全体の間で2を超える、及び好ましくは50未満の体積比を有する。
詳細な実施形態によれば、本発明によるカプセルは一般に、コアと中間及び外殻全体の間で5と10の間に含まれる体積比を有する。
更に本発明は、脱核赤血球細胞、詳細には網状赤血球及び/又は赤血球をex vivoで生成するための、本発明の範囲内に記載する少なくとも1個のカプセルの使用に関する。
更に本発明は、脱核赤血球細胞を生成するためのex vivo法であって、脱核赤血球細胞の生成を可能にする条件下で、本発明の範囲内で定義する少なくとも1個のカプセル中に含有された、造血能がある細胞を培養する工程を含む方法に関する。
詳細には、本発明の方法によって生成される脱核赤血球細胞は網状赤血球及び/又は赤血球である。
詳細には、本発明の方法の範囲内で使用される造血能がある細胞は、造血幹細胞及び/又は赤血球前駆細胞及び/又は赤血球前駆体、より詳細にはヒト赤血球前駆体である。
したがって本発明の範囲内において、造血能がある細胞を
a)1μg/mlと50μg/mlの間に含まれる濃度のインスリン、
b)100μg/mlと2,000μg/mlの間に含まれる濃度のトランスフェリン、及び
c)1%と30%の間に含まれる濃度の血漿又は血清
を含む培養培地内で培養することができる。
「培養培地」とは、造血能がある細胞、詳細には造血幹細胞、赤血球前駆細胞及び赤血球前駆体、より詳細にはヒト赤血球前駆体の増殖をサポートすることができ、脱核赤血球細胞、詳細には網状赤血球及び/又は赤血球の生成を可能にする任意の培地、詳細には任意の液体培地を意味する。
本発明による培養培地のインスリンは詳細にはヒト組換えインスリンである。その濃度は、優先的には5μg/mlと20μg/mlの間、より優先的には8μg/mlと12μg/mlの間に含まれ、及び更により優先的には10μg/mlである。
本発明による培養培地のトランスフェリンは詳細にはヒトトランスフェリンである。より詳細には、トランスフェリンは鉄で飽和される。その濃度は、優先的には200μg/mlと1,000μg/mlの間、より優先的には300μg/mlと500μg/mlの間に含まれ、及び更により優先的には330μg/ml又は450μg/mlである。トランスフェリンは組換え型で存在してもよい。
本発明による培養培地の血漿又は血清は詳細にはヒト血漿又は血清である。それらの濃度は、優先的には1%と20%の間、より優先的には4%と12%の間に含まれ、及び更により優先的には5%又は10%である。
本発明の一態様によれば、培養培地は、詳細には0.5IU/mlと5IU/mlの間、優先的には1.5IU/mlと3.5IU/mlの間に含まれる、及び更により優先的には2IU/mlの濃度のヘパリンも含む。詳細には、培養培地が血漿を更に含む場合、本発明による培養培地はヘパリンを含む。
培養培地は、'EPO及び/又はSCF及び/又はIL-3及び/又はヒドロコルチゾンを更に含むことができる。
本発明による培養培地のEPO(エリスロポエチン)は詳細には組換えヒトEPOである。その濃度は優先的には0.5IU/mlと20IU/mlの間、より優先的には2.5IU/mlと3.5IU/mlの間に含まれ、及び更により優先的には3IU/mlである。
本発明による培養培地のSCF(幹細胞因子)は詳細には組換えヒトSCFである。その濃度は優先的には50ng/mlと200ng/mlの間、より優先的には80ng/mlと120ng/mlの間に含まれ、及び更により優先的には100ng/mlである。
本発明による培養培地のIL-3(インターロイキン3)は詳細には組換えヒトIL-3である。その濃度は優先的には1ng/mlと30ng/mlの間、より優先的には4ng/mlと6ng/mlの間に含まれ、及び更により優先的には5ng/mlである。
場合によっては培養培地に加えられるヒドロコルチゾンは、本発明によれば、優先的には5.10-7Mと5.10-6Mの間に含まれる、及びより優先的には5.10-6Mの濃度を有する。
本発明の一態様によれば、培養培地は以下の化合物：TPO、FLT3、BMP4、VEGF-A165及びIL-6の少なくとも1個を含むことができる。
本発明による培養培地のTPO(トロンボポエチン)は詳細には組換えヒトTPOである。その濃度は優先的には20ng/mlと200ng/mlの間、より優先的には80ng/mlと120ng/mlの間に含まれ、及び更により優先的には100ng/mlである。
本発明による培養培地のFLT3(FMS様チロシンキナーゼ3リガンド)は詳細には組換えヒトFLTである。その濃度は優先的には20ng/mlと200ng/mlの間、より優先的には80ng/mlと120ng/mlの間に含まれ、及び更により優先的には100ng/mlである。
本発明による培養培地のBMP4(骨形成タンパク質4)は詳細には組換えヒトBMP4である。その濃度は優先的には1ng/mlと20ng/mlの間、より優先的には8ng/mlと12ng/mlの間に含まれ、及び更により優先的には10ng/mlである。
本発明による培養培地のVEGF-A165(血管内皮増殖因子A165)は詳細には組換えヒトVEGF-A165である。その濃度は優先的には1ng/mlと20ng/mlの間、より優先的には4ng/mlと6ng/mlの間に含まれ、及び更により優先的には5ng/mlである。
本発明による培養培地のL'IL-6(インターロイキン6)は詳細には組換えヒトIL-6である。その濃度は優先的には1ng/mlと20ng/mlの間、より優先的には4ng/mlと6ng/mlの間に含まれ、及び更により優先的には5ng/mlである。
本発明の範囲内で、培養培地は基本培養培地を含み、後者は造血能がある細胞、詳細には造血幹細胞、赤血球前駆細胞及び/又は赤血球前駆体、より詳細にはヒト赤血球前駆体の増殖をサポートすることができ、脱核赤血球細胞、詳細には網状赤血球及び/又は赤血球の生成を可能にする特徴を有する。このタイプの基本培養培地は当業者によく知られている。例えば、グルタミン又はグルタミン含有ペプチドを補充したイスコフ改変ダルベッコ培地(IMDM)に言及することができる。
したがって、本発明による培養培地は、優先的には、グルタミン又はグルタミン含有ペプチドを補充したイスコフ改変ダルベッコ培地を更に含む。
詳細には、造血能がある細胞を、以下を含む培地内で培養する:
第1の工程、5〜9日間、詳細には7日間の間は、
- 8μg/mlと12μg/mlの間に含まれる濃度のインスリン、
- 300μg/mlと350μg/mlの間に含まれる濃度のトランスフェリン、
- 3%と7%の間に含まれる濃度の血漿、
- 1.5IU/mlと2.5IU/mlの間に含まれる濃度のヘパリン、
- 場合によっては5.10-7Mと5.10-6Mの間に含まれる濃度のヒドロコルチゾン、
- 80ng/mlと120ng/mlの間に含まれる濃度のSCF、
- 4ng/mlと6ng/mlの間に含まれる濃度のIL-3、及び
- 2.5IU/mlと3.5IU/mlの間に含まれる濃度のEPO
並びに次に第2の工程、0〜5日間、詳細には3〜4日間の間は、
- 8μg/mlと12μg/mlの間に含まれる濃度のインスリン、
- 300μg/mlと350μg/mlの間に含まれる濃度のトランスフェリン、
- 3%と7%の間に含まれる濃度の血漿、
- 1.5IU/mlと2.5IU/mlの間に含まれる濃度のヘパリン、
- 場合によっては5.10-7Mと5.10-6Mの間に含まれる濃度のヒドロコルチゾン、
- 80ng/mlと120ng/mlの間に含まれる濃度のSCF、及び
- 2.5IU/mlと3.5IU/mlの間に含まれる濃度のEPO
並びに第3の工程、6〜10日間、詳細には第1の工程の最初から最大18又は21日間の間は、
- 8μg/mlと12μg/mlの間に含まれる濃度のインスリン、
- 300μg/mlと350μg/mlの間に含まれる濃度のトランスフェリン、
- 3%と7%の間に含まれる濃度の血漿、
- 1.5IU/mlと2.5IU/mlの間に含まれる濃度のヘパリン、及び
- 2.5IU/mlと3.5IU/mlの間に含まれる濃度のEPO。
或いは、造血能がある細胞を、以下を含む培地内で培養する:
第1の工程、6〜8日間、詳細には7日間の間は、
- 8μg/mlと12μg/mlの間に含まれる濃度のインスリン、
- 300μg/mlと350μg/mlの間に含まれる濃度のトランスフェリン、
- 1%と7%の間に含まれる濃度の血漿、
- 1.5IU/mlと2.5IU/mlの間に含まれる濃度のヘパリン、
- 80ng/mlと120ng/mlの間に含まれる濃度のSCF、
- 5ng/mlと30ng/mlの間に含まれる濃度のIL-3、
- 80ng/mlと120ng/mlの間に含まれる濃度のTPO、及び
- 30ng/mlと60ng/mlの間に含まれる濃度のFLT3
並びに次に第2の工程、10〜16日間、詳細には14日間の間は、
- 8μg/mlと12μg/mlの間に含まれる濃度のインスリン、
- 300μg/mlと350μg/mlの間に含まれる濃度のトランスフェリン、
- 1%と7%の間に含まれる濃度の血漿、
- 1.5IU/mlと2.5IU/mlの間に含まれる濃度のヘパリン、
- 場合によっては5.10-7Mと5.10-6Mの間に含まれる濃度のヒドロコルチゾン、
- 80ng/mlと120ng/mlの間に含まれる濃度のSCF、
- 2.5IU/mlと3.5IU/mlの間に含まれる濃度のEPO、及び
- 4ng/mlと6ng/mlの間に含まれる濃度のIL-3
並びに第3の工程、6〜12日間、詳細には第1の工程の最初から最大28又は32日間の間は、
- 8μg/mlと12μg/mlの間に含まれる濃度のインスリン、
- 300μg/mlと350μg/mlの間に含まれる濃度のトランスフェリン、
- 1%と7%の間に含まれる濃度の血漿、
- 1.5IU/mlと2.5IU/mlの間に含まれる濃度のヘパリン、及び
- 2.5IU/mlと3.5IU/mlの間に含まれる濃度のEPO。
或いは、造血能がある細胞を、以下を含む培地内で培養する:
第1の工程、5〜25日間、詳細には20日間の間は、
- 8μg/mlと12μg/mlの間に含まれる濃度のインスリン、
- 425μg/mlと475μg/mlの間に含まれる濃度のトランスフェリン、
- 3%と7%の間に含まれる濃度の血漿、
- 1.5IU/mlと2.5IU/mlの間に含まれる濃度のヘパリン、
- 80ng/mlと120ng/mlの間に含まれる濃度のSCF、
- 80ng/mlと120ng/mlの間に含まれる濃度のTPO、
- 80ng/mlと120ng/mlの間に含まれる濃度のFLT3、
- 8ng/mlと12ng/mlの間に含まれる濃度のBPM4、
- 4ng/mlと6ng/mlの間に含まれる濃度のVEGF-A165、
- 4ng/mlと6ng/mlの間に含まれる濃度のIL-3、
- 4ng/mlと6ng/mlの間に含まれる濃度のIL-6、及び
- 2.5IU/mlと3.5IU/mlの間に含まれる濃度のEPO
並びに次に第2の工程、6〜10日間、詳細には8日間の間は、
- 8μg/mlと12μg/mlの間に含まれる濃度のインスリン、
- 425μg/mlと475μg/mlの間に含まれる濃度のトランスフェリン、
- 8%と12%の間に含まれる濃度の血漿、
- 2.5IU/mlと3.5IU/mlの間に含まれる濃度のヘパリン、
- 80ng/mlと120ng/mlの間に含まれる濃度のSCF、
- 4ng/mlと6ng/mlの間に含まれる濃度のIL-3、及び
- 2.5IU/mlと3.5IU/mlの間に含まれる濃度のEPO
並びに次に第3の工程、2〜4日間、詳細には3日間の間は、
- 8μg/mlと12μg/mlの間に含まれる濃度のインスリン、
- 425μg/mlと475μg/mlの間に含まれる濃度のトランスフェリン、
- 8%と12%の間に含まれる濃度の血漿、
- 2.5IU/mlと3.5IU/mlの間に含まれる濃度のヘパリン、
- 80ng/mlと120ng/mlの間に含まれる濃度のSCF、及び
- 2.5IU/mlと3.5IU/mlの間に含まれる濃度のEPO
並びに第4の工程、10〜16日間、詳細には13日間の間は、
- 8μg/mlと12μg/mlの間に含まれる濃度のインスリン、
- 425μg/mlと475μg/mlの間に含まれる濃度のトランスフェリン、
- 8%と12%の間に含まれる濃度の血漿、
- 2.5IU/mlと3.5IU/mlの間に含まれる濃度のヘパリン、及び
- 2.5IU/mlと3.5IU/mlの間に含まれる濃度のEPO。
本発明の範囲内で、細胞は第0日、すなわちあまり分化が進んでいない段階、例えば造血幹細胞の段階で被包することが好ましいが、後の段階、すなわち赤血球前駆細胞又は赤血球前駆体の段階で被包することもできる。
したがって、造血能がある少なくとも1個の細胞を含む本発明によるカプセルは、排他的に、造血幹細胞のような分化が非常に進んでいるわけではない細胞、赤血球前駆細胞、赤血球前駆体等のより進んだ分化段階の細胞のみ、又は造血能が異なる分化段階にある細胞の混合物を含むことができる。
本発明を、本発明の範囲を制限しない以下の図面と実施例によって更に詳細に例示する。
カプセルの調製の原理の図である。 三重殻構造を例示し、(造血能がある少なくとも1個の細胞を含む)コアを形成する流体が垂直方向矢印によって示される中心殻中に導入され、一方中間流体は三重殻構造の左側に位置する矢印によって示される中間殻中に導入され、外殻中の殻の流体は三重殻構造の右側に位置する矢印によって示される。 このようにして形成されたカプセルはゲル化浴に落下する。 インジェクターの斜視図である。 インジェクターの断面図である。 インジェクターは三箇所の引入口を含み、第1の引入口は中間流体の入口に対応する断面図の左側に位置し、第1の引入口に対応する第2の引入口は、対応する断面図の上部の、コア流体の入り口に位置し、第2の引入口に対応する第3の引入口は、対応する断面図の上部の、殻の流体の入り口に位置する。 細胞の被包化の図である。
造血能がある被包化細胞の培養
細胞の調製
細胞CD34+を、(純度94±3%を超える)Mini-MACSカラム(Miltenyi Biotech社、Bergisch Glodbach、ドイツ)を使用することにより、超磁性マイクロビーズを用いた選択によって胎盤血から単離する。
2mMのL-グルタミン(Invitrogen社、Cergy-Pontoise、フランス)、330μg/mlの鉄飽和型ヒトトランスフェリン、10μg/mlのインスリン(Sigma社、Saint-Quentin Fallavier、フランス)、2IU/mlのヘパリンChoay(Sanofi社、フランス)、及び5%の血漿(溶媒/洗浄剤ウイルス不活化血漿(S/D))を補充したIMDM培地(イスコフ改変ダルベッコ培地、Biochrom社、ドイツ)内で細胞を培養し、1ml当たり104個のCD34+細胞を、(Amgen社、Thousand Oaks、CAによって提供された)100ng/mlのSCF、5ng/mlのIL-3(R and D Systems社、Abingdon、英国)、及び3IU/mlのEPO(Janssen Cilag社、lssy-les-Moulineaux、フランスによって提供されたEprex)の存在下で培養する。第4日に、1体積の細胞培養物を、SCF、IL-3及びEPOを含有する4体積の新たな培地に希釈する。培養物は空気中5%のCO2で37℃において維持する。第8日に、細胞を計数し、それらの濃度を被包化培地(IMDM、ヘパリン、血漿、インスリン、トランスフェリン、EPO、SCF及びIL-3)において調節し所望の濃度を得る。
細胞は第8日に被包化する。
細胞を被包化するための手順
カプセル形成の一般原理を図1中に示す。
被包化手順前日に、以下の要素を調製した。
1リットルの1%CaCl2を、ゲル化浴中で使用するため0.2μmのフィルターで濾過した。2リットルの生理食塩水(生理食塩水NaCl0.9%)を調製し、これを、装備、すなわち被包化デバイスを形成するインジェクター、チューブ、シリンジ及びコネクター、並びにカプセルの洗浄用に使用する。1リットルのmilliQ水も装備を水面下に配置するため調製する。最後に、2%アルギン酸塩及びSDS0.5mMの30ml溶液を調製する。以下の要素、クリスタライザー、(カプセルを回収しそれらを洗浄するための)150mlビーカー10個、クランプ、マイクロ流体コネクター(チューブ径1/16インチ用)、テフロン(登録商標)チューブ(径1/16インチ、60cm)をオートクレーブで処理した。
翌日、被包化デバイスを以下の操作手順に従い取り付ける。設定に従い、70%のEtOHで洗浄し次にmilliQ水で濾過する(インジェクターXII、図2及び図3参照)。それは、内径が0.78mmであり外径が1mmであるキャピラリー、及び1つは攪拌される5mlの内側相、他の2つは10mlの他の2相用の3シリンジSGE(VWR)を含む。装備は水面下に取り付けて気泡の存在を排除し、次いで10%PBS/FCS(ウシ胎児血清)を充填し、1時間放置して後にチューブ又はインジェクターの壁に細胞が接着するのを回避する。次いでそれを生理食塩水で洗浄する。IMDM(イスコフ改変ダルベッコ培地)、ヘパリン及び血漿を含有する培養培地で内側相の回路を洗浄しながら、中間相の回路をIMDMで洗浄する。最終的な構成は、殻については2%アルギン酸塩溶液、中間相についてはIMDM、並びに内側相についてはIMDM、ヘパリン、血漿、インスリン、トランスフェリン、EPO、SCF及びIL-3を含有する完全培養培地中に1.25.105細胞/ml〜2.5.105細胞/mlを含む細胞懸濁液で構成する。被包化は図4中に示すように一滴ずつの被包化法(滴下)によって達成する。異なる内側-中間-殻相に使用した流量はそれぞれ5、1及び3ml/時間である。カプセルの形成時間は4.9秒である。このようにして得たカプセルは1.6mmの直径を有する。これらは、カルシウムの存在下でゲル化する外側相、その形成中にカプセルを安定化させる目的がある中間相、及び細胞を含有する内側相からなる。
次いでゲル化工程を、塩化カルシウム及び10%で滴下したTween20(登録商標)の溶液を含有するゲル化浴で実施する。
20〜30個のカプセルをゲル化浴中に浸す。細胞を含有するこれらのカプセルは浴中に5分を超えて留めてはならない。
次いでカルシウム溶液を除去しカプセルを滴下させ、3×30mlの生理食塩水でカプセルを洗浄する。次いで生理食塩水を、カプセルを10mlの培養培地中に再懸濁しながら、除去する。次いで全体を25cm2の培養フラスコ内に移す。カプセルを適切に浸すため、フラスコは垂直に保つ。
次いで細胞を、第19日までEPOの存在下において新たな培地中で培養する。培養物は空気中5%のCO2で37℃において維持する。
結果
結果は以下のTable 1(表1)中に示す。
Figure 2016539652
被包化細胞は赤色を有し、それによってヘモグロビンの存在を露呈する。
カプセルを溶解しMay-GrunwaldGiemsa染色した後、被包化細胞を観察する。
有糸分裂細胞、及び非常に少数のアポトーシス細胞及び非常に少数の空砲細胞の存在を観察する。
三週間の培養後カプセル内で細胞の体積分率2%、及び静止培養において測定した生存率と等しい生存率を得る。
したがって、本発明による造血能がある細胞を含有するカプセルは、造血能がある細胞の大規模な細胞培養への適用を、初めて想定する可能性をもたらす。

Claims (17)

  1. 液体コア、液体コアの周囲を完全に被包するゲル状殻を含むカプセルであって、カプセルを気体に曝した場合にゲル状殻が液体コアを保持することができ、ゲル状殻が少なくとも1個のゲル状多価電解質及び少なくとも1個の界面活性剤を含み、造血能がある少なくとも1個の細胞を液体コアが含むことを特徴とするカプセル。
  2. a)造血能がある少なくとも1個の細胞を含有する第1の生理的に許容される液体溶液と、ゲル化し得る液体多価電解質を含有する第2の液体溶液とをジャケット内で別々に移動させる工程、
    b)ジャケットの流出口において一連の小滴を形成する工程であって、それぞれの小滴が前記第1の溶液で形成される中心コアと、前記第2の溶液で形成され中心コアを完全に覆う周縁フィルムとを含む、工程、
    c)フィルムの多価電解質と反応可能な試薬を含有するゲル溶液中にそれぞれの小滴を浸して、小滴を液体状態からゲル状態に移行させゲル状殻を形成させ、中心コアが液体コアを形成する、工程、
    d)形成されたカプセルを回収する工程
    を含む方法であって、第2の溶液が第1の溶液との接触前に少なくとも1個の界面活性剤を含有する、方法を適用することによって得られることを特徴とする、請求項1に記載のカプセル。
  3. ジャケットの流出口における第1の溶液の流量の第2の溶液の流量に対する比が1と200の間、有利には10と200の間に含まれ、形成されたカプセルの回収後、ゲル状殻が、カプセル直径の0.1%と10%の間、有利には0.1%と2%の間に含まれる厚さを有することを特徴とする、請求項2に記載のカプセル。
  4. ジャケット内での同時押出によって形成された小滴が、一定体積の空気中を通ってゲル溶液中に自由落下することを特徴とする、請求項2又は3のいずれか一項に記載のカプセル。
  5. 第1の生理的に許容される液体溶液が、生理食塩水溶液、バッファー溶液、生理的に許容される粘性溶液、生理的に許容される賦形剤、有利には増粘剤又はレオロジー調節剤、及び/又は幾つかの培養培地を含むことを特徴とする、請求項2から4のいずれか一項に記載のカプセル。
  6. 液体コアの周囲を完全に被包する中間殻を更に含み、前記中間殻自体がゲル状殻によって周囲を完全に被包されていることを特徴とする、請求項1から5のいずれか一項に記載のカプセル。
  7. 前記造血能がある少なくとも1個の細胞が造血幹細胞及び/又は赤血球前駆細胞及び/又は赤血球前駆体であることを特徴とする、請求項1から6のいずれか一項に記載のカプセル。
  8. 前記造血能がある少なくとも1個の細胞又は造血幹細胞又は赤血球前駆細胞又は赤血球前駆体がヒト細胞又は前駆体であることを特徴とする、請求項1から7のいずれか一項に記載のカプセル。
  9. 脱核赤血球細胞をex vivoで生成するための、請求項1から8のいずれか一項に記載の少なくとも1個のカプセルの使用。
  10. 脱核赤血球細胞が網状赤血球及び/又は赤血球であることを特徴とする、請求項9に記載の使用。
  11. 脱核赤血球細胞を生成するためのex vivo法であって、脱核赤血球細胞の生成を可能にする条件下で、請求項1から8のいずれか一項に定義された少なくとも1個のカプセル中に含有された、造血能がある細胞を培養する工程を含む方法。
  12. 造血能がある細胞を
    e)1μg/mlと50μg/mlの間に含まれる濃度のインスリン、
    f)100μg/mlと2,000μg/mlの間に含まれる濃度のトランスフェリン、及び
    g)1%と30%の間に含まれる濃度の血漿又は血清
    を含む培養培地内で培養することを特徴とする、請求項11に記載の方法。
  13. 培養培地がEPO及び/又はSCF及び/又はIL-3及び/又はヒドロコルチゾンを更に含むことを特徴とする、請求項12に記載の方法。
  14. 培養培地が以下の化合物：TPO、FLT3、BMP4、VEGF-A165及びIL-6の少なくとも1種を更に含むことを特徴とする、請求項12又は13のいずれか一項に記載の方法。
  15. 培養培地がグルタミン又はグルタミン含有ペプチドを補充したイスコフ改変ダルベッコ培地を更に含むことを特徴とする、請求項12から14のいずれか一項に記載の方法。
  16. 脱核赤血球細胞が網状赤血球及び/又は赤血球であることを特徴とする、請求項11から15のいずれか一項に記載の方法。
  17. 造血能がある細胞が造血幹細胞及び/又は赤血球前駆細胞及び/又は赤血球前駆体であることを特徴とする、請求項11から16のいずれか一項に記載の方法。
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