JP2020508700A

JP2020508700A - 細胞を培養し、試験するための微粒子

Info

Publication number: JP2020508700A
Application number: JP2019568813A
Authority: JP
Inventors: ディルクレッフェルト; アレクサンデルダジコヴィッチ; トーマスデュボワ
Original assignee: ビオミレニアソシエテパアクシオンスシンプリフィエ
Priority date: 2017-03-03
Filing date: 2018-03-02
Publication date: 2020-03-26
Also published as: US20200003770A1; WO2018158450A1; EP3589741A1; US11448645B2

Abstract

微粒子中で組み合わせられる、少なくとも２つの培養空間を含む、培養及び／又は試験システムであって、球状に形作られた微粒子が、（ｉ）前記球状に形作られた微粒子の中心のコア中の第１の培養空間、（ｉｉ）前記微粒子のコアを取り囲む壁中の第２の培養空間を含み、（ｉｉｉ）コアを取り囲む壁が、分子、たとえば塩、栄養素、ペプチド、化学物質、及び他の化合物の交換を可能にして、第１の培養空間中の細胞が第２の培養空間中の細胞と相互作用し、その逆も同様である、培養及び／又は試験システム。試験システムにおいて、細胞は、共培養され、次いで、微粒子は、第１又は第２の培養空間における細胞の表現型に基づいて選択される。

Description

本発明は、細胞の、特に株の開発の分野におけるものである。本発明は、真核細胞又は特定の細菌株の存在下において共培養にかけられた後の細菌細胞の選択に関する。本出願は、細胞培養物分析の分野におけるものである。より正確には、単又は多細胞レベルでの細胞培養物分析の分野におけるものである。本出願はまた、表現型のソートによる細胞のマイクロフルイディクス及び／又はＦＡＣＳ分析の分野におけるものでもある。

マイクロバイオームは、他の生物と共生して生きているマイクロバイオームを含め、非常に多様で極限の環境におけるあらゆる生態的地位に生息する。これらのマイクロバイオームは、限定されないが、抗生物質の摂取、栄養の種類、又はいわゆる腸内毒素症に至り得る病原性微生物の抵抗不可能な成長などのような外因子によって影響を与えられ得る。腸内毒素症（細菌異常増殖症とも呼ばれる）は、微生物叢障害などのように、身体の表面の又は身体の内部の微生物のアンバランス又は不適応に関する用語である。たとえば、皮膚細菌叢、消化管細菌叢、又は膣細菌叢などのようなヒトの微生物叢の一部は、通常優位に立っている種が少数になり、通常競争に負ける又は抑制される種が増加し、隙間を満たすと、混乱し得る。

腸内毒素症は、特に小腸の細菌異常増殖又は小腸の真菌異常増殖の間の胃腸管における状態として最もよく報告される。身体の表面に又は身体の中で見つけられる典型的な微生物コロニーは、通常、良性である又は有益である。これらの有益で、適切なサイズの微生物コロニーは、消化の支援又は病原微生物の侵入から身体を保護することへの寄与などのような一連の役立つ、必要な機能を実行する。これらの有益な微生物コロニーは、空間及び資源について互いに競い合い、１０：１の倍率でヒト細胞より数が多い。

多くの科学的研究は、とりわけ、消化管又は皮膚若しくは膣などのような他の身体環境に存在するある微生物の、健康に対する有益な効果を報告した。他の微生物は、発酵食品、特に乳製品に存在することが示された。これらの微生物は、一般に、「プロバイオティクス」と呼ばれる（ＦＡＯ／ＷＨＯｒｅｐｏｒｔｏｎｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｈｅａｌｔｈａｎｄｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓｉｎｆｏｏｄ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｐｏｗｄｅｒｍｉｌｋｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｌｉｖｅｌａｃｔｉｃａｃｉｄｂａｃｔｅｒｉａ；Ｃｏｒｄｏｂａ，Ａｒｇｅｎｔｉｎａ；Ｏｃｔ．１−４，２００１）。

今まで、天然のサンプル中に含有される非常に多様性の微生物から有望で有益な微生物を単離し、試験することは本来、困難であった。現在、多くの細菌株及び他の細菌株、マイクロバイオーム、又は哺乳動物細胞とのそれらの相互作用について詳しく調べるための方法が存在していないので、既に単離されている細菌株の効果の試験さえ困難である。現在に至るまで、試験は、主として、より大きな発酵装置、マイクロタイタープレートベースの試験、又はより小さなもの、たとえば、限られた数のサンプルしか同時に試験することができないチャンバーを有するマイクロ流体デバイスに限られている。

同時に試験される複数のマイクロタイタープレートを越えるハイスループット法は存在しない。微生物の培養においてハイスループットに至るより進歩した手段は、液滴ベースのマイクロフルイディクス又はミリフルイディクス（ｍｉｌｌｉｆｌｕｉｄｉｃｓ）で実現することができる。しかしながら、細胞が別々の液滴中にカプセル化されるので、細胞は、生理学的接触を続けることができず、そのため、微生物株及びセレクター細胞の間の生理学的相互作用の結果に基づいて選択することができない。微生物細胞及びセレクター細胞の両方を一つの液滴の中に組み入れることは、所望の有益な効果を促進しないかもしれず、それどころか、競合的な状態を続けるかもしれず、適切な選択条件を提供することができない。特定の好ましい１つの選択条件は、たとえば消化管中に存在しているように、微生物細胞を嫌気性成長環境に閉じ込めることであるかもしれない。両方を組み入れると、酸素を必要とする哺乳動物細胞及び嫌気的条件でむしろ成長するであろう細菌細胞は、液滴中に物理的に同じ場所に置かれた場合、活性化することができない。

本発明は、限定されないが、プロバイオティック効果及びそのような細菌株の続く単離などのような、特定の有益な効果についての試験及び／又はスクリーニングのために、微生物株又は哺乳動物細胞株などのような他のセレクター細胞モデルの、多くの微生物株又はさらにマイクロバイオームサンプルとの共培養を可能にするウルトラハイスループット法を提供する。ウルトラハイスループット法は、理論的に限界がなく、１０⁹まで及びそれ以上の微生物株の選択を並列して実現することができるので、この処理能力は、前例がないものである。

本発明の第１の態様は、微粒子中で組み合わせられる、少なくとも２つの培養空間を含む、培養及び／又は試験システムであって、球状に形作られた微粒子が、
ｉ）前記球状に形作られた微粒子の中心のコア中の第１の培養空間、
ｉｉ）前記微粒子のコアを取り囲む壁中の第２の培養空間を含み、
コアを取り囲む壁が分子、たとえば塩、栄養素、ペプチド、化学物質、及び他の化合物の交換を可能にして、第１の培養空間中の細胞が第２の培養空間中の細胞と相互作用し、その逆も同様であり
第１の培養空間が細菌細胞を含有し、第２の培養空間が真核細胞を含有するか、その逆である、培養及び／又は試験システムに関する。

第２の態様によれば、本発明は、上記に記載される微粒子システム中で一緒に細菌細胞及び真核細胞を共培養する及び／又は試験するための方法であって、
ｉ）前記微粒子システム中で前記細菌細胞及び真核細胞を共培養するステップ、
ｉｉ）２つの空間の間の化合物拡散によって相互作用するための時間を共培養された細胞に与えるステップ、
ｉｉｉ）１つ以上の微粒子中に存在する細胞の１つ以上のグループの表現型に基づいて前記微粒子をソートするステップであって、表現型がプロバイオティック表現型を含むステップ、を含む方法にさらに関する。

本発明の第３の態様は、微粒子中で組み合わせられる、少なくとも２つの培養空間を含む、培養及び／又は試験システムであって、球状に形作られた微粒子が、
ｉ）前記球状に形作られた微粒子の中心のコア中の第１の培養空間、
ｉｉ）前記微粒子のコアを取り囲む壁中の第２の培養空間を含み、
コアを取り囲む壁が、分子、たとえば塩、栄養素、ペプチド、化学物質、及び他の化合物の交換を可能にして、前記微粒子の培養空間の間の相互作用を可能にし、
第１の及び／又は第２の培養空間は、細菌細胞、真核細胞、及び／又はプレバイオティック物質を含有する、培養及び／又は試験システムに関する。

第４の態様によれば、本発明はまた、微粒子中で組み合わせられる、少なくとも２つの培養空間を含む、培養及び／又は試験システムであって、球状に形作られた微粒子が、
ｉ）前記球状に形作られた微粒子の中心のコア中の第１の培養空間、
ｉｉ）前記微粒子のコアを取り囲む壁中の第２の培養空間を含み、
コアを取り囲む壁が分子、たとえば塩、栄養素、ペプチド、化学物質、及び他の化合物の交換を可能にして、前記微粒子の培養空間の間の相互作用を可能にし、
第１の培養空間が細菌細胞及び／又は真核細胞を含有し、第２の培養空間が細胞を含有しないか、又はその逆である、培養及び／又は試験システムにも関する。

図１は、本発明による方法の１つの好ましい実施形態を示す図である。図２は、本発明による方法の分析ワークフローを示す図である。

本発明及びその様々な実施形態は、この部においてさらに詳細に開示される。

本明細書において開示される本発明の第１の態様は、微粒子中で組み合わせられる、少なくとも２つの培養空間を含む、培養及び／又は試験システムであって、球状に形作られた微粒子が、
ｉ）前記球状に形作られた微粒子の中心のコア中の第１の培養空間、
ｉｉ）前記微粒子のコアを取り囲む壁中の第２の培養空間を含み、
コアを取り囲む壁が、分子、たとえば塩、栄養素、ペプチド、化学物質、及び他の化合物の交換を可能にして、第１の培養空間中の細胞が第２の培養空間中の細胞と相互作用し、その逆も同様であり、
第１の培養空間が細菌細胞を含有し、第２の培養空間が真核細胞を含有するか、又はその逆である、培養及び／又は試験システムに関する。

細菌細胞、真核細胞、ウイルス粒子、及び真菌細胞などのような様々なタイプの細胞を、微粒子中で培養することができる。しかしながら、本発明は、細菌細胞及び真核細胞の共培養又は他の特定の細菌株と細菌細胞の共培養に関する。本発明は、標的病原菌に対して特異的な抗菌剤を試験すること及び所望の成果を得るために試験株と相乗的に働くことができる細菌株を検出することに用途を見出せるので、その使用は多目的である。

本発明の第１の態様の好ましい実施形態では、培養空間の１つにおける細菌細胞が結腸細菌であり、さらなる培養空間の１つにおける真核細胞が結腸上皮細胞である。

本発明によるシステムにおける結腸細菌などのような消化管中に典型的に存在する微生物株及び結腸上皮細胞の共培養が特に好ましいシステムである。これは、本発明者らが、驚いたことに、これを人工消化管システムとして使用し、結腸上皮細胞に対する特定の結腸細菌株の効果についてスクリーニングする又は試験するのを可能にすることができることを見つけたためである。それによって、結腸細菌のプロバイオティック効果などのような効果を、同定することができる。

本発明では、少なくとも２つの培養空間が、天然の消化管微小環境を模倣する微粒子によって示される、定められた空間において組み合わせられる。本明細書において使用されるように、用語「組み合わせられる」は、微粒子内の個々の培養空間の空間的な構成を指す。

本発明の第１の態様によれば、第１の培養空間は、球状に形作られた微粒子の中心のコアに位置する。第２の（又はさらなる）培養空間は、第１の培養空間を取り囲む。微粒子内の２つ以上の培養空間は、生体適合性多孔性ポリマーマトリックスから作製された壁によって互いに相互作用し、それによって、分子の交換を可能にしてもよい。本発明では、異なる培養空間の間に相互作用がある。これは、細胞の成長に適した化合物を交換することによって連絡するための少なくとも２つの培養空間の能力を指す。そのため、壁は、ただ、微粒子内の培養空間を空間的に定めているにすぎないことが意図される。

本発明では、細胞の間で交換される分子は、細胞が連絡し、環境に対して応答することを可能にするものであることが意図される。

交換は、アミノ酸、ペプチド、炭水化物、ビタミン、及びミネラルを含む群から選択される化合物の通過を可能にする分離壁を通して行われる。

培養空間を含む微粒子は、球状に形作られる。本明細書において使用されるように、用語「球状の形作られた」は、微粒子が球状の、楕円形の形態，又はその他同種の形態をした微粒子を指してもよい。本発明では、球状の形態は、少なくとも２つの理由で有利であるかもしれないので、好ましい：ｉ）球状の形態は、第１の培養空間のまわりに第２の（又はさらなる）培養空間が均一に且つ均質に分布するのに好都合であるかもしれない；ｉｉ）球状の形態は、微生物株が微粒子の定められたコンパートメント（培養空間）中に集中するので、関心のある微生物株を正確に選択する確率を最大にする。

本発明の一実施形態では、上記に記載される微粒子システム中で一緒に細菌細胞及び真核細胞を共培養する及び／又は試験するための方法は、結腸細菌及び結腸上皮細胞を共培養する及び／又は試験するために使用される。

第２の態様によれば、本発明は、上記に記載される微粒子システム中で一緒に細菌細胞及び真核細胞を共培養する及び／又は試験するための方法であって、
ｉ）前記微粒子システム中で前記細菌細胞及び真核細胞を共培養するステップ、
ｉｉ）２つの空間の間の化合物拡散によって相互作用するための時間を共培養された細胞に与えるステップ、
ｉｉｉ）１つ以上の微粒子中に存在する細胞の１つ以上のグループの表現型に基づいて前記微粒子をソートするステップであって、表現型は、プロバイオティック表現型を含むステップ、を含む方法にさらに関する。

本明細書において使用されるように、用語「微粒子システム」は、１つ以上の培養空間を含む本発明の第１の態様による微粒子を指す。

共培養ステップ（ｉｉ）の時間は、細菌株の成長応答及び検出されることになっている関心のある化合物の産生によって変動し得る。本発明では、共培養時間は、１５分〜数日の範囲に及ぶ。

本明細書において使用されるように、用語「プロバイオティック表現型」は、第２の微生物に有益な効果を提供する第１の微生物由来の発現形質を指す。本発明では、用語「プロバイオティック表現型」及び「プロバイオティック効果」は、区別なく使用することができる。

本発明の一実施形態では、細胞の１つ以上のグループのプロバイオティック表現型は、共培養された真核細胞に対する細菌細胞のプロバイオティック効果の検出によって決定され、逆もまた同じである。

別の実施形態によれば、プロバイオティック効果は、抗菌効果、抗真菌効果、成長の促進、免疫調節性の効果、及び神経学的な調節性の効果を含む群から選択される。プロバイオティック効果はまた、調節性の効果を指してもよく、これは、たとえば、ある細菌種の抵抗不可能な成長の後に、たとえば腸内毒素症の間に、バランスのとれた細菌集団を再建することによって、腸内毒素症の状態を改善する。

腸内毒素症は、歯周病、炎症性腸疾患、慢性疲労症候群、肥満、癌、細菌性膣症、及び大腸炎などのような病気に関連し得る多因子障害である。腸内毒素症は、特に小腸の細菌及び／又は真菌異常増殖により、胃腸管におけるミクロフローラがアンバランスな状態として定義される。

別の実施形態によれば、本発明による微粒子は、プレバイオティック物質を含有することができる。プレバイオティック物質は、細菌細胞などのような微生物の成長又は活性を誘発し、それによってそれらの宿主の健康に寄与する物質である。この現象は、たとえば、胃腸管又は皮膚において生じ、プレバイオティクスは、それぞれ消化管マイクロバイオーム又は皮膚マイクロバイオームにおける生物体の組成に影響を与えることができる。

プレバイオティック物質は、細菌及び／又は真核細胞に対してプレバイオティック効果を有する物質である。本発明では、プレバイオティック効果は、細菌及び／又は真菌株の成長の促進を指し、それによって、バランスのとれたマイクロバイオームを促進する。プレバイオティック物質は、たとえばトランス−ガラクトオリゴ糖及びイヌリンである。他の食物繊維もまた、カラマツアラビノガラクタン、レジスタントスターチ、ペクチン、ベータグルカン、及びキシロオリゴ糖などのように、プレバイオティクスの定義の範囲内にあるが、さらに、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ヌクレオチド、及び脂質などのような他の分子を含んでいてもよい。

別の実施形態によれば、プレバイオティック物質は、オリゴ糖、多糖、繊維、トランス−ガラクトオリゴ糖、イヌリン、又は細菌細胞及び／若しくは真核細胞に対してプレバイオティック効果を有する任意の他の物質を含む群から選択される。

本発明の一実施形態では、微粒子中の細菌細胞は、微粒子内の第２のさらなる培養空間中に含有されるプレバイオティック物質の存在に対するそれらの表現型の反応によって選択され、逆もまた同じである。別の実施形態では、細菌細胞は、プレバイオティック物質を産生してもよい又はプレバイオティック物質の供給源であってもよい。

さらなる実施形態では、細菌細胞は、表現型的可塑性を示してもよい。本発明では、用語「表現型的可塑性」は、生物体が環境における変化に応じてその表現型を変化させる能力を指す。表現型的可塑性は、永久的であっても、永久的でなくてもよく、それは、形態学的及び／又は生理学的変化を包含する。

本明細書において開示される方法はまた、少なくとも１つ又は複数の細菌株の、別の細菌株に対する、別の細菌株が自然界に存在するとおりのプロバイオティック効果の分析にも適している。

本発明の別の実施形態によれば、限定されないが哺乳動物細胞などのような真核細胞に対する、糞便マイクロバイオームサンプル、消化管マイクロバイオームサンプル、膣マイクロバイオームサンプル、土壌マイクロバイオームサンプル、及び皮膚マイクロバイオームサンプルを含むが、これらに限定されない天然のサンプルから単離された少なくとも１つの又は複数の細菌株のプロバイオティック効果は、分析される。

別の実施形態によれば、１つの微粒子中で共培養された細胞のプロバイオティック効果は、細胞増殖アッセイ、免疫調節性のアッセイ、サイトカイン、インターロイキン、ロイコトリエン、ホルモン、ヒスタミン、一酸化窒素、神経伝達物質を測定するためのアッセイによって決定される。

一実施形態によれば、１つの微粒子中で共培養された細胞のプロバイオティック効果はまた、これらに限定されないが、サイトカイン、インターロイキン、ロイコトリエン、ホルモン、ヒスタミン、一酸化窒素、神経伝達物質、ムロペプチド、オリゴ糖、テイコ酸、リポテイコ酸、揮発性脂肪酸、リポタンパク質などのような特定の物質の検出によって達成することもできる。

本発明の好ましい実施形態では、逆もまた同じであるが、真核細胞に対する共培養された細菌細胞のプロバイオティック効果は、分析される。さらに好ましい実施形態では、真核細胞に対する共培養された細菌細胞のプロバイオティック効果は、分析される。最も好ましくは、結腸上皮細胞に対する共培養された結腸細菌のプロバイオティック効果は、分析される。

本発明の別の実施形態では、微粒子内の一方の培養空間中の細菌細胞の、第２の又はさらなる培養空間中の真核細胞に対するプロバイオティック効果は、分析される。

本発明の一実施形態では、プロバイオティック特性を有する細菌細胞が検出される微粒子は、選択され、単離することができる。ソートの間に実現される選択及び単離は、これらに限定されないが、マイクロフルイディクス、ミリフルイディクス、及びＦＡＣＳなどのようなウルトラハイスループットフローシステムによって実行することができる。

本発明による単離方法は、１０⁹までの細胞及び少なくとも１００の細胞を同時にソートすることを可能にする。これは、当技術分野において知られている従来のスクリーニング方法にまさる本発明の方法の高処理能力（ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔａｂｉｌｉｔｙ）の点から注目すべき利点に相当するであろう。

さらに、本発明によれば、第１の培養空間は、少なくとも１００００００の細胞、より好ましくは１０００の細胞、さらにより好ましくは１００の細胞、さらにより好ましくは１０の細胞を含有し、最も好ましくは細胞を含有しない。第２の培養空間は、０〜２５０００の細胞、より好ましくは１０の細胞、さらにより好ましくは５０の細胞、さらにより好ましくは５００の細胞、最も好ましくは１０００の細胞を含有する。

別の実施形態によれば、微粒子中で共培養された細菌細胞及び真核細胞の間の相互作用を可能にするために、これは、ソートされる前に、少なくとも１２時間、好ましくは２４時間、さらにより好ましくは７２時間、及び／又は２週間まで、培養されるべきである。

微粒子は、これらに限定されないが、ＤＭＥＭ及びＲＰＭＩなどのような一般的な細胞培養培地において培養することができる。本発明の一実施形態では、微粒子は、希釈土壌サンプル、希釈された糞便、及び膣、鼻咽腔、鼻腔、皮膚由来の微生物分離株又は他の天然のサンプルを含む群から選択される混合物中で培養される。

一実施形態によれば、本発明による微粒子は、磁気ビーズを含むことができる。微粒子中の磁気ビーズの存在は、所望の培地中での培養の後に微粒子の精製を簡単にする。

本発明による微粒子は、内側の水性液相及びゲル相中の外側のポリマーマトリックスから好ましくは作製される。

さらに、本発明の一実施形態では、微粒子は、２つの培養空間を有し、第２の培養空間は、コア近くの内壁及び外壁を有する。

本発明によれば、第２の培養空間は、コア近くの内壁及び外壁の間にスポンジ様の構造を有する。別の実施形態では、第１の培養空間は、第２の培養空間の内壁の内側にスポンジ様の構造を有する。さらに、微粒子の壁は、アルギナート、アガロース、ポリアクリルアミド、キトサン、及びセルロースの群から選択される物質を含む。

本発明による微粒子の培養空間は、特定の直径を有し、これは、所望の利用に従って調整することができる。本発明の一実施形態では、第１の培養空間は、２０μｍ〜１ｃｍの、より好ましくは５００μｍ、さらにより好ましくは２５０μｍ、さらにより好ましくは１５０μｍ、最も好ましくは２０μｍの直径を有する。

微粒子の寸法は、方法の高処理能力と逆相関しているとおり、いくつかの技術的な効果を提供する。特に、化合物の濃度は容量が小さいほど高いので、微粒子の直径が小さいほど、生理学的効果を測定する際の本発明の方法の能力は高速になる。

さらに、第２の空間の外壁の厚さが、定められる。直径は、５００μｍ〜１０μｍ、より好ましくは２５０μｍ、さらにより好ましくは２００μｍ、さらにより好ましくは１５０μｍ、最も好ましくは５０μｍである。

微粒子の産生のための方法は、たとえば国際公開第２０１０／０６３９３７Ａ１号パンフレットにおいて開示される。

本発明の代替の実施形態は、微粒子中で組み合わせられる、少なくとも２つの培養空間を含む、培養及び／又は試験システムであって、球状に形作られた微粒子は、
ｉ）前記球状に形作られた微粒子の中心のコア中の第１の培養空間、
ｉｉ）前記微粒子のコアを取り囲む壁中の第２の培養空間を含み、
コアを取り囲む壁は、前記微粒子の培養空間の間の相互作用を可能にするために分子、たとえば塩、栄養素、ペプチド、化学物質、及び他の化合物の交換を可能にし、
第１の及び／又は第２の培養空間は、細菌細胞、真核細胞、及び／又はプレバイオティック物質を含有する、培養及び／又は試験システムを開示する。

本発明の代替の実施形態は、微粒子中で組み合わせられる、少なくとも２つの培養空間を含む、培養及び／又は試験システムであって、球状に形作られた微粒子は、
ｉ）前記球状に形作られた微粒子の中心のコア中の第１の培養空間、
ｉｉ）前記微粒子のコアを取り囲む壁中の第２の培養空間を含み、
コアを取り囲む壁は、前記微粒子の培養空間の間の相互作用を可能にするために分子、たとえば塩、栄養素、ペプチド、化学物質、及び他の化合物の交換を可能にし、
第１の培養空間は、細菌細胞及び／又は真核細胞を含有し、第２の培養空間は、細胞を含有せず、逆もまた同じである、培養及び／又は試験システムを開示する。

大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）の株（たとえばＭＧ１６５５）を、強力な恒常的プロモーターのコントロール下にあるｔｒｐＡＢＣＤＥオペロンを含有するプラスミド（ここではｐＴｒｐと命名）により形質転換する。ｐＴｒｐを内部に持つ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株は、Ｌ−トリプトファンを過剰産生し、その周囲にアミノ酸を分泌することができ、以下、「プロデューサー」株と呼ぶ。

Ｌ−トリプトファン及びヒスチジンに対して栄養要求性の出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｖｉｓｉａｅ）の株（たとえばＹＦＬ０４０Ｗ）を強力な恒常的プロモーター（Ｐ_TEF1）のコントロール下にある蛍光タンパク質（たとえばＧＦＰ、ｅＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＲＦＰ）のコード配列及びヒスチジンの細胞内産生を可能にする遺伝子又は遺伝子オペロンを含有するプラスミド（ここではｐＦｌｕｏｒと命名）により形質転換する。ヒスチジン栄養要求株のそのような補完は、ｐＦｌｕｏｒプラスミドを内部に持つ出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｖｉｓｉａｅ）のポジティブ選択を可能にする。Ｌ−トリプトファンは存在するが、ヒスチジンは存在しない状態で培養すると、ｐＦｌｕｏｒを内部に持つ栄養要求性出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｖｉｓｉａｅ）株は、増殖し、蛍光タンパク質を細胞内で発現する。この株の増殖は、蛍光測定を介してモニターすることができる、すなわち、ある波長の又はある範囲の波長の光により細胞を照射し、照射に使用される波長よりも大きな、ある波長又はある範囲の波長で細胞によって放射される光の量を測定する。この栄養要求性出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株は、以下、「ディテクター株」と呼ぶことにする。

プロデューサー株を、最少培地（たとえば４ｇ／Ｌグルコースを有するＭ９最少培地）に接種する。この培養物は、２００ｒｐｍで振盪しながら３７℃で４〜８時間成長させ、次いで、同じ最少培地を使用して０．０２のＯＤ６００まで希釈する。ディテクター株を、Ｌ−トリプトファン（細胞成長を可能にする）を含有するが、ヒスチジン（ｐＦｌｕｏｒプラスミドの維持の確実にする）を欠いている合成限定培地（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃａｌｌｙｄｅｆｉｎｅｄｍｅｄｉｕｍ）に接種する。このディテクター株の培養物を、２００ｒｐｍで振盪しながら３０℃で４〜８時間成長させる。次いで、ディテクター株の培養物を、等張バッファーにより洗浄し、Ｌ−トリプトファン及びヒスチジンの両方を欠いている合成限定培地を使用して再懸濁する。

直径が３０μｍのアルギナートコア−シェルカプセルを、２つの水溶液、ヒスチジン及びＬ−トリプトファンを欠いている培地中にプロデューサー株を含有する内側の相及びヒスチジン及びＬ−トリプトファンを欠いている培地中にディテクター株を含有する外側の相、２％ｗ／ｖアルギン酸ナトリウム、並びに１００ｍＭエチレンジアミン四酢酸カルシウムジナトリウム塩（以下Ｃａ−ＥＤＴＡ）を、フッ素化界面活性剤及び０．１５％ｖ／ｖ酢酸を含有するフッ素化油（たとえばＨＦＥ７５００）によって切断する、マイクロ流体システムを使用して産生する。フッ素化油中の酢酸は、ＥＤＴＡ複合体からカルシウムを放出させる。次いで、カルシウムは、アルギナートに結合し、それを凝固させ、コア−シェルヒドロゲルがもたらされ、そのコア内にはプロデューサー株があり、ヒドロゲル中にはディテクター株がある。これらのカプセルを収集し、ペルフルオロ−１−オクタノールを使用して油シェルから放出させ、ディテクター株の洗浄後に使用したものと同じ、Ｌ−トリプトファンを欠いている培地中に再懸濁する。次いで、油をその溶液から除去し、プロデューサー株の成長、Ｌ−トリプトファンの産生、ディテクター株の続く成長、及び蛍光タンパク質の同時の産生を可能にするために、カプセルを３０℃でインキュベートする。カプセルは、次いで分析し、場合によっては、マイクロタイタープレートのウェルの中に個々のカプセルを分注する能力を有するＦＡＣＳ（蛍光標識細胞分取）デバイスを使用してソートする。各カプセルの蛍光は、関心のある蛍光タンパク質の励起最大値に対応する波長を有するレーザーによりカプセルを照射し、照射／励起に使用される波長よりも長い、ある範囲の波長でカプセルによって放射される光の量を測定することによって分析する。高い蛍光を呈するカプセルほど、高い濃度の蛍光タンパク質を含有しているに違いなく、そのため、より多くの、ディテクター株の細胞を含有しているに違いない。より多くのディテクター株細胞を含有する液滴がまた、より多い量のＬ−トリプトファンを生成したプロデューサー株細胞を含有しているに違いないこともまた推測されるかもしれない。ＦＡＣＳデバイスを使用して、ハイレベルの蛍光を呈するカプセルは、残りのカプセルプールから分離し及び／又は検出し、図２に示されるように、マイクロタイタープレートのウェルの中に個々に分注することができる。

材料
試薬：ロイシン、ヒスチジン、及びトリプトファンに対して栄養要求性である出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＭｅｙｅｎｅｘＥ．Ｃ．Ｈａｎｓｅｎ（ＡＴＣＣ（登録商標）２０１１６８（商標）、ａｔｃｃ）；ｐＤ１２１７；ｐＲＦＳＤ−ｍＣｈｅｒｒｙ（Ｂｉｏｍｉｌｌｅｎｉａがプラスミドを産生した）（ＡＴＵＭ）酵母形質転換キットＹＥＡＳＴ１（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）；酵母窒素ベースアミノ酸不含酵母分類培地（Ｓｉｇｍａ）。アミノ酸不含酵母合成ドロップアウト培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）；トリプトファン不含酵母合成ドロップアウト培地栄養補助剤（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）；ヒスチジン不含酵母合成ドロップアウト培地栄養補助剤（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）；ｐＳＣ１０１−ｔｒｐ．Ｉ１５を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＡＴＣＣ）；アミノフルオレセイン、異性体Ｉ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）；Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドナトリウム塩（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）；ＭＥＳヘミナトリウム塩（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）；Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミドハイドロクロライド（Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ）；ＳｎａｋｅＳｋｉｎ（商標）透析チューブ、３．５ＫＭＷＣＯ、２２ｍｍ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）。

機器
マイクロフルイディクス
実験は、ナノリットルからピコリットルの容量に試薬を区画化するために油中水型エマルション液滴を使用する、マイクロ流体液滴システムの鍵となる特徴に基づく。液滴ベースのマイクロフルイディクスは、低レイノルズ数及び層流領域で、不混和相において不連続の容量の流動体を扱う。液滴生成に使用される２つの不混和相は、連続相（液滴が生成される媒質）及び分散相（液滴相）と呼ばれる。生成される液滴のサイズは、連続相及び分散相の流速、２相の間の界面張力、並びに液滴生成に使用される外形によって主にコントロールされる。水性相の液滴を分離する油は、近隣の液滴中の試薬間の相互汚染を予防し、チャネル表面及び試薬の間の非特異的結合を低下させることができる。蛍光顕微鏡を使用する液滴の流動体コントロール及びモニタリングと同じ技術原理を用いた。

微粒子生成チップの調製
ポリ（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ）でのソフトリソグラフィーを、微粒子生成デバイス（１）を調製するために使用した。ＳＵ−８フォトレジスト型を、ＰＤＭＳを調製するために使用した。ＳＵ−８鋳型を調製するために、ＳＵ−８の層を、シリコンウェーハ上にスピンコートした。ウェーハは、設計したマスクによって覆い、一定時間、ＵＶに曝露した。現像が完了し、ウェーハを焼いた後に、ＳＵ−８型は、ＰＤＭＳの準備ができた。この実施例における微粒子作製チップのためのＳＵ−８の厚さは、２５μｍとした。チップによって生成される微粒子容量は、ＳＵ−８の厚さに依存する。微粒子を生成するために、厚さは、５００μｍ〜２０μｍまで変動させることができる。ＳＵ−８型の調製の後、ＰＤＭＳを、型に流し込み、ガラス製のスライドに結合させた。マイクロ流体チャネルの内側の部分は、チャネル表面を疎水性にするための市販の表面コーティング剤（トリクロロ−（１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−パーフルオロオクチル）−シラン、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）又は高分子電解質（たとえばポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド及びポリ（４−スチレンスルホン酸ナトリウム）の交互積層による堆積によって処置した。

手順
アミノフルオレセインによるアルギナートの染色
産生の後のアルギナート微粒子の画像解析について。これは、微粒子がコア−シェルかどうかを確かめるのを助けるであろう。

アルギナートは、ＥＤＣ−ＮＨＳ反応を使用して蛍光性にマークすることができる。蛍光分子は、蛍光分子のアミノ基をアルギナートのカルボキシル基に結合させることによって、アルギナートとコンジュゲートすることができる。この反応は、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）などのようなカルボジイミドによって触媒される。ＥＤＣは、カルボキシル基に結合し、非常に反応性の中間体を形成する。Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）の追加は、そのＥＤＣエステル前駆体よりも加水分解を受けにくいエステルスルホ−ＮＨＳ中間体をもたらす。アミノフルオレセインなどのような蛍光分子を追加すると、アミン基は、スルホ−ＮＨＳ中間体と反応し、アミノフルオレセインとスルホ−ＮＨＳを交換し、マークされたアルギナート分子がもたらされる。

プロトコール
アルギナートの標識は、変更した以前の方法において記載されるように実行した（Ｓｔｒａｎｄｅｔａｌ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌ．２００２（１９）：６１５−６３０）。

試薬の追加は、電磁撹拌機により混合しながら実行した。２．０５ｇのアルギナートを、６０ｍＬの蒸留水中に溶解した。５０ｍＬのＭＥＳバッファー（０．２ＭＭＥＳ、ｐＨ５．５）を、アルギナート溶液に追加し、一晩置いた。ＭＥＳバッファーのｐＨは、１ＭＮａＯＨ又は１ＭＨＣｌの追加によって調整した。０．２０８ｇのＥＤＣ及び０．２３５ｇのスルホ−ＮＨＳを９ｍＭＭＥＳバッファーの３ｍＬ溶液中に溶解し、アルギナート溶液に順に追加した。溶液を３０分間室温で撹拌した。次いで、０．１８８ｇのアミノフルオレセインを、４ｍＬの９ｍＭＭＥＳ中に溶解し、４．５ｍＭの濃度までアルギナート溶液に追加する。溶液は、反応が１８時間生じるよう、置いた。

反応しない分子は、透析によって除去した。アルギナート溶液は、３，５００ＭＷＣＯ透析膜に追加し、水が透明になるまで水を１日に２回交換しながら脱イオン水に対して透析した。

次いで、溶液のｐＨは、１ＭＮａＯＨ又は１ＭＨＣｌの追加によってｐＨ７．２〜７．４に調整し、光から保護しながら冷凍乾燥させる。次いで、アミノフルオレセインにより標識された乾燥アルギナートは、室温に保ち、光から保護する。

赤色蛍光タンパク質による出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｖｉｓｉａｅ）の形質転換
特異的なｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子配列を有し、隣接ＳａｐＩ制限部位が追加されたプラスミドの増幅
Ｆｏｒプライマー：ｔａｃａｃｇｔａｃｔｔａｇｔｃｇｃｔｇａａｇｃｔｃｔｔｃｔａｔｇＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧ（配列番号１）
Ｒｅｖプライマー：ｔａｇｇｔａｃｇａａｃｔｃｇａｔｔｇａｃｇｇｃｔｃｔｔｃｔａｃｃＣＴＡＡＡＧＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣ（配列番号２）
大文字：ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子の末端に対して相補的な配列。
小文字：ＰＣＲ産物に隣接するＳａｐＩ制限部位の追加のための配列。

ｐＤ１２１７の中への挿入
ＳａｐＩ制限酵素、ＰＣＲ産物、ｐＤ１２１７、及び反応バッファーを組み合わせ、２０分間３７℃でインキュベートする。次いで、プラスミドは、コンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の中に形質転換し、カナマイシンを有するＬＢの培養プレート上で平板培養し、３７℃で一晩インキュベートする。カナマイシンを補完し、ｐＤ１２１７−ｍＣｈｅｒｒｙを含有するコンピテント細胞を接種した液体培養物を調製し、プラスミドをｍｉｎｉｐｒｅｐキットを使用して回収する。

酵母形質転換プロトコール
酵母形質転換プロトコールは、最終ステップについてヒスチジン不含酵母合成ドロップアウト培地栄養補助剤を使用し、メーカーの手順（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に従って実行した。

酵母形質転換
酵母形質転換について、下記のステップを実行した：
１．ＹＰＤ及び合成完全（ＳＣ）ドロップアウト培地プレートを調製し、それらを別々にオートクレーブする。
２．１００ｍｌ滅菌フラスコ中の２０ｍｌのＹＰＤ培地の中にプレートから酵母細胞を接種する。
３．振盪しながら一晩成長させる。
４．ＯＤ６００が０．３になるまで１００ｍｌのＹＰＤの中に上記の培養物からの細胞を希釈する。
５．細胞を優しくペレットにする。
６．７〜８ｍｌの１×ＴＥ−ＬｉＡｃ溶液中に再懸濁し、１〜１．５時間２３℃で回転させる。
７．形質転換用及び１本はネガティブコントロール用に指定した滅菌マイクロチューブ中に１０μＬの１０ｍｇ／ｍｌサケ精巣ＤＮＡ（カタログ番号Ｄ９１５６、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を追加する。
８．各チューブに０．１μｇの酵母プラスミドＤＮＡ（詳しく調べなければならない）を追加し、各チューブの中に１００μｌのコンピテント細胞を追加し、次いで、ボルテックスする。
９．６００μＬの新たに調製したＰＥＧ−ＴＥ−ＬｉＡｃ溶液を追加し、ボルテックスし、振盪しながら３０分間３０℃でインキュベートする。
１０．任意選択のＤＭＳＯ（カタログ番号Ｄ８４１８、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を、１０％（ｖ／ｖ）まで追加することができ、その後、４２℃での１５分間の熱ショックを続ける。
１１．３秒間回転させ、滅菌水中に細胞を再懸濁し、適切なＳＣドロップアウト培地を使用して平板培養する。
ヒスチジン不含酵母合成ドロップアウト培地栄養補助剤を補足した酵母合成ドロップアウト培地と混合したアルギナート中での出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の成長
ヒスチジン不含酵母合成ドロップアウト培地栄養補助剤を補足した酵母合成ドロップアウト培地に、２％ｗ／ｖまで、マークされたアルギナートを追加する。
酵母を接種し、赤色蛍光をチェック、蛍光顕微鏡
接種なしのネガティブコントロール、アルギナートあり／なしのＹＰＤにおけるポジティブコントロール

大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の成長
ルリア−ベルターニ（ＬＢ）中での成長

ｔｒｙｐｔｏ欠損ｍＣｈｅｒｒｙ産生酵母及びｔｒｙｐｔｏ産生大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）によるカプセル作製
１．Ｌ−トリプトファン不含酵母合成ドロップアウト培地栄養補助剤を補足した酵母合成ドロップアウト培地中で、ｐＳＣ１０１−ｔｒｐ．Ｉ１５により形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を一晩培養する。
２．形質転換酵母を、ヒスチジン不含酵母合成ドロップアウト培地栄養補助剤、２％ｗ／ｖアルギナート、１００ｍＭＣａ−ＥＤＴＡを補足した酵母合成ドロップアウト培地中で一晩培養する。
３．カプセル化の直前に、形質転換酵母を、等張バッファーにより洗浄し、トリプトファン不含酵母合成ドロップアウト培地栄養補助剤を補足した酵母合成ドロップアウト培地中に再懸濁する。
４．アルギナートマトリックス中の酵母及びコア中の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）によりコア−シェルカプセルを産生し、トリプトファン不含酵母合成ドロップアウト培地栄養補助剤を補足した酵母合成ドロップアウト培地中に再懸濁する。
５．蛍光顕微鏡下で、カプセル化の間に又は直後に及びインキュベーションの後にｍＣｈｅｒｒｙ蛍光をチェックする。

Claims

微粒子中で組み合わせられる、少なくとも２つの培養空間を含む、培養及び／又は試験システムであって、球状に形作られた微粒子が、
ｉ）前記球状に形作られた微粒子の中心のコア中の第１の培養空間、
ｉｉ）前記微粒子の前記コアを取り囲む壁中の第２の培養空間を含み、
前記コアを取り囲む前記壁が、分子、たとえば塩、栄養素、ペプチド、化学物質、及び他の化合物の交換を可能にして前記第１の培養空間中の細胞が前記第２の培養空間中の細胞と相互作用し、その逆も同様であり、
前記第１の培養空間が細菌細胞を含有し、前記第２の培養空間が真核細胞を含有するか、又はその逆である、培養及び／又は試験システム。
前記細菌細胞が結腸細菌細胞であり、前記真核細胞が結腸上皮細胞である、請求項１に記載のシステム。
請求項１又は２に記載の微粒子システム中で細菌細胞及び真核細胞を合わせて共培養する及び／又は試験するための方法であって、
ｉ）前記微粒子システム中で前記細菌細胞及び真核細胞を共培養するステップ、
ｉｉ）前記２つの空間の間の化合物拡散によって相互作用するための時間を前記共培養された細胞に与えるステップ、
ｉｉｉ）１つ以上の前記微粒子中に存在する細胞の１つ以上のグループの表現型に基づいて前記微粒子をソートするステップであって、前記表現型がプロバイオティック表現型を含むステップ、を含む方法。
細胞の前記１つ以上のグループの前記プロバイオティック表現型が、前記共培養された真核細胞に対する前記細菌細胞のプロバイオティック効果の検出によって決定されるか、又はその逆である、請求項３に記載の方法。
前記プロバイオティック効果が抗菌効果、抗真菌効果、成長の促進、免疫調節性の効果、及び神経学的な調節性の効果を含む群から選択される、請求項３又は４に記載の方法。
前記微粒子がプレバイオティック物質を含有する、請求項３〜５の何れか１項に記載の方法。
前記プレバイオティック物質がオリゴ糖、多糖、繊維、トランス−ガラクトオリゴ糖、イヌリン、又は細菌細胞及び／若しくは真核細胞に対してプレバイオティック効果を有する任意の他の物質を含む群から選択される、請求項６に記載の方法。
糞便マイクロバイオームサンプル、消化管マイクロバイオームサンプル、膣マイクロバイオームサンプル、土壌マイクロバイオームサンプル、及び皮膚マイクロバイオームサンプルを含む天然のサンプルから単離された少なくとも１つの又は複数の細菌株の、哺乳動物細胞を含む真核細胞に対するプロバイオティック効果が分析される、請求項３〜７の何れか１項に記載の方法。
１つの微粒子中の前記共培養された細胞のプロバイオティック効果の前記分析が、細胞増殖アッセイ、免疫調節性のアッセイ、様々な細菌株の組成によって決定される、請求項３〜８の何れか１項に記載の方法。
１つの微粒子中の前記共培養された細胞のプロバイオティック効果の前記分析が、サイトカイン、インターロイキン、ロイコトリエン、ホルモン、ヒスタミン、一酸化窒素、神経伝達物質、ムロペプチド、オリゴ糖、テイコ酸、リポテイコ酸、揮発性脂肪酸、及びリポタンパク質を含む群から選択される特定の物質の検出によって決定される、請求項３〜９の何れか１項に記載の方法。
前記ソートが、マイクロフルイディクス、ミリフルイディクス、及びＦＡＣＳを含むウルトラハイスループットフローシステムによって行われる、請求項３〜１０の何れか１項に記載の方法。
１０⁹までの細胞及び少なくとも１００の細胞を同時にソートすることができる、請求項３〜１１の何れか１項に記載の方法。
前記第１の培養空間が、１００００００の細胞、より好ましくは１０００の細胞、さらにより好ましくは１００の細胞を含有し、最も好ましくは細胞を含有しない、請求項３〜１２の何れか１項に記載の方法。
前記第２の培養空間が、０〜２５０００の細胞、少なくとも１０の細胞、より好ましくは１００の細胞、さらにより好ましくは５００の細胞、最も好ましくは１０００の細胞を含有する、請求項３〜１３の何れか１項に記載の方法。
前記微粒子中の前記細菌細胞及び前記真核細胞が、ソートされる前に、少なくとも１２時間、好ましくは２４時間、さらにより好ましくは７２時間、及び／又は２週間まで、共培養される、請求項３〜１４の何れか１項に記載の方法。
前記微粒子が、希釈土壌サンプル、希釈された糞便、及び膣、鼻咽腔、鼻腔、皮膚由来の微生物分離株又は他の天然のサンプルを含む群から選択される混合物中で培養される、請求項３〜１５の何れか１項に記載の方法。
前記微粒子が、磁気ビーズを含む、請求項３〜１６の何れか１項に記載の方法。
微粒子中で組み合わせられる、少なくとも２つの培養空間を含む、培養及び／又は試験システムであって、球状に形作られた微粒子が、
ｉ）前記球状に形作られた微粒子の中心のコア中の第１の培養空間、
ｉｉ）前記微粒子の前記コアを取り囲む壁中の第２の培養空間を含み、
前記コアを取り囲む前記壁が、分子、たとえば塩、栄養素、ペプチド、化学物質、及び他の化合物の交換を可能にして前記微粒子の前記培養空間の間の相互作用を可能にし、
前記第１の及び／又は前記第２の培養空間が、細菌細胞、真核細胞、及び／又はプレバイオティック物質を含有する、培養及び／又は試験システム。
微粒子中で組み合わせられる、少なくとも２つの培養空間を含む、培養及び／又は試験システムであって、球状に形作られた微粒子が、
ｉ）前記球状に形作られた微粒子の中心のコア中の第１の培養空間、
ｉｉ）前記微粒子の前記コアを取り囲む壁中の第２の培養空間を含み、
前記コアを取り囲む前記壁が、分子、たとえば塩、栄養素、ペプチド、化学物質、及び他の化合物の交換を可能にすることにより前記微粒子の前記培養空間の間の相互作用を可能にし、
前記第１の培養空間が細菌細胞及び／又は真核細胞を含有し、前記第２の培養空間が細胞を含有しないか、その逆である、培養及び／又は試験システム。