JPH03147782A - 細胞移植方法 - Google Patents
細胞移植方法Info
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- JPH03147782A JPH03147782A JP1281794A JP28179489A JPH03147782A JP H03147782 A JPH03147782 A JP H03147782A JP 1281794 A JP1281794 A JP 1281794A JP 28179489 A JP28179489 A JP 28179489A JP H03147782 A JPH03147782 A JP H03147782A
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Landscapes
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野]
本発明は、細胞の生体内移植方法に関する。さらに詳細
には、特定の機能を保持した細胞を安定にかつ大量に生
体内に移植する方法に関する。
には、特定の機能を保持した細胞を安定にかつ大量に生
体内に移植する方法に関する。
〔従来技術および発明が解決しようとする問題点医療技
術の発達に伴い、生体機能の代行を行わせるための人工
臓器の研究開発が内外で活発に行われてきた。
術の発達に伴い、生体機能の代行を行わせるための人工
臓器の研究開発が内外で活発に行われてきた。
このような研究開発においては、これまで主として物理
的強度、生体適合性を兼ね備えたプラスチック、金属等
を底形、加工し、これを生体内にうめこんだり、血液等
を体外循環させて利用するなどの方向で進展してきた。
的強度、生体適合性を兼ね備えたプラスチック、金属等
を底形、加工し、これを生体内にうめこんだり、血液等
を体外循環させて利用するなどの方向で進展してきた。
その結果、現在までにポリエステルやポリテトラフルオ
ロエチレンを加工した人工血管(米国特許385306
2号、米国特許3962153号)や、多孔性膜を利用
した人工腎臓ではすでに一部実用化されており、さらに
、これらに新しい機能を付与する試みもすでに開始され
ている。
ロエチレンを加工した人工血管(米国特許385306
2号、米国特許3962153号)や、多孔性膜を利用
した人工腎臓ではすでに一部実用化されており、さらに
、これらに新しい機能を付与する試みもすでに開始され
ている。
しかし、こういった材料を加工したものではその適応が
非常に狭い範囲に限られ、特に、生理活性物質を分椰す
る臓器や種々の複雑な機能を有する臓器の完全な代行は
不可能とされている。
非常に狭い範囲に限られ、特に、生理活性物質を分椰す
る臓器や種々の複雑な機能を有する臓器の完全な代行は
不可能とされている。
また、最近になってこれらの観点から実際に生体内由来
の細胞等を利用したものが考えられるようになってきて
いる0例えば、膵臓ランゲルハンス細胞を中空系上に単
層に接着させて人工膵臓に応用する試み(Scienc
e、 197,780(1977))や遊離肝細胞の細
胞懸濁液を生体内に移植する試み(組織培養、7,20
1 (1981))もなされている。
の細胞等を利用したものが考えられるようになってきて
いる0例えば、膵臓ランゲルハンス細胞を中空系上に単
層に接着させて人工膵臓に応用する試み(Scienc
e、 197,780(1977))や遊離肝細胞の細
胞懸濁液を生体内に移植する試み(組織培養、7,20
1 (1981))もなされている。
しかしながら、これらの手法を用いても利用しうる細胞
数が生体に比べると極端に低密度であったりまた移植し
てもごく一部の細胞しか生着せず、実際に十分に機能を
発現させるには移植細胞の十分な増殖を待たねばならな
い等の問題点があった。
数が生体に比べると極端に低密度であったりまた移植し
てもごく一部の細胞しか生着せず、実際に十分に機能を
発現させるには移植細胞の十分な増殖を待たねばならな
い等の問題点があった。
本発明は、このような技術的背景を踏えてなされたもの
であり、細胞を高機能でしかも、高密度で移植すること
の可能な生体内細胞移植方法を提供することを目的とす
るものである。
であり、細胞を高機能でしかも、高密度で移植すること
の可能な生体内細胞移植方法を提供することを目的とす
るものである。
このような問題点を解決すべくなされた本発明の生体内
細胞移植方法は、細胞の3次元的集合体を人為的操作に
より形成させ、これを生体内に移植することを特徴とす
るものである。
細胞移植方法は、細胞の3次元的集合体を人為的操作に
より形成させ、これを生体内に移植することを特徴とす
るものである。
細胞の3次元的集合体の形成は、例えば、細胞懸濁液を
遠心操作したり、透過性基材上に播種した後該基材上か
ら加圧操作したり、該基材下から吸引操作することによ
り容易に行なえる。この際、細胞に親和性が高くかつ抗
原性の低いコラーゲン、例えば、アテロコラーゲン等を
細胞懸濁液中に混在させておくことが好ましい。
遠心操作したり、透過性基材上に播種した後該基材上か
ら加圧操作したり、該基材下から吸引操作することによ
り容易に行なえる。この際、細胞に親和性が高くかつ抗
原性の低いコラーゲン、例えば、アテロコラーゲン等を
細胞懸濁液中に混在させておくことが好ましい。
このような操作により得られた細胞集合体の中で細胞は
互いに密に接触しあっているため細胞間相互作用が円滑
におこなえ細胞の機能は安定し、また細胞密度が高いた
めに少量の移植体積で十分な機能発現を期待することが
できる。さらに、これらは液状体であるため注射器等で
取り扱えるため、性体内への移植が容易に行なえるとい
う利点がある。
互いに密に接触しあっているため細胞間相互作用が円滑
におこなえ細胞の機能は安定し、また細胞密度が高いた
めに少量の移植体積で十分な機能発現を期待することが
できる。さらに、これらは液状体であるため注射器等で
取り扱えるため、性体内への移植が容易に行なえるとい
う利点がある。
本発明で形成させる細胞集合体は、細胞懸濁液から作製
すれば細胞の種類や割合が任意に選べる上一定量を分取
し調査する事により細胞集合体の単位体積あたりの細胞
数および生存率を算出することができる。
すれば細胞の種類や割合が任意に選べる上一定量を分取
し調査する事により細胞集合体の単位体積あたりの細胞
数および生存率を算出することができる。
また特に、初代培養系の細胞は機能性が高く細胞間相互
作用がその安定化に有利なためこれらを細胞に選べば移
植した後に安定して生着し、生体内で行なっていた機能
を高いレベルで発現できるようになる。さらに上記細胞
集合体の移植場所としては血流が豊富で細胞が生着でき
る足場をもっ膵臓を選ぶと効果的である。例えば、肝実
質細胞は、細胞集合体を形成させて膵臓を移植すること
で初めて移植直後から高いレベルでの機能発現が可能と
なった。
作用がその安定化に有利なためこれらを細胞に選べば移
植した後に安定して生着し、生体内で行なっていた機能
を高いレベルで発現できるようになる。さらに上記細胞
集合体の移植場所としては血流が豊富で細胞が生着でき
る足場をもっ膵臓を選ぶと効果的である。例えば、肝実
質細胞は、細胞集合体を形成させて膵臓を移植すること
で初めて移植直後から高いレベルでの機能発現が可能と
なった。
このように、本発明の細胞の生体内移植方法は、人為的
に三次元的な細胞集合体を形成しこれを生体内に移植す
ることを特徴とするものである。
に三次元的な細胞集合体を形成しこれを生体内に移植す
ることを特徴とするものである。
上記の細胞集合体は、細胞懸濁液を遠心操作することに
よりもしくは圧力を利用することにより形成させる方法
が好んで使用される。遠心操作を利用する場合の回転数
および時間は細胞の大きさ等により適宜選択されるが好
ましくは300rpmないし2000rpmで1分ない
し20分、さらに好ましくは600rpmないし150
0rpmで2分ないし15分である。
よりもしくは圧力を利用することにより形成させる方法
が好んで使用される。遠心操作を利用する場合の回転数
および時間は細胞の大きさ等により適宜選択されるが好
ましくは300rpmないし2000rpmで1分ない
し20分、さらに好ましくは600rpmないし150
0rpmで2分ないし15分である。
細胞集合体は、生理的塩類溶液や培養液に懸濁させたも
のから調製するのが好ましいがこの時同時に細胞親和性
の高いコラーゲン等を混在させておくと移植後の生着率
がさらに向上する。この場合のコラーゲンは抗原性の低
いアテロコラーゲンを選択するのが好ましく、移植後に
コラーゲンが細胞間の隙間でゲル化するように0.1%
以上の濃度で混在させるのが好ましいが、この場合には
細胞集合体を取り扱う際にコラーゲンがゲル化しないよ
うに0〜4°Cで行なうことが必要である。
のから調製するのが好ましいがこの時同時に細胞親和性
の高いコラーゲン等を混在させておくと移植後の生着率
がさらに向上する。この場合のコラーゲンは抗原性の低
いアテロコラーゲンを選択するのが好ましく、移植後に
コラーゲンが細胞間の隙間でゲル化するように0.1%
以上の濃度で混在させるのが好ましいが、この場合には
細胞集合体を取り扱う際にコラーゲンがゲル化しないよ
うに0〜4°Cで行なうことが必要である。
細胞集合体を構成する細胞は必要に応じて自由に選択で
きるが、特に、肝実質細胞、膵臓ランゲルハンス細胞等
のような初代培養系のものが好んで利用される。
きるが、特に、肝実質細胞、膵臓ランゲルハンス細胞等
のような初代培養系のものが好んで利用される。
また、これらの細胞集合体は、一種類の細胞で構成して
もよいし2種以上の細胞を組合せて利用してもよいが、
いずれの場合にも正常細胞が選ばれる。
もよいし2種以上の細胞を組合せて利用してもよいが、
いずれの場合にも正常細胞が選ばれる。
また、移植する際の手技については特に限定しないが、
細胞集合体が液状としても取り扱えることを利用して注
射器等で直接注入する事が可能である。細胞集合体を移
植する場所は特に限定しないが、十分に血液があり、移
植後の細胞が生着する足場が存在する場所が好ましく、
例えば肺臓、膵臓ランゲルハウス肺臓等−が例示される
。
細胞集合体が液状としても取り扱えることを利用して注
射器等で直接注入する事が可能である。細胞集合体を移
植する場所は特に限定しないが、十分に血液があり、移
植後の細胞が生着する足場が存在する場所が好ましく、
例えば肺臓、膵臓ランゲルハウス肺臓等−が例示される
。
また、注入する細胞集合体の量についても特に限定しな
いが、例えば、肺臓に注入する場合には肺臓の体積の1
/2までが適当である。
いが、例えば、肺臓に注入する場合には肺臓の体積の1
/2までが適当である。
また、これらの細胞集合体は一定期間培養した後に移植
することも可能である。この場合は、栄養物、酸素等の
供給を円滑にするために多孔性膜上で培養することが好
ましく、細胞集合体がそのまま取り扱えるように細胞集
合体作製時に、コラーゲンを0.1%以上の濃度となる
よう細胞懸濁液に加えるのがのぞましい。
することも可能である。この場合は、栄養物、酸素等の
供給を円滑にするために多孔性膜上で培養することが好
ましく、細胞集合体がそのまま取り扱えるように細胞集
合体作製時に、コラーゲンを0.1%以上の濃度となる
よう細胞懸濁液に加えるのがのぞましい。
以下に、本発明の実施例および比較例を記載して本発明
を具体的に説明する。
を具体的に説明する。
実施例 l
コラゲナーゼ潅流法および遠心分離によって単離したマ
ウス肝実質細胞を0.1%のコラーゲン溶液中(pH7
,0イ一グルMEM培地に溶かしたもの)および、ME
M培地中で4°Cで10分間懸濁させた後101000
rp分の遠心操作を行い、細胞の集合体を得た。上清を
瘉棄してこの集合体中に含まれる生細胞数をカウントす
るとlμl当り3.8X10’個であった。
ウス肝実質細胞を0.1%のコラーゲン溶液中(pH7
,0イ一グルMEM培地に溶かしたもの)および、ME
M培地中で4°Cで10分間懸濁させた後101000
rp分の遠心操作を行い、細胞の集合体を得た。上清を
瘉棄してこの集合体中に含まれる生細胞数をカウントす
るとlμl当り3.8X10’個であった。
この細胞集合体をLml入りシリンジを用いて10ピキ
のマウスの肺臓に50μiずつ注入した。
のマウスの肺臓に50μiずつ注入した。
2週間後には金側が生存しておりそれらの肺臓の切片を
作製したところ、多数の肝実質細胞塊が確認された。尚
、コラーゲンを使用せずに作製した細胞集合体を移植し
たものは一部肝細胞の牌外への漏出が認められた。
作製したところ、多数の肝実質細胞塊が確認された。尚
、コラーゲンを使用せずに作製した細胞集合体を移植し
たものは一部肝細胞の牌外への漏出が認められた。
これら肺臓中に生着した肝実質細胞塊中での肝特異的な
アルブミンのmRNAをノザンプロットで調べたところ
高いアルブミン合成能を有している事が判明した。この
結果を図1に示す。
アルブミンのmRNAをノザンプロットで調べたところ
高いアルブミン合成能を有している事が判明した。この
結果を図1に示す。
一方、肝細胞の懸濁液を牌内に50ui、注入したもの
では、2週間後肝細胞の存在がほとんど確認できず、移
植後1年2ケ月生かしたものでも、アルブξン合成能は
細胞集合塊を移植して2週間経ったものより明らかに低
いレベルであった。
では、2週間後肝細胞の存在がほとんど確認できず、移
植後1年2ケ月生かしたものでも、アルブξン合成能は
細胞集合塊を移植して2週間経ったものより明らかに低
いレベルであった。
細胞集合体を圧力を利用した方法で作製した場合にも同
様の結果が得られた。
様の結果が得られた。
実施例 2
実施例1と同様に調製した肝細胞集合体をコラーゲンコ
ートした多孔性ポリカーボネート膜(孔径8μm)の上
にのせ、(10hコ)血清、各種増殖因子を含まないウ
ィリアムスE培地に膜ごと浮かべて3日間培養し、これ
らを膜ごとマウス皮下に移植した。2ケ月後にマウスを
開腹し移植した細胞集合体を調べたところ、肝細胞は生
着しアルブミンの合成が行われていることが1nsit
uハイブリダイゼーシヨン法で明らかとなった。尚コラ
ーゲンを使用した場合には細胞集合体は速やかにゲル化
し数時間の培養後に移植することも可能であった。
ートした多孔性ポリカーボネート膜(孔径8μm)の上
にのせ、(10hコ)血清、各種増殖因子を含まないウ
ィリアムスE培地に膜ごと浮かべて3日間培養し、これ
らを膜ごとマウス皮下に移植した。2ケ月後にマウスを
開腹し移植した細胞集合体を調べたところ、肝細胞は生
着しアルブミンの合成が行われていることが1nsit
uハイブリダイゼーシヨン法で明らかとなった。尚コラ
ーゲンを使用した場合には細胞集合体は速やかにゲル化
し数時間の培養後に移植することも可能であった。
一方、細胞懸濁液をマウス皮下に移植したちのでは、2
ケ月後に肝細胞の存在が確認できなかった。
ケ月後に肝細胞の存在が確認できなかった。
以上のように、本発明の細胞の生体内移植方法によれば
細胞どうしが相互作用行なえる形で非常に高密度移植で
きる効果がある、さらに、この方法を用いて特に高い機
能を有する初代培養系の細胞を用いることにより、人工
臓器として応用できる特有の利点がある。
細胞どうしが相互作用行なえる形で非常に高密度移植で
きる効果がある、さらに、この方法を用いて特に高い機
能を有する初代培養系の細胞を用いることにより、人工
臓器として応用できる特有の利点がある。
第1図は、アルブミンc DNA (1,2k b)を
プローブとしてアルブミンのmRNAをノザンプロット
で調べた結果を示す。 ■・・・・・・・・・肝臓 ■・・・・・・・・・肺臓 ■・・・・・・・・・肝細胞の細胞集合体を50μl注
入して2週間後の肺臓 ■・・・・・・・・・肝細胞の細胞集合体(コラーゲン
を含む)を50μl注入して2週間後の牌 ■・・・・・・・・・肝細胞の懸濁液を50μ2注入し
て1年2ケ月後のpI臓 代 理 人
プローブとしてアルブミンのmRNAをノザンプロット
で調べた結果を示す。 ■・・・・・・・・・肝臓 ■・・・・・・・・・肺臓 ■・・・・・・・・・肝細胞の細胞集合体を50μl注
入して2週間後の肺臓 ■・・・・・・・・・肝細胞の細胞集合体(コラーゲン
を含む)を50μl注入して2週間後の牌 ■・・・・・・・・・肝細胞の懸濁液を50μ2注入し
て1年2ケ月後のpI臓 代 理 人
Claims (9)
- (1)人為的操作により形成せしめた細胞の三次元的集
合体を生体内に移植することを特徴とする細胞移植方法
。 - (2)人為的操作が、細胞懸濁液を遠心操作することで
ある特許請求の範囲第一項記載の細胞移植方法。 - (3)人為的操作が、細胞懸濁液を多孔性基材上から加
圧操作もしくは該基材下から吸引操作することである特
許請求の範囲第一項記載の細胞移植方法。 - (4)細胞の懸濁液にコラーゲンを0.1%以上の濃度
で存在させることを特徴とする特許請求の範囲第二項ま
たは第三項記載の細胞移植方法。 - (5)コラーゲンが、アテロコラーゲンであることを特
徴とする特許請求の範囲第四項記載の細胞移植方法。 - (6)細胞が、初代培養系のものであることを特徴とす
る特許請求の範囲第一項ないし第五項記載の細胞移植方
法。 - (7)細胞が、肝実質細胞または膵臓ランゲルハンス細
胞である事を特徴とする特許請求の範囲第一項ないし第
六項記載の細胞移植方法。 - (8)細胞の三次元的集合体を生体内に移植する場所が
、膵臓であることを特徴とする特許請求の範囲第一項な
いし第七項記載の細胞移植方法。 - (9)細胞の三次元的集合体を生体外で培養した後に生
体内に移植することを特徴とする特許請求の範囲第一項
ないし第八項記載の細胞移植方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP1281794A JPH03147782A (ja) | 1989-10-31 | 1989-10-31 | 細胞移植方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP1281794A JPH03147782A (ja) | 1989-10-31 | 1989-10-31 | 細胞移植方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH03147782A true JPH03147782A (ja) | 1991-06-24 |
Family
ID=17644072
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP1281794A Pending JPH03147782A (ja) | 1989-10-31 | 1989-10-31 | 細胞移植方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH03147782A (ja) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2000044881A1 (fr) * | 1999-01-29 | 2000-08-03 | Japan Science And Technology Corporation | ORGANES POUR TRANSPLANTATION PRODUITS $i(IN VITRO) |
WO2003064635A1 (fr) * | 2002-01-29 | 2003-08-07 | Japan Tissue Engineering Co., Ltd. | Methode de construction de spheroides, spheroides et compositions contenant des spheroides |
US7897377B2 (en) | 2005-06-15 | 2011-03-01 | Capsant Neurotechnologies, S.A. | Cell- and tissue culture device |
US8927282B2 (en) | 2005-06-15 | 2015-01-06 | Capsant Neurotechnologies S.A. | Method of producing organotypic cell cultures |
-
1989
- 1989-10-31 JP JP1281794A patent/JPH03147782A/ja active Pending
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2000044881A1 (fr) * | 1999-01-29 | 2000-08-03 | Japan Science And Technology Corporation | ORGANES POUR TRANSPLANTATION PRODUITS $i(IN VITRO) |
WO2003064635A1 (fr) * | 2002-01-29 | 2003-08-07 | Japan Tissue Engineering Co., Ltd. | Methode de construction de spheroides, spheroides et compositions contenant des spheroides |
US7897377B2 (en) | 2005-06-15 | 2011-03-01 | Capsant Neurotechnologies, S.A. | Cell- and tissue culture device |
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