JPH01277486A - 肝細胞の球状培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 肝細胞はアルブミン、フィブリノーゲンなどの多種の蛋
白質の生合成を行なったり、解毒などの非常に複雑な代
謝機能を有している細胞である。

この複雑な機能を保持した肝細胞の培養系を確立するこ
とは、生体にとって重要な種々の機能を１ｎＶｉｔｒＯ
で再現することを可能にする。すなわち、未だ不明な肝
細胞の機能を明らかにするためのモデルを提供し、細胞
生物学の主要な研究手法として数多く利用されるもので
あり、薬物なとの種々の物質の毒性試験においても、生
体を用いることなく　ｉｎ　ｖｉｔｒｏの系で行うこと
を可能にするものである。

さらに、生物学的人工肝臓として、前記の多種多様の機
能を代行しつる人工的肝補助の装置作製に対して大きな
期待を抱かせるものである。

本発明は長期間の安定した機能を持つ肝細胞の培養方法
に関するものである。

（従来の技術） 培養肝細胞の生物活性を左右するものとして多くの原因
か考えられるが、なかでも血清因子と培養基質が重要と
されている。血清因子としては、インシュリン、上皮成
長因子などの各種ホルモンが肝細胞の生着、増殖に重要
な役割を果たしていることか知られている。しかし、血
？ｉ’ｆ中のその他の多くの因子か肝細胞の長期生存に
及ぼす効果については一定の見解かなく検討を要する。

培養基質としては、肝の細胞外間質物質が知られている
。

従来は、成熟動物の肝臓をコラゲナーゼかん流法により
肝細胞を分離して、コラーゲンやフィブロネクチン等の
基質上で行う単層培養が頻用されている。

また、肝の細胞外間質物質である肝小葉内間質物質を培
養容器に塗布して基質とし、無血清培地中で培養するこ
とによっても長期間培養可能である。

さらに、自己増殖能を持った継代培養細胞も用いられて
いる。

（発明が解決しようとする課題） 従来繁用されている初代肝細胞の単層培養法については
、長期にわたる機能維持については問題点が多い。つま
り、アルブミン等の分泌物質の生合成、分泌量か生体内
でのそれに比較して非常に低値を示すからである。

また、血清添加培地中で培養を行なった場合、実質細胞
は１〜２週間で死滅し、非実質細胞の出現が起こり、長
期間の培養は不可能である。

長期間培養するには形質転換を起こしていわゆるガン化
した肝細胞を用いれば継代できて目的にかなうか、正常
の肝細胞が本来持つ分化機能を喪失している場合か多く
、機能維持には大きな疑問点か残る。

肝小葉内間質物質を培養基質として、無血清培地中で培
養すると細胞が球状に集合し浮遊した形態をとり、２週
間培養可能であり、培養液中へのアルブミン、トランス
フェリン、フィブリノーゲン的の蛋白質の分泌が確認さ
れ、２週間その分泌量はｉｎ　ｖｉｖｏのレベルを維持
することかできる。

しかし、この肝小葉内間質物質を得るには複雑な操作を
要する。

（課題を解決するための手段） 以上のような問題点を解決すべく、本発明者らは鋭意検
討した結果、比較的長期間培養が可能であり、細胞は球
状に集合して浮遊し、形態的にも、またアルブミン等の
蛋白質分泌能などの機能的にも生体内のそれに等しく維
持でき、操作としては簡便な培養方法を確立した。

すなわち本発明は、肝臓より分離した肝実質細胞を、陰
性荷電を持たないプラスチック製の培養容器中で、細胞
接着のための基質及び肝細胞性間質物質を添加せずに、
無血清培地を用いて培養し、球状に集合して浮遊した細
胞塊を形成させることを特徴とする肝細胞の球状培養方
法である。

以下本発明の詳細な説明する。

肝細胞は、成熟動物の新鮮な肝臓から無傷の肝実質細胞
を得ればよく、その手法については特に限定しない。例
えば、動物を麻酔下に開腹し、門脈内にカニユーレを挿
入し、前かん流した後０．０５％コラゲナーセ液により
がん流して肝細胞を分散し、低速遠心により実質細胞を
分離することができる。

使用する無血清培地は、通常動物細胞の初代培養に用い
られているものを用いれば良い。具体的には、ウィリア
ム　メディウムＥにインシュリン１０μｇ／ｍｌ、グル
カゴン１０１１ｇ／ｍｌ、上皮成長囚子５０ｎｇ／ｒｎ
ｌ、プロラクチン２０　ｍυ／ｍｌ、成長ホルモン１０
μＵｌ用１．銅０．１μＭ、セレニウム３μＭ、亜鉛５
０ｐＭを添加した無血清培地などを例示することができ
る。

培養容器は、基材として陰性荷電を持たないプラスチッ
ク製のものであって、コラーゲン、フィブロネクチン等
の細胞接着のための基質および肝細胞性間質物質を塗布
していないものであれば良い。即ち、電気的には、中性
または陽性の、好ましくは陽性のプラスチック製容器を
用いればよい。

例えば、ポリスレチン製、塩化ビニル製容器などがあげ
られる。具体的には、プライマリアディッンユ（ベクト
ン＆ディッキントン社製）を例示することかできる。

細胞接着のための基質は、浮遊した細胞塊を形成させる
のに妨げとなるので、また肝細胞性間質物質は調製に複
雑な操作と長時間を要するため、本発明では使用しない
。

以上記したものを用いて培養を行う。培養環境。

細胞数については公知の方法を用いれば良く、特に限定
しない。

例えば、培養液は１日ごとに交換して培養を続けると４
１ヨ目には肝細胞は球状に集合した塊を形成し、培養液
中に浮遊した状態になる。これをそのまま継続して培養
を続ければよい。

（作用） 肝細胞が浮遊した細胞塊となる理由は、陰性荷電を持た
ないプラスチック上に接種された細胞か、プロテオグリ
カンを分泌し、これが該プラスチック上に固相化される
ためと考えられる。また無血清培地を用いるので、細胞
の長期間培養か可能である。

（発明の効果） 本発明により、安定した機能および形態を持つ肝細胞を
、球状に集合して浮遊した状態で長期間の培養か可能で
ある。

調製に非常に複雑な操作と長い時間を要すると考えられ
る肝細胞性間質物質を本発明では、容器に塗布する必要
がなく、この点からみると本発明は非常に簡便な操作に
より、肝細胞の長期培養系を確立できたといえる。

（実施例） 以下、本発明を実施例にてさらに詳細に説明するか、本
発明はこれら実施例にのみ限定されるものではない。

実施例１ ２００〜２５０ｇの成熟ラットをネンブタール麻酔下に
開腹し、肝臓門脈内に挿入したカニユーレよりカルシウ
ムイオンを含まないハンクス液で前がん流を行った。次
いて０．０５％コラゲナーゼ液により６〜８分かん流を
行った。その後肝細胞は分散させ分離して、５０Ｘｇ、
１分間の低速遠心を３回行って非実質細胞を除去した。

ウィリアム　メディウムＥにインシュリン１０μ ｍ１．上皮成長因子５０ｎｇ／ｍｌ，プロラクチン２０
ｍＵ／ｍｌ。

成長ホルモン１０μυ／ｍｌ，銅０．１μＭ，セレニウ
ム３μ間，亜鉛５０ｐＭを添加した無血清培地６ｍｌあ
たりに上記の肝細胞５ＸＬＯ”個を浮遊させ、これをプ
ライマリアホ１−ル（ベクトン＆デイツキンソン社製）
内で、炭酸ガス５％に調節した３７°Ｃの炭酸ガスイン
キュベーター内で４日間培養して位相差顕微鏡を用いて
観察した。

その結果、細胞は培養開始後１日目には培養容器に接着
した状態であったが、その後次第に細胞同士が重なり合
うようになり、培養後４日目には浮遊した球状の細胞塊
を形成した。また、この後、２週間培養してもその形態
は保持されていた。さらに、電子顕微鏡により観察する
と、細胞内オルガネラも生体内の肝細胞のそれと等しい
形態を保持しており、細胞間の接着斑や微少胆管も形成
されておりこの点からも形態的に安定に維持されている
と考えられた。

またアルブミンの分泌量は２日目は１，０μｇ／μｇ　
ＤＮＡ／日であって、これか６日目まで（こ１．３μｇ
／μｇＤＮＡ７日に上昇し、２週間口までこのレベルを
保った。従って、機能的にも安定した培養系であること
か確認された。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）肝臓より分離した肝実質細胞を、陰性荷電を持た
   ないプラスチック製の培養容器中で、細胞接着のための
   基質及び肝細胞外間質物質を添加せずに、無血清培地を
   用いて培養し、球状に集合して浮遊した細胞塊を形成さ
   せることを特徴とする肝細胞の球状培養方法。