CN105734006A - 一种脱细胞海藻酸钠仿生水凝胶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种脱细胞海藻酸钠仿生水凝胶的制备方法，其特征是将A细胞和海藻酸钠溶液混合，经过钙化反应形成含A细胞的海藻酸钙微胶珠，培养之后使用柠檬酸钠溶液溶解该微胶珠，并高速离心去除A细胞，再将获得的溶液透析去除柠檬酸钠，并冷冻干燥，之后再复溶成溶液，并混合B细胞，经过钙化反应形成含有A细胞分泌的因子、蛋白及细胞外基质的海藻酸钠仿生水凝胶，从而调控B细胞的生理功能。本发明操作简单，成本低，A细胞分泌的带有正电荷的因子、蛋白及细胞外基质可通过静电作用吸附到海藻酸钠分子上，提高了海藻酸钠凝胶的生化特性，从而此仿生水凝胶能够模拟体内特异组织细胞外基质的结构与功能，实现对B细胞生理功能的调控。
Description
技术领域
本发明涉及再生医学及肿瘤领域，具体涉及一种脱细胞海藻酸钠仿生水凝胶的制备方法。
背景技术
体内微环境维持了细胞的正常生理功能，细胞外基质是体内微环境的重要组成部分，它作为一个三维网络，给细胞提供了结构和功能支撑。三维水凝胶支架是目前体外用来模拟体内细胞外基质的常用手段，它的三维构造使得细胞能够在近似体内的三维条件下生长，已经广泛用于细胞培养、三维组织构建及肿瘤模型研发等领域，然而其特性与体内细胞外基质相比还相差很大。
要使得水凝胶更加接近体内特异组织细胞外基质，我们需要对水凝胶的物理及生化特性进行调控。在物理特性上，我们已经可以通过改变水凝胶制备参数来调控其物理特性，如形状、尺寸、孔隙率、刚度、粗糙度等。而在生化特性上，尽管通过接枝功能分子、混合特异性蛋白等方法能在一定程度上提高支架的生物活性，但是与体内天然组织细胞外基质成分相差还甚远，因此迫切需要发展新型的能够高效模拟体内细胞外基质成分和功能的仿生水凝胶。
在体内多种细胞共存，不同种类细胞之间存在相互作用。比如肝脏中存在着肝实质细胞和纤维细胞等非肝实质细胞，非肝实质细胞分泌的因子、蛋白及细胞外基质对与维持肝实质细胞的功能至关重要。研究也表明，特异组织成熟细胞分泌的因子、蛋白及细胞外基质对干细胞向特异组织细胞定向分化起决定性作用。此外，肿瘤微环境中间质细胞显著促进了肿瘤细胞的转移、耐药。这些结果提示，如果利用水凝胶支架先包埋并培养一种A细胞，A细胞分泌的因子、蛋白及细胞外基质将存在于水凝胶当中，之后去掉A细胞，再将此仿生支架包埋并培养B细胞，将大大提高仿生水凝胶的生物学功能，更好地起到调控B细胞功能的目的。从中可知，A细胞在水凝胶中的接种密度将决定支架中存留多少活性成分，而B细胞的接种密度则影响了调控的效果。因此，如何制备这种仿生水凝胶及获得最优的A及B细胞接种密度是急需要解决的难题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种脱细胞海藻酸钠仿生水凝胶的制备方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
将A细胞和海藻酸钠溶液混合，经过钙化反应形成含A细胞的海藻酸钙微胶珠，培养之后使用柠檬酸钠溶液溶解该微胶珠，并离心去除A细胞，再将获得的溶液透析去除柠檬酸钠，并冷冻干燥，之后再复溶成溶液，并混合B细胞，经过钙化反应形成含有A细胞分泌的因子、蛋白及细胞外基质的能够调控B细胞生理功能的海藻酸钠仿生水凝胶。
所述海藻酸钠的分子量为100-1000kDa，海藻酸钠分子中古罗糖醛酸和甘露糖醛酸比例(G/M)为0.2-3:1，海藻酸钠溶液浓度为1-3％(W/V)，单位为g/mL。
所述钙化反应为将含有细胞的海藻酸钠溶液滴加到100-200mM的氯化钙溶液(凝胶浴)中，反应30min。
所述柠檬酸钠溶液浓度为50mM，溶解微胶珠的反应时间为5-10min。
所述离心的离心条件为5000rpm，10min，4℃；所述的透析条件为4℃下使用纯净水避光透析3天，搅拌速率200rpm，每天换水4次，透析袋截留分子量3500；所述的冷冻干燥条件为-50℃，真空度1×10-2毫巴以上，冷冻干燥3天。
所述复溶溶液的浓度为1-3％(W/V)，单位为g/mL。
所述A细胞和B细胞的选择是依据A细胞对B细胞的功能具有调控作用，具体配对包括：
当B细胞是肝细胞时，A细胞为成纤维细胞、血管内皮细胞、间充质干细胞、转基因细胞一种或二种以上；
当B细胞是干细胞时，A细胞为神经细胞、肝细胞、心肌细胞、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、转基因细胞中的一种；
当B细胞是肿瘤细胞时，A细胞为成纤维细胞、血管内皮细胞、间充质干细胞、转基因细胞一种或二种以上；
所述A细胞和海藻酸钠溶液混合，A细胞在海藻酸钠溶液中的密度为6×106-2×107cells/mL。
所述B细胞在复溶海藻酸钠溶液中的密度为1×106-6×106cells/mL。
所述B细胞的生理功能包括生长、活性、迁移、转移、分化、合成、解毒、耐药。
本发明具有如下优点：
1.操作简单，成本低。本发明利用A细胞分泌的带正电的因子、蛋白及细胞外基质与带负电的海藻酸钠分子发生静电吸附反应，以实现对水凝胶生化特性的修饰，方法简单，避免使用昂贵材料和工艺；
2.高效模拟体内特异组织细胞外基质成分和功能。海藻酸钙微胶珠可为B细胞提供近似体内的三维细胞外基质框架，而吸附在水凝胶支架上的A细胞分泌的因子、蛋白及细胞外基质模拟了含有A细胞的特异组织的细胞外基质成分和功能，因此本发明能够进一步提高B细胞的生理功能。
附图说明
图1在仿生支架中培养14天的LM3细胞形态；
图2培养14天时实验组、对照组以及二维正常细胞的MMP明胶酶谱照片；
图3培养14天时实验组、对照组以及二维正常细胞的Transwell细胞侵袭实验量化分析(**P＜0.01，#P＜0.05)；
图4培养7天时实验组、对照组的Nestin细胞比例(*P＜0.05)；
图5培养7天时实验组、对照组的Nestin细胞总数(*P＜0.05)；
图6培养14天时实验组、对照组、低成纤维细胞组及高HepG2细胞组肝细胞外泌白蛋白水平(*P＜0.05)；
图7培养14天时实验组、对照组、低成纤维细胞组及高HepG2细胞组肝细胞CYP3A4基因表达(*P＜0.05)；
具体实施方式
实施例1：脱细胞海藻酸钠仿生水凝胶促进肿瘤细胞转移
将血管内皮细胞与浓度为1.5％(g/mL)的海藻酸钠(分子量700kDa，古罗糖醛酸和甘露糖醛酸比2)溶液混合，细胞密度为6×106cells/mL，滴加到100mM氯化钙溶液中，反应30min，形成含有血管内皮细胞的海藻酸钙微胶珠，并使用含有10％血清的DMEM培养液培养10天。之后，使用50mM柠檬酸钠溶液溶解微胶珠，反应时间10min，离心(5000rpm，10min，4℃)收集上清液。然后将此上清液倒入透析袋(MWCO3500)，使用纯净水在4℃下避光透析3天，搅拌速率200rpm，每天换水4次。之后，将得到的溶液进行冷冻干燥3天，条件为-50℃，真空度2×10-2毫巴。将得到的絮状物质溶解在生理盐水中，浓度2％(W/V)(单位为g/mL)，并加入肝癌细胞系LM3，细胞密度2×106cells/mL，添加含有10％血清的DMEM培养液培养14天，作为仿生凝胶实验组。使用经过上述处理的但未培养过血管内皮细胞的海藻酸钠包埋LM3细胞，作为对照组。细胞培养结束后，使用柠檬酸钠溶液收集实验组以及对照组的LM3细胞，检测MMP蛋白表达以及进行Transwell侵袭实验，评价LM3侵袭能力的变化。
实验发现，仿生凝胶实验组中的LM3细胞生长良好，呈细胞团生长(图1)，其MMP蛋白表达高于二维细胞以及对照组(图2)，其Transwell细胞侵袭能力也最高(图3)。这些结果说明脱细胞海藻酸钠仿生水凝胶显著促进了肿瘤细胞转移。
实施例2：脱细胞海藻酸钠仿生水凝胶促进干细胞定向分化与增殖
将神经母细胞瘤细胞与浓度为1.8％(g/mL)的海藻酸钠(分子量500kDa，古罗糖醛酸和甘露糖醛酸比1)溶液混合，细胞密度为8×106cells/mL，滴加到200mM氯化钙溶液中，反应30min，形成含有神经母细胞瘤细胞的海藻酸钙微胶珠，并使用含有10％血清的DMEM培养液培养10天。之后，使用50mM柠檬酸钠溶液溶解微胶珠，反应时间10min，高速离心(5000rpm，10min，4℃)收集上清液。然后将此上清液倒入透析袋(MWCO3500)，使用纯净水在4℃下避光透析3天，搅拌速率200rpm，每天换水4次。之后，将得到的溶液进行冷冻干燥3天，条件为-50℃，真空度2×10-2毫巴。将得到的絮状物质溶解在生理盐水中，浓度3％(W/V)(单位为g/mL)，并加入第4代人脐带间充质干细胞，细胞密度3×106cells/mL，添加含有1％N2的DMEM/F12培养液培养7天，作为仿生凝胶实验组。使用经过上述处理的但未培养过神经母细胞瘤细胞的海藻酸钠包埋干细胞，作为对照组。细胞培养结束后，使用柠檬酸钠溶液收集实验组以及对照组的分化细胞，检测Nestin细胞比例以及数量，评价干细胞的定向分化。
实验发现，仿生凝胶实验组中的Nestin阳性细胞比例以及数量均高于对照组(图4与5)，这说明脱细胞海藻酸钠仿生水凝胶显著促进了干细胞的定向分化与增殖。
实施例3：脱细胞海藻酸钠仿生水凝胶提高肝细胞功能
将成纤维细胞与浓度为2％(g/mL)的海藻酸钠(分子量400kDa，古罗糖醛酸和甘露糖醛酸比1)溶液混合，细胞密度为1×107cells/mL，滴加到200mM氯化钙溶液中，反应30min，形成含有成纤维细胞的海藻酸钙微胶珠，并使用含有10％血清的DMEM培养液培养10天。之后，使用50mM柠檬酸钠溶液溶解微胶珠，反应时间10min，高速离心(5000rpm，10min，4℃)收集上清液。然后将此上清液倒入透析袋(MWCO3500)，使用纯净水在4℃下避光透析3天，搅拌速率200rpm，每天换水4次。之后，将得到的溶液进行冷冻干燥3天，条件为-50℃，真空度2×10-2毫巴。将得到的絮状物质溶解在生理盐水中，浓度3％(W/V)(单位为g/mL)，并加入HepG2细胞，细胞密度2×106cells/mL，添加含有10％血清的MEM培养液培养14天，作为仿生凝胶实验组。使用经过上述处理的但未培养过成纤维细胞的海藻酸钠包埋HepG2细胞，作为对照组。另外，将较低的成纤维细胞接种密度(4×106cells/mL)组(低成纤维细胞组)以及较高的HepG2细胞接种密度(1×107cells/mL)组(高HepG2细胞组)也作为对照组。培养结束后，使用柠檬酸钠溶液收集实验组、对照组、低成纤维细胞组及高HepG2细胞组的肝细胞，检测肝细胞外泌白蛋白的水平以及CYP3A4基因表达，评价肝细胞的功能变化。
实验发现，仿生凝胶实验组中的外泌白蛋白的水平与CYP3A4基因表达均高于对照组，并且降低成纤维细胞密度或者提高HepG2细胞密度将导致肝细胞功能下降(图6与7)。这些结果说明脱细胞海藻酸钠仿生水凝胶与未修饰水凝胶相比能显著提高肝细胞功能，并且成纤维细胞以及HepG2细胞的密度两个参数对肝细胞功能有明显影响。
Claims (10)
1.一种脱细胞海藻酸钠仿生水凝胶的制备方法，其特征在于：将A细胞和海藻酸钠溶液混合，经过钙化反应形成含A细胞的海藻酸钙微胶珠，培养之后使用柠檬酸钠溶液溶解该微胶珠，并离心去除A细胞，再将获得的溶液透析去除柠檬酸钠，并冷冻干燥，之后再复溶成溶液，并混合B细胞，经过钙化反应形成含有A细胞分泌的因子、蛋白及细胞外基质的能够调控B细胞生理功能的海藻酸钠仿生水凝胶。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述海藻酸钠的分子量为100-1000kDa，海藻酸钠分子中古罗糖醛酸和甘露糖醛酸比例(G/M)为0.2-3:1，海藻酸钠溶液浓度为1-3％(W/V)，单位为g/mL。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述钙化反应为将含有细胞的海藻酸钠溶液滴加到100-200mM的氯化钙溶液(凝胶浴)中，反应30min。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述柠檬酸钠溶液浓度为50mM，溶解微胶珠的反应时间为5-10min。
5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述离心的离心条件为5000rpm，10min，4℃；所述的透析条件为4℃下使用纯净水避光透析3天，搅拌速率200rpm，每天换水4次，透析袋截留分子量3500；所述的冷冻干燥条件为-50℃，真空度1×10-2毫巴以上，冷冻干燥3天。
6.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述复溶溶液的浓度为1-3％(W/V)，单位为g/mL。
7.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述A细胞和B细胞的选择是依据A细胞对B细胞的功能具有调控作用，具体配对包括：
当B细胞是肝细胞时，A细胞为成纤维细胞、血管内皮细胞、间充质干细胞、转基因细胞一种或二种以上；
当B细胞是干细胞时，A细胞为神经细胞、肝细胞、心肌细胞、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、转基因细胞中的一种；
当B细胞是肿瘤细胞时，A细胞为成纤维细胞、血管内皮细胞、间充质干细胞、转基因细胞一种或二种以上。
8.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述A细胞和海藻酸钠溶液混合，A细胞在海藻酸钠溶液中的密度为6×106-2×107cells/mL。
9.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述B细胞在复溶海藻酸钠溶液中的密度为1×106-6×106cells/mL。
10.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述B细胞的生理功能包括生长、活性、迁移、转移、分化、合成、解毒、耐药。
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