CN103849567A

CN103849567A - 非接触共培养诱导干细胞体外三维定向分化的生物反应器

Info

Publication number: CN103849567A
Application number: CN201210520526.3A
Authority: CN
Inventors: 马小军; 刘洋; 刘畅; 孙广炜; 于炜婷
Original assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Current assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date: 2012-12-06
Filing date: 2012-12-06
Publication date: 2014-06-11

Abstract

本发明涉及一种非接触共培养诱导干细胞体外三维定向分化的生物反应器。所述生物反应器为一用于细胞培养的容器，于容器中设有一个或二个以上的分隔网，将容器分隔成二个以上的腔室；包埋有诱导细胞的海藻酸钠微胶囊和包埋有干细胞的海藻酸钙微胶珠分别置于不同的腔室中，从而在同一体系中实现了两种或两种以上细胞在三维生长条件下的非接触动态共培养；该反应器通过微胶囊内诱导细胞分泌的诱导因子促进干细胞在三维条件下的定向分化；在分化结束后，可获得含有分化细胞的微胶珠，利用柠檬酸钠溶液溶解该微胶珠，最后可获得分化细胞。本发明操作简单，成本低，生物反应器的分隔网使得微胶囊和微胶珠彻底分离，避免了两种载体的混合。

Description

非接触共培养诱导干细胞体外三维定向分化的生物反应器

技术领域

本发明涉及干细胞及组织工程领域，是一种非接触共培养诱导干细胞体外三维定向分化的生物反应器。

背景技术

干细胞是具有自我更新能力和多向分化潜能的干细胞，它能够向神经、心肌、肝、成软骨等细胞类型分化，是修复体内受损组织的理想种子细胞，在细胞治疗、外科整形及组织工程等方面具有重要的研究和临床应用价值。已有研究表明，将干细胞直接植入受损组织时，其修复的效果不理想，并常伴有并发症，如心率失常等。这是由于受损组织的微环境已被破坏，干细胞识别此微环境的能力下降，定向分化效率降低。另外，由于干细胞可多向分化，直接将其植入体内还可能产生肿瘤。因此，干细胞在植入人体之前，应在体外先进行初步定向诱导分化，使其成为定向祖细胞，以提高其在体内向受损组织类型继续分化的效率，并降低临床应用的风险。

目前，体外调控干细胞定向分化有两种模式：1)含有化学试剂、生长因子的条件培养液诱导模式；2)使用成熟体细胞促进干细胞分化的共培养诱导模式。虽然一些化学试剂和外源生长因子等有促进干细胞定向分化的作用，但是单靠有限种类的细胞因子组合难以维持细胞正常的生理功能，并且化学试剂的毒性可能刺激干细胞发生变异，因此使用条件培养液不仅诱导效果有限，还会增加临床应用的风险。共培养诱导模式是使用诱导细胞来促进干细胞定向分化，可进一步模拟体内多种细胞共存的生长微环境，获得的分化细胞具有较高的生理功能。共培养模式可分为直接接触与非接触共培养方式。直接接触共培养方式是将体细胞和干细胞共同培养在同一个体系中，两者直接接触，这种方式存在着干细胞分离纯化困难、免疫安全性差、容易引起病毒传播等严重问题，不能应用于临床。非接触共培养方式，如常用的Transwell体系，依靠聚碳酸酯膜等分离膜将两种细胞分隔开，在同一体系中实现两种细胞共培养，解决了不同细胞的分离问题。然而，Transwell体系中细胞以二维方式生长，与体内细胞真实生长状况差别较大，大量研究表明体外二维培养体系使得细胞丢失其在体内具有的正常生物学性状，而体外三维培养则较好地维持了细胞功能。另外，Transwell体系基于为24孔板或6孔板，体系规模很小，价格昂贵，半透膜的作用面积有限，内部缺乏流体流动，存在严重的物质浓度梯度，这使得现有的Transwell体系在规模、效率以及成本等方面均不能满足未来临床应用的大量需求。因此，急需研发一种便捷实用的、低成本的、可规模化操作的非接触共培养诱导干细胞体外三维定向分化的生物反应器，以实现调控干细胞体外三维定向分化的目的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种非接触共培养诱导干细胞体外三维定向分化的生物反应器，其既能促进干细胞在三维条件下向诱导细胞类型体外定向分化，同时也实现了诱导细胞的去除以及分化细胞的收获。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

所述生物反应器为一用于细胞培养的容器，于容器中设有一个或二个以上的分隔网，将容器分隔成二个以上的腔室；包埋有诱导细胞的海藻酸钠微胶囊和包埋有干细胞的海藻酸钙微胶珠分别置于不同的腔室中，从而在同一体系中实现了两种或两种以上细胞在三维生长条件下的非接触动态共培养；该反应器通过微胶囊内诱导细胞分泌的诱导因子促进干细胞在三维条件下的定向分化；在分化结束后，可获得含有分化细胞的微胶珠，利用柠檬酸钠溶液溶解该微胶珠，最后可获得分化细胞。

所述分隔网的材质包括金属或非金属；

金属包括碳素钢、或包含铁、锌、锰、铜、镍、银元素中一种或二种以上的合金钢；

非金属包括聚碳酸酯、聚乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚酯树脂、或聚甲基丙烯酸甲酯；

分隔网的目数范围从10到100。

所述干细胞包括胚胎干细胞、iPS细胞、或间充质干细胞，诱导细胞包括体细胞或细胞系；

干细胞和诱导细胞可以是同源同种细胞、同源异种细胞、异源异种细胞；

调控干细胞向神经细胞分化的诱导细胞包括神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞、髓鞘细胞、或神经组织来源的肿瘤细胞系；

调控干细胞向心肌细胞分化的诱导细胞包括；原代心肌细胞或心肌细胞系；

调控干细胞向肝细胞分化的诱导细胞包括原代肝实质细胞、原代内皮细胞、内皮细胞系、肝星状细胞、成纤维细胞、3T3细胞系、或肝组织来源的肿瘤细胞系；

调控干细胞向胰岛细胞分化的诱导细胞包括原代胰岛或β-胰岛细胞；

调控干细胞向成骨细胞分化的诱导细胞包括原代成骨细胞或骨组织来源的肿瘤细胞系；

调控干细胞向软骨细胞分化的诱导细胞包括原代软骨细胞或软骨细胞系；

调控干细胞向脂肪细胞分化的诱导细胞为原代脂肪细胞。

所述定向分化包括干细胞向神经、心肌、肝、胰岛、成骨、软骨、或脂肪组织的细胞定向分化。

所述海藻酸钠微胶囊为海藻酸钠/聚赖氨酸微胶囊或海藻酸钠/壳聚糖微胶囊，直径范围为200-2000微米；

所述海藻酸钙微胶珠由海藻酸钠和钙离子反应形成，直径范围200-2000微米；

海藻酸钠的分子量为100-1000kDa，G/M比范围为0.2-3，且海藻酸钠为未修饰海藻酸钠、精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸（RGD）修饰海藻酸钠、异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-缬氨酸（IKVAV）修饰海藻酸钠、酪氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-丝氨酸-精氨酸（YIGSR）修饰海藻酸钠中一种或二种以上的海藻酸钠；

海藻酸钠微胶囊以及海藻酸钙微胶珠含有胶原、硫酸软骨素、或透明质酸，其中海藻酸钠所占的质量比例为40%-100%。

所述生物反应器为一用于细胞培养的容器，于容器内设置有一个或二个以上的载体分隔网，载体分隔网将容器分隔成二个以上的腔室；

于容器上设有培养液进口和培养液出口，培养液进口和培养液出口分别通过管路与储液罐相连，储液罐内设一气体渗透管，导气管二端为气体进口和气体出口，气体进口分别经气泵与空气气源和二氧化碳气源相连，气体出口放空；

于培养液进口和培养液出口与储液罐间的连接管路上分别设有阻挡细胞的隔离膜；

于培养液进口或培养液出口与储液罐间的连接管路上设有蠕动泵。

容器置于一控温箱内，含干细胞的微胶珠和含诱导细胞的微胶囊分别置于容器内的不同腔室中。

于容器内被载体分隔网分隔的每个腔室的容器侧壁上均设有载体进出口。

本发明具有如下优点：

1．操作简单，成本低。本发明利用海藻酸钠微胶囊和海藻酸钙微胶珠作为细胞三维培养载体，容易制备，避免使用昂贵材料和工艺，并且所建立的灌注式生物反应器系统未使用特殊部件；

2.能够很好地模拟体内细胞生长三维微环境，提高干细胞分化效率。一方面，微胶囊和微胶珠可为细胞提供近似体内的三维生长微环境，实现细胞高活性、高功能生长；另一方面，诱导细胞和干细胞的共培养方式进一步模拟了体内组织细胞和干细胞之间的相互作用，从而本发明实现了干细胞在近似体内环境中的定向分化，除了诱导效果的提高，还避免了有毒性化学诱导剂以及昂贵生长因子组合的使用；

3．能够实现分化细胞和诱导细胞的分离和收获，保证应用的安全性。微胶囊膜能够将干细胞和诱导细胞进行免疫隔离，避免了两者的免疫反应，且灌注式生物反应器中使用了分隔网，避免了两种载体的混合。共培养结束后诱导细胞的微胶囊可以完全去除，获得含有分化细胞的微胶珠，使用柠檬酸钠盐溶液溶解微胶珠，通过离心在生理条件下可最终收获高活性的分化细胞；

4．可实现动态大规模干细胞三维诱导分化。由于微胶囊和微胶珠体积小，密度低，表面积大，容易悬浮，因此该生物反应器适合进行动态共培养诱导，可加强诱导因子的质量传递，以实现大规模诱导干细胞体外三维定向分化；

5．应用范围广。由于微胶囊的免疫隔离特性，本发明方法可使用多来源异体、异种的诱导细胞(体细胞或细胞系)进行诱导；可促进多来源干细胞体外定向分化，分化的目的细胞类型可包括神经、心肌、肝、胰岛、成骨、软骨、或脂肪细胞等，具有广泛的临床应用前景。

附图说明

图1A和B为生物反应器的示意图：细胞培养容器1，含干细胞的微胶珠2，含诱导细胞的微胶囊3，控温箱4，隔离膜5，蠕动泵6，储液罐7，气体进口8，气体出口9，气体渗透管10，分隔网11，培养液进口12，培养液出口13，载体进出口14；

图2微囊化神经母细胞瘤细胞(A)和微胶珠中干细胞(B)的明场照片；

图3干细胞向神经前体细胞分化的标志物Nestin基因表达情况；

图4干细胞向神经前体细胞分化的Nestin阳性细胞百分比；

图5动态共培养体系获得的神经前体细胞向神经元(A)以及星型胶质细胞(B)继续分化的荧光染色照片；

图6微囊化C2C12细胞(A)和微胶珠中干细胞(B)的明场照片；

图7干细胞向心肌祖细胞分化的早期标志物GATA4基因表达情况；

图8动态共培养体系获得的心肌祖细胞向成熟心肌细胞继续分化的β-MyHC(A)和Nkx2.5(B)荧光染色照片。

具体实施方式

生物反应器系统：由用于细胞培养的容器1，含干细胞的微胶珠2，含诱导细胞的微胶囊3，控温箱4，隔离膜5，蠕动泵6，储液罐7，气体进口8，气体出口9，气体渗透管10，分隔网11，培养液进口12，培养液出口13，载体进出口14构成（图1A和B）；

生物反应器系统包括一用于细胞培养的容器1，于容器1内设置有一个或二个以上的分隔网11，分隔网11将容器分隔成二个以上的腔室；

于容器1上设有培养液进口12和培养液出口13，培养液进口12和培养液出口13分别通过管路与储液罐7相连，储液罐内设一气体渗透管10，导气管二端为气体进口8和气体出口9，气体进口8分别经气泵与空气气源和二氧化碳气源相连，气体出口9放空；

于培养液进口12和培养液出口13与储液罐7间的连接管路上分别设有隔离膜5；

于培养液进口12或培养液出口13与储液罐7间的连接管路上设有蠕动泵6；

容器1置于一控温箱4内，含干细胞的微胶珠2和含诱导细胞的微胶囊3分别置于容器1内的二个不同腔室中；

于容器1内被分隔网11分隔的每个腔室的容器侧壁上均设有载体进出口14。

实施例1：非接触动态共培养诱导间充质干细胞体外三维定向分化为神经前体细胞

首先，制备精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(RGD)、异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-缬氨酸(IKVAV)、酪氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-丝氨酸-精氨酸(YIGSR)多肽修饰的海藻酸钠。将海藻酸钠(分子量430kDa，古罗糖醛酸和甘露糖醛酸比1.5)溶解于含有0.5M NaCl的0.1M 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液中(pH值6.5)，得到1%(W/V)海藻酸钠溶液。再加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)，N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)和单一种类的多肽，室温搅拌反应24小时。EDC和海藻酸钠摩尔比为1:20，EDC和sulfo-NHS摩尔比为2:1，多肽和海藻酸钠质量比为1:1000。然后进行透析并冷冻干燥，从而得到多肽修饰的海藻酸钠。之后，将上述三种多肽修饰的海藻酸钠粉末分别溶解于生理盐水中，溶液浓度均为1.5%(W/V)，并配置体积比为1:1:1的三种多肽修饰海藻酸钠的混合溶液，混合溶液终浓度仍为1.5%(W/V)。

将人神经母细胞瘤细胞与1.5%(W/V)的RGD单独修饰海藻酸钠溶液混合，调整细胞密度为2×10⁶cells·mL^-1，将该细胞悬液经过注射器泵滴入100mmol·L^-1 CaCl₂溶液中钙化20min，得到海藻酸钙微胶珠。将海藻酸钙微胶珠与0.05%(W/V)的聚赖氨酸反应成膜10min，形成非液化的海藻酸钠/聚赖氨酸微胶囊，再与0.15%(W/V)海藻酸钠溶液反应5min，最后用55mmol·L^-1柠檬酸钠液化5min，就得到了包埋有人神经母细胞瘤细胞的海藻酸钠/聚赖氨酸/海藻酸钠微胶囊。将此微胶囊使用DMEM/F12培养基洗涤3次，之后按1:10的体积比(微胶囊:培养液)加入含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养液，置于培养箱培养3天。

将第5代人脐带间充质干细胞与上述1.5%(W/V)含有三种多肽的海藻酸钠混合溶液进行混合，调整细胞密度为4×10⁶cells·mL^-1，将该细胞悬液经过注射器泵滴入100mmol·L^-1CaCl₂溶液中钙化20min，得到含有干细胞的海藻酸钙微胶珠，使用DMEM/F12培养基洗涤3次，再加入含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养液，置于培养箱培养3天。

之后，将生物反应器的容器(总体积50ml)、培养液和气体管路高压灭菌，在无菌环境下与蠕动泵、隔离膜、控温箱等相连接(如图1所示)。使用PBS以及含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养液润洗反应器以及管路，之后用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养液灌满整个管路，控制温度37℃。再将含有神经母细胞瘤细胞的微胶囊以及含有干细胞的微胶珠分别接种在反应器容器的三个腔室中，后者接种在中间腔室，前者接种在其上下的两个腔室，前者和后者的接种体积比例为2:1，即两种细胞接种数量之比为1:1。排除气泡后，启动蠕动泵，泵速5ml·min^-1，并开动气体循环，气体预先通过无菌过滤膜，由5%CO₂和95%空气构成，气体流量50ml·min^-1，通过气体渗透管将气体中的氧气和二氧化碳扩散到储液罐中的培养液中，动态共培养4天。同时设立对照组，使用含有10ng·mL^-1 EGF和bFGF的DMEM/F12培养液诱导在微胶珠中三维培养的干细胞以及在培养瓶中二维培养的干细胞，培养4天。

动态共培养4天之后，关闭控温装置、蠕动泵和气泵。使用培养液将反应器腔室中的含有分化细胞的微胶珠冲洗出来，培养液洗涤3次。共培养组和对照组均加入微胶珠体积10倍的55mmol·L^-1柠檬酸钠溶液10min，以溶解微胶珠，之后离心收获分化细胞，分析其神经前体细胞标志Nestin的基因表达以及Nestin阳性细胞的百分比，并将其接种到培养板中，贴壁后加入含有10%血清的DMEM/F12培养液，继续分化1周，通过进行β-tubulin Ⅲ和GFAP荧光染色来检测获得的神经前体细胞向神经元和星型胶质细胞分化的能力。

实验结果见图2-5，结果显示，动态三维共培养获得的分化细胞与使用生长因子诱导的二维以及三维分化细胞相比，其Nestin的基因表达与阳性细胞百分比显著升高，Nestin阳性细胞百分比约为40%，并且具有向成熟神经细胞分化的能力，这说明此生物反应器能够显著促进干细胞向神经前体细胞分化并维持了其继续向成熟神经细胞分化的能力。

实施例2：非接触动态共培养诱导间充质干细胞体外三维定向分化为心肌祖细胞

首先，按照实施例1的方法制备精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(RGD)修饰的海藻酸钠粉末。再将RGD修饰的海藻酸钠粉末溶解于生理盐水中，溶液浓度为1.5%(W/V)。

将C2C12细胞与1.5%(W/V)的RGD修饰海藻酸钠溶液混合，调整细胞密度为2×10⁶cells·mL^-1，将该细胞悬液经过注射器泵滴入100mmol·L^-1 CaCl₂溶液中钙化20min，得到海藻酸钙微胶珠。将海藻酸钙微胶珠与0.5%(W/V)分子量6万的壳聚糖反应成膜10min，形成非液化的海藻酸钠/壳聚糖微胶囊膜，再与0.15%(W/V)海藻酸钠溶液反应5min，最后用55mmol·L^-1柠檬酸钠液化5min，就得到了包埋有C2C12细胞的海藻酸钠/壳聚糖/海藻酸钠微胶囊。将此微胶囊使用DMEM培养基洗涤3次，之后按1:10的体积比(微胶囊:培养液)加入含有10%胎牛血清的DMEM培养液，置于培养箱培养3天。

将第5代人脐带间充质干细胞与1.5%(W/V)RGD修饰的海藻酸钠溶液混合，调整细胞密度为4×10⁶cells·mL^-1，将该细胞悬液经过注射器泵滴入100mmol·L^-1CaCl₂溶液中钙化20min，得到含有干细胞的海藻酸钙微胶珠，使用DMEM培养基洗涤3次，再加入含有10%胎牛血清的DMEM培养液，置于培养箱培养3天。

之后，按照实施例1中的方法建立动态共培养系统，并按相同条件接种2种细胞进行共培养7天，培养液为含有10%胎牛血清的DMEM培养液。同时设立对照组，使用10μg·mL^-15氮胞苷处理24小时后，加入含有10%胎牛血清的DMEM培养液诱导在微胶珠中三维培养的干细胞以及在培养瓶中二维培养的干细胞，培养7天。

动态共培养7天之后，关闭控温装置、蠕动泵和气泵。使用培养液将反应器腔室中的含有分化细胞的微胶珠冲洗出来，培养液洗涤3次。共培养组和对照组均加入微胶珠体积10倍的55mmol·L^-1柠檬酸钠溶液10min，以溶解微胶珠，之后离心收获分化细胞，分析其心肌祖细胞标志GATA4的基因表达，并将其接种到培养板中，贴壁后加入含有10%血清的DMEM培养液，继续分化1周，通过进行β-MyHC和Nkx2.5荧光染色来检测获得的心肌祖细胞向心肌细胞分化的能力。

实验结果见图6-8，结果显示，动态三维共培养获得的分化细胞与使用生长因子诱导的二维以及三维分化细胞相比，其GATA4的基因表达显著升高，继续分化以后，β-MyHC和Nkx2.5荧光染色呈现阳性，这说明此非接触动态共培养体系能够显著促进干细胞向心肌祖细胞分化并保持了其继续分化为心肌细胞的能力。

Claims

1.非接触共培养诱导干细胞体外三维定向分化的生物反应器，其特征在于：所述生物反应器为一用于细胞培养的容器，于容器中设有一个或二个以上的分隔网，将容器分隔成二个以上的腔室；包埋有诱导细胞的海藻酸钠微胶囊和包埋有干细胞的海藻酸钙微胶珠分别置于不同的腔室中，从而在同一体系中实现了两种或两种以上细胞在三维生长条件下的非接触动态共培养；该反应器通过微胶囊内诱导细胞分泌的诱导因子促进干细胞在三维条件下的定向分化；在分化结束后，可获得含有分化细胞的微胶珠，利用柠檬酸钠溶液溶解该微胶珠，最后可获得分化细胞。

2.按照权利要求1所述的生物反应器，其特征在于：

所述分隔网的材质包括金属或非金属；

分隔网的目数范围从10到100。

3.按照权利要求1所述的生物反应器，其特征在于：

调控干细胞向脂肪细胞分化的诱导细胞为原代脂肪细胞。

4.按照权利要求1所述的生物反应器，其特征在于：

5.按照权利要求1所述的生物反应器，其特征在于：

6.按照权利要求1所述的生物反应器，其特征在于：

所述生物反应器为一用于细胞培养的容器，于容器（1）内设置有一个或二个以上的载体分隔网（11），载体分隔网（11）将容器分隔成二个以上的腔室；

于容器（1）上设有培养液进口（12）和培养液出口（13），培养液进口（12）和培养液出口（13）分别通过管路与储液罐（7）相连，储液罐内设一气体渗透管（10），导气管二端为气体进口（8）和气体出口（9），气体进口（8）分别经气泵与空气气源和二氧化碳气源相连，气体出口（9）放空；

于培养液进口（12）和培养液出口（13）与储液罐（7）间的连接管路上分别设有阻挡细胞的隔离膜（5）；

于培养液进口（12）或培养液出口（13）与储液罐（7）间的连接管路上设有蠕动泵（6）。

7.按照权利要求6所述的生物反应器，其特征在于：

容器（1）置于一控温箱（4）内，含干细胞的微胶珠（2）和含诱导细胞的微胶囊（3）分别置于容器（1）内的不同腔室中。

8.按照权利要求6所述的生物反应器，其特征在于：

于容器（1）内被载体分隔网（11）分隔的每个腔室的容器侧壁上均设有载体进出口（14）。