CN112458078A - 一种诱导干细胞定向分化的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种诱导干细胞定向分化的方法，其方法包括如下步骤：选取信号发生器、功率放大器和超声换能器，并将它们之间通过导线连接，信号发生器与功率放大器连接，功率放大器分别与电源和超声换能器连接，再选取培养皿以及与其配合使用的夹持器；本发明利用超声装置所产生的超声波作用于体外培养的干细胞，联合或不联合现有干细胞定向诱导方法对干细胞进行定向分化诱导，以解决目前干细胞诱导成功率和成活率低等问题，而且可根据实验需求，通过调节设备及参数，可以控制干细胞分化方向和速度，同时搭配目标细胞进行共培养，可提高干细胞分化为目标细胞的效率，给干细胞技术发展带来重大突破。
Description
技术领域
本发明涉及干细胞培养技术领域，具体为一种诱导干细胞定向分化的方法。
背景技术
干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，它可以分化成多种功能细胞，具有经培养不定期地分化并产生特化细胞的能力。根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞和成体干细胞，越来越多的证据表明，当成体干细胞被移植入受体时，它们表现出很强的可塑性。干细胞技术的发展可为腰椎间盘突出、血液疾病、视网膜蜕变等诸多人类疾病带来福音，移植入体的干细胞可部分分化为病变部位所需的细胞，对退行性疾病起到治疗作用。
目前常用的诱导干细胞分化的方法有：
1.自发分化法：自发分化法即不添加任何外源因子，使干细胞自发分化，这是研究者最先尝试的一种诱导分化方法。自发分化不需要添加外源因子、操作简单，是相对简单的一种分化方法。但分化效率低下(<1％)、细胞分化不同步，获得的细胞需要长时间分选和纯化后才能用于后续研究。
2.共培养诱导分化法：共培养诱导分化体系中，用于共培养的各种细胞通过分泌因子释放到培养液中，可一定程度上提高干细胞的分化效率，但是具体发挥作用的因子及其机制目前并不清楚，且其潜在的异源细胞污染为临床应用带来了隐患。
上述方法均存在诱导率和成活率低等问题，这也是阻碍干细胞技术发展的重要因素。
发明内容
本发明的目的在于提供一种诱导干细胞定向分化的方法，具备干细胞诱导成功率和成活率高，且分化效率高的优点，解决了上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种诱导干细胞定向分化的方法，其方法包括如下步骤：
(1)准备工作：选取信号发生器、功率放大器和超声换能器，并将它们之间通过导线连接，信号发生器与功率放大器连接，功率放大器分别与电源和超声换能器连接，再选取培养皿以及与其配合使用的夹持器，同时选取超声探头夹持器用于配合超声换能器；
(2)干细胞接种：在培养皿内侧的底部放置一个环形垫片，将干细胞接种在该环形垫片所形成的环形区域内；
(3)细胞共生培养：将目标细胞和接种后的干细胞进行混合，然后把培养皿置于培养箱中培养，之后取出加入海藻酸钠溶液，配置成一定细胞密度的细胞悬液，同时向其中添加溶液，使它们发生反应；
(4)超声波作用：将超声换能器的超声探头通过夹持器置于步骤(3)处理后的培养皿上方，并通过固定装置将两者进行固定；
(5)诱导过程：信号发生器发出电信号经功率放大器放大后再经超声换能器将电信号转换为声信号(超声波)，超声波穿透培养皿作用于体外培养的干细胞，通过机械作用、热作用和空化作用多重机制对干细胞分化起到诱导作用。
优选的，所述步骤(1)中，超声换能器包括但不限于线阵、环阵、弧面阵、平面阵、柔性超声换能器或MEMS超声换能器，超声探头夹持器和培养皿夹持器为任何与之适配的夹持器。
优选的，所述步骤(2)中，干细胞包括但不限于胚胎干细胞、骨髓间充质干细胞或间充质干细胞。
优选的，所述步骤(2)-(3)中，环形垫片的厚度为10-200μm，所添加混合溶液的高度为2-3mm。
优选的，所述步骤(3)中，向细胞悬液中添加的溶液为含有钙离子的溶液，以此制成细胞凝胶作为超声介质，钙离子溶液和细胞悬液中发生的反应为离子反应。
优选的，所述步骤(3)中，海藻酸钠溶液的PH值为5-9，细胞悬液的细胞密度为6×106个/mL，海藻酸钠溶液的质量分数为1.0-1.5％。
优选的，所述步骤(3)中，培养箱中的温度稳定在37℃，CO2水平稳定在5％，pH值稳定在7.2-7.4，相对饱和湿度稳定在95％。
优选的，所述步骤(3)中，培养皿通过配合使用的夹持器进行取出，且其取出的标准为培养皿中的细胞出现细胞贴壁现象。
优选的，所述步骤(5)中，超声参数选择：通过搭配不同的波形、脉宽、脉冲重复频率、辐照总时间和声压对干细胞分化诱导速度及进行控制。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明利用超声装置所产生的超声波作用于体外培养的干细胞，联合或不联合现有干细胞定向诱导方法对干细胞进行定向分化诱导，以解决目前干细胞诱导成功率和成活率低等问题，而且可根据实验需求，通过调节设备及参数，可以控制干细胞分化方向和速度，同时搭配目标细胞进行共培养，可提高干细胞分化为目标细胞的效率，给干细胞技术发展带来重大突破。
具体实施方式
下面将结合本发明中的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种诱导干细胞定向分化的方法，其方法包括如下步骤：
(1)准备工作：选取信号发生器、功率放大器和超声换能器，并将它们之间通过导线连接，信号发生器与功率放大器连接，功率放大器分别与电源和超声换能器连接，再选取培养皿以及与其配合使用的夹持器，同时选取超声探头夹持器用于配合超声换能器；
(2)干细胞接种：在培养皿内侧的底部放置一个环形垫片，将干细胞接种在该环形垫片所形成的环形区域内；
(3)细胞共生培养：将目标细胞和接种后的干细胞进行混合，然后把培养皿置于培养箱中培养，之后取出加入海藻酸钠溶液，配置成一定细胞密度的细胞悬液，同时向其中添加溶液，使它们发生反应；
(4)超声波作用：将超声换能器的超声探头通过夹持器置于步骤(3)处理后的培养皿上方，并通过固定装置将两者进行固定；
(5)诱导过程：信号发生器发出电信号经功率放大器放大后再经超声换能器将电信号转换为声信号(超声波)，超声波穿透培养皿作用于体外培养的干细胞，通过机械作用、热作用和空化作用多重机制对干细胞分化起到诱导作用。
实施例一：
一种诱导干细胞定向分化的方法，其方法包括如下步骤：
(1)准备工作：选取信号发生器、功率放大器和超声换能器，并将它们之间通过导线连接，信号发生器与功率放大器连接，功率放大器分别与电源和超声换能器连接，再选取培养皿以及与其配合使用的夹持器，同时选取超声探头夹持器用于配合超声换能器，超声换能器包括但不限于线阵、环阵、弧面阵、平面阵、柔性超声换能器或MEMS超声换能器，超声探头夹持器和培养皿夹持器为任何与之适配的夹持器；
(2)干细胞接种：在培养皿内侧的底部放置一个环形垫片，环形垫片的厚度为10-200μm，将干细胞接种在该环形垫片所形成的环形区域内，干细胞包括但不限于胚胎干细胞、骨髓间充质干细胞或间充质干细胞；
(3)细胞共生培养：将目标细胞和接种后的干细胞进行混合，然后把培养皿置于培养箱中培养，之后取出加入海藻酸钠溶液，配置成一定细胞密度的细胞悬液，同时向其中添加溶液，使它们发生反应，所添加混合溶液的高度为2-3mm；
(4)超声波作用：将超声换能器的超声探头通过夹持器置于步骤(3)处理后的培养皿上方，并通过固定装置将两者进行固定；
(5)诱导过程：信号发生器发出电信号经功率放大器放大后再经超声换能器将电信号转换为声信号(超声波)，超声波穿透培养皿作用于体外培养的干细胞，通过机械作用、热作用和空化作用多重机制对干细胞分化起到诱导作用。
实施例二：
一种诱导干细胞定向分化的方法，其方法包括如下步骤：
(1)准备工作：选取信号发生器、功率放大器和超声换能器，并将它们之间通过导线连接，信号发生器与功率放大器连接，功率放大器分别与电源和超声换能器连接，再选取培养皿以及与其配合使用的夹持器，同时选取超声探头夹持器用于配合超声换能器，超声换能器包括但不限于线阵、环阵、弧面阵、平面阵、柔性超声换能器或MEMS超声换能器，超声探头夹持器和培养皿夹持器为任何与之适配的夹持器；
(2)干细胞接种：在培养皿内侧的底部放置一个环形垫片，环形垫片的厚度为10-200μm，将干细胞接种在该环形垫片所形成的环形区域内，干细胞包括但不限于胚胎干细胞、骨髓间充质干细胞或间充质干细胞；
(3)细胞共生培养：将目标细胞和接种后的干细胞进行混合，然后把培养皿置于培养箱中培养，之后取出加入海藻酸钠溶液，配置成一定细胞密度的细胞悬液，同时向其中添加溶液，使它们发生反应，所添加混合溶液的高度为2-3mm，向细胞悬液中添加的溶液为含有钙离子的溶液，以此制成细胞凝胶作为超声介质，钙离子溶液和细胞悬液中发生的反应为离子反应，海藻酸钠溶液的PH值为5-9，细胞悬液的细胞密度为6×106个/mL，海藻酸钠溶液的质量分数为1.0-1.5％，培养箱中的温度稳定在37℃，CO2水平稳定在5％，pH值稳定在7.2-7.4，相对饱和湿度稳定在95％；
(4)超声波作用：将超声换能器的超声探头通过夹持器置于步骤(3)处理后的培养皿上方，并通过固定装置将两者进行固定；
(5)诱导过程：信号发生器发出电信号经功率放大器放大后再经超声换能器将电信号转换为声信号(超声波)，超声波穿透培养皿作用于体外培养的干细胞，通过机械作用、热作用和空化作用多重机制对干细胞分化起到诱导作用。
实施例三：
一种诱导干细胞定向分化的方法，其方法包括如下步骤：
(1)准备工作：选取信号发生器、功率放大器和超声换能器，并将它们之间通过导线连接，信号发生器与功率放大器连接，功率放大器分别与电源和超声换能器连接，再选取培养皿以及与其配合使用的夹持器，同时选取超声探头夹持器用于配合超声换能器，超声换能器包括但不限于线阵、环阵、弧面阵、平面阵、柔性超声换能器或MEMS超声换能器，超声探头夹持器和培养皿夹持器为任何与之适配的夹持器；
(2)干细胞接种：在培养皿内侧的底部放置一个环形垫片，环形垫片的厚度为10-200μm，将干细胞接种在该环形垫片所形成的环形区域内，干细胞包括但不限于胚胎干细胞、骨髓间充质干细胞或间充质干细胞；
(3)细胞共生培养：将目标细胞和接种后的干细胞进行混合，然后把培养皿置于培养箱中培养，之后取出加入海藻酸钠溶液，培养皿通过配合使用的夹持器进行取出，且其取出的标准为培养皿中的细胞出现细胞贴壁现象，配置成一定细胞密度的细胞悬液，同时向其中添加溶液，使它们发生反应，所添加混合溶液的高度为2-3mm，向细胞悬液中添加的溶液为含有钙离子的溶液，以此制成细胞凝胶作为超声介质，钙离子溶液和细胞悬液中发生的反应为离子反应，海藻酸钠溶液的PH值为5-9，细胞悬液的细胞密度为6×106个/mL，海藻酸钠溶液的质量分数为1.0-1.5％，培养箱中的温度稳定在37℃，CO2水平稳定在5％，pH值稳定在7.2-7.4，相对饱和湿度稳定在95％；
(4)超声波作用：将超声换能器的超声探头通过夹持器置于步骤(3)处理后的培养皿上方，并通过固定装置将两者进行固定；
(5)诱导过程：信号发生器发出电信号经功率放大器放大后再经超声换能器将电信号转换为声信号(超声波)，超声波穿透培养皿作用于体外培养的干细胞，通过机械作用、热作用和空化作用多重机制对干细胞分化起到诱导作用，超声参数选择：通过搭配不同的波形、脉宽、脉冲重复频率、辐照总时间和声压对干细胞分化诱导速度及进行控制，常用的为正弦波形，在安全范围内，高占空比(高脉宽、低脉冲重复频率)搭配较长辐照时间和较高声压可提高干细胞分化的诱导速度；低占空比(低脉宽、高脉冲重复频率)搭配较短辐照时间和较低声压可降低干细胞分化的诱导速度。
本发明利用超声装置所产生的超声波作用于体外培养的干细胞，联合或不联合现有干细胞定向诱导方法对干细胞进行定向分化诱导，以解决目前干细胞诱导成功率和成活率低等问题，而且可根据实验需求，通过调节设备及参数，可以控制干细胞分化方向和速度，同时搭配目标细胞进行共培养，可提高干细胞分化为目标细胞的效率，给干细胞技术发展带来重大突破。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (9)
1.一种诱导干细胞定向分化的方法，其特征在于：其方法包括如下步骤：
(1)准备工作：选取信号发生器、功率放大器和超声换能器，并将它们之间通过导线连接，信号发生器与功率放大器连接，功率放大器分别与电源和超声换能器连接，再选取培养皿以及与其配合使用的夹持器，同时选取超声探头夹持器用于配合超声换能器；
(2)干细胞接种：在培养皿内侧的底部放置一个环形垫片，将干细胞接种在该环形垫片所形成的环形区域内；
(3)细胞共生培养：将目标细胞和接种后的干细胞进行混合，然后把培养皿置于培养箱中培养，之后取出加入海藻酸钠溶液，配置成一定细胞密度的细胞悬液，同时向其中添加溶液，使它们发生反应；
(4)超声波作用：将超声换能器的超声探头通过夹持器置于步骤(3)处理后的培养皿上方，并通过固定装置将两者进行固定；
(5)诱导过程：信号发生器发出电信号经功率放大器放大后再经超声换能器将电信号转换为声信号(超声波)，超声波穿透培养皿作用于体外培养的干细胞，通过机械作用、热作用和空化作用多重机制对干细胞分化起到诱导作用。
2.根据权利要求1所述的一种诱导干细胞定向分化的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，超声换能器包括但不限于线阵、环阵、弧面阵、平面阵、柔性超声换能器或MEMS超声换能器，超声探头夹持器和培养皿夹持器为任何与之适配的夹持器。
3.根据权利要求1所述的一种诱导干细胞定向分化的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，干细胞包括但不限于胚胎干细胞、骨髓间充质干细胞或间充质干细胞。
4.根据权利要求1所述的一种诱导干细胞定向分化的方法，其特征在于：所述步骤(2)-(3)中，环形垫片的厚度为10-200μm，所添加混合溶液的高度为2-3mm。
5.根据权利要求1所述的一种诱导干细胞定向分化的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，向细胞悬液中添加的溶液为含有钙离子的溶液，以此制成细胞凝胶作为超声介质，钙离子溶液和细胞悬液中发生的反应为离子反应。
6.根据权利要求1所述的一种诱导干细胞定向分化的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，海藻酸钠溶液的PH值为5-9，细胞悬液的细胞密度为6×106个/mL，海藻酸钠溶液的质量分数为1.0-1.5％。
7.根据权利要求1所述的一种诱导干细胞定向分化的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，培养箱中的温度稳定在37℃，CO2水平稳定在5％，pH值稳定在7.2-7.4，相对饱和湿度稳定在95％。
8.根据权利要求1所述的一种诱导干细胞定向分化的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，培养皿通过配合使用的夹持器进行取出，且其取出的标准为培养皿中的细胞出现细胞贴壁现象。
9.根据权利要求1所述的一种诱导干细胞定向分化的方法，其特征在于：所述步骤(5)中，超声参数选择：通过搭配不同的波形、脉宽、脉冲重复频率、辐照总时间和声压对干细胞分化诱导速度及进行控制。
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2020
- 2020-11-27 CN CN202011353376.2A patent/CN112458078A/zh active Pending
Patent Citations (3)
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Non-Patent Citations (1)
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|---|---|---|---|
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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Application publication date: 20210309 |
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