CN104818247A - 一种间充质干细胞的培养方法及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了属于细胞生物学技术领域的一种间充质干细胞的培养方法及用途。本发明的方法首先通过对皮肤真皮层的获取和前处理，然后进行贴壁和扩大培养，培养中加入自主研制的营养液，最终获得间充质干细胞。该间充质干细胞具有分化为皮肤真皮组织和类肺泡器官的潜能。为将来实现皮肤移植和肺泡器官移植打下了良好的基础。
Description
技术领域
本发明属于细胞生物学技术领域，具体涉及一种间充质干细胞的培养方法及用途。
背景技术
间充质干细胞是一种具有自我复制能力和多向分化潜能的成体干细胞，这种干细胞能够发育成硬骨、软骨、脂肪和其他类型的细胞。间充质干细胞可以接受移植，而它们会成长为何种类型的细胞取决于其被注入的部位及营养液的种类。1976年，Freidenstein首次发现在骨髓里存在一群不纯一的细胞群体，这种细胞在体外培养时贴壁生长，形态和成纤维细胞相似，呈克隆性增殖，并提出骨髓间充质干细胞的概念。后经过深入和广泛的研究，发现存在于人体发生、发育过程的许多种组织中。人类对间充质干细胞的生物学特性、来源、诱导分化、前期临床应用等取得了长足的进展。
目前，尚没有有效的从皮肤中培养获得间充质干细胞的报道，也没有应用该种类的干细胞进行皮肤再生和分化成其他种类的干细胞的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种间充质干细胞的培养方法。
本发明的目的还在于提供上述制备的间充质干细胞在构建真皮组织和肺泡中的应用。
一种间充质干细胞的培养方法，按照如下步骤进行：
(1)将皮肤的真皮层组织取出，平铺在平皿上，采用清洗液和消毒液清洗真皮层组织；
(2)向平皿中缓慢加入间充质干细胞培养基，放入培养箱进行培养，培养3-5天加入占间充质干细胞培养基质量5-10％的营养液，培养至8-10天更换一次间充质干细胞培养基和营养液，此后每隔2-4天更换一次间充质干细胞培养基和营养液；
(3)当平皿内的贴壁细胞融合率达到60-70％时，使用消化酶使贴壁细胞脱离平皿底部，离心，去除上清液，加入间充质干细胞培养基重新悬浮，再接种于细胞培养瓶中进行传代并扩增培养，每隔1-2天换充质干细胞培养一次，至融合率达到80-95％，得到皮肤间充质干细胞。
所述清洗液为PBS，BSS，生理盐水或者去离子水。
所述消毒液为双氧水，70％乙醇水溶液或者酒精。
所述营养液为肌醇溶液，氨基酸溶液，白细胞介素，转铁蛋白溶液，葡萄糖，丙酮酸钠，乳酸钠，胎牛血清，干细胞生长因子中的一种或一种以上。
上述间充质干细胞的培养方法制备的间充质干细胞在构建真皮组织中的应用，所述构建步骤如下：将培养至三代或三代以上的间充质干细胞消化成单细胞，按细胞数量1：1混合后接种于Matrigel中，使用间充质干细胞培养基进行培养，2天后换用真皮培养基，具体操作为胰酶消化间充质干细胞为单细胞悬液，计数后用培养基重悬，并与等体积4℃解冻的Matrigel混合，接种于24孔板，置于37℃细胞培养箱，20分钟后，待Matrigel凝固，加入培养基，每孔接种2.5×105间充质干细胞，与50μL Matrigel混合后接种，接种成功后，隔天换液，体外培养1天后，细胞聚集成圆盘形状，3天后，可见真皮组织形成,6-10天后真皮组织长到最厚。
所述真皮培养基的组成成分如下：3-10wt％BSA，3-10％FBS，胰岛素0.1-2％，转铁蛋白0.1-2％，核黄素0.1-2％，75-90％去离子水。
上述间充质干细胞的培养方法制备的间充质干细胞在构建肺泡中的应用，所述构建步骤如下：将培养至三代或三代以上的间充质干细胞消化成单细胞，按细胞数量1：1混合后接种于Matrigel中，使用间充质干细胞培养基进行培养，2天后换用肺泡培养基，具体操作为胰酶消化间充质干细胞为单细胞悬液，计数后用培养基重悬，并与等体积4℃解冻的Matrigel混合，接种于24孔板，置于37℃细胞培养箱，20分钟后，待Matrigel凝固，加入培养基，每孔接种2.5×105间充质干细胞，与50μL Matrigel混合后接种，接种成功后，隔天换液，体外培养1天后，细胞聚集成类肺泡形状，3天后，可见肺泡形成,6-10天后肺泡长到最大。
所述真皮培养基的组成成分如下：3-10wt％BSA，3-10％FBS，碱性成纤维因子0.1-2％，白细胞介素-80.1-2％，桂皮鞣质D10.1-2％，75-90％去离子水。
本发明的有益效果：本发明的方法从真皮层分离并成功培养了间充质干细胞，该方法简单，效率高，制备的间充质干细胞具有分化为真皮组织及类肺泡器官的功能，为将来实现皮肤移植和肺泡器官移植打下了良好的基础。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例1
一种间充质干细胞的培养方法，按照如下步骤进行：
(1)将皮肤的真皮层组织取出，平铺在平皿上，采用PBS和酒精清洗真皮层组织；
(2)向平皿中缓慢加入间充质干细胞培养基，放入培养箱进行培养，培养3-5天加入占间充质干细胞培养基质量5-10％的转铁蛋白溶液，培养至8-10天更换一次间充质干细胞培养基和转铁蛋白溶液(质量分数为2％)，此后每隔2-4天更换一次间充质干细胞培养基和转铁蛋白溶液；
(3)当平皿内的贴壁细胞融合率达到60-70％时，使用消化酶使贴壁细胞脱离平皿底部，离心，去除上清液，加入间充质干细胞培养基重新悬浮，再接种于细胞培养瓶中进行传代并扩增培养，每隔1-2天换充质干细胞培养一次，至融合率达到80-95％，得到皮肤间充质干细胞。
从真皮层组织处理到得到皮肤间充质干细胞，整个周期为40天。
实施例2
一种间充质干细胞的培养方法，按照如下步骤进行：
(1)将皮肤的真皮层组织取出，平铺在平皿上，采用BSS和去离子水清洗真皮层组织；
(2)向平皿中缓慢加入间充质干细胞培养基，放入培养箱进行培养，培养3-5天加入占间充质干细胞培养基质量5-10％的肌醇溶液，培养至8-10天更换一次间充质干细胞培养基和肌醇溶液(质量分数为1％)，此后每隔2-4天更换一次间充质干细胞培养基和肌醇溶液；
(3)当平皿内的贴壁细胞融合率达到60-70％时，使用消化酶使贴壁细胞脱离平皿底部，离心，去除上清液，加入间充质干细胞培养基重新悬浮，再接种于细胞培养瓶中进行传代并扩增培养，每隔1-2天换充质干细胞培养一次，至融合率达到80-95％，得到皮肤间充质干细胞。
从真皮层组织处理到得到皮肤间充质干细胞，整个周期为40天。
实施例3
一种间充质干细胞的培养方法，按照如下步骤进行：
(1)将皮肤的真皮层组织取出，平铺在平皿上，采用PBS和酒精清洗真皮层组织；
(2)向平皿中缓慢加入间充质干细胞培养基，放入培养箱进行培养，培养3-5天加入占间充质干细胞培养基质量5-10％的丙酮酸钠溶液，培养至8-10天更换一次间充质干细胞培养基和丙酮酸钠溶液(质量分数为1.5％)，此后每隔2-4天更换一次间充质干细胞培养基和丙酮酸钠溶液；
(3)当平皿内的贴壁细胞融合率达到60-70％时，使用消化酶使贴壁细胞脱离平皿底部，离心，去除上清液，加入间充质干细胞培养基重新悬浮，再接种于细胞培养瓶中进行传代并扩增培养，每隔1-2天换充质干细胞培养一次，至融合率达到80-95％，得到皮肤间充质干细胞。
从真皮层组织处理到得到皮肤间充质干细胞，整个周期为40天。
实施例4
一种间充质干细胞的培养方法，按照如下步骤进行：
(1)将皮肤的真皮层组织取出，平铺在平皿上，采用PBS和酒精清洗真皮层组织；
(2)向平皿中缓慢加入间充质干细胞培养基，放入培养箱进行培养，培养3-5天加入占间充质干细胞培养基质量5-10％的营养液，培养至8-10天更换一次间充质干细胞培养基和营养液，此后每隔2-4天更换一次间充质干细胞培养基和营养液；
所述营养液包含如下质量分数的组分：肌醇0.3％，白细胞介素0.15％，转铁蛋白0.4％，葡萄糖1.5％，丙酮酸钠0.6％，乳酸钠0.6％，干细胞生长因子0.15％，余量为去离子水。
(3)当平皿内的贴壁细胞融合率达到60-70％时，使用消化酶使贴壁细胞脱离平皿底部，离心，去除上清液，加入间充质干细胞培养基重新悬浮，再接种于细胞培养瓶中进行传代并扩增培养，每隔1-2天换充质干细胞培养一次，至融合率达到80-95％，得到皮肤间充质干细胞。
从真皮层组织处理到得到皮肤间充质干细胞，整个周期为32天。
实施例5
采用实施例1制备的间充质干细胞在构建真皮组织中的应用，所述构建步骤如下：将培养至三代或三代以上的间充质干细胞消化成单细胞，按细胞数量1：1混合后接种于Matrigel中，使用间充质干细胞培养基进行培养，2天后换用真皮培养基，具体操作为胰酶消化间充质干细胞为单细胞悬液，计数后用培养基重悬，并与等体积4℃解冻的Matrigel混合，接种于24孔板，置于37℃细胞培养箱，20分钟后，待Matrigel凝固，加入培养基，每孔接种2.5×105间充质干细胞，与50μL Matrigel混合后接种，接种成功后，隔天换液，体外培养1天后，细胞聚集成圆盘形状，3天后，可见真皮组织形成,10天后真皮组织长到最厚。
所述真皮培养基的组成成分如下：6wt％BSA，6％FBS，胰岛素1％，转铁蛋白1％，核黄素1％，85％去离子水。
实施例6
采用实施例1制备的间充质干细胞在构建真皮组织中的应用，所述构建步骤如下：将培养至三代或三代以上的间充质干细胞消化成单细胞，按细胞数量1：1混合后接种于Matrigel中，使用间充质干细胞培养基进行培养，2天后换用真皮培养基，具体操作为胰酶消化间充质干细胞为单细胞悬液，计数后用培养基重悬，并与等体积4℃解冻的Matrigel混合，接种于24孔板，置于37℃细胞培养箱，20分钟后，待Matrigel凝固，加入培养基，每孔接种2.5×105间充质干细胞，与50μL Matrigel混合后接种，接种成功后，隔天换液，体外培养1天后，细胞聚集成圆盘形状，3天后，可见真皮组织形成,6天后真皮组织长到最厚。
所述真皮培养基的组成成分如下：6wt％BSA，6％FBS，胰岛素1％，转铁蛋白1％，白细胞介素-61％，85％去离子水。
实施例7
采用实施例4制备的间充质干细胞在构建肺泡中的应用，所述构建步骤如下：将培养至三代或三代以上的间充质干细胞消化成单细胞，按细胞数量1：1混合后接种于Matrigel中，使用间充质干细胞培养基进行培养，2天后换用肺泡培养基，具体操作为胰酶消化间充质干细胞为单细胞悬液，计数后用培养基重悬，并与等体积4℃解冻的Matrigel混合，接种于24孔板，置于37℃细胞培养箱，20分钟后，待Matrigel凝固，加入培养基，每孔接种2.5×105间充质干细胞，与50μL Matrigel混合后接种，接种成功后，隔天换液，体外培养1天后，细胞聚集成类肺泡形状，3天后，可见肺泡形成,8天后肺泡长到最大。
所述真皮培养基的组成成分如下：4wt％BSA，8％FBS，碱性成纤维因子0.5％，白细胞介素-80.5％，桂皮鞣质D11％，86％去离子水。
实施例8
采用实施例4制备的间充质干细胞在构建肺泡中的应用，所述构建步骤如下：将培养至三代或三代以上的间充质干细胞消化成单细胞，按细胞数量1：1混合后接种于Matrigel中，使用间充质干细胞培养基进行培养，2天后换用肺泡培养基，具体操作为胰酶消化间充质干细胞为单细胞悬液，计数后用培养基重悬，并与等体积4℃解冻的Matrigel混合，接种于24孔板，置于37℃细胞培养箱，20分钟后，待Matrigel凝固，加入培养基，每孔接种2.5×105间充质干细胞，与50μL Matrigel混合后接种，接种成功后，隔天换液，体外培养1天后，细胞聚集成类肺泡形状，3天后，可见肺泡形成,9天后肺泡长到最大。
所述真皮培养基的组成成分如下：3wt％BSA，10％FBS，碱性成纤维因子0.1％，白细胞介素-80.4％，桂皮鞣质D10.5％，86％去离子水。
Claims (8)
1.一种间充质干细胞的培养方法，其特征在于，按照如下步骤进行：
(1)将皮肤的真皮层组织取出，平铺在平皿上，采用清洗液和消毒液清洗真皮层组织；
(2)向平皿中缓慢加入间充质干细胞培养基，放入培养箱进行培养，培养3-5天加入占间充质干细胞培养基质量5-10％的营养液，培养至8-10天更换一次间充质干细胞培养基和营养液，此后每隔2-4天更换一次间充质干细胞培养基和营养液；
(3)当平皿内的贴壁细胞融合率达到60-70％时，使用消化酶使贴壁细胞脱离平皿底部，离心，去除上清液，加入间充质干细胞培养基重新悬浮，再接种于细胞培养瓶中进行传代并扩增培养，每隔1-2天换充质干细胞培养一次，至融合率达到80-95％，得到皮肤间充质干细胞。
2.根据权利要求1所述一种间充质干细胞的培养方法，其特征在于，所述清洗液为PBS，BSS，生理盐水或者去离子水。
3.根据权利要求1所述一种间充质干细胞的培养方法，其特征在于，所述消毒液为双氧水，70％乙醇水溶液或者酒精。
4.根据权利要求1所述一种间充质干细胞的培养方法，其特征在于，所述营养液为肌醇溶液，氨基酸溶液，白细胞介素，转铁蛋白溶液，葡萄糖，丙酮酸钠，乳酸钠，胎牛血清，干细胞生长因子中的一种或一种以上。
5.如权利里要求1所述间充质干细胞的培养方法制备的间充质干细胞在构建真皮组织中的应用，其特征在于，所述构建步骤如下：将培养至三代或三代以上的间充质干细胞消化成单细胞，按细胞数量1：1混合后接种于Matrigel中，使用间充质干细胞培养基进行培养，2天后换用真皮培养基，具体操作为胰酶消化间充质干细胞为单细胞悬液，计数后用培养基重悬，并与等体积4℃解冻的Matrigel混合，接种于24孔板，置于37℃细胞培养箱，20分钟后，待Matrigel凝固，加入培养基，每孔接种2.5×105间充质干细胞，与50μLMatrigel混合后接种，接种成功后，隔天换液，体外培养1天后，细胞聚集成圆盘形状，3天后，可见真皮组织形成,6-10天后真皮组织长到最厚。
6.根据权利要求5所述间充质干细胞在构建真皮组织中的应用，其特征在于，所述真皮培养基的组成成分如下：3-10wt％BSA，3-10％FBS，胰岛素0.1-2％，转铁蛋白0.1-2％，核黄素0.1-2％，75-90％去离子水。
7.如权利里要求1所述间充质干细胞的培养方法制备的间充质干细胞在构建肺泡中的应用，其特征在于，所述构建步骤如下：将培养至三代或三代以上的间充质干细胞消化成单细胞，按细胞数量1：1混合后接种于Matrigel中，使用间充质干细胞培养基进行培养，2天后换用肺泡培养基，具体操作为胰酶消化间充质干细胞为单细胞悬液，计数后用培养基重悬，并与等体积4℃解冻的Matrigel混合，接种于24孔板，置于37℃细胞培养箱，20分钟后，待Matrigel凝固，加入培养基，每孔接种2.5×105间充质干细胞，与50μLMatrigel混合后接种，接种成功后，隔天换液，体外培养1天后，细胞聚集成类肺泡形状，3天后，可见肺泡形成,6-10天后肺泡长到最大。
8.根据权利要求7所述间充质干细胞在构建肺泡中的应用，其特征在于，所述真皮培养基的组成成分如下：3-10wt％BSA，3-10％FBS，碱性成纤维因子0.1-2％，白细胞介素-8 0.1-2％，桂皮鞣质D1 0.1-2％，75-90％去离子水。
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