CN111635860B - 一种用于干细胞培养的系统及培养方法 - Google Patents

一种用于干细胞培养的系统及培养方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111635860B
CN111635860B CN202010552359.5A CN202010552359A CN111635860B CN 111635860 B CN111635860 B CN 111635860B CN 202010552359 A CN202010552359 A CN 202010552359A CN 111635860 B CN111635860 B CN 111635860B
Authority
CN
China
Prior art keywords
stem cell
culture
cell culture
culture medium
connecting pipe
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010552359.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111635860A (zh
Inventor
刘宏
杨鸿儒
桑元华
甘宜梧
刘锋
段佳志
孔颖
何建龙
郝敏
袁文虎
王书华
王建军
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shandong University
Original Assignee
Shandong University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shandong University filed Critical Shandong University
Priority to CN202010552359.5A priority Critical patent/CN111635860B/zh
Publication of CN111635860A publication Critical patent/CN111635860A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111635860B publication Critical patent/CN111635860B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/16—Particles; Beads; Granular material; Encapsulation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M27/00—Means for mixing, agitating or circulating fluids in the vessel
    • C12M27/02—Stirrer or mobile mixing elements
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C12M29/04—Filters; Permeable or porous membranes or plates, e.g. dialysis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C12M29/18—External loop; Means for reintroduction of fermented biomass or liquid percolate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C12M29/26—Conditioning fluids entering or exiting the reaction vessel
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
    • C12M35/04—Mechanical means, e.g. sonic waves, stretching forces, pressure or shear stimuli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M37/00—Means for sterilizing, maintaining sterile conditions or avoiding chemical or biological contamination
    • C12M37/02—Filters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/12—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/26—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of pH
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
    • C12M47/10—Separation or concentration of fermentation products

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Thermal Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Mechanical Engineering (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种用于干细胞培养的系统及培养方法，属于生物医学工程技术领域。本发明的系统包括：物质补给装置、空气连通装置、干细胞培养装置和代谢回收装置。采用本发明的系统及培养方法，可以避免干细胞在三维培养过程中因剪切力过大而损伤干细胞活性，同时尽可能提高了干细胞培养的效率，并保持了干细胞的多向分化潜能。

Description

一种用于干细胞培养的系统及培养方法
技术领域
本发明涉及生物医学工程技术领域，具体涉及一种用于干细胞培养的系统及培养方法。
背景技术
干细胞是一种具有多向分化潜能和自我更新能力的细胞，能够在体内分化产生某种特定组织类型的细胞。由于干细胞免疫原性相对较低并且具有免疫调节作用，所以干细胞成为细胞治疗与组织器官替代治疗最理想的种子细胞。病人可以用自己的成体干细胞治疗自身疾病从而避免免疫排斥反应。例如近年来干细胞研究领域最热门的MSC，能够通过抑制细胞免疫来抑制免疫排斥反应，非常适用于临床移植治疗，在心血管疾病、肝脏疾病、免疫性疾病等方面的治疗都具有重要意义。干细胞研究的热度直接催生了再生医学的概念，因为其具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，在医学界获得了“万用细胞”的美誉。
但是，成体干细胞的数量很少，且分离、纯化难度较大；人工培养干细胞方式包括：二维培养和三维培养；其中，普通的干细胞培养过程属于二维培养，细胞在二维培养过程中只能沿平面延伸，二维培养微环境与体内微环境差异太大，容易导致细胞在体外改变的环境下增生逐渐丧失了原有的生物学特性及功能，影响细胞的基因表达、信号转导等，失去研究及应用价值。与二维培养不同，三维培养(3D细胞培养)由于充分利用空间更加有助于大规模细胞培养，同时能够模拟了一个更类似于细胞体内生长的微环境，可使干细胞在培养过程中更好的保持原有生物学特性和功能，例如多系分化能力。但是，三维干细胞培养过程中需要在培养介质中通过一些内部的力，比如磁力或震动等来维持悬浮状态，由此产生的剪切力等就会不可避免地对干细胞造成损伤。所以如何能够快速大量的体外培养干细胞并保持其多向分化能力就成为干细胞临床应用面临的技术瓶颈。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种用于干细胞培养的系统及培养方法。采用本发明的系统及培养方法，可以避免干细胞在三维培养过程中因剪切力过大而损伤干细胞活性，同时尽可能提高了干细胞培养的效率，并保持了干细胞的多向分化潜能。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种用于干细胞培养的系统，包括：
物质补给装置，所述物质补给装置设有物质注入口和物质出口，物质补给装置内设有第一滤菌膜，在所述第一滤菌膜的上方设有搅拌器；
空气连通装置，所述空气连通装置通过第一连接管与所述物质补给装置的物质出口相连通，空气连通装置的顶部设有空气过滤器和二氧化碳进口，所述二氧化碳进口通过管道与CO2气瓶相连，空气连通装置内设有第二滤菌膜，在所述第二滤菌膜的上方设有pH监测计；
干细胞培养装置，所述干细胞培养装置包括：滚筒，滚筒两端分别设有进口和出口，滚筒设有进口的一端通过第二连接管与所述空气连通装置相连，在滚筒上对称设有两个搅拌器，滚筒内装载有用于承载干细胞的微载体；
代谢回收装置，所述代谢回收装置通过第三连接管与滚筒设有出口的一端连接，代谢回收装置内设有过滤膜，在过滤膜的下方设有出液口，所述出液口通过第四连接管依次与蠕动泵、物质补给装置相连。
优选的，所述第一滤菌膜和第二滤菌膜的孔径均为0.2-0.4μm；第一滤菌膜和第二滤菌膜的材质可以选用PTFE或者聚碳酸酯之类的材料。其中，第一滤菌膜的作用是过滤掉物质补给中补给营养物质过程中掺入的细菌或真菌；第二滤菌膜是过滤掉空气过滤装置未过滤掉的空气引入中的细菌或真菌或者物质补给装置中第一滤菌膜未过滤掉的细菌或真菌，避免其进入整个干细胞培养系统。
优选的，两个搅拌器所处的连接线与滚筒旋转的轴线垂直并相交。
优选的，所述微载体为明胶微球或氧化石墨烯/壳聚糖微球；或者其他生物相容性好的微载体。
进一步的，所述干细胞培养装置还设有控温装置。
优选的，所述过滤膜的孔径为10-30nm。主要是过滤掉干细胞培养过程中产生代谢废物和细胞碎片之类的，过滤后得到基础培养基。
本发明的第二方面，提供上述系统在干细胞三维培养中的应用。
本发明的第三方面，提供一种利用上述系统对干细胞进行三维培养的方法，包括以下步骤：
(1)将待培养的干细胞接种至干细胞培养装置内的微载体上；将培养基通过物质注入口加入到物质补给装置中，利用搅拌器搅拌均匀，之后通过第一滤菌膜进行第一次过滤；
(2)经第一次过滤后的培养基通过第一连接管从物质补给装置输送到空气连通装置，所述空气连通装置通过空气过滤器与外部空气连通，CO2从CO2气瓶中通入到空气连通装置内，形成干细胞培养的气氛环境；通过pH监测计实时监测培养基的pH值，使培养基的pH值维持在7.0；符合干细胞培养需求的培养基通过第二滤菌膜进行第二次过滤；
(3)经第二次过滤后的培养基通过第二连接管从空气连通装置输送到干细胞培养装置，在干细胞培养装置内对干细胞进行三维培养，滚筒转速为3-5rpm，两个搅拌器转速均为1-3rpm，维持干细胞培养装置内的培养基温度为37℃；
(4)干细胞三维培养过程中产生的代谢废物随使用过的培养基经第三连接管进入代谢回收装置，通过过滤膜将代谢废物滤除，经过滤后的培养基作为基本培养基通过第四连接管输送到物质补给装置中。
优选的，步骤(1)中，所述培养基的组成为：α-MEM培养基+10％胎牛血清+0.5％青霉素+0.5％链霉素+2ng/ml碱性成纤维生长因子(bFGF)。采用上述组成的培养基，可以对MSC骨髓来源的间充质干细胞进行有效的三维培养。
优选的，步骤(2)中，所述气氛环境为：正常空气+5％CO2。
本发明的有益效果：
(1)本发明设计了一种可以用于干细胞体外培养的四槽培养系统，该四槽培养系统的核心是干细胞培养装置，所述干细胞培养装置的主体为滚筒结构，在滚筒内装载有用于承载干细胞的明胶或者其它生物相容性好的微载体，干细胞贴附在微载体上，形成干细胞微球，由于微载体的存在提高了有效利用面积，从而大大提高了干细胞培养的效率；通过对滚筒施加合适的转速可以使培养基流动，从而实现干细胞微球的悬浮避免沉积堆叠，为进一步减少堆叠以及避免剪切力对干细胞造成损伤，本发明开创性的在滚筒壁上180°对称添加了两个搅拌器，通过滚筒转动以及搅拌器的转动来实现培养基三维方向上的流动，从而避免二维方向流体剪切力过大损伤干细胞的活性，同时最大可能提高干细胞的培养效率。
(2)本发明的四槽培养系统可以实现在一定时间段内的干细胞连续培养，即通过物料补给装置进行加料和中间补料，并对培养体系内的培养基的pH进行调整，通过空气连通转至实现培养系统与外部空气的连通，并通过CO2气瓶补入CO2，维持培养系统内干细胞培养所需的气氛环境，通过干细胞培养装置对干细胞进行三维立体培养，干细胞培养过程中产生的代谢废物可以随使用过的培养基进入到代谢回收装置内，将代谢废物滤除后的培养基还可以作为基本培养基回到物料补给装置中，通过添加生长因子和血清等物质再继续加以利用，蠕动泵作为整个培养系统的动力源。
(3)采用本发明的培养系统可以实现体外快速、大量的培养干细胞，并保持其多向分化潜能。
附图说明：
图1：本发明的用于干细胞培养的系统的结构示意图；
图中：1-物质补给装置，2-空气连通装置，3-干细胞培养装置，4-代谢回收装置，5-蠕动泵，6-第一连接管，7-第二连接管，8-第三连接管，9-第四连接管；
11-物质注入口，12-物质出口，13-第一滤菌膜，14-搅拌器，15-培养基回流入口；
21-空气过滤器，22-管道，23-第二滤菌膜，24-空气连通装置进口，25-空气连通装置出口，26-CO2气瓶，27-pH监测计，28-二氧化碳进口；
31-超声波发生器，32-微载体，33-控温装置，34-干细胞培养装置进口，35-干细胞培养装置出口；
41-过滤膜，42-代谢回收装置出口。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
正如背景技术部分所介绍的，现有的干细胞三维培养的过程中，为保持培养基的悬浮状态，所产生的剪切力等会不可避免地对干细胞造成损伤。
基于此，本发明设计研发了一种用于干细胞培养的系统，利用该系统可以实现干细胞培养过程中培养基在三维方向上的流动，从而避免了二维方向流体剪切力过大损伤干细胞活性。
在本发明的一种实施方案中，给出的用于干细胞培养的系统，包括物质补给装置、空气连通装置、干细胞培养装置、代谢回收装置和蠕动泵五部分，物质补给装置在瓶塞处配有物质注射口和搅拌器，瓶内部有滤菌膜，通过物质注射口将干细胞培养过程中所需要的生长因子、血清以及抑制细菌真菌产生的抗生素添加入干细胞基本培养基中，借助于搅拌器将添加完各种成分的培养基混匀，之后通过第一滤菌膜进行第一次滤菌，完成后培养基通过第一连接管从物质补给装置输送到空气连通装置，空气连通装置的瓶塞处配有空气过滤器、二氧化碳进口和pH监测计，通过空气过滤器实现培养系统与外部空气的连通，通过二氧化碳进口与CO2气瓶相连通，维持培养系统内干细胞所需的气氛环境，pH监测计用来实时监测培养基的pH值，是否满足干细胞培养要求，符合干细胞培养需求的培养基通过第二滤菌膜之后进入第二连接管，从气体连接瓶进入干细胞培养装置。干细胞培养装置内有用于承载干细胞的明胶或其它生物相容性好的微载体，干细胞贴附在微载体上，形成干细胞微球，由于微载体的存在提高了有效利用面积，从而大大提高了干细胞培养的效率。干细胞培养装置的主体为滚筒结构，通过施加合适转速来实现培养器内培养液流动从而实现干细胞微球的悬浮避免沉积堆叠，为了进一步减小沉积堆叠的可能我们开创性的在滚筒上额外180°对称添加了两个搅拌器，通过滚筒转动以及搅拌器搅动来实现培养基三维方向上的流动，从而在避免二维方向流体剪切力过大损伤干细胞活性的同时最大可能提高干细胞培养的效率。干细胞培养装置中配有温度调控装置，维持干细胞培养器内的温度在37℃的恒温。干细胞培养过程中产生的代谢废物随使用过的培养基经第三连接管进入代谢回收装置，通过过滤膜将代谢废物滤除后，剩余的培养基还可以作为基本培养基通过在物质补给装置中添加生长因子和血清等再继续加以利用。通过第四连接管将代谢回收装置和物质补充装置连接，中间通过蠕动泵作为整个连续培养系统的动力源。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。
实施例1：用于干细胞培养的系统
用于干细胞培养的系统，其结构示意图如图1所示。所述系统包括：
物质补给装置1，所述物质补给装置1设有物质注入口11、物质出口12和培养基回流入口15，物质补给装置1内设有第一滤菌膜13，在所述第一滤菌膜13的上方设有搅拌器14；物质出口12位于第一滤菌膜13的下方，培养基回流入口15位于第一滤菌膜13的上方。
空气连通装置2，所述空气连通装置2的进口24通过第一连接管6与所述物质补给装置1的物质出口12相连通，空气连通装置2的顶部设有空气过滤器21和二氧化碳进口28，所述二氧化碳进口28通过管道22与CO2气瓶26相连，空气连通装置2内设有第二滤菌膜23，在所述第二滤菌膜23的上方设有pH监测计27。
干细胞培养装置3，所述干细胞培养装置3的主体为两端封闭的滚筒结构，相应的，干细胞培养装置3还包括驱动滚筒旋转的驱动装置(图中未画出)；用于封闭滚筒两端的盖子上分别设有进口34和出口35，进口34和出口35不随滚筒转动而转动(此为现有技术中的已有结构，可通过多种结构形式实现，例如，进口或者出口与滚筒通过设有密封胶圈的卡箍连接，滚筒可以在卡箍中转动，而进口或者出口不随着转动)；滚筒设有进口34的一端通过第二连接管7与所述空气连通装置2相连，在滚筒的外壁上对称设有两个搅拌器31，两个搅拌器31所处的连接线与滚筒旋转的轴线垂直并相交，即两个搅拌器在滚筒壁上呈180°对称设置；搅拌器的搅拌叶片位于滚筒内，为避免搅拌叶片对干细胞造成损伤，本发明一方面将搅拌叶片采用柔性材料制成，另一方面，严格限定搅拌转速，采用慢搅拌的方式，可以最大程度的避免搅拌叶片对干细胞造成的损伤；滚筒内装载有用于承载干细胞的微载体32；干细胞培养装置3还设有控温装置33，通过控温装置33维持干细胞培养装置3内的培养温度条件。
用于封闭滚筒两端的盖子可以开启和关闭，往滚筒内装微载体32或者将培养完成后的干细胞取出时，将盖子开启，培养过程中保持盖子关闭。
代谢回收装置4，所述代谢回收装置4通过第三连接管8与滚筒设有出口35的一端连接，代谢回收装置4内设有过滤膜41，在过滤膜41的下方设有出液口42，所述出液口42通过第四连接管9依次与蠕动泵5、物质补给装置1的培养基回流入口15相连。蠕动泵5作为整个培养系统的动力源。
为方便体系的运行和培养基成分的调整，在第一连接管6、第二连接管7、第三连接管8和第四连接管9上均设有阀门，可通过某一或某几个阀门的关闭，将体系中的某一区段截断；所有阀门开启，则体系保持通畅运行。
实施例2：间充质干细胞(MSC)的三维培养
利用实施例1的系统对人骨髓间充质干细胞进行三维培养，具体如下：
(1)将待培养的人骨髓间充质干细胞接种至干细胞培养装置3内的微载体32上；将培养基通过物质注入口11加入到物质补给装置1中，利用搅拌器14搅拌均匀，之后通过第一滤菌膜13进行第一次过滤；
所述培养基的组成为：α-MEM培养基+10％胎牛血清+0.5％青霉素+0.5％链霉素+2ng/ml碱性成纤维生长因子(bFGF)。
(2)经第一次过滤后的培养基通过第一连接管6从物质补给装置1输送到空气连通装置2，所述空气连通装置2通过空气过滤器21与外部空气连通，通过二氧化碳进口28与CO2气瓶26相连，维持系统内干细胞培养所需的气氛环境(正常空气氛围+5％CO2，CO2占正常空气的体积分数5％)；通过pH监测计27实时监测培养基的pH值，使培养基的pH值维持在7.0，在干细胞培养过程中，如果监测到培养基的pH值不在7.0时，通过物质补给装置1的物质注入口11加入酸或碱进行调节；符合干细胞培养需求的培养基通过第二滤菌膜23进行第二次过滤；
(3)经第二次过滤后的培养基通过第二连接管7从空气连通装置2输送到干细胞培养装置3，在干细胞培养装置3内对干细胞进行三维培养，干细胞在微载体上初始贴壁阶段时，保持滚筒转速为4rpm，两个搅拌器器31的转速均为2rpm，贴附后扩增过程中，将滚筒转速升至5rpm，两个搅拌器器31的转速调整为3rpm；维持干细胞培养装置3内的培养基温度为37℃；
通过施加合适转速来实现培养器内培养液流动从而实现干细胞微球的悬浮避免沉积堆叠，本发明同时根据干细胞的不同生长阶段，将贴壁阶段的滚筒转速设为4rpm，将贴壁后扩增过程的滚筒转速设为5rpm，可以有效的避免干细胞在培养过程中出现沉积堆叠。为了进一步减小沉积堆叠以及剪切力对干细胞造成损伤，我们开创性的在滚筒壁额外180°对称添加了两个搅拌器，通过滚筒转动配合搅拌器来实现培养基三维方向上的流动，从而在避免二维方向流体剪切力过大损伤干细胞活性的同时最大可能提高干细胞培养的效率。
(4)干细胞三维培养过程中产生的代谢废物随使用过的培养基经第三连接管8进入代谢回收装置4，通过过滤膜41将代谢废物滤除，经过滤后的培养基作为基本培养基通过第四连接管9输送到物质补给装置1中，通过在物质补给装置1中添加生长因子和血清等再继续加以利用。
干细胞培养完成后可以将干细胞培养器一端打开后取出干细胞微载体，之后将干细胞从微载体上消化下来加以利用。
当每个微载体贴附2-3个MSC干细胞时，培养3-4天，增长的MSC干细胞可在微载体表面长满。经流式细胞数测定干细胞纯度为97.5％。
干细胞在培养过程中由于其具有的多向分化潜能性，培养系统细微的差异变化都会导致干细胞分化，分化后的干细胞就失去了多向分化潜能，也就不具有进一步干细胞治疗的意义。因此，干细胞纯度可以作为评价干细胞培养系统的一个重要指标，干细胞纯度越高，干细胞培养系统的性能越优异。采用本发明的系统培养得到的干细胞的纯度在97.5％以上，与现有报道的干细胞培养方法相比，本发明的系统培养干细胞的性能更为优异。
通过正置显微镜观察所培养的干细胞的形状，干细胞聚集成较圆、较规则的球形。因此，通过本发明的培养方法得到的干细胞更接近于真实的组织状态，更接近其结构与功能特征，有利于其干性的保持与提高。
将培养后的干细胞用PBS冲洗两三次，用2ml PBS重悬细胞团，在其中加入4μLEthD-III，1μL Calcein AM，室温孵育30min，弃去染液，用PBS冲洗两三次，用荧光显微镜进行拍照观察，其中活细胞呈绿色，而死细胞呈红色，统计细胞成活率。结果表明，采用本发明的方法培养的干细胞，其成活率达99.8％以上，能够很好的保持细胞活力。
在成骨和成脂诱导液的作用下，采用本发明培养的骨髓间充质干细胞均能够分化为成骨和脂肪细胞。说明本发明的培养方法能够较好的保持干细胞的干性。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (1)

1.利用用于干细胞培养的系统对人骨髓间充质干细胞进行三维培养的方法，其特征在于，所述用于干细胞培养的系统包括：
物质补给装置，所述物质补给装置设有物质注入口、物质出口和培养基回流入口，物质补给装置内设有第一滤菌膜，在所述第一滤菌膜的上方设有搅拌器；物质出口位于第一滤菌膜的下方，培养基回流入口位于第一滤菌膜的上方；
空气连通装置，所述空气连通装置的进口通过第一连接管与所述物质补给装置的物质出口相连通，空气连通装置的顶部设有空气过滤器和二氧化碳进口，所述二氧化碳进口通过管道与CO2气瓶相连，空气连通装置内设有第二滤菌膜，在所述第二滤菌膜的上方设有pH监测计；
干细胞培养装置，所述干细胞培养装置的主体为两端封闭的滚筒结构，用于封闭滚筒两端的盖子上分别设有进口和出口，进口和出口不随滚筒转动而转动；滚筒设有进口的一端通过第二连接管与所述空气连通装置相连，在滚筒的外壁上对称设有两个搅拌器，两个搅拌器所处的连接线与滚筒旋转的轴线垂直并相交，即两个搅拌器在滚筒壁上呈180°对称设置；搅拌器的搅拌叶片位于滚筒内，搅拌叶片采用柔性材料制成；滚筒内装载有用于承载干细胞的微载体；干细胞培养装置还设有控温装置，通过控温装置维持干细胞培养装置内的培养温度条件；
代谢回收装置，所述代谢回收装置通过第三连接管与滚筒设有出口的一端连接，代谢回收装置内设有过滤膜，在过滤膜的下方设有出液口，所述出液口通过第四连接管依次与蠕动泵、物质补给装置的培养基回流入口相连；
在第一连接管、第二连接管、第三连接管和第四连接管上均设有阀门；
所述三维培养的方法包括以下步骤：
（1）将待培养的人骨髓间充质干细胞接种至干细胞培养装置内的微载体上；将培养基通过物质注入口加入到物质补给装置中，利用搅拌器搅拌均匀，之后通过第一滤菌膜进行第一次过滤；
所述培养基的组成为：α-MEM培养基 +10%胎牛血清+0.5%青霉素+0.5%链霉素+2ng/ml碱性成纤维生长因子（bFGF）；
（2）经第一次过滤后的培养基通过第一连接管从物质补给装置输送到空气连通装置，所述空气连通装置通过空气过滤器与外部空气连通，通过二氧化碳进口与CO2气瓶相连，维持系统内干细胞培养所需的气氛环境，所述气氛环境为正常空气氛围+5%CO2，CO2占正常空气的体积分数为5%；通过pH监测计实时监测培养基的pH值，使培养基的pH值维持在7.0，在干细胞培养过程中，如果监测到培养基的pH值不在7.0时，通过物质补给装置1的物质注入口加入酸或碱进行调节；符合干细胞培养需求的培养基通过第二滤菌膜进行第二次过滤；
（3）经第二次过滤后的培养基通过第二连接管从空气连通装置输送到干细胞培养装置，在干细胞培养装置内对干细胞进行三维培养，干细胞在微载体上初始贴壁阶段时，保持滚筒转速为4rpm，两个搅拌器的转速均为2 rpm，贴附后扩增过程中，将滚筒转速升至5rpm，两个搅拌器的转速调整为3 rpm；维持干细胞培养装置内的培养基温度为37℃；
（4）干细胞三维培养过程中产生的代谢废物随使用过的培养基经第三连接管进入代谢回收装置，通过过滤膜将代谢废物滤除，经过滤后的培养基作为基本培养基通过第四连接管输送到物质补给装置中，通过在物质补给装置中添加生长因子和血清再继续加以利用；
干细胞培养完成后将干细胞培养器一端打开后取出干细胞微载体，之后将干细胞从微载体上消化下来加以利用。
CN202010552359.5A 2020-06-17 2020-06-17 一种用于干细胞培养的系统及培养方法 Active CN111635860B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010552359.5A CN111635860B (zh) 2020-06-17 2020-06-17 一种用于干细胞培养的系统及培养方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010552359.5A CN111635860B (zh) 2020-06-17 2020-06-17 一种用于干细胞培养的系统及培养方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111635860A CN111635860A (zh) 2020-09-08
CN111635860B true CN111635860B (zh) 2022-04-29

Family

ID=72327420

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010552359.5A Active CN111635860B (zh) 2020-06-17 2020-06-17 一种用于干细胞培养的系统及培养方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111635860B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112940934B (zh) * 2021-01-29 2023-11-07 上海睿钰生物科技有限公司 一种体外生命维持灌流培养系统及其控制方法
CN113862153A (zh) * 2021-11-08 2021-12-31 中南大学湘雅医院 一种用于间充质干细胞外泌体制备的培养装置

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4330216A (en) * 1980-11-21 1982-05-18 Becton, Dickinson And Company Gravity-induced stirring device for rotating liquid containers
US20040211747A1 (en) * 2003-01-02 2004-10-28 Whitley Kenneth W. Roller bottle
CN105713869A (zh) * 2016-03-30 2016-06-29 王凌仪 回输临床治疗用人胎盘叶状绒毛膜来源的间充质干细胞体外三维分离培养保存方法
CN107267452B (zh) * 2017-07-27 2021-06-29 浙江优牙生物科技有限公司 一种牙髓干细胞复苏液及牙髓干细胞的复苏方法
CN207307742U (zh) * 2017-10-10 2018-05-04 苏州山町蜂产品有限公司 一种滚筒式蜂蜜搅拌装置
CN108949558A (zh) * 2018-07-20 2018-12-07 中南大学 用于植物细胞高密度培养的滚筒中空纤维反应器及番石榴叶细胞高密度培养的方法
CN110038497A (zh) * 2019-04-11 2019-07-23 山东大学 一种用于干细胞培养的氧化石墨烯/壳聚糖微球及其连续制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN111635860A (zh) 2020-09-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Prewett et al. Three-dimensional modeling of T-24 human bladder carcinoma cell line: a new simulated microgravity culture vessel
CN111635860B (zh) 一种用于干细胞培养的系统及培养方法
CN103849593B (zh) 一种磁分离式细胞三维共培养方法
CN103194390B (zh) 双环路振荡灌注式生物反应系统
CN103261395B (zh) 具有便于进入培养腔的盖子的生物反应器
CN113755426A (zh) 类器官培养体系及类器官的培养方法
CN111632037A (zh) 一种海藻酸钠-壳聚糖微球、其包被的干细胞及其制剂、制法和应用
WO2023005119A1 (zh) 一种用于自动化可持续大规模3d细胞生产系统装置
CN111363680B (zh) 一种用于外泌体分泌、分离和收集的脉冲搅拌式生物反应器
CN103849567A (zh) 非接触共培养诱导干细胞体外三维定向分化的生物反应器
CN111876329A (zh) 一种用于造血干细胞体外培养的免疫隔离动态共培养生物反应器
CN210140594U (zh) 一种用于外泌体分泌、分离和收集的生物反应器
CN207193305U (zh) 中空纤维交换器及中空纤维交换式培养系统
CN110129199A (zh) 一种干细胞的三维仿真培养系统
CN216155857U (zh) 一种用于自动化可持续大规模3d细胞生产系统装置
CN115960824A (zh) 一种药用级间充质干细胞及其培养方法
CN114376985A (zh) 一种3d干细胞微球胶囊、其制备方法及在移植治疗领域的应用
CN111363679B (zh) 一种用于刺激细胞大量分泌外泌体的方法
CN113755425A (zh) 一种载三维胰岛β细胞聚集体的多孔微载体的制备方法
CN109276712B (zh) 纳米合成酶在细胞中促进高分子透明质酸合成的应用
CN101897995B (zh) 一种可植入的披膜三维载体及其制备方法
CN212426067U (zh) 用于造血干细胞体外培养的免疫隔离动态共培养反应器
JP7526384B2 (ja) 細胞培養基材
CN114369565B (zh) 高效生产细胞外囊泡的方法
CN221777853U (zh) 干细胞培养生物反应器

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant