CN113755426A - 类器官培养体系及类器官的培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于类器官和细胞培养技术领域，具体来说，本发明涉及一种类器官培养体系、类器官的培养方法，基于类器官培养体系或培养方法获得的类器官及其应用。本发明提供的类器官培养体系或培养方法实现了以来源于细胞系的细胞进行类器官培养，可有效简化类器官的培养过程，降低培养成本，适合各种组织的类器官模型的培养及应用，为疾病模型构建、药物筛选、药物毒性测试、个体化治疗等领域提供了重要的研究和应用平台。

Description

类器官培养体系及类器官的培养方法
技术领域
本发明属于类器官和细胞培养技术领域，具体来说，本发明涉及一种类器官培养体系、类器官的培养方法，基于类器官培养体系或培养方法获得的类器官及其应用。
背景技术
二维(two-dimensions，2-D)细胞培养是常用的细胞体外培养方法，2-D培养过程简单高效，广泛应用于生物医学研究中。然而，2-D培养细胞的生长环境与体内环境存在巨大差距，导致细胞生物学特征及细胞行为发生了巨大改变，难以模拟体内的三维微环境。三维(three-dimensions，3-D)细胞培养是将细胞与具有三维结构的生物材料共同培养，生物材料提供了细胞分化并产生组织特异性结构所需的生长因子或立体结构等，从而更加真实地模拟源组织的体内微环境。
类器官模型是通过3-D细胞培养后形成的细胞团，表现出与体内来源组织或器官相似的结构或功能。类器官模型不仅维持了细胞间的相互作用和细胞与外基质的相互作用，在理想状态下，还能表现出与体内分化组织相似的生理反应。与现有2-D细胞培养相比，类器官培养更接近体内细胞生存空间、生长状态及功能，在药物筛选与评价、个体遗传与发育、疾病发生与发展、生物医学材料及组织工程等方面显示出重要应用前景。
类器官为肿瘤模型的建立及治疗，药物筛选、测试以及毒理学评价等提高了良好的研究、评价平台。肾脏是人体代谢排泄的主要器官，对于药物评价及药物代谢具有重要意义。因此，对肾细胞进行3-D培养，构建肾脏类器官有助于更真实地了解药物的安全性、毒性。此外，通过3-D培养构建的肿瘤等疾病的类器官模型可以更加真实地反映疾病组织的复杂性和遗传异质性，对于疾病发生、发展的研究，药物筛选，个体化治疗等方面具有重要的应用前景。
专利文献CN109609441A中公开了一种肾脏组织类器官的培养方法，包括：取肾脏组织冰上剪碎，加入胶原酶重悬，摇床消化，过滤细胞，滤液加入DMEM/F12终止消化，离心，去除上清；取红细胞裂解液重悬细胞，离心，去除上清，加入DMEM/F12重悬，离心，去除上清；细胞计数，混合matrigel，滴于孔板孔正中，放置培养皿，凝固martrigel；每孔加入培养基，细胞培养箱培养。该方法虽然实现了对肾脏组织类器官的3D培养，但是其需要经过复杂的组织破碎和细胞分离的过程，存在培养步骤复杂，以及培养成本高的问题，不利于类器官的大规模培养和应用。
发明内容
发明要解决的问题
鉴于现有技术中存在的问题，例如，类器官需要使用组织来源的细胞或多能干细胞进行3-D培养，其细胞的获取步骤复杂，导致类器官的培养步骤繁琐、培养成本高等问题。为此，本发明提供了一种类器官培养体系，其基于来源于细胞系的细胞进行类器官培养，可有效简化类器官的培养过程，降低培养成本，适合各种组织的类器官模型的培养及应用。
进一步的，本发明提供了类器官的培养方法，为使用本发明中的类器官培养体系培养类器官提供了适合的培养步骤及培养条件，能够实现类器官的体外大规模培养。
用于解决问题的方案
第一方面，本发明提供了一种类器官培养体系或3-D培养体系，其中，所述类器官培养体系或3-D培养体系包括：基质胶，和与所述基质胶相混合的细胞悬液；所述基质胶与所述细胞悬液的体积比为(3～4):(5～10)；
所述细胞悬液中包含来源于细胞系的细胞，所述细胞附着于所述基质胶的表面和/或内部；并且，所述细胞悬液中，所述来源于细胞系的细胞含量为80-1600个/100μl。
在一些实施方式中，根据本发明所述的类器官培养体系，所述基质胶与所述细胞悬液的体积比为3:4、3:5、3:6、3:7、3:8、3:9、3:10、4:5、4:6、4:7、4:8、4:9或4:10；更优选地，所述基质胶与所述细胞悬液的体积比为30:50、32:50、34:50、36:50、40:50、30:100、32:100、34:100、36:100、38:100或40:100。
在一些实施方式中，根据本发明所述的类器官培养体系，所述细胞悬液中，所述来源于细胞系的细胞含量为80个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、1100个、1200个、1300个、1400个、1500个或1600个/100μl。
在一些实施方式中，根据本发明所述的类器官培养体系，其中，每32μl所述基质胶附着的细胞数量为80-800个，优选为200、400、600、800个；优选地，所述基质胶选自RGF BME基质胶或Matrigel基质胶；更优选地，所述基质胶为RGF BME基质胶。
在一些实施方式中，根据本发明所述的类器官培养体系，其中，所述来源于细胞系的细胞选自来源于下述任一种细胞系的细胞：293、293T、A549、MDA-MB-231、PC-3。
在一些实施方式中，根据本发明所述的类器官培养体系，其中，所述细胞悬液包括细胞培养基，和分散于所述细胞培养基内的细胞；优选地，所述细胞培养基为含有10％(v/v)胎牛血清的IMDM培养基。
第二方面，本发明提供了一种类器官的培养方法，其中，所述培养方法包括如下步骤：
制备步骤：制备细胞悬液，所述细胞悬液中包含来源于细胞系的细胞，所述来源于细胞系的细胞含量为80-1600个/100μl；
混合步骤：按照(3～4)：(5～10)的体积比混合基质胶与所述细胞悬液，使所述细胞悬液液中的细胞附着于所述基质胶的内部和/或表面，得到类器官培养体系；
培养步骤：对所述类器官培养体系进行培养，得到类器官。
在一些实施方式中，根据本发明所述的培养方法，其中培养步骤中所述细胞悬液中包含来源于细胞系的细胞，所述来源于细胞系的细胞含量为80个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、1100个、1200个、1300个、1400个、1500个或1600个/100μl。
在一些实施方式中，根据本发明所述的培养方法，其中，所述混合步骤中基质胶与所述细胞悬液的体积比为3:4、3:5、3:6、3:7、3:8、3:9、3:10、4:5、4:6、4:7、4:8、4:9或4:10；更优选地，所述基质胶与所述细胞悬液的体积比为30:50、32:50、34:50、36:50、40:50、30:100、32:100、34:100、36:100、38:100或40:100。
在一些实施方式中，根据本发明所述的培养方法，其中，所述制备步骤包括：
培养来源于细胞系的细胞，然后将细胞消化、离心，将离心所得的细胞沉淀分散于细胞培养基中，得到细胞悬液；
优选地，所述细胞来源于下述任一种细胞系的细胞：293、293T、A549、MDA-MB-231、PC-3；更优选地，所述细胞为293T细胞；
优选地，所述细胞培养基为含有10％(v/v)胎牛血清的IMDM培养基。
在一些实施方式中，根据本发明所述的培养方法，其中，所述混合步骤包括：
(1)取液态基质胶铺设于细胞培养容器内，所述液态基质胶固化后，得到第一包被层；
(2)向所述第一包被层上加入细胞悬液，所述细胞悬液中的细胞被接种于所述第一包被层的内部和/或表面，得到第二包被层；
优选地，所述混合步骤还包括：(3)静置一段时间，向所述第二包被层上加入含有基质胶的细胞培养基；
优选地，所述基质胶为Matrigel和/或RGF BME基质胶；
更优选地，所述混合步骤包括：
(1)取液态基质胶铺设于细胞培养容器内，所述液态基质胶固化后，得到第一包被层；
(2)向所述第一包被层上加入细胞悬液，所述细胞悬液中的细胞被接种于所述包被层的内部和/或表面，得到第二包被层，静置10-15min；
(3)向所述第二包被层上加入含有液态基质胶的细胞培养基；
其中，步骤(3)细胞培养基中液态基质胶的体积比为10％(v/v)，步骤(2)中细胞悬液和步骤(3)中细胞培养基的体积比为1:1。
第三方面，本发明提供了根据第一方面所述的类器官培养体系或根据第二方面所述的培养方法在培养类器官中的应用。
第四方面，本发明提供了一种类器官，其中，所述类器官使用根据第一方面所述的类器官培养体系或根据第二方面所述的培养方法而获得。
第五方面，本发明提供了根据第四方面所述的类器官在如下(a1)-(a3)至少一种中的应用：
(a1)药物筛选，或构建药物筛选模型；
(a2)药物毒性测试，或构建药物毒性测试模型；
(a3)疾病研究，或构建疾病模型。
发明的效果
在一些实施方式中，本发明提供的类器官培养体系，首次以来源于细胞系的细胞为起始细胞，培养形成了具有球状形态的类器官模型。本发明中的类器官培养体系不需要对组织破碎的细胞分离，也不需要使用价格高、培养条件要求高的干细胞构建类器官，有效简化了类器官的培养过程及培养成本，适合各种组织类型的类器官的培养和应用。
在一些实施方式中，本发明提供的类器官的培养方法，为使用来源于细胞系的细胞培养类器官提供了所需的培养步骤和培养条件，本发明中培养方法其培养步骤简单、条件易于实现，原料易获取，适合对类器官的大规模体外培养，为疾病发生、发展的研究，药物筛选，药物毒性测试，个体化治疗，再生医学等领域的发展提供了重要的研究和应用的平台。
附图说明
图1示出了实施例1-4中培养的类器官的形貌观察结果；
图2示出了实施例5-7中培养的类器官的形貌观察结果。
具体实施方式
以下将详细说明本发明的各种示例性实施例、特征和方面。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
另外，为了更好地说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在另外一些实例中，对于本领域技术人员熟知的方法、手段、器材和步骤未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。
如无特殊声明，本说明书中所使用的单位均为国际标准单位，并且本发明中出现的数值，数值范围，均应当理解为包含了工业生产中所不可避免的系统性误差。
本说明书中，使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。
本说明书中，所提及的“一些具体/优选的实施方式”、“另一些具体/优选的实施方式”、“实施方式”等是指所描述的与该实施方式有关的特定要素(例如，特征、结构、性质和/或特性)包括在此处所述的至少一种实施方式中，并且可存在于其它实施方式中或者可不存在于其它实施方式中。另外，应理解，所述要素可以任何合适的方式组合在各种实施方式中。
本说明书中，使用“数值A～数值B”表示的数值范围是指包含端点数值A、B的范围。
本说明书中，使用“v/v”表示体积百分比含量。
另外，本说明书中，所述“水”包含去离子水、蒸馏水、离子交换水、双蒸水、高纯水、纯净水等能够使用的任何可行的水。
本说明书中，使用“常温”、“室温”时，其温度可以是10-40℃。
本说明书中，“类器官模型”与“类器官”可以互换地使用。
类器官培养体系
本发明提供的类器官培养体系包括基质胶，和与所述基质胶相混合的细胞悬液；所述基质胶与所述细胞悬液的体积比为(3～4):(5～10)；
所述细胞悬液中包含来源于细胞系的细胞，所述细胞附着于所述基质胶的表面和/或内部；并且，所述细胞悬液中，所述来源于细胞系的细胞含量为80-1600个/100μl。
本发明的类器官培养体系首次实现了以细胞系来源的细胞进行类器官的培养、构建，由于细胞系来源的细胞来源丰富、易于培养，能够实现类器官模型的大规模培养和应用，有效解决了目前类器官培养时存在的培养过程复杂、培养成本高的问题。类器官培养体系中的基质胶可为细胞系来源的细胞提供其生长所需的三维空间环境，并且提供多种蛋白、生长因子等营养物质，诱导细胞系来源的细胞经3-D培养形成球状的细胞团，为不同组织类型的类器官的培养提供条件。
在本发明中，“细胞系来源的细胞”“来源于细胞系的细胞”两者可互换的使用，是指在体外培养的、可长期连续传代的培养群。细胞系来源的细胞不需要分离于组织，经过原代培养等步骤，可以是来源于ATCC、HGMR、CAR等已有细胞库中的细胞。并且，本发明中的细胞系来源的细胞不包括多能干细胞、胚胎干细胞等各类的干细胞。
在一些实施方式中，细胞系来源的细胞是来源于健康成体的体细胞，例如，来源于人肾脏、肝脏等组织的细胞系。利用不同位置处的商品化细胞系，可培养形成不同组织类型的类器官，为药物疗效、毒理学性质检测、个体化医疗等领域的应用提供丰富的类器官模型。
在一些具体的实施方式中，细胞系来源的细胞为293细胞或293T细胞。293细胞系和293T细胞系是目前生物医学领域中广泛使用的细胞系类型，易于获取、价格低，且通过常规的2-D细胞培养方法即能实现对细胞的大量保存和培养。293细胞或293T细胞来源于人肾上皮细胞系，能够用于培养人肾脏组织类器官，为药物筛选、毒性测试提供重要的类器官模型。
在一些实施方式中，细胞系来源的细胞为肿瘤细胞。通过对肿瘤细胞的3-D培养获得球状细胞团，用于构建不同肿瘤组织类型的类器官，为肿瘤发生、发展的研究，抗肿瘤药物的筛选提供条件。
在一些具体的实施方式中，细胞系来源的细胞为A549细胞、MDA-MB-231细胞或PC-3细胞。其中，A549细胞是肺癌人类肺泡基底上皮细胞，可用于构建肺癌类器官；MDA-MB-231细胞是人乳腺癌细胞，可用于构建人乳腺癌类器官；PC-3细胞是人前列腺癌细胞，可用于构建人前列腺癌类器官。
在一些实施方式中，细胞悬液中细胞系来源的细胞的含量为80-1600个/100μl。示例性的，每100μl细胞悬液中细胞的个数为80个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、1100个、1200个、1300个、1400个、1500个、1600个等等。
进一步的，基质胶与细胞悬液的体积比为(3～4):(5～10)，示例性的，基质胶与细胞悬液的体积比为30:50、32:50、34:50、36:50、40:50、30:100、32:100、34:100、36:100、38:100、40:100等等。当基质胶与细胞悬液的体积比为(3～4):(5～10)，细胞悬液中80-1600个/100μl的细胞时，能够通过3-D培养获得具有球状细胞团，为类器官生长提供合适的三维形态环境以及营养环境，实现对肾脏、肿瘤等不同组织类型的类器官培养。
作为优选的实施方式，每32μl基质胶附着的细胞数量为80-800个，更优选为800个。本发明通过实验发现，当每32μl的基质胶上附着的细胞个数为800个时，可显著提高细胞3-D培养的细胞团状态和细胞的扩增速度，优化类器官的生长条件。
示例性的，本发明中的细胞悬液是接种于细胞培养板内包被的基质胶上。在一些具体的实施方式中，在96孔细胞板内铺设基质胶，然后在基质胶上加入细胞悬液，使细胞培养板内每个培养孔内接种的细胞个数为800个，当细胞接种数为800cell/孔时，可获得生长状态最好的类器官模型。
进一步的，基质胶选自RGF BME基质胶或Matrigel基质胶。在本发明中，RGF BME基质胶或Matrigel基质胶可通过购买得到。例如，RGF BME基质胶为Cultrex Reduced GrowthFactor Basement Membrane Extract，Type 2，Pathclear R&D；3533-005-02；Matrigel基质胶为
Figure BDA0003300018390000091
Figure BDA0003300018390000092
Growth Factor Reduced(GFR)Basement Membrane Matrix，Phenol Red-free，LDEV-free，Life Sciences；356231。
在一些优选的实施方式中，基质胶为RGF BME基质胶。本发明发现，与Matrigel基质胶相比，RGF BME基质胶更适合对细胞系来源的细胞的3-D培养，促进具有球状形态的类器官的形成。
在一些优选的实施方式中，每32μl的RGF BME基质胶附着的细胞含量为80-800个。本发明发现，按照上述的比例在RGF BME基质胶上接种细胞系来源的细胞，可为细胞提供适合3-D培养形成类器官的适合的培养条件。更优选地，当每32μl的RGF BME基质胶附着的细胞个数为800个时，为细胞在RGF BME基质胶表面和/或内部的附着、生长提供最适条件，可以得到增殖、生长状态最佳的球状类器官模型。
进一步的，RGF BME基质胶与细胞悬液的按比例接种于细胞培养板内。例如，在细胞培养板的培养孔内先包被RGF BME基质胶，然后按照32:100或32:50的体积比混合细胞悬液，并且最终使细胞培养板的每孔接种细胞数为800cell/孔。
在一些实施方式中，细胞悬液是将细胞系来源的细胞分散于细胞培养基中形成。其中，细胞培养基可以是适合培养细胞系来源的细胞的各类培养基，例如，DMEM培养基、DMEM/F12培养基、MEM培养基或者1640培养基、IMDM培养基等。在本发明中，细胞培养基可以添加生长因子或不添加生长因子。本发明的类器官培养体系可以在不添加生长因子的条件下，通过3-D培养得到类器官的球状细胞团。
在一些具体的实施方式中，细胞培养基为IMDM(Iscove’s Modified Dulbecco’sMedium)培养基，IMDM培养基适合培养快速增殖、高密度的细胞，其中添加有10％(v/v)的胎牛血清。
本发明提供的类器官培养体系，以附着于基质胶表面和/或内部的来源于细胞系的细胞为起始细胞，经过3-D培养得到球状细胞团，用于构建肾脏组织类器官、肿瘤组织类器官等类器官模型。
类器官的培养方法
本发明提供的类器官的培养方法，包括如下步骤：
制备步骤：制备细胞悬液，所述细胞悬液中包含来源于细胞系的细胞，所述来源于细胞系的细胞含量为80-1600个/100μl；
混合步骤：按照(3～4):(5～10)的体积比混合基质胶与所述细胞悬液，使所述细胞悬液中的细胞附着于所述基质胶的内部和/或表面，得到类器官培养体系；
培养步骤：对所述类器官培养体系进行培养，得到类器官。
本发明提供的类器官的培养方法，具有培养步骤简单、易操作、培养效率高等优势，可在3-D培养环境下培养形成球状细胞团，得到各种组织类型的类器官。
在一些实施方式中，制备步骤包括：培养来源于细胞系的细胞，然后将细胞消化、离心，将离心所得的细胞沉淀分散于细胞培养基中，得到细胞悬液。
进一步的，来源于细胞系的细胞可以是传代培养中的细胞，或是将冻存细胞复苏后进行传代的细胞，均适用于本发明中类器官的培养。
在一些实施方式中，来源于细胞系的细胞是来源于健康成体的体细胞，例如，293细胞、293T细胞等等。在另外一些实施方式中，来源于细胞系的细胞是肿瘤细胞，例如，A549细胞、MDA-MB-231细胞、PC-3细胞等等。利用上述的细胞可构建肾脏组织、肿瘤组织等不同类型的类器官，进一步用于药物筛选、毒性检测、疾病研究等方面。
对于来源于细胞系的细胞培养，是通过2-D细胞培养，将细胞系来源的细胞铺于细胞培养器(例如，细胞培养皿)，待细胞培养至细胞状态良好且细胞生长密度至60-80％以上。
对于细胞的消化，是使用PBS缓冲液清洗细胞，然后用0.25wt％的胰酶进行消化，待培养皿底部有细胞开始脱落后，用细胞培养基进行终止反应，收集细胞液。
对于细胞的离心，是以1000rpm的转速，将细胞液离心5min，使用PBS缓冲液洗涤细胞沉淀，重复离心、洗涤细胞的步骤，最终使用细胞培养基重悬细胞，至细胞含量为80-1600个/100μl，得到细胞悬液。
在一些具体的实施方式中，细胞培养基为含有10％(v/v)的胎牛血清的IMDM培养基。在另外一些实施方式中，细胞培养基还可以是其他种类的培养基，以适合不同种类细胞的培养。
在本发明中，基质胶与细胞悬液的混合可以通过包被、包埋等不同的方法实现。
在一些实施方式中，首先在细胞培养器内铺设液态基质胶，固化得到第一包被层，然后将细胞悬液加入第一包被层上，得到第二包被层。
在一些实施方式中，在细胞培养器内铺设液态基质胶，固化得到第一包被层；将细胞悬液加入第一包被层上，得到第二包被层，继续在第二包被层上覆盖液态基质胶，液态基质胶固化为第三包被层。
在一些实施方式中，将细胞悬液与液态基质胶混合后铺于细胞培养器内，待液态基质胶固化后，实现包被层的内部包埋细胞。
在一些具体的实施方式中，混合步骤包括：
(1)取液态基质胶铺设于细胞培养容器内，所述液态基质胶固化后，得到第一包被层；
(2)向所述第一包被层上加入细胞悬液，所述细胞悬液中的细胞被接种于所述第一包被层的内部和/或表面，得到第二包被层。
在一些更为具体的实施方式中，液态基质胶铺设于细胞培养容器(例如，细胞培养板)内后，对其进行孵育，使液态基质胶固化形成包覆于细胞培养容器内部表面的第一包被层。
进一步的，将铺有液态基质胶的细胞培养容器在37℃下，孵育30min，实现基质胶的固化。进一步的，液态基质胶可以是RGF BME基质胶或Matrigel基质胶。作为优选，液态基质胶为RGF BME基质胶。RGF BME基质胶固化后，提供适合细胞系来源的细胞生长为类器官的三维生长环境，并提供所需营养物质。
示例性的，在96孔板的每个培养孔内铺设32μl的液态基质胶，待液态基质胶固化为第一包被层后，向第一包被层上加入细胞悬液，细胞悬液中的细胞附着于包被层的表面和/或内部，得到第二包被层，完成对细胞系来源的细胞的接种。并且，每个培养孔内接种的细胞数为800个。
在一些更为具体的实施方式中，所述混合步骤还包括：(3)静置一段时间，向所述第二包被层上加入含有基质胶的细胞培养基。
进一步的，所述混合步骤包括：
(1)取液态基质胶铺设于细胞培养容器内，所述液态基质胶固化后，得到第一包被层；
(2)向所述第一包被层上加入细胞悬液，所述细胞悬液中的细胞被接种于所述包被层的内部和/或表面，得到第二包被层，静置10-15min；
(3)向所述第二包被层上加入含有液态基质胶的细胞培养基。
其中，步骤(3)中细胞培养基中液态基质胶的体积比为10％(v/v)的液态基质胶。本发明发现，将包含一定量液态基质胶的细胞培养基覆盖于第二包被层上可提高细胞3-D培养的状态和增殖速率，优化3-D培养的类器官。
进一步的，步骤(2)中细胞悬液和步骤(3)中细胞培养基的体积比为1:1。本发明发现，当采用上述的加入比例时，能够获得生长、增殖状态最好的具有球状细胞团，得到效果最佳的类器官组织。
示例性的，在96孔板的细胞培养孔内加入32μl的液态基质胶，固化后形成第一包被层；向第一包被层上加入50μl的细胞悬液，得到第二包被层；静置10min后，继续加入50μl的包含液态基质胶的细胞培养基；其中，50μl的细胞悬液中包含800个细胞，细胞培养基中包含的液态基质胶的体积比为10％(v/v)。
在一些实施方式中，对类器官培养体系进行培养的条件为：37℃，5％CO2。
通过本发明的培养方法可实现对类器官的大规模培养，进而应用于药物筛选、药物毒性测试、疾病研究等同的用途。
实施例
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：3-D培养肾脏组织类器官
步骤1，复苏293T细胞，用IMDM(10％(v/v)胎牛血清)进行培养，传代。
步骤2，选取培养皿中培养状态良好且长得较满的293T细胞，先用PBS洗两遍后，用0.25％的胰酶进行消化，待培养皿底部有细胞开始脱落后，用培养基进行终止反应。
步骤3，收集细胞悬液至离心管中，用离心机1000rpm，离心5min，弃上清，用PBS洗涤细胞，之后用离心机1000rpm，离心5min，重复洗涤2次，之后用1ml培养基重悬细胞，然后用细胞计数仪进行细胞计数。
步骤4，根据细胞数量，用培养基将细胞稀释至100μl体系含80个细胞，获得细胞悬液，备用。
步骤5，选择Matrigel(
Figure BDA0003300018390000131
Figure BDA0003300018390000132
Growth Factor Reduced(GFR)Basement Membrane Matrix，Phenol Red-free，LDEV-free，Life Sciences；356231)作为基质胶，先取32μl Matrigel，铺在96孔板中，37℃，孵育30min，让胶凝固。
步骤6，之后加步骤4所述细胞悬液100μl，将其放入培养箱中进行培养，不同天数拿出来进行拍照。
实施例2：3-D培养肾脏组织类器官
本实施例与实施例1的区别在于：步骤5中选用的基质胶为RGF-BME(CultrexReduced Growth Factor Basement Membrane Extract，Type 2，Pathclear R&D；3533-005-02)。
实施例3：3-D培养肾脏组织类器官
本实施例与实施例2的区别在于：步骤4中细胞稀释为100μl体系含800个细胞。
实施例4：3-D培养肾脏组织类器官
本实施例与实施例1的区别在于：
步骤4，根据细胞数量，用培养基将细胞稀释至100μl体系含1600个细胞，获得细胞悬液，备用。
步骤5，选择RGF BME(Cultrex Reduced Growth Factor Basement MembraneExtract，Type 2，Pathclear R&D；3533-005-02)作为基质胶，先取32μl RGF BME，铺在96孔板中，37℃，孵育30min，让胶凝固。
步骤6，加入步骤4所述细胞悬液50μl，10min后，再加入50μl含10％RGF BME基质胶的细胞培养基，将其放入培养箱中进行培养，不同天数拿出来进行拍照。
实验结果：实施例1-4的结果如图1所示，由图中可以看出，采用本发明的培养方法，可以得到球状细胞，即获得了肾细胞的类器官模型，其中当细胞个数为80cell/孔时，其效果较差于800cell/孔，当基质胶选择RGF BMF，且先铺一层基质胶，后在细胞悬液中再加入含基质胶的培养基时，效果最优。也即，实施例4中提供了最优的类器官培养方法。
实施例5：3-D培养肿瘤组织类器官
本实施例与实施例4的区别在于：培养细胞为A549细胞。
实施例6：3-D培养肿瘤组织类器官
本实施例与实施例4的区别在于：培养细胞为MDA-MB细胞。
实施例7：3-D培养肿瘤组织类器官
本实施例与实施例4的区别在于：培养细胞为PC-3细胞。
实验结果：实施例5-7的结果如图2所示，由图中可以看出，在培养6天后，上述细胞成球状，说明本发明的培养方法能够实现对肿瘤组织的类器官培养。
本发明的上述实施例仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种类器官培养体系，其中，所述类器官培养体系包括：基质胶，和与所述基质胶相混合的细胞悬液；所述基质胶与所述细胞悬液的体积比为(3～4):(5～10)；
所述细胞悬液中包含来源于细胞系的细胞，所述细胞附着于所述基质胶的表面和/或内部；并且，所述细胞悬液中，所述来源于细胞系的细胞含量为80-1600个/100μl；
优选地，所述基质胶与所述细胞悬液的体积比为3:4、3:5、3:6、3:7、3:8、3:9、3:10、4:5、4:6、4:7、4:8、4:9或4:10；更优选地，所述基质胶与所述细胞悬液的体积比为30:50、32:50、34:50、36:50、40:50、30:100、32:100、34:100、36:100、38:100或40:100；
进一步优选地，所述细胞悬液中，所述来源于细胞系的细胞含量为80个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、1100个、1200个、1300个、1400个、1500个或1600个/100μl。
2.根据权利要求1所述的类器官培养体系，其中，每32μl所述基质胶附着的细胞数量为80-800个，优选为200、400、600、800个；
优选地，所述基质胶选自RGF BME基质胶或Matrigel基质胶；更优选地，所述基质胶为RGF BME基质胶。
3.根据权利要求1或2所述的类器官培养体系，其中，所述来源于细胞系的细胞选自来源于下述任一种细胞系的细胞：293、293T、A549、MDA-MB-231、PC-3。
4.根据权利要求1-3任一项所述的类器官培养体系，其中，所述细胞悬液包括细胞培养基，和分散于所述细胞培养基内的细胞；优选地，所述细胞培养基为含有10％(v/v)胎牛血清的IMDM培养基。
5.一种类器官的培养方法，其中，所述培养方法包括如下步骤：
制备步骤：制备细胞悬液，所述细胞悬液中包含来源于细胞系的细胞，所述来源于细胞系的细胞含量为80-1600个/100μl；
混合步骤：按照(3～4):(5～10)的体积比混合基质胶与所述细胞悬液，使所述细胞悬液液中的细胞附着于所述基质胶的内部和/或表面，得到类器官培养体系；
培养步骤：对所述类器官培养体系进行培养，得到类器官；
优选地，混合步骤中所述基质胶与所述细胞悬液的体积比为3:4、3:5、3:6、3:7、3:8、3:9、3:10、4:5、4:6、4:7、4:8、4:9或4:10；更优选地，所述基质胶与所述细胞悬液的体积比为30:50、32:50、34:50、36:50、40:50、30:100、32:100、34:100、36:100、38:100或40:100；
优选地，制备步骤中所述来源于细胞系的细胞含量为80个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、1100个、1200个、1300个、1400个、1500个或1600个/100μl。
6.根据权利要求5所述的培养方法，其中，所述制备步骤包括：
培养来源于细胞系的细胞，然后将细胞消化、离心，将离心所得的细胞沉淀分散于细胞培养基中，得到细胞悬液；
优选地，所述细胞来源于下述任一种细胞系的细胞：293、293T、A549、MDA-MB-231、PC-3；更优选地，所述细胞为293T细胞；
优选地，所述细胞培养基为含有10％(v/v)胎牛血清的IMDM培养基。
7.根据权利要求5所述的培养方法，其中，所述混合步骤包括：
(1)取液态基质胶铺设于细胞培养容器内，所述液态基质胶固化后，得到第一包被层；
(2)向所述第一包被层上加入细胞悬液，所述细胞悬液中的细胞被接种于所述第一包被层的内部和/或表面，得到第二包被层；
优选地，所述混合步骤还包括：(3)静置一段时间，向所述第二包被层上加入含有基质胶的细胞培养基；
优选地，所述基质胶为Matrigel和/或RGF BME基质胶；
更优选地，所述混合步骤包括：
(1)取液态基质胶铺设于细胞培养容器内，所述液态基质胶固化后，得到第一包被层；
(2)向所述第一包被层上加入细胞悬液，所述细胞悬液中的细胞被接种于所述包被层的内部和/或表面，得到第二包被层，静置10-15min；
(3)向所述第二包被层上加入含有液态基质胶的细胞培养基；
其中，步骤(3)细胞培养基中液态基质胶的体积比为10％(v/v)，步骤(2)中细胞悬液和步骤(3)中细胞培养基的体积比为1:1。
8.根据权利要求1-4任一项所述的类器官培养体系或根据权利要求5-7任一项所述的培养方法在培养类器官中的应用。
9.一种类器官，其中，所述类器官使用根据权利要求1-4任一项所述的类器官培养体系或根据权利要求5-7任一项所述的培养方法而获得。
10.根据权利要求9所述的类器官在如下(a1)-(a3)至少一种中的应用：
(a1)药物筛选，或构建药物筛选模型；
(a2)药物毒性测试，或构建药物毒性测试模型；
(a3)疾病研究，或构建疾病模型。
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