CN109593704A - 一种三维微载体细胞吸附培养的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种三维微载体细胞吸附培养的方法。它包括如下步骤：1)接种细胞：将细胞悬液与干燥的三维微载体混合，得到混合细胞悬液的微载体；2)细胞吸附：将步骤1)中得到的所述混合细胞悬液的微载体采用旋转动态吸附方法孵育，使细胞粘附于所述三维微载体上；3)细胞培养：步骤2)中待所述细胞粘附后，加入完全培养基，培养。本发明为细胞提供更多的生长面积，简化了细胞接种于微载体的操作，避免了染菌的风险；适用于大规模生物反应器的培养；三维微载体独特的吸胀性，可以是大量的细胞进入载体连通的孔径内部，更好的形成仿生的三维立体生长模式，促进体外细胞培养过程中的功能发挥。

Description

一种三维微载体细胞吸附培养的方法
技术领域
本发明涉及一种三维微载体细胞吸附培养的方法，属于细胞吸附培养技术领域。
背景技术
随着生物医学，材料学，机械学，工程学等交叉学科的快速发展，越来越多的人关注于细胞在体外培养的微环境与体内生存微环境的差异。传统的两维细胞培养(基于商业化的培养皿或多孔板)技术发展已有百余年的历史，在生命科学基础研究、医学研究等领域具有广泛应用。然而随着显微成像技术的快速发展，研究者逐渐发现细胞在两维的培养环境下的生存状态，细胞形态与其在体内真实环境的培养条件下相距甚远。因此这种简化的两维微环境不能很好的模拟和重现体内的三维微环境。而依赖于传统两维环境下培养的干细胞，在干细胞移植治疗过程中，由于体内外生存环境的巨变，导致了干细胞存活率和功能的降低，修复与再生功能的减退，从而制约了干细胞治疗在临床应用的效果。研究表明，相比于细胞的两维培养，体外三维微环境的模拟有利于细胞的增值和分化，保持细胞干性，使体外培养的细胞与体内环境状态下的细胞更加相近。因此三维细胞培养技术在近年来备受关注，并得到了大幅度的发展。
构建细胞体外的三维培养模型，所用的生物材料由于需要在体内与组织直接接触，因此必须具备一定的特殊要求：如材料基质的来源(天然或合成材料)、材料基质的物化性能(化学相容性、机械性能、降解性、结构特性等)、材料基质的生物活性(粘附位点、诱导信号等)，三维培养技术所需的设备、使用条件、适用范围，细胞的吸附方式、粘附方式、培养方式、检测方式等等。理想的三维细胞培养系统能够实现在细胞种植、培养、增殖、传代过程中以及后续的成像与定性上比传统的两维培养方式更加接近于体内状态，并在操作手段上同传统两维细胞培养方式同样简便易行。
结合生物学，医学，工程学，材料学等多学科交叉知识，选择最优的生物材料，设计最为简便快捷的细胞载体制作工艺，从而达到大规模简易制造，保证细胞载体的形态均一性和吸附能力尤为重要，同时也为推进细胞治疗的临床应用奠定了坚实的基础。
竞品微载体为实心球体且在接种细胞之前经过溶胀，因此竞品微载体无法再吸收更多液体，吸附细胞的时候，细胞仅能贴附于表面。
发明内容
本发明的目的是提供一种三维微载体细胞吸附培养的方法，本发明为细胞提供更多的生长面积，简化了细胞接种于微载体的操作。
本发明提供的一种三维微载体细胞吸附培养的方法，包括如下步骤：1)接种细胞：将细胞悬液与干燥的三维微载体混合，得到混合细胞悬液的微载体；
2)细胞吸附：将步骤1)中得到的所述混合细胞悬液的微载体采用吸附方法孵育，使细胞粘附于所述三维微载体上；
3)细胞培养：步骤2)中待所述细胞粘附后，加入完全培养基，培养。
上述的方法中，所述细胞悬液的密度为1×104～1×10 8个细胞/mL；所述细胞悬液为细胞重悬于培养基或者液态生物基质材料中得到，上述材料具体可为胶原、明胶、明胶衍生物、蛋白多糖、糖蛋白、藻酸盐、藻酸盐衍生物、琼脂、基质胶、透明质酸、纤连蛋白或层连蛋白；
所述细胞悬液的体积与所述三维微载体的质量比为1～1000μL：1mg；具体可为10μL：1mg、1～10μL：1mg、10～15μL：1mg、5～15μL：1mg或250～350μL：1mg。
上述的方法步骤1)中，所述细胞悬液与所述三维微载体混合的步骤如下：将所述细胞悬液滴加于所述三维微载体上。
本发明中，步骤1)中采用的是干燥的所述三维微载体，将所述细胞悬液直接与其混合，省了所述三维微载体需提前溶胀的步骤，因此简化了细胞接种于微载体的操作
上述的方法中，所述孵育条件如下：温度可为35～40℃，具体可为37℃、37～40℃或35～37℃，时间可为0.5～24小时，具体可为2小时或24小时；二氧化碳体积百分浓度为5～30％，具体可为5％、5～10％或5～20％；
所述吸附方法包括重力吸附法、溶胀吸附法、搅拌器旋转吸附法、离心法、表面声波法或磁力吸附法。
上述的方法中，所述培养的条件如下：温度为35～40℃，具体可为37℃、37～40℃或35～37℃，二氧化碳体积百分浓度为5～30％，具体可为5％、5～10％或5～20％。
上述的方法中，步骤1)之前还包括将所述三维微载体气体灭菌、射线灭菌或紫外灭菌的步骤。
上述的方法中，所述三维微载体为多孔微载体，具体可为3D FloTrix微载体，商购于北京华龛生物科技有限公司，货号CNF-F01T-50；Cytopore 1和Cytopore 2，商购于GE，货号17-0911、17-1271；CultiSpher(M9418)商购于Sigma。
本发明适用的细胞为本领域常见的细胞。
本发明具有以下优点：
本发明采用高密度低体积方法，直接采用细胞悬液将三维微载体进行溶胀。细胞悬液加入干燥的三维微载体立刻被微载体吸入，促进细胞在接种的时候就直接被微载体的孔隙吸入，将细胞分散于微载体的孔隙中，随后粘附再生长，为细胞提供更多的生长面积，另一方面节省了微载体需提前溶胀的步骤，因此简化了细胞接种于微载体的操作。无菌操作培养更加简便，避免了染菌的风险；适用于大规模生物反应器的培养；三维微载体独特的吸胀性，可以是大量的细胞进入载体连通的孔径内部，更好的形成仿生的三维立体生长模式，促进体外细胞培养过程中的功能发挥。
附图说明
图1为本发明实施例1中使用的内置叶轮细胞培养瓶。
图2为本发明实施例1中细胞与微载体经过旋转吸附法逐渐吸附到微载体上的细胞数和吸附效率。
图3为本发明实施例2中方法吸附细胞后荧光染色的结果图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中细胞为脂肪间充质干细胞；
三维微载体为3D FloTrix微载体，商购于北京华龛生物科技有限公司，货号CNF-F01T-50。
实施例1、采用搅拌器旋转吸附法进行三维微载体细胞吸附的方法
1、微载体准备：称取微载体粉末200mg进行紫外灭菌后倒入无菌的内置叶轮细胞培养瓶(如图1所示)中；准备三组；
2、细胞准备：事先准备好脂肪间充质干细胞悬液，5×106个细胞重悬于60mL完全培养基中待用；准备三组；
3、接种细胞：将上述细胞悬液混入内置叶轮细胞培养瓶中，与200mg微载体混匀；
4、细胞吸附：将内置叶轮细胞培养瓶置于低速搅拌器上并放入37℃，5％二氧化碳培养箱中进行80rpm搅拌，使细胞通过旋转的方式粘附于微载体上；
5、原位计数获取吸附率：
a.微载体收集：三组分别在搅拌2小时、4小时、6小时将与细胞悬液进行混合过的微载体经过70μm的细胞筛网收集后用PBS清洗一次，目的是将没有附着在微载体上的细胞清洗掉。然后将含有细胞的微载体悬液进行离心，1500rpm，2分钟，弃上清。
b.细胞计数：200mg微载体加入50ml的0.1％的结晶紫溶液(结晶紫0.1g，柠檬酸2.1g，20μL吐温-80，去离子水100ml)，37℃下2-5h后，通过细胞计数板进行计数，并根据初始接种数目进行换算获得吸附率。
c.结果分析：图2中显示，随着搅拌时间的增加，细胞与微载体经过旋转吸附法能逐渐吸附到微载体上，吸附效率在2小时的搅拌就能达到67％，在4小时达到81％，在6小时达到92％。
实施例2、小体积高密度溶胀吸附法进行三维微载体细胞吸附的方法
1、微载体准备：称取微载体粉末20mg进行紫外灭菌，待用；
2、细胞准备：事先准备好脂肪间充质干细胞悬液，密度为2.5×106个细胞/mL，每20mg三维微载体需准备200μL待用；
3、接种细胞：吸取200μL细胞悬液滴加于20mg微载体使细胞悬液与微载体充分混匀；
4、细胞吸附：将混匀细胞悬液的微载体放入37℃，5％二氧化碳培养箱中孵育2小时，使细胞粘附于微载体上；
5、细胞培养：待细胞粘附后，加入3mL完全培养基，放入37℃，5％二氧化碳培养箱中培养24小时后观察细胞；
6、对照实验：步骤3-5为此为小体积高密度吸附法，为本发明的方法；另外准备普通吸附方法的对比实验组(大体积低密度)，即将200uL细胞悬液混入3mL完全培养基中，直接加入20mg微载体中24小时后观察细胞；
7、观察细胞：
1)试剂盒：Live&Dead Viability/Cytotoxicity Assay Kit for Animal Cell，货号：KGAF001
2)取50-100μL的含有细胞的三维微载体悬液加入到96孔板内；
3)尽量去除上清，加入PBS洗一次，2min后尽量去除PBS，每孔加入按照试剂盒使用说明书配置好的染液100μL进行染色，室温避光染色20-30min后，在荧光显微镜下进行观察；结果如图3所示。
由图3可知，活细胞将被染液染上后，通过荧光可以观察其发光，发光的细胞为活细胞。图中显示通过大体积低密度的吸附方法，吸附于微载体上的细胞较少，且主要分布在微载体表面，而通过小体积高密度的吸附方法则可以把大量细胞吸附于微载体，且细胞不仅存在于微载体表面，也存在于多孔微载体的孔隙中，从而可见本发明的小体积高密度吸附方法可能更有效地将细胞吸附与微载体上且更好地利用了多孔微载体多孔的大面积培养空间。

Claims (7)

1.一种三维微载体细胞吸附培养的方法，包括如下步骤：1)接种细胞：将细胞悬液与干燥的三维微载体混合，得到混合细胞悬液的微载体；
2)细胞吸附：将步骤1)中得到的所述混合细胞悬液的微载体孵育，使细胞粘附于所述三维微载体上；
3)细胞培养：步骤2)中待所述细胞粘附后，加入完全培养基，培养。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述细胞悬液的密度为1×104～1×108个细胞/mL；所述细胞悬液为细胞重悬于培养基或者液态生物基质材料中得到；
所述细胞悬液的体积与所述三维微载体的质量比为1～1000μL：1mg。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤1)中，所述细胞悬液与所述三维微载体混合的步骤如下：将所述细胞悬液滴加于所述三维微载体上。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于：所述孵育条件如下：温度为35～40℃，时间为0.5～24小时；二氧化碳体积百分浓度为5～30％；
所述吸附方法包括重力吸附法、溶胀吸附法、搅拌器旋转吸附法、离心法、表面声波法或磁力吸附法。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于：所述培养的条件如下：温度为35～40℃，二氧化碳体积百分浓度为5～30％。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于：所述三维微载体为多孔微载体。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于：步骤1)之前还包括将所述三维微载体气体灭菌、射线灭菌或紫外灭菌的步骤。
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