CN113699093A - 一种保存细胞制剂的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种保存细胞制剂的方法。该保存细胞制剂的方法包括将微组织悬液进行离心，弃上清，获得微组织；采用氯化钠水溶液清洗所述微组织；采用氯化钠水溶液、1%人白蛋白或5%葡萄糖溶液将清洗后的微组织在氯化钠水溶液中在4℃‑25℃保存；所述微组织悬液为采用微载体培养细胞获得的。该方法利用多孔结构微载体的空间结构优势对细胞进行保护，在较长保存时间(＞6h)保持细胞活性不低于80%。

Description

一种保存细胞制剂的方法
技术领域
本发明属于干细胞临床应用领域，具体涉及一种保存细胞制剂的方法。
背景技术
细胞治疗是指使用活细胞注射到病人体内治疗某种疾病的方法。所使用的细胞为自体或异体细胞，在体外经过处理后，回输人体。体外处理可以包括细胞在体外的分离、传代、扩增、筛选、给予药物或基因编辑等改造其细胞生物学行为的手段。细胞活性是决定病人的医疗安全和疗效关键因素。而制备的细胞由于培养和应用空间不统一、人为等限制，时常不能立即在制备场地进行应用，所以制备好的活细胞从制备环境运输到实施治疗的环境是细胞治疗的“最后一公里”，合适的储存、运输条件对保存其活性的影响尤为重要。
因此，针对保存期细胞的活性保护，科研及医疗机构一般会从细胞的保存介质、保存温度和保存时间等方向入手。目前，细胞的保存介质通常选用0.9％氯化钠水溶液(即生理盐水)、5％葡萄糖溶液或1％人血白蛋白溶液，其中0.9％氯化钠水溶液最为常用；保存温度通常选用4℃低温保存，保存时间通常控制在6h以内。
现有技术的缺陷在于：1）为保障临床应用的细胞活性不低于80％，细胞在保存介质中的保存时间应控制在6h内，保存时间较短，不利于制备、检测和应用等多项工作开展；2）为延长保存时间至6h，细胞保存温度需严格控制4℃，这需要极其精密的低温运输装置，显著增加了细胞保存的成本。因此，有必要寻找实现细胞保存不受温度影响及较长保存时间（＞6h）保存条件的方法。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种保存细胞制剂的方法。
本发明提供了一种保存细胞制剂的方法，所述方法包括将微组织悬液进行离心，弃上清，获得微组织；采用氯化钠水溶液清洗所述微组织；采用氯化钠水溶液、1%人白蛋白或5%葡萄糖溶液重悬清洗后的微组织获得细胞制剂；所述细胞制剂在4℃-25℃保存；所述微组织悬液为采用微载体培养细胞获得的。
可选地，根据上述的方法，所述微载体由明胶制备而成。
微载体为细胞提供附着及增殖所需的贴壁基底，微载体大小可为10-1000微米的多孔微球，其中有若干相互连通的大于10微米直径的小孔构成的多孔通透结构包裹细胞，如同蜂巢与蜜蜂的关系，微载体的多孔结构为细胞提供了巢穴保护其受到外界不利因素的影响。
可选地，根据上述的方法，所述微载体为多孔结构，孔隙率＞90%，粒径为50-500μm。
可选地，根据上述的方法，所述微载体的孔直径为15-50微米。细胞受微载体的孔壁的保护，降低细胞所受外界压力（比如在运输过程中，保存介质在容器中来回晃动冲刷细胞造成的损伤、温度波动的影响），而保持细胞活性。
可选地，根据上述的方法，所述微载体为北京华龛生物科技有限公司的TableTrix®微载片，货号F01-100或W01-100。
可选地，根据上述的方法，所述采用微载体培养细胞中所述细胞与所述微载体的比例为2.5×106-5×107个：100mg。
可选地，根据上述的方法，所述细胞制剂中，细胞和所述氯化钠水溶液、1%人白蛋白或5%葡萄糖溶液的比例为1×106个-1×107个：1 ml。
可选地，根据上述的方法，所述采用微载体培养细胞为悬浮培养，培养条件为恒速或间速，37℃，5％CO2，培养20-96小时；所述恒速为30-50rpm；所述间速为30rpm 2min,1rpm 2h, 20rpm 2min。
可选地，根据上述的方法，所述离心为1000-1500RPM，5min。
可选地，根据上述的方法，所述氯化钠水溶液是溶质为0.9%的氯化钠，溶剂为水的溶液；所述1%人白蛋白溶液溶质为1%人白蛋白，溶剂为水的溶液；5%葡萄糖溶液溶质为5%葡萄糖，溶剂为水的溶液；所述%为质量百分含量。
可选地，根据上述的方法，所述细胞为间充质干细胞和/或胚胎干细胞。例如，脐带干细胞或脂肪干细胞。
本发明实施例利用多孔结构微载体的空间结构优势对细胞进行保护，在较长保存时间(＞6h)保持细胞活性不低于80%。
在本发明实施例中，以多孔结构微载体和细胞形成的微组织进行细胞保存，在低温4oC条件下，能够维持干细胞在72h内细胞活性不低于80%；以多孔微载体和细胞形成的微组织进行细胞保存，在室温25oC条件下，能够维持干细胞在40h内细胞活性不低于80%。
附图说明
图1为实施例1细胞活性测定结果。
图2为实施例1细胞活性测定结果。
图3为实施例1的4℃时细胞随时间的活性变化。
图4为实施例1的4℃时细胞保存68小时活性降低程度。
图5为实施例1的25℃时细胞随时间的活性变化。
图6为实施例1的25℃时细胞保存43小时活性降低程度。
图7为实施例2 活死细胞染色结果。
图8为实施例2 活细胞计数结果。
图9为实施例3的细胞微载体预混不同时间活死细胞染色结果。
图10为实施例3的细胞微载体预混不同时间细胞数量和活性情况。
图11为实施例3的动态恒速或间速预混不同时间细胞贴附情况。
图12为实施例3的动态恒速或间速预混不同时间细胞贴附数量。
图13为实施例4的使用不同制剂保存细胞制剂的细胞活性变化。
图14为实施例5的不同细胞浓度下微组织对细胞保护作用。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所涉及的3D微载体如无特别说明，为北京华龛生物科技有限公司的3D FloTrix®细胞扩增试剂盒（货号FK01-100, 官方网站http://www.cytoniche.com/）中的 3D TableTrix®微载片（货号F01-100）。3D TableTrix®微载片遇水后将分散成万颗3D多孔明胶微载体，3D多孔明胶微载体的孔隙率>90%，粒径大小为50-500μm，且属于药用辅料，并获得2项国家药监局药用辅料资质，登记号为F20200000496和F20210000003，及美国FDA的 DMF药用辅料资质备案（DMF：35481）。
下述实施例中所涉及的裂解液为北京华龛生物科技有限公司的3D FloTrix®细胞扩增试剂盒（货号FK01-100, 官方网站http://www.cytoniche.com/）中的 3D FloTrix ® Digest裂解液，并按说明书进行配置。
下述实施例中所涉及的细胞为离体的人脂肪间充质干细胞，为本领域常见细胞。
下述实施例中所涉及的人脂肪间充质干细胞无血清培养基，采购于北京华龛生物科技有限公司，货号RMZ010-GY，官方网站www.cytoniche.com。
下述实施例中的PBS为维森特生物技术有限公司的无钙镁离子缓冲液，货号311-010-CL。
下述实施例中的人白蛋白为ORYZOGEN公司的人重组血清白蛋白，货号HYC002C01。
下述实施例中的葡萄糖为北京索莱宝科技有限公司的葡萄糖，货号G8150-500g。
下述实施例中的125ml可透气内置叶轮细胞培养瓶采购于北京华龛生物科技有限公司，型号SF125，官方网站www.cytoniche.com。
下述实施例中的500ml可透气内置叶轮细胞培养瓶采购于北京华龛生物科技有限公司，型号SF500，官方网站www.cytoniche.com。
下述实施例中的3D FloTrix® miniSPIN生物反应器采购于北京华龛生物科技有限公司，型号miniSPIN-M1，官方网站www.cytoniche.com。
实施例1、常温或低温保存干细胞
1. 样品准备
1.1 3D微载体和干细胞形成的微组织：将2.5×106个人间充质干细胞、5片微载片（共100mg）、60ml无血清培养基无菌转移到125ml可透气内置叶轮细胞培养瓶，置于安装于二氧化碳培养箱中的3D FloTrix® miniSPIN生物反应器搅拌台上，转速设置为恒速50RPM，37℃，5％CO2，连续培养4天后形成微组织悬液，均匀收集转移至2个离心管中（即30mL/管），标记为X和Y。
1.2 2D培养后的收获细胞：2.5×106个人间充质干细胞（细胞同上），接种于T75培养瓶中，加入12ml无血清培养基，十字混匀置于二氧化碳培养箱中，培养4天，其中细胞汇合度为90%时，加入0.125%胰酶消化1-2分钟以使细胞从T75培养瓶中脱落，加入等量培养基终止消化，收集细胞单悬液转移离心管中。
2. 样品处理
2.1 2D培养后的单悬细胞处理：
取步骤1.2中收获细胞悬液混匀后，吸取10ul到血球计数板于显微镜下进行细胞数目计量。将剩余的细胞悬液离心1000rpm, 5min，弃除培养基后，加入等量保存介质，0.9％氯化钠溶液中（溶质为0.9质量的氯化钠，溶剂为水），再一次离心1000rpm, 5min清洗一遍，再以1×106个/ml重悬于0.9%氯化钠溶液，获得细胞制剂，并将其分装1mL /管至1.5mL EP管中，共20管，标记2D-1到2D-20，每管1ml，即1×106个细胞/管，取EP管2D-1到2D10放于低温保存的设备，如4°C冰箱或或细胞冷藏运输箱（温度范围2-8℃，设置为4℃），EP管2D-11到2D-20放于常温保存的设备，如25°C恒温箱或常温保存箱（温度范围25-30℃，设置为25℃）。记录放置时间。放置4℃的EP管在放置0小时、22小时、43小时、68小时取出测量细胞活性。放置25℃的EP管在放置0小时、22小时、43小时、68小时取出测量细胞活性。
2.2 3D微组织处理：
A. 3D微组织取样计数：将步骤1.1中的X离心管中的微组织悬液均匀混合，在保证微组织悬液均匀混悬状态下平行取3个样品，每个样品1ml，离心去培养上清加1ml裂解液轻轻吹悬，37℃条件下裂解30分钟微载体消失变成单细胞悬液，对每个样品采用血球计数板于显微镜下进行细胞计数，取平均值×27mL得到剩余微组织中的细胞总量（30mL培养体积减去3mL取样）。
B. 微组织分装：将步骤1.1制备的剩余微组织悬液进行离心1000rpm，5min，弃培养上清，加入等量保存介质，0.9％氯化钠溶液中（溶质为0.9质量的氯化钠，溶剂为水），再一次离心1000rpm，5min清洗一遍，根据步骤2.2A中所计算的细胞总量，推算所需保存介质，以1×106个细胞/ml重悬于0.9%氯化钠溶液，获得细胞制剂，并将其均匀分装1mL /管至1.5mL EP管中，共20管。标记为3D-1到3D-20， 每管1ml。取编号3D-1到3D-10共10管放于低温保存的设备，如4°C冰箱或或细胞冷藏运输箱（温度范围2-8℃，设置为4℃）；3D-11到3D-20放于常温保存的设备，如25°C恒温箱或常温保存箱（温度范围25-30℃，设置为25℃）。记录放置时间。放置4℃的EP管在放置0小时、22小时、43小时、68小时取出测量细胞活性。放置25℃的EP管在放置0小时、22小时、43小时、68小时取出测量细胞活性。
2.3 3D培养后的单悬细胞处理：
将步骤1.1中的Y离心管中的微组织悬液静置5分钟，待微组织完全沉降后，弃培养上清，加入10ml裂解液，轻轻吹悬，37℃条件下裂解30分钟微载体消失变成单细胞悬液，充分混匀后，吸取10ul到血球计数板于显微镜下进行细胞数目计量。将剩余的细胞悬液离心1000rpm, 5min，弃除培养基后，加入等量保存介质，0.9％氯化钠溶液中，再一次离心1000rpm, 5min清洗一遍，再以1×106个/ml重悬于0.9%氯化钠溶液，获得细胞制剂，并将其分装1mL /管至1.5mL EP管中，共20管。标号裂-1到裂-20，每管1ml。取编号裂-1到裂-10共10管放于低温保存的设备，如4°C冰箱或细胞冷藏运输箱（温度范围2-8℃，设置为4℃）；裂-11到裂-20放于常温保存的设备，如25°C恒温箱或常温保存箱（温度范围25-30℃，设置为25℃）。记录放置时间。放置4℃的EP管在放置0小时、22小时、43小时、68小时取出测量细胞活性。放置25℃的EP管在放置0小时、22小时、43小时、68小时取出测量细胞活性。
3. 测定细胞活性
细胞活性定义为总细胞中的活细胞数比例，即活细胞数/活细胞和死细胞数目总和x100%。
3.1样品预处理
单悬细胞的活性检测无需样品预处理，即步骤2.1的2D培养后的单悬细胞和步骤2.3的3D培养后的单悬细胞无需预处理。
步骤2.2中的3D微组织需进行如下预处理：检测细胞活力前，需将微组织中的细胞从微载体上释放出来，即先将EP管以1000rpm离心5分钟，去除0.95%氯化钠水溶液后，加1ml裂解液轻轻吹悬，37℃条件下裂解30分钟，微载体消失后释放细胞变成单细胞悬液后方可进行活性检测。
3.2 活性检测
细胞活死荧光染色计数活性：根据细胞活力（活死细胞染色）检测试剂盒的说明书配置活死荧光染液（采购于江苏凯基生物技术股份有限公司，货号KGAF001，官方网站http://www.keygentec.com.cn）配置细胞活力检测液。在相应的检测时间点，从步骤2.1、步骤2.2和2.3中标记为2D-1到2D-20、3D-1到3D-20（提前进行了检测细胞活力前的预处理）以及裂-1到裂-20的样品中，各条件随机取2-3管 EP管，1000RPM离心5min后弃0.95%氯化钠水溶液，避光加入100微升配置好的细胞活力检测液，室温避光染色10-15分钟，补加900ulPBS，轻轻混匀，取样到血球计数板使用荧光显微镜计数活死细胞，每个样品取3个样进行计数，并计算平均值和方差。计数时，使用490nm激发光计数活细胞数目，转换535nm激发光计数死细胞数目（只转换显微镜的激发光，确保样品视野位置不动）。以2D-1（2D培养获得的单悬细胞在4℃存放22小时）为例子，图1和图2分别展示了同一个视野下的活细胞和死细胞。
4.结果显示
细胞活性测定结果如图1和图2所示。图1和图2为2D-1（存放22小时）血球计数板上同一视野下活死细胞状况，其中图1荧光点状为活细胞（如图所示有51个），图2中荧光点状为死细胞（如图所示有4个），此时细胞活性=51/（51+4）×100%=91.07%
图3是3种干细胞制剂（2D培养收获的单悬细胞、3D微组织、3D培养收获的单悬细胞）在4°C存放不同时间的细胞活率结果。直至68h，3D微组织中的细胞活率都保持在90%以上，且在所有时间点上，3D微组织的细胞活率均比其他两种干细胞制剂活率要高。而无论是2D培养还是3D培养，干细胞以单悬细胞做为制剂的形式保存，在22小时开始降低至90%以下，在43小时仅略高于80%。而在43小时后降至80%以下。
图4是3种干细胞制剂在4°C存放68小时后的活性降低程度检测结果，3D 微组织的活性降低程度最小，仅降低1.89%，而3D培养收获的单悬细胞和2D培养收获的单悬细胞的降低程度分别是16.9%和23.1%。降低程度=100% -（68小时活性/0小时活性）%。可见，以3D培养后保留微组织形式保存干细胞制剂可以更好地维持细胞在4°C的活率，从而有效地延长细胞制备后运输到临床应用地点的时效。
图5是3种干细胞制剂（2D培养收获的单悬细胞、3D微组织、3D培养收获的单悬细胞）在25°C存放不同时间的细胞活率结果。直至43h，3D微组织中的细胞活率都保持在80%以上，且在所有时间点上，3D微组织的细胞活率均比其他两种干细胞制剂活率要高。而无论是2D培养还是3D培养，干细胞以单悬细胞做为制剂的形式保存，在22小时开始降低至80%或以下，在43小时已低于80%。
图6是3种干细胞制剂在25°C存放43小时活性降低程度检测结果，3D 微组织的活性降低程度最小，仅降低10.61%，而3D培养收获的单悬细胞和2D培养收获的单悬细胞的降低程度分别是17.42%和26.04%。降低程度=100% -（43小时活性/0小时活性）%。可见，以3D培养后保留微组织形式保存干细胞制剂可以更好地维持细胞在25°C的活率，能够有效地延长了细胞制备后常温运输到临床应用地点的时效，因而降低对运输条件的要求，更便利于干细胞制剂的应用。
实施例2、不同微载体常温保存干细胞的效果对比
1. 样品准备
不同微载体和干细胞形成的微组织：将2.5×106个人间充质干细胞、100mg 微载体、60ml无血清培养基无菌转移到125ml可透气内置叶轮细胞培养瓶，置于安装于二氧化碳培养箱中的3D FloTrix® miniSPIN生物反应器搅拌台上，转速设置为恒速50RPM，37℃，5％CO2，连续培养4天后形成微组织悬液。所采用的微载体分别为多孔的3D TableTrix® 微载片和实心球的Cytodex微载体（货号17-0485-01，购于Cytiva），所形成的微组织分别收集转移至离心管中，标记为F01和CD。
2.样品处理
3D TableTrix®微载片形成的微组织F01：按照实施例1中步骤2.2A进行取样计数后，根据实施例1中步骤2.2B进行分装，以约1.5×106个细胞/ml重悬于0.9%氯化钠溶液，获得细胞制剂，并将其均匀分装1mL /管至1.5mL EP管中。放于25°C恒温箱。
Cytodex形成的微组织CD：将步骤1中的CD离心管中的微组织悬液均匀混合，在保证微组织悬液均匀混悬状态下平行取3个样品，每个样品1ml，离心去培养上清加1ml 0.25%胰酶（含EDTA）轻轻吹悬，37℃条件下消化直至细胞脱落（约15分钟），使用40μm筛网将微载体和消化下来的细胞分离后，对每个样品进行计数，取平均值×剩余微组织的体积以得到CD微组织的细胞总量。将步骤1制备的剩余CD微组织进行离心1000rpm, 5min，弃培养上清，加入等量保存介质，0.9％氯化钠溶液中（溶质为0.9质量的氯化钠，溶剂为水），再一次离心1000rpm, 5min清洗一遍，根据计算的细胞总量，推算所需保存介质，以约1.5×106个细胞/ml重悬于0.9%氯化钠溶液，获得细胞制剂，并将其均匀分装1mL /管至1.5mL EP管中。放于25°C恒温箱，记录放置时间。
3.活死细胞染色
在放置0小时、24小时、48小时，分别各取一管经过步骤2处理的不同微组织形式保存的细胞制剂，进行活死细胞染色以观察不同微载体形成的微组织保存细胞活性的情况。
3.1染色液配置：根据细胞活死染色试剂盒（Live＆Dead Viability/Cytotoxicity Assay Kit for Animal Cell，货号： KGAF001，购于凯基生物）配置染色液。
3.2样品染色和观察：每个样品取50μL细胞制剂加入到96孔板内；尽量去除上清，加入PBS洗一次，2min后尽量去除PBS，每孔加入按照试剂盒使用说明书配置好的染色液100μL进行染色，室温避光染色20-30min后，在荧光显微镜下进行观察。
结果如图7显示，荧光点状为死细胞，3D TableTrix® 微载片和实心球的Cytodex微载体形成的微组织在0小时是有少量死细胞，随着放置时间增加，即24小时和48小时，微组织中的死细胞都明显增多，但相较于3D TableTrix® 微载片形成的微组织，实心球的Cytodex微载体的死细胞在放置48小时的时候明显更多，可见3D TableTrix®微载片保存干细胞的活性更佳。
4. 活细胞计数
在放置24小时和48小时，分别各取一管上述步骤2获得的细胞制剂，进行活细胞计数，活性降低程度＝［（0小时的活细胞数-48小时的活细胞数）/0小时的活细胞数）］×100%。
活细胞计数具体方法为：每个干细胞制剂进行一定比例稀释后，与0.4%台盼蓝染色液（货号C0040，购于北京索莱宝科技有限公司）一比一充分混合后，采用细胞计数仪进行活细胞计数（CounStar细胞计数仪，购于上海睿钰生物科技有限公司）。
结果如图8显示，其中，横坐标0、24、48分别表示步骤2中1mL细胞制剂细胞计数结果、步骤4中放置24小时1mL细胞制剂活细胞计数结果和步骤4中放置48小时1mL细胞制剂活细胞计数结果。3D TableTrix® 微载片相较于Cytodex形成的微组织在放置24小时和48小时的活细胞数量变化较小，可见多孔的3D微载体比实心球的微载体保存干细胞的活性更佳。
实施例3、微组织制备方案优化
1. 载体细胞预混不同时间细胞贴附和增殖情况
1.1分组：预混4、8、16、20、24、28h，500万/10mg接种。
1.2实验步骤：
1、500万细胞在200 µl培养基中接种到一片3D微载体（北京华龛生物科技有限公司，W01-100），2h后补充培养基4ml；
2、孵育2、4、8、16、20、24、28h后分别取微组织进行活死染色，并使用生理盐水进行清洗3次后取样染色观察细胞贴附情况，染色采用细胞活力（活死细胞染色）检测试剂盒（采购于江苏凯基生物技术股份有限公司，货号KGAF001，官方网站http://www.keygentec.com.cn）进行染色；
3、用20G针头注射，取一部分进行死活染色看细胞贴附情况。孵育16、20、24、28h后分别取微组织100uL全裂解后进行细胞计数，活性统计。活性统计方法与实施例1的活性检测方法相同。
1.3实验结果：
1.3.1预混不同时间细胞贴附情况
采用静态预混的方法，将500万细胞和10mg微载体预混，观察2、4、8、16、20、24、28h预混后细胞贴附和活率。细胞贴附情况如图9A，结果显示，预混2h时细胞无法很好贴附。预混4-8h，细胞可以贴附但是有部分游离细胞在载体外。预混16-28h，细胞已能够较好贴附，但是静态接种细胞易成团。
1.3.2生理盐水清洗后细胞贴附情况
细胞能够很好贴附微载体，但是微组织在制备过程中需要清洗以去除培养基等成分，此过程有可能造成细胞脱落。因此观察了预混4、8、16、20、24、28h预混清洗后细胞贴附情况。细胞贴附情况如图9B所示，预混4-8h微组织经过清洗过程，有明显大量细胞脱落现象。预混16h微组织经过清洗，有较少数细胞脱落。预混20h微组织经过清洗，细胞偶有脱落。预混24小时及以上细胞贴附情况较好，无明显细胞脱落。
1.3.3预混不同时间贴附细胞数量
预混不同时间与细胞贴附数量的关系目前尚不明确，因此检测了预混16、20、24、28h微组织注射后每片10mg载体的细胞总量。如图10A所示，预混16h每10mg微载体细胞量为3.98×106个，预混20h每10mg微载体细胞总量为4.13×106个，明显低于接种量，说明在制备过程中有较大损失。预混24h每10mg微载体细胞总量为4.62×106个，微组织细胞总量接近于接种量，说明细胞贴附较好，没有出现明显的细胞损失。预混28h每10mg微载体细胞总量为6.16×106个，微组织细胞总量明显高于接种量，说明细胞贴附好后开始增殖。细胞活性如图10B所示，各组细胞活性均较高，大于90%。
2 动态恒速和间速接种不同时间细胞贴附和增殖情况
2.1分组：动态间速或恒速预混20、24、28h。
2.2实验步骤：
1、5000万细胞与100mg微载体共同加入转瓶中，补充培养基到50ml；调节接种转速，间速：2h：30rpm 2min, 1rpm 2h, 20rpm 2min，循环12个后调节为恒速：40rpm；或恒速：40rpm，37℃，5％CO2；
2、取预混20、24、28h微组织进行死活染色，并使用生理盐水进行清洗3次后取样计数和染色。
2.3实验结果：
1、动态间速或恒速接种不同时间细胞贴附情况
由于静态预混造成细胞成团，使用动态间速或恒速预混20、24、28h观察细胞贴附情况。如图11所示，恒速接种细胞20-28h均不能使细胞很好贴附，间速预混20-28h以上微组织细胞贴附较好，没有出现明显的细胞脱落。
2、细胞数量统计
恒速和间速接种后载体上细胞数量如图12所示，恒速接种细胞不能完全贴附于载体上，20h, 24h, 28h贴附到载体上细胞数量分别为5.53×105个、1.61×106个、3.27×106个。间速接种20h, 24h, 28h贴附到载体上细胞数量分别为4.06×106个、4.94×106个、6.15×106。间速接种20-14h细胞贴附数量与接种数量接近，28h组细胞有明显增殖。
2.4总结及讨论：
动态间速预混20-28h细胞可以贴附，预混24h是细胞数量和贴附能力较平衡的时间点，不到24h可能细胞贴附不牢，超过24h可能细胞出现增殖。
实施例4、不同保存溶液中干细胞和干细胞微组织活性维持
1. 样品准备
1.1 3D微载体和干细胞形成的微组织：将3.5×106个人间充质干细胞、7片微载片（共140mg）、70ml无血清培养基无菌转移到125ml可透气内置叶轮细胞培养瓶，置于安装于二氧化碳培养箱中的3D FloTrix® miniSPIN生物反应器搅拌台上，转速设置为恒速50RPM，37℃，5％CO2，第二天补充35ml培养基连续培养4天后形成微组织悬液，去除部分上清，剩余共60ml微组织混悬液，均匀收集转移至2个离心管中（即30mL/管），标记为3D白蛋白组和3D葡萄糖组。
1.2 2D培养后的收获细胞，1.4×106个人间充质干细胞（细胞同上），接种于T175培养瓶中，加入30ml无血清培养基，十字混匀置于二氧化碳培养箱中，培养4天，其中细胞汇合度为90%时，加入0.125%胰酶消化1-2分钟以使细胞从T175培养瓶中脱落，加入等量培养基终止消化，收集细胞单悬液转移到两个离心管中，分别标记为2D白蛋白组和2D葡萄糖组。
2. 样品处理
2.1 2D培养后的单悬细胞处理：
取实施例4步骤1.2中收获细胞悬液混匀后，吸取10ul到血球计数板于显微镜下进行细胞数目计量。将剩余的细胞悬液离心1000rpm, 5min，弃除培养基后，加入等量1%（质量）人白蛋白或5%（质量）葡萄糖溶液中，再一次离心1000rpm, 5min清洗一遍，再以1×106个/ml重悬于1%（质量）人白蛋白或5%（质量）葡萄糖溶液，获得细胞制剂，并将其分装1mL /管至1.5mL EP管中，各10管，标记2D白蛋白组-1到2D白蛋白组-10，和2D葡萄糖组-1到2D葡萄糖组-10，每管1ml，即1×106个细胞/管，取EP管放于低温保存的设备，如4°C冰箱或细胞冷藏运输箱（温度范围2-8℃，设置为4℃）。记录放置时间。EP管在放置0小时、24小时、48小时、72小时取出台盼蓝染色测量细胞活性。
2.2 3D微组织处理：
3D微组织取样计数：将实施例4步骤1.1中的离心管中的微组织悬液均匀混合，在保证微组织悬液均匀混悬状态下平行取3个样品，每个样品1ml，离心去培养上清加1ml裂解液轻轻吹悬，37℃条件下裂解30分钟微载体消失变成单细胞悬液，对每个样品采用血球计数板于显微镜下进行细胞计数，取平均值×27mL得到剩余微组织中的细胞总量（30mL培养体积减去3mL取样）。
微组织分装：将均分的两份微组织悬液进行离心1000rpm，5min，弃培养上清，加入等量1%（质量）人白蛋白或5%（质量）葡萄糖溶液中，再一次离心1000rpm，5min清洗一遍，根据步骤上一步计数结果计算的细胞总量，推算所需保存介质，以1×106个细胞/ml重悬于1%（质量）人白蛋白或5%（质量）葡萄糖溶液，获得细胞制剂，并将其均匀分装1mL /管至1.5mLEP管中，每种细胞保存剂分装10管。标记为3D白蛋白组-1到3D白蛋白组-10，以及3D葡萄糖组-1到3D葡萄糖组-10，每管1ml，即1×106个细胞/管，取EP管放于低温保存的设备，如4°C冰箱或或细胞冷藏运输箱（温度范围2-8℃，设置为4℃）。记录放置时间。EP管在放置0小时、24小时、48小时、72小时取出台盼蓝染色测量细胞活性，检测方法和实施例2中4活细胞计数中的方法相同。
3. 实验结果
使用台盼蓝染液检测细胞活性，结果如图13所示，A为采用1%白蛋白重悬的细胞活性检测结果，B为采用5%葡萄糖重悬的细胞活性检测结果，2D为2D培养后的单悬细胞处理，3D为3D微组织处理。
使用1%白蛋白重悬二维细胞，活性从0h的99.03%降低到24h的12.54%，之后细胞活性一直下降到72h的8.83%。微组织中的细胞活性则一直维持在85%以上一直到72h，具体数值分别是0h为 96.22%, 24h为 85.76%，48h为 89.91%，72h为 85.32%。
使用5%葡萄糖重悬二维细胞， 0h和24h活性较稳定分别为99.03%和94.66%，之后细胞活性下降到48h为63.53%，72h为50.16%。微组织中的细胞活性则一直维持在90%以上，具体数值分别是0h为 96.69%, 24h为 94.9%，48h为 96.07%，72h为 95.83%。
表明采用1%人白蛋白或5%葡萄糖溶液重悬微组织，保存72小时，细胞活性均能保持在85%以上。
实施例5、不同浓度干细胞制剂保存
1. 样品准备
1.1 3D微载体和干细胞形成的微组织：将2.5×107个人间充质干细胞、50片微载片（共1000mg）、500ml无血清培养基无菌转移到500ml培养瓶， 3D FloTrix® miniSPIN生物反应器搅拌台上，转速设置为恒速40RPM，37℃，5％CO2，第三天换250ml培养基连续培养4天后形成微组织悬液，去除上清，留100ml微组织悬液用于下一步实验。
1.2 2D培养后的收获细胞，1.4×106个人间充质干细胞（细胞同上），接种于T175培养瓶中，加入30ml无血清培养基，十字混匀置于二氧化碳培养箱中，培养3天，消化细胞制成细胞悬液待用。
2. 样品处理
2.1 2D培养后的单悬细胞处理：
取实施例5步骤1.2中收获细胞悬液混匀后，细胞计数。将剩余的细胞悬液根据细胞需求量分成三组分别为2D-100万、2D-500万、2D-1000万组，对应细胞量1×106个/ml、5×106个/ml、10×106个/ml，离心1000rpm，5min，弃除培养基后，加入生理盐水，再一次离心1000rpm, 5min清洗一遍，再重悬于对应量的0.9%生理盐水，获得不同细胞浓度的制剂，并将其分装至1.5mL EP管中，每组各12管，取EP管放于低温保存的设备，如4°C冰箱或或细胞冷藏运输箱（温度范围2-8℃，设置为4℃）。记录放置时间。EP管在放置0小时、24小时、48小时、72小时取出台盼蓝染色测量细胞活性，检测方法和实施例2中4活细胞计数中的方法相同。。
2.3 3D微组织处理：
3D微组织取样计数：将实施例4步骤1.1中的离心管中的微组织悬液均匀混合，在保证微组织悬液均匀混悬状态下平行取3个样品，每个样品1ml，离心去培养上清加1ml裂解液轻轻吹悬，37℃条件下裂解30分钟微载体消失变成单细胞悬液，对每个样品采用血球计数板于显微镜下进行细胞计数，取平均值×27mL得到剩余微组织中的细胞总量（100mL培养体积减去3mL取样）。
微组织分装：根据上一步细胞计数结果将微组织分成三组分别为3D-100万、3D-500万、3D-1000万组，对应细胞量1×106个/ml、5×106个/ml、10×106个/ml，离心1000rpm,5min，弃除培养基后，加入生理盐水，再一次离心1000rpm, 5min清洗一遍，再重悬于对应量的0.9%生理盐水，获得不同细胞浓度的制剂，并将其分装至1.5mL EP管中，每组各12管，取EP管放于低温保存的设备，如4°C冰箱或或细胞冷藏运输箱（温度范围2-8℃，设置为4℃）。记录放置时间。EP管在放置0小时、24小时、48小时、72小时取出台盼蓝染色测量细胞活性，检测方法和实施例2中4活细胞计数中的方法相同。
3. 实验结果
使用台盼蓝染液检测细胞活性，结果如图14所示。3D-100万组在保存48h和72h 时细胞活性为94.71%和95.41%，而2D-100万组为85.50%和72.03%。3D-500万组在保存48h和72h时3D时细胞活性分别为96.87%、96.88%，而2D-500万组为87.96%、77.25%。3D-1000万组在保存48h和72h时细胞活性分别为97.28%、96.21%，而2D-1000万组为81.67%、70.11%。表明以细胞量1-10×106个/ml浓度保存，细胞活性均无显著区别。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (9)

1.一种保存细胞制剂的方法，其特征在于：所述方法包括将微组织悬液进行离心，弃上清，获得微组织；采用氯化钠水溶液清洗所述微组织；采用氯化钠水溶液、1%人白蛋白或5%葡萄糖溶液重悬清洗后的微组织获得细胞制剂；所述细胞制剂在4℃-25℃保存；所述微组织悬液为采用微载体培养细胞获得的。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述微载体由明胶制备而成。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述微载体为多孔结构，孔隙率＞90%，粒径为50-500微米。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述微载体的孔直径为15-50微米。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述采用微载体培养细胞中所述细胞与所述微载体的比例为2.5×106-5×107个：100mg。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述细胞制剂中，细胞和所述氯化钠水溶液、1%人白蛋白或5%葡萄糖溶液的比例为1×106个-1×107个：1 ml。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述离心为1000-1500RPM，5min。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述氯化钠水溶液是溶质为0.9%的氯化钠，溶剂为水的溶液；所述1%人白蛋白溶液溶质为1%人白蛋白，溶剂为水的溶液；5%葡萄糖溶液溶质为5%葡萄糖，溶剂为水溶液；所述%为质量百分含量。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述细胞为间充质干细胞和/或胚胎干细胞。
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