CN110229782A - 一种基于三维微载体细胞培养的原位传代方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于三维微载体细胞培养的原位传代方法。本发明提供了基于三维微载体细胞培养的原位传代方法，包括如下步骤：将种子微载体接入新的微载体；所述种子微载体为培养有待传代细胞的微载体。本发明方法避免了传统二维细胞的消化传代，既可减少消化液对细胞的损伤，又可省去消化传代等繁琐的操作过程，因此在大规模培养扩增时会节省相当的人力物力，并且可获取高质量细胞。节省时间，细胞消化下来再接种到需要时间操作，而此传代方式会省去操作时间。选择原位传代，不需要用到消化液等试剂耗材，精简过程、降低成本。

Description

一种基于三维微载体细胞培养的原位传代方法
技术领域
本发明涉及细胞培养领域，具体涉及一种基于三维微载体细胞培养的原位传代方法。
背景技术
在细胞培养扩增过程中，细胞传代是一个关键步骤。随着培养时间的延长和细胞不断分裂，培养器皿表面逐渐长满细胞，细胞之间相互接触会发生接触性抑制，生长速度减慢甚至停止，因此需要将细胞收集再分成若干份，重新接种到若干个培养器皿内，以提供更多的培养表面，再进行培养。这一程序常称为传代或传代培养。对于贴壁细胞，无论采取二维培养或三维培养，传统意义的细胞传代需要将细胞从培养器皿的基底上(比如培养瓶、培养皿)收获下来(称为消化)之后再接种到新的培养器皿里进行传代。
常用的消化方法主要有酶消化法、离子螯合剂、物理法和冷冻法。其中最常用的是酶消化法。酶消化的方法受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量、细胞类型、密度等诸多因素的影响。消化过程中还需实时观察细胞的状态避免造成过度消化，否则对细胞损害很大。同样的，离子螯合剂、物理法(即直接吹打或用细胞刮子将干细胞刮下来)、冷冻法都对细胞有不同程度的损伤。
现有的三维细胞传代，大多使用胰酶等消化细胞的试剂进行细胞的消化传代，将细胞从三维材料中消化成游离的单悬细胞后，然后再重新种植到新的材料中，进行扩增培养。其中，关键问题在于，三维培养的细胞难于用胰酶进行，一方面消化不完全大量细胞呈现三维团簇生长，胰酶很难深入快速深入内部实现完全消化，另一方面为了消化完全，胰酶的消化时间过长，导致细胞大量损伤或死亡，影响了细胞制品的质量。而且，现有的三维细胞传代会打断细胞培养扩增过程中三维培养环境的连续性。且随着传代次数的增加，细胞所受的损伤逐渐累积，对细胞质量产生影响。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于三维微载体细胞培养的原位传代方法。
本发明所提供的方法以三维微载体为培养基底，可实现通过直接添加新的微载体就能完成细胞原位传代，避免需要将细胞收获下来再接种到新的培养基底上的复杂操作。该方法可实现细胞传代不再打断三维培养的过程，从而在制备三维培养的细胞制品或组织工程产品时，全程保持细胞处于三维状态。可以实现全封闭式的细胞培养和连续扩增。
本发明要求保护一种基于三维微载体细胞培养的原位传代方法。
本发明所要求保护的基于三维微载体细胞培养的原位传代方法，可包括如下步骤：将种子微载体接入新的微载体；所述种子微载体为培养有待传代细胞的微载体。所述新的微载体是指不含有细胞的微载体。
进一步地，所述方法中，所述种子微载体中的细胞密度为1万-100万细胞/mg微载体(如10-50万细胞/mg微载体，再如12-50万细胞/mg微载体)。所述种子微载体与所述新的微载体的比例为0.0002-200mg种子微载体/mg新的微载体(如2-15mg种子微载体/100mg新的微载体)。
更进一步地，所述种子微载体中的细胞密度为12万-50万细胞/mg微载体(尤其适用于下文所述静态原位传代)或者15万-50万细胞/mg微载体(尤其适用于下文所述动态原位传代)。所述种子微载体与所述新的微载体的比例为1-3mg种子微载体/20mg新的微载体(尤其适用于下文所述静态原位传代)或2-6.7mg种子微载体/100mg新的微载体(尤其适用于下文所述动态原位传代)。
所述方法可为基于三维细胞微载体培养的静态原位传代方法或者动态原位传代方法。
其中，所述基于三维细胞微载体培养的动态原位传代方法，具体可包括如下步骤：
(A1)制备新的微载体悬液：将新的微载体置于内置叶轮细胞培养瓶中，按照1～2000μL：1mg微载体的比例加入细胞培养基，静置或搅拌0h以上，得到所述新的微载体悬液；
(A2)制备种子微载体悬液：所述种子微载体中的细胞密度为1万-100万细胞/mg微载体(如10-50万细胞/mg微载体)，用细胞培养基将所述种子微载体重悬至0.1-50mg/mL，得所述种子微载体悬液；
(A3)接种：将(A2)中制备的所述种子微载体悬液混入(A1)装有所述新的微载体悬液的所述内置叶轮细胞培养瓶中，所述种子微载体与所述新的微载体的比例为0.0002-200mg种子微载体/mg新的微载体，加入细胞培养基调整微载体与培养基的比例至1mg：1～1000μL，将所述内置叶轮细胞培养瓶置于搅拌器(如低速搅拌器)上并放入培养箱中进行搅拌，搅拌时长为0至100小时；
(A4)培养：继续搅拌至达到扩增效果，完成所述动态原位传代。
其中，所述基于三维细胞微载体培养的静态原位传代方法，具体可包括如下步骤：
(B1)制备种子微载体悬液：所述种子微载体中的细胞密度为1万-100万细胞/mg微载体(如10-50万细胞/mg微载体)，用细胞培养基将所述种子微载体重悬至0.1-50mg/mL，得所述种子微载体悬液；
(B2)接种：将(B1)中制备的所述种子微载体悬液滴加到新的微载体中，所述种子微载体与所述新的微载体的比例为0.0002-200mg种子微载体/mg新的微载体，混匀后放入培养箱孵育0.5-24h；
(B3)培养：按常规细胞培养方法加入细胞培养基继续培养，即完成所述静态原位传代。
进一步地，步骤(A1)中，置于所述内置叶轮细胞培养瓶中的所述新的微载体和所述细胞培养基的配比可为100mg微载体/10mL细胞培养基；将所述新的微载体和所述细胞培养基置于所述内置叶轮细胞培养瓶中后可静置0.1-24h(在本发明的具体实施方式中，所述静置时间具体为14h)。
进一步地，步骤(A2)中，所述种子微载体中的细胞密度可为15万-50万细胞/mg微载体；所述种子微载体悬液中所述种子微载体的含量可为1-10mg/mL(在本发明的具体实施方式中，所述种子微载体悬液中所述种子微载体的含量具体为1mg/mL)。
在本发明的一个实施例中，所述种子微载体中的细胞密度具体为50万细胞/mg微载体；所述种子微载体悬液中所述种子微载体的含量具体为1mg/mL。
在本发明的另一个实施例中，所述种子微载体中的细胞密度具体为15万细胞/mg微载体；所述种子微载体悬液中所述种子微载体的含量具体为1mg/mL。
进一步地，步骤(A3)中，所述种子微载体与所述新的微载体的比例可为1-10mg种子微载体/100mg新的微载体(如2-6.7mg种子微载体/100mg新的微载体)；加入所述细胞培养基调整微载体与培养基的比例可至1-10mg：1mL(如106.7-204mg：60mL)；所述搅拌速度可为1rpm-200rpm，搅拌可通过恒速搅拌或变速交替式或变数循环式搅拌，搅拌方向可为顺时搅拌，逆时搅拌或交替方向的搅拌，使种子微载体上的细胞转移至新微载体上。
在本发明的一个实施例中，所述种子微载体与所述新的微载体的比例具体为2mg种子微载体/100mg新的微载体；加入所述细胞培养基调整微载体与培养基的比例具体至204mg：60mL；所述搅拌具体为变速循环顺时搅拌，参数具体为60rmp 5min，20rpm 20min共循环24小时。
在本发明的另一个实施例中，所述种子微载体与所述新的微载体的比例具体为6.7mg种子微载体/100mg新的微载体；加入所述细胞培养基调整微载体与培养基的比例具体至106.7mg：60mL；所述搅拌具体为变速循环顺时搅拌，参数具体为60rmp 5min，20rpm20min共循环24小时。
进一步地，步骤(B)中，所述种子微载体中的细胞密度可为12万-50万细胞/mg微载体；所述种子微载体悬液中所述种子微载体的含量可为5-15mg/mL。
在本发明的一个实施例中，所述种子微载体中的细胞密度具体为50万细胞/mg微载体；所述种子微载体悬液中所述种子微载体的含量具体为5mg/mL。
在本发明的另一个实施例中，所述种子微载体中的细胞密度具体为12万细胞/mg微载体；所述种子微载体悬液中所述种子微载体的含量具体为15mg/mL。
进一步地，步骤(B2)中，所述种子微载体与所述新的微载体的比例可为1-3mg种子微载体/20mg新的微载体；所述孵育时间可为0-24h。
在本发明的一个实施例中，所述种子微载体与所述新的微载体的比例具体为1mg种子微载体/20mg新的微载体；所述孵育时间具体为2h。
在本发明的另一个实施例中，所述种子微载体与所述新的微载体的比例具体为3mg种子微载体/20mg新的微载体；所述孵育时间具体为2h。
其中，所述方法的全程培养时间可根据细胞、投放的种子和新载体比例、希望最终获得的细胞数等而定。
进一步地，所述细胞可为贴壁动物细胞。
更进一步地，所述贴壁动物细胞可为干细胞。如间充质干细胞。
在本发明的一个实施例中，所述细胞具体为脂肪间充质干细胞。
在本发明的另一个实施例中，所述细胞具体为脐带间充质干细胞。
在本发明的具体实施方式中，所述微载体为3D FloTrix微载体(北京华龛生物科技有限公司，货号：CNF-F01T-50)。
在本发明的具体实施方式中，所述内置叶轮细胞培养瓶为美国Bellco Glass产品，货号为1965-61001。
在本发明的具体实施方式中，所述搅拌器为低速搅拌器(3D FloTrix miniSpin低速搅拌器，北京华龛生物科技有限公司，货号：3D FTmS-2-2)。
本发明将培养有细胞的微载体(即种子微载体)接入新的微载体中实现“原位传。细胞可于此三维微载体上进行黏附、延伸、扩展、增殖、迁移等正常细胞活动，通过种子微载体上的细胞脱落再与新微载体接触后黏附于新微载体上再进行增殖生长，或者新微载体和种子微载体的接触，种子微载体上的细胞迁移实现种子微载体上的细胞转移至新微载体上继续增殖生长，巧妙的利用此优势实现了三维微载体上细胞的“原位传代”。
本发明方法的优势：
(1)避免了传统二维细胞的消化传代，既可减少消化液对细胞的损伤，又可省去消化传代等繁琐的操作过程，因此在大规模培养扩增时会节省相当的人力物力，并且可获取高质量细胞。
(2)节省时间，细胞消化下来再接种到需要时间操作，而此传代方式会省去操作时间。
(3)选择原位传代，不需要用到消化液等试剂耗材，精简过程、降低成本。
附图说明
图1为脂肪间充质干细胞通过静态原位传代方法在接种时，只有少部分微载体上有细胞(亮点)，而经过原位传代培养后的第4天，所有微载体上都有细胞。
图2为脐带间充质干细胞通过静态原位传代方法在接种后第2天，只有少部分微载体上很多细胞(亮点)，而经过原位传代培养后的第4天，所有微载体上都有细胞。
图3为脂肪间充质干细胞通过静态原位传代方法，细胞数量从接种时的50万增加至210万，而且和常规的消化后传代方法获得的细胞数量(240万)没有显著性差异(p＝0.32)
图4为脐带间充质干细胞通过静态原位传代方法培养后，细胞数量从接种时的30万增加至190万。
图5为内置叶轮细胞培养瓶的示意图。
图6为脂肪间充质干细胞通过动态原位传代方法在接种后的第2天，只有少部分微载体上有较多细胞(亮点)，而经过原位传代培养后的第5天，所有微载体上都有细胞。
图7为脐带间充质干细胞通过动态原位传代方法在接种时，只有少部分微载体上有较多细胞(亮点)，而经过原位传代培养后的第5天，所有微载体上都有细胞。
图8为脂肪间充质干细胞通过动态原位传代方法可以生长扩增，从初始只有200万细胞的种子微载体，经过5天培养后，扩增至5000万。
图9为脐带间充质干细胞通过动态原位传代方法可以生长扩增，从初始只有100万细胞的种子微载体，经过7天培养后，扩增至1520万。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用的微载体均为3D FloTrix微载体(北京华龛生物科技有限公司，货号：CNF-F01T-50)。
实施例1、基于三维细胞微载体培养的静态原位传代
供试细胞：脂肪间充质干细胞和脐带间充质干细胞。
一、静态原位传代方法
1、新的微载体准备
取无菌干燥微载体放入培养器皿中；本实施例使用20mg微载体于6孔板中。
2、种子微载体悬液准备
种子微载体为培养有供试细胞的微载体。种子微载体的培养方法依据专利申请号201910098003.6(一种三维微载体细胞吸附培养的方法)进行。以1万-100万细胞/mg微载体的细胞密度作为种子微载体，用细胞培养基将种子微载体重悬至0.1-50mg/mL(即0.5-2500万细胞/mL体积)。
其中，对于脂肪间充质干细胞：细胞密度为50万细胞/mg微载体，5mg/mL的重悬密度；对于脐带间充质干细胞：细胞密度为12万细胞/mg微载体，15mg/mL的重悬密度。
3、接种
将上述步骤2准备好的种子微载体悬液混匀后，吸取适量种子微载体悬液，滴加于步骤1准备好的装有20mg新微载体的6孔板中，使种子微载体悬液与新微载体充分混匀；种子微载体与新微载体的比例为0.0002-200mg种子微载体/mg新微载体。将混匀的微载体放入培养箱中孵育适当时间，时间可为0.5～24小时，具体可为2小时或24小时；使种子微载体上的细胞传代至新微载体上。
其中，对于脂肪间充质干细胞：为1mg种子微载体接种到20mg新微载体；对于脐带间充质干细胞：为3mg种子微载体悬液接种到20mg微载体；两组细胞均在培养箱中孵育2小时。
4、培养：待孵育后，按常规细胞培养方法加入细胞培养基继续培养，即完成静态原位传代。
二、对照实验
对照实验采用将细胞消化后再接种到微载体上进行传代，即将种子微载体上的细胞消化收集下来(按专利申请“一种收获三维微载体上的细胞的方法”201910101736.0进行操作)，重悬成只有细胞的悬液，以与步骤3中同等细胞浓度和接种体积与20mg微载体混合，同等孵育2小时后，加入细胞培养基继续培养。
三、结果
1、观察细胞
(1)试剂盒：Live&Dead Viability/Cytotoxicity Assay Kit for Animal Cell，货号：KGAF001。
(2)取50-100μL的含有细胞的微载体悬液加入到96孔板内；
(3)尽量去除上清，加入PBS洗一次，2min后尽量去除PBS，每孔加入按照试剂盒使用说明书配制好的染液100μL进行染色，室温避光染色20-30min后，在荧光显微镜下进行观察。
结果分析：
图1中显示，脂肪间充质干细胞通过静态原位传代方法在接种时，只有少部分微载体上有细胞(亮点)，此为种子微载体，其他没有细胞的为新微载体，而经过原位传代培养后的第4天，所有微载体上都有细胞，说明种子微载体上的细胞可以转移传代到新微载体上并增殖。
图2中显示，脐带间充质干细胞通过静态原位传代方法在接种后第2天，只有少部分微载体上很多细胞(亮点)，此为种子微载体，其他有较少细胞的为新微载体，而经过原位传代培养后的第4天，所有微载体上都有细胞，说明种子微载体上的细胞可以转移传代到新微载体上。
2、细胞计数以确定细胞是否完成传代扩增
按专利申请“一种收获三维微载体上的细胞的方法”(申请号201910101736.0)进行。
培养4天后，将20mg长了细胞的微载体从培养孔板中转移到离心管中，离心400×g，2分钟，吸尽上清，加入适量PBS，用手轻轻摇晃20-30s，尽量吸尽上清，重复PBS洗一次；加入3mL裂解液(裂解液配方：0.1％胶原蛋白酶、0.1％乙二胺四乙酸、0.05％胰蛋白酶；％表示g/100mL)，放入培养箱中孵育30min，期间每隔10min用1ml移液器轻轻吹打几次；30min后，微载体裂解完全用，加入3mL全培养基终止裂解过程；离心200×g，5分钟，弃去上清，将细胞重悬，通过细胞计数板进行计数。
结果分析：
图3中显示，脂肪间充质干细胞通过静态原位传代方法，细胞数量从接种时的50万增加至210万，而且和常规的消化后传代方法获得的细胞数量(240万)没有显著性差异(p＝0.32)。
图4中显示，脐带间充质干细胞通过静态原位传代方法培养后，细胞数量从接种时的30万增加至190万，说明细胞进行了增殖扩增。
实施例2、基于三维细胞微载体培养的动态原位传代
供试细胞：脂肪间充质干细胞和脐带间充质干细胞。
一、动态原位传代
1、新微载体悬液的准备：称取新的微载体粉末200mg倒入内置叶轮细胞培养瓶(美国Bellco Glass，货号为1965-61001，示意图如图5所示)中；按1～2000μL：1mg微载体的比例加入细胞培养基，静置或搅拌0小时以上(不含0小时，不限时间)。
其中，对于脂肪间充质干细胞：为200mg新微载体加入20ml细胞培养基静置14h。对于脐带间充质干细胞：为100mg新微载体加入10ml细胞培养基静置14h。
2、种子微载体悬液准备
种子微载体为培养有供试细胞的微载体。种子微载体的培养方法依据专利申请号201910098003.6(一种三维微载体细胞吸附培养的方法)进行。以1万-100万细胞/mg微载体(如10-50万细胞/mg微载体)的细胞密度作为种子微载体，将种子微载体重悬至0.1-50mg/mL(即种子微载体细胞浓度为0.5-2500万细胞/mL)。
其中，对于脂肪间充质干细胞：使用的种子微载体细胞密度为50万/mg，1mg/mL的重悬密度。对于脐带间充质干细胞：使用的种子微载体细胞密度为15万/mg，1mg/mL的重悬密度。
3、接种
将上述步骤2准备好的种子微载体悬液混入步骤1的内置叶轮细胞培养瓶中，与新微载体悬液搅拌混匀；种子微载体与新微载体的比例为0.0002-200mg种子微载体/mg新微载体；加入细胞培养基，调整微载体与培养基的比例至1mg：1～1000μL。
其中，对于脂肪间充质干细胞：使用4mg种子微载体(共200万细胞)接种于200mg新微载体中，细胞培养基补至60mL。对于脐带间充质干细胞：使用6.7mg种子微载体(共100万细胞)接种于100mg新微载体中，细胞培养基补至60mL。
将内置叶轮细胞培养瓶置于低速搅拌器上(3D FloTrix miniSpin低速搅拌器，北京华龛生物科技有限公司，货号：3D FTmS-2-2)并放入培养箱中进行搅拌，搅拌可通过恒速搅拌或变速交替式或变数循环式搅拌，搅拌方向可为顺时搅拌，逆时搅拌或交替方向的搅拌，使种子微载体上的细胞转移至新微载体上，搅拌时长为0.1至100小时。
其中，对于两种间充质干细胞均使用变速循环顺时搅拌方法，具体为60rmp 5min，20rpm 20min共循环24小时。
4、培养
接种后，可继续搅拌培养至达到扩增效果。
二、对照实验
对照实验以脂肪间充质干细胞为例，将细胞消化后再接种到微载体上进行传代，即将种子微载体上的细胞消化收集下来(按专利申请“一种收获三维微载体上的细胞的方法”201910101736.0进行操作)，重悬成只有细胞的悬液。将200万细胞重悬于4mL中，在内置叶轮细胞培养瓶中接种于200mg新微载体中，细胞培养基补至60mL。将内置叶轮细胞培养瓶置于低速搅拌器(3D FloTrix miniSpin低速搅拌器，北京华龛生物科技有限公司，货号：3DFTmS-2-2)上并放入培养箱中进行搅拌，具体为60rmp 5min，20rpm 20min共循环24小时后，继续搅拌培养至达到扩增效果。
三、结果
1、观察细胞：
(1)试剂盒：Live&Dead Viability/Cytotoxicity Assay Kit for Animal Cell，货号：KGAF001。
(2)取50-100μL的含有细胞的微载体悬液加入到96孔板内；
(3)尽量去除上清，加入PBS洗一次，2min后尽量去除PBS，每孔加入按照试剂盒使用说明书配置好的染液100μL进行染色，室温避光染色20-30min后，在荧光显微镜下进行观察。
结果分析：
图6中显示，脂肪间充质干细胞通过动态原位传代方法在接种后的第2天，从荧光图片中可以看到只有少部分微载体上有较多细胞(亮点)，此为种子微载体，但从明场上明显可以看到还有其他微载体，其他较少细胞的为新微载体，证明有一部分细胞通过原位传代转移至新微载体上，而经过原位传代培养后的第5天，所有微载体上都有细胞，说明传代至新微载体上的细胞增殖扩增了。
图7中显示，脐带间充质干细胞通过动态原位传代方法在接种时，从荧光图片中可以看到只有少部分微载体上有较多细胞(亮点)，此为种子微载体，但从明场上明显可以看到还有其他微载体，其他没有细胞的为新微载体，而经过原位传代培养后的第5天，所有微载体上都有细胞，说明种子微载体上的细胞可以转移传代到新微载体上并增殖扩增。
2、细胞计数以确定细胞是否完成传代扩增
按专利“一种收获三维微载体上的细胞的方法”(申请号201910101736.0)进行。
在接种后的不同天数，从瓶中取3mL微载体悬液转移到离心管中，离心400×g，2分钟，吸尽上清，加入适量PBS，用手轻轻摇晃20-30s，尽量吸尽上清，重复PBS洗一次；加入3mL裂解液(裂解液配方：0.1％胶原蛋白酶、0.1％乙二胺四乙酸、0.05％胰蛋白酶；％表示g/100mL)，放入37℃的细胞培养箱中孵育30min，期间每隔10min用1ml移液器轻轻吹打几次；30min后，微载体裂解完全用，加入3mL全培养基终止裂解过程；离心200×g，5分钟，弃去上清，根据后续应用需求，将细胞重悬，通过细胞计数板进行计数。
结果分析：
图8中显示，脂肪间充质干细胞通过动态原位传代方法可以生长扩增，从初始只有200万细胞的种子微载体，经过5天培养后，扩增至5977万。而且和常规的消化后传代方法获得的细胞数量(5140万)没有显著性差异(p＝0.14)。
图9中显示，脐带间充质干细胞通过动态原位传代方法可以生长扩增，从初始只有100万细胞的种子微载体，经过7天培养后，扩增至1520万。

Claims (10)

1.一种基于三维微载体细胞培养的原位传代方法，包括如下步骤：将种子微载体接入新的微载体；所述种子微载体为培养有待传代细胞的微载体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述种子微载体中的细胞密度为1万-100万细胞/mg微载体；
进一步地，所述种子微载体中的细胞密度为12万-50万细胞/mg微载体或者15万-50万细胞/mg微载体；
和/或
所述种子微载体与所述新的微载体的比例为0.0002-200mg种子微载体/mg新的微载体；
进一步地，所述种子微载体与所述新的微载体的比例为1-3mg种子微载体/20mg新的微载体或2-6.7mg种子微载体/100mg新的微载体。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法为基于三维细胞微载体培养的动态原位传代方法，包括如下步骤：
(A1)制备新的微载体悬液：将新的微载体置于内置叶轮细胞培养瓶中，按照1～2000μL：1mg微载体的比例加入细胞培养基，静置或搅拌0h以上，得到所述新的微载体悬液；
(A2)制备种子微载体悬液：所述种子微载体中的细胞密度为1万-100万细胞/mg微载体，用细胞培养基将所述种子微载体重悬至0.1-50mg/mL，得所述种子微载体悬液；
(A3)接种：将(A2)中制备的所述种子微载体悬液混入(A1)装有所述新的微载体悬液的所述内置叶轮细胞培养瓶中，所述种子微载体与所述新的微载体的比例为0.0002-200mg种子微载体/mg新的微载体，加入细胞培养基调整微载体与培养基的比例至1mg：1～1000μL，将所述内置叶轮细胞培养瓶置于搅拌器上并放入培养箱中进行搅拌，搅拌时长为0至100小时；
(A4)培养：继续搅拌，完成所述动态原位传代。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法为基于三维细胞微载体培养的静态原位传代方法，包括如下步骤：
(B1)制备种子微载体悬液：所述种子微载体中的细胞密度为1万-100万细胞/mg微载体，用细胞培养基将所述种子微载体重悬至0.1-50mg/mL，得所述种子微载体悬液；
(B2)接种：将(B1)中制备的所述种子微载体悬液滴加到新的微载体中，所述种子微载体与所述新的微载体的比例为0.0002-200mg种子微载体/mg新的微载体，混匀后放入培养箱孵育0.5-24h；
(B3)培养：加入细胞培养基继续培养，即完成所述静态原位传代。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤(A1)中，置于所述内置叶轮细胞培养瓶中的所述新的微载体和所述细胞培养基的配比为100mg微载体/10mL细胞培养基；和/或，将所述新的微载体和所述细胞培养基置于所述内置叶轮细胞培养瓶中后静置0.1-24h；
和/或
步骤(A2)中，所述种子微载体中的细胞密度为15万-50万细胞/mg微载体；和/或，所述种子微载体悬液中所述种子微载体的含量为1-10mg/mL；
和/或
步骤(A3)中，所述种子微载体与所述新的微载体的比例为1-10mg种子微载体/100mg新的微载体；和/或，加入所述细胞培养基调整微载体与培养基的比例至1-10mg：1mL；和/或，所述搅拌速度为1rpm-200rpm，所述搅拌为恒速搅拌或变速交替式或变数循环式搅拌，搅拌方向可为顺时搅拌，逆时搅拌或交替方向的搅拌；
进一步地，所述搅拌为变速循环顺时搅拌，参数为60rmp5min，20rpm20min共循环24小时。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(B1)中，所述种子微载体中的细胞密度为12万-50万细胞/mg微载体；和/或，所述种子微载体悬液中所述种子微载体的含量为5-15mg/mL；
和/或
步骤(B2)中，所述种子微载体与所述新的微载体的比例为1-3mg种子微载体/20mg新的微载体；和/或，所述孵育时间为0-24h。
7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：所述细胞为贴壁动物细胞。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述贴壁动物细胞为干细胞。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述干细胞为间充质干细胞。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述间充质干细胞为脂肪间充质干细胞或脐带间充质干细胞。
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