CN111411074A - 一种骨髓细胞培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种骨髓细胞培养基，其在基础培养基中添加了抗生素和固体血清替代物。利用本发明提供的培养基培养后的骨髓细胞可用于染色体制片，并表现出染色体呈现状态良好，更易观察等优势，在医学检测领域具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种骨髓细胞培养基，具体涉及一种用于染色体核型分析的骨髓细胞培养基。
背景技术
人们用各种不同的方法，以及用不同的染料处理染色体标本后，使每条染色体上出现明暗相间，或深浅不同带纹的技术成为显带技术(banding technique)。本世纪70年代以来，显带技术得到了很大发展，而G带由于主要是被Giemsa染料染色后显带，且所显示的带纹分布在整个染色体上，因此在目前众多的显带技术中(Q带、G带、C带、R带、T带)，G带是被广泛应用的一种带型。
染色体核型分析是以分裂中期染色体为研究对象，根据染色体的长度、着丝点位置、长短臂比例、随体的有无等特征，并借助显带技术对染色体进行分析、比较、排序和编号，根据染色体结构和数目的变异情况来进行诊断。核型分析可以为细胞遗传分类、物种间亲缘的关系以及染色体数目和结构变异的研究提供重要依据。
染色体畸形病变与恶性血液病之间具有紧密相关性，骨髓细胞染色体核型分析应用于恶性血液病的临床诊断、治疗以及预后具有非常重要的意义。然而骨髓染色体的制备过程复杂，影响因素众多，常常出现可分析分裂象少，染色体粗短，分散不良等现象，大大降低了染色体核型分析的成功率，且成本较高。
因此，建立一种具有细胞生长状态好、染色体呈现的状态好、更容易观察等特征的骨髓细胞培养基尤为重要。
发明内容
为克服现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种骨髓细胞培养基，使培养出的骨髓细胞用于染色体G带制片时背景更加清晰、分裂相更多、形态及分散度更加良好，从而便于观察。
本发明是通过如下技术方案得以实现上述目的。
第一方面，本发明提供了一种骨髓细胞培养基，所述培养基中含有RPMI-1640基础培养基、血清、抗生素。
优选地，所述骨髓细胞培养基中RPMI-1640基础培养基中还含有谷氨酰胺。
优选地，所述谷氨酰胺的浓度为1-4mmol/L，更优选地，谷氨酰胺的浓度为3mmol/L。
优选地，所述血清为固体血清替代物或胎牛血清，更优选为固体血清替代物。
优选地，所述固体血清替代物的浓度为0.5-2g/L，最优选地，所述固体血清替代物的浓度为1g/L。
优选地，所述抗生素为青霉素和/或链霉素。
优选地，所述抗生素的浓度为50-100ug/ml。
第二方面，本发明提供了一种骨髓细胞培养及染色体制片的方法，所述方法包括如下步骤：
1)向装有本发明第一方面所述骨髓细胞培养基的器皿中接种骨髓细胞穿刺液；
2)对步骤1接种有骨髓穿刺液的骨髓细胞培养基进行培养；
3)向步骤2所述培养器皿中加入秋水仙胺终止培养；
4)对步骤3终止培养的细胞进行离心处理，去除上清收集细胞；
5)对步骤4所收集细胞进行低渗处理；
6)对步骤5低渗处理后的细胞进行离心处理，去除上清收集细胞；
7)向步骤6收集细胞中加入固定液，进行固定处理；
8)重复步骤6和7；
9)将步骤8固定处理后的细胞悬液滴至载玻片并晾干；
10)对步骤9晾干后的细胞进行染色处理并做染色体核型分析。
优选地，步骤1)中所述骨髓细胞培养基中含有RPMI-1640基础培养基、血清、抗生素。
优选地，步骤1)中所述骨髓细胞培养中RPMI-1640基础培养基中还含有谷氨酰胺。
优选地，所述谷氨酰胺的浓度为1-4mmol/L，更优选地，谷氨酰胺的浓度为3mmol/L。
优选地，所述血清为固体血清替代物或胎牛血清，更优选为固体血清替代物。
优选地，所述固体血清替代物的浓度为0.5-2g/L，最优选地，所述固体血清替代物的浓度为1g/L。
优选地，所述抗生素为青霉素和/或链霉素。
优选地，所述抗生素的浓度为50-100ug/ml。
优选地，在二氧化碳培养箱中对步骤2的骨髓细胞进行培养。
优选地，步骤2)的培养时间为24-100小时，进一步优选地，培养时间为40-90小时，更优选地，培养时间为50-80小时，最优选地，培养时间为72小时。
优选地，步骤3)中加入秋水仙胺的终浓度为0.05-0.2ug/ml，最优选地，加入秋水仙胺的终浓度为0.1ug/ml。
优选地，步骤3)中加入秋水仙胺终止培养的时间为5-60分钟，进一步优选地，加入秋水仙胺终止培养的时间为10-40分钟，更优选地，加入秋水仙胺终止培养的时间为15-30分钟。
优选地，步骤5)中进行低渗处理的溶液为KCL溶液，进一步优选地，KCL溶液的浓度为0.05-0.1M，最优选地，KCL溶液的浓度为0.075M。
优选地，步骤6)中固定处理的固定液为醋酸与甲醇混合液，优选地，固定液醋酸与甲醇的体积比为3：1。
优选地，步骤10)中染色处理的染色液为Giemsa染料。
第三方面，本发明提供了第一方面所述骨髓细胞培养基在骨髓染色体制片中的应用。
本发明通过在实验室长期研究的基础上，提供了一种新型的骨髓细胞培养基，经该培养基培养出的骨髓细胞在进行染色体核型分析时具有背景更加清晰、分裂相更多、形态及分散度更加良好等优点，从而便于观察。
附图说明
图1是用本发明的培养基培养骨髓细胞制备出来的染色体样本，1000倍显微镜视角结果；
图2是用本发明的培养基培养骨髓细胞制备出来的染色体样本，1000倍显微镜视角，局部图片放大结果；
图3是用本发明的培养基培养骨髓细胞制备出来的染色体样本，1000倍显微镜视角，将原始照片中的染色体重新排列的结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明的内容。本领域的普通技术人员应当理解，在不脱离本发明技术方案的实质和范围的情况下，对本发明的技术方案进行修改或等同替换，均属于本发明的保护范围。
实施例1骨髓细胞培养基的制备
在基础培养基中添加血清、抗生素。其中基础培养基为RPMI-1640基础培养基，所述各成分的浓度如下：
青霉素 100ug/ml
链霉素 50ug/ml
固体血清替代物 1g/L
同时，基础培养基中还含有谷氨酰胺，谷氨酰胺在其中的浓度为3mmol/L。
实施例2骨髓细胞培养
按照如下方法进行骨髓细胞培养，培养后的细胞用于染色体制片。所述方法包括的步骤为：
(1)制备骨髓细胞培养基：按照实施例1所述组分及其用量配置；
(2)种骨髓：向装有10ml步骤(1)培养基的玻璃或者塑料瓶中接种0.5ml的骨髓细胞穿刺液，轻轻转动培养管使其混合；
(3)培养：对接种有骨髓细胞的培养基置于37摄氏度二氧化碳培养箱中进行培养，培养时间为72小时；
(4)终止培养：向培养基中加入终浓度为0.1ug/ml的秋水仙胺，进行静置15-30分钟，以终止培养。
实施例3骨髓细胞染色体制片
按照如下方法进行骨髓细胞染色体制片，制片后的细胞用于染色体核型分析。所述方法包括的步骤为：
(1)收集细胞：将实施例2终止培养的细胞转移至离心管中，在500g离心力作用下，离心5分钟后去除上清，收集细胞；
(2)低渗处理：向步骤(1)所收集的细胞中加入5-10ml 0.075M的KCL溶液进行细胞悬浮，并于37摄氏度下孵化培养10-12分钟；
(3)离心：对步骤(2)低渗处理后的细胞悬浮液进行离心处理，在500g离心力作用下，离心5分钟后弃去上清；
(4)固定：向离心管中加入新鲜配制的、预冷的醋酸：甲醇＝1:3的固定液5-10ml，并在4摄氏度条件下，固定10分钟；
(5)重复步骤(3)与(4)；
(6)滴片：用吸管吸取0.5-1ml固定液，滴至干燥洁净的载玻片上，在空气中晾干；
(7)对步骤(6)所晾干的骨髓细胞进行Giemsa染色处理。
染色后的骨髓细胞处理结果如图1-3所示，我们发现，采用本发明中的骨髓培养基，骨髓细胞染色后具有染色体清晰可见，背景清晰、分裂相多、形态及分散度良好等效果。
Claims (10)
1.一种骨髓细胞培养基，其特征在于，所述培养基由RPMI-1640基础培养基、血清、抗生素组成。
2.如权利要求1所述的骨髓细胞培养基，其特征在于，所述骨髓细胞培养基还含有谷氨酰胺。
3.如权利要求1或2所述的骨髓细胞培养基，其特征在于，所述血清为胎牛血清或固体血清替代物，优选为固体血清替代物。
4.如权利要求2或3所述的骨髓细胞培养基，其特征在于，所述谷氨酰胺的浓度为1-4mmol/L，优选为3mmol/L。
5.如权利要求3或4所述的骨髓细胞培养基，其特征在于，所述固体血清替代物的浓度为0.5-2g/L，优选地，固体血清替代物的浓度为1g/L。
6.如权利要求1-5任一所述的骨髓细胞培养基，其特征在于，所述抗生素为青霉素和/或链霉素，所述青霉素和/或链霉素的浓度为50-100ug/ml。
7.一种染色体制片的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)提供一种骨髓细胞培养基，并向其中接种骨髓细胞穿刺液；
2)培养步骤1)所述的接种有骨髓细胞穿刺液的骨髓细胞培养基；
3)向步骤2)的骨髓细胞培养基中加入秋水仙胺终止培养；
4)对步骤3)终止培养的骨髓细胞进行离心处理，去除上清收集细胞；
5)对步骤4)所收集细胞进行低渗处理；
6)对步骤5)低渗处理后的骨髓细胞进行离心处理，去除上清收集细胞
7)向步骤6收集细胞中加入固定液，进行固定处理，得到细胞悬液；
8)重复步骤6)和7)；
9)对步骤8)固定处理后的细胞悬液滴至载玻片晾干；
10)对步骤9)晾干后的细胞染色处理并做染色体核型分析。
8.如权利要求7所述的染色体制片方法，其特征在于，所述骨髓细胞培养基含有RPMI-1640基础培养基、血清、抗生素；优选地，所述骨髓细胞培养基含有RPMI-1640基础培养基、血清、抗生素、谷氨酰胺；
所述血清为胎牛血清或固体血清替代物，优选为固体血清替代物，所述固体血清替代物的浓度为0.5-2g/L，优选地，固体血清替代物的浓度为1g/L；
所述谷氨酰胺的浓度为1-4mmol/L，优选为3mmol/L；
所述抗生素为青霉素和/或链霉素，所述青霉素和/或链霉素的浓度为50-100ug/ml。
9.如权利要求7或8所述的染色体制片方法，其特征在于，步骤2)为在二氧化碳培养箱中进行培养，培养时间为24-100小时，进一步优选地，培养时间为40-90小时，更优选地，培养时间为50-80小时，最优选地，培养时间为72小时；
步骤3)中加入秋水仙胺的终浓度为0.05-0.2ug/ml，最优选地，加入秋水仙胺的终浓度为0.1ug/ml；加入秋水仙胺终止培养的时间为5-60分钟，进一步优选地，加入秋水仙胺终止培养的时间为10-40分钟，最优选地，加入秋水仙胺终止培养的时间为15-30分钟；
步骤5)中进行低渗处理的溶液为KCL溶液，KCL溶液的浓度为0.05-0.1M，最优选地，KCL溶液的浓度为0.075M；
步骤6)中固定处理的固定液为醋酸与甲醇混合液，优选地，固定液醋酸与甲醇的体积比为3：1；
步骤10)中染色处理的染色液为Giemsa染料。
10.权利要求1-6任一所述骨髓细胞培养基在骨髓染色体制片中的应用。
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2019
- 2019-01-05 CN CN201910009761.6A patent/CN111411074A/zh active Pending
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