CN111944739B - 一种类器官培养基质材料及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种类器官培养基质材料及其制备方法和应用,该类器官培养基质材料的制备方法包括以下步骤:将一型胶原、四型胶原、层粘黏蛋白、透明质酸、肝素用醋酸溶液溶解,得到胶原溶液;将磷酸二氢钠、生长因子、A83‑01、Y27632加入至高糖DMEM/减血清DMEM混合营养液中,混合均匀后再与所述胶原溶液混合均匀,用NaOH调节pH至7.2~8.3,既得。本发明的类器官培养基质材料在部分种类类器官的培养中,细胞增殖速率高于Matrigel作为基质材料培养时的细胞增殖速率,并且在类器官的培养和传代过程中,可以更好的保持类器官的干性,价格还远低于通用的类器官培养材料Matrigel的价格。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,具体涉及一种类器官培养基质材料及其制备方法和应用。
背景技术
在过去十年,干细胞研究领域取得的关键进展之一就是类器官体系的发展。类器官属于三维(3D)细胞培养物,包含其代表器官的一些关键特性。此类体外培养系统包括一个自我更新干细胞群,可分化为多个器官特异性的细胞类型,与对应的器官拥有类似的空间组织并能够重现对应器官的部分功能,从而提供一个高度生理相关系统。含有成体干细胞的组织样本、单一成体干细胞或者通过多能干细胞的定向诱导分化都能够产生类器官。由于部分类器官模型系统特征是具有活性干细胞群的存在,类器官能够极大地实现扩增。例如,在5到6周的时间内,一个单一祖细胞能够产生高达1×106个肝脏类器官,为研究人员提供了研究各种器官的高度可靠和可扩展的平台。
与常规细跑培养在二维环境中培养单一细胞类群不同,类器官培养是在三维环境中培养出特定组织器官包含的多种细胞类群,其培养体系与体内微环境更为相似。迄今为止,三个主要细胞谱系都已经发展出对组织结构进行建模的类器官培养系统。虽然不同的组织需要对应的特定培养方法,但是一般来说,将适当的多能干细胞或者特定组织的祖细胞嵌入或者其他适当的细胞外基质中,培养基则使用含有特定生长因子的细胞培养基模拟维持干细胞群所需的体内信号。在此生长条件下,嵌入的细胞增殖并自我组织成3D类器官结构,并在许多系统中可进行无限期传代和维持培养。但是,Matrigel是一种非常复杂的体系,体现在其成分复杂、批间差异大,并且价格昂贵,世界上许多科研机构和学者都纷纷致力于其替代产品的研究,以期研究出一种质量可控,性能优良,价格优惠的类器官培养基质。
发明内容
有鉴于此,本发明旨在提供一种类器官培养基质材料及其制备方法和应用以解决上述问题。本发明的技术方案为:
第一个方面,本发明提供一种类器官培养基质材料的制备方法,包括以下步骤:
(1)将一型胶原、四型胶原、层粘黏蛋白、透明质酸、肝素用醋酸溶液溶解,得到胶原溶液;
(2)将磷酸二氢钠、生长因子、A83-01、Y27632加入至高糖DMEM/减血清DMEM混合营养液中,混合均匀后再与所述胶原溶液混合均匀,用NaOH溶液调节pH至7.2~8.3,既得。
进一步地,所述生长因子包括EGF和FGF。
进一步地,所述醋酸溶液体积浓度为1~4%。
进一步地,所述高糖DMEM/减血清DMEM混合营养液中高糖DMEM和减血清DMEM的体积比为(3~5):1。
进一步地,所述NaOH溶液浓度为0.1~0.4M。
第二个方面,本发明提供一种利用上述制备方法获得的类器官培养基质材料。
进一步地,所述类器官培养基质材料中各组分的终浓度为:一型胶原12-18mg/ml,层粘黏蛋白1.5-3.2mg/ml,四型胶原0.1-1mg/ml,磷酸二氢钠0.1-1%,透明质酸1-5mg/ml,肝素0.5-0.9mg/ml,A83-01 0.9-1.9ng/ml,Y27632 8-15uM/ml,EGF 10-100ng/ml,FGF 10-100ng/ml。
第三个方面,本发明提供上述类器官培养基质材料及其制备方法在类器官培养中的应用。
优选地,所述类器官包括小鼠肝脏类器官、小鼠肺类器官、小鼠胰腺类器官、人肠癌类器官。
第四个方面,本发明提供一种类器官的培养方法,是采用上述类器官培养基质材料,包括:取待培养组织,进行处理后,采用所述类器官培养基质材料种胶滴,并在特定条件下培养。
本发明的有益效果是:
1、本发明的类器官培养基质材料制备过程简单,并且价格远低于通用的类器官培养材料Matrigel的价格。
2、本发明的类器官培养基质材料在部分种类类器官的培养中,细胞增殖速率高于Matrigel作为基质材料培养时的细胞增殖速率。
3、相对于Matrigel,本发明的类器官培养基质材料在类器官的培养和传代过程中,可以更好的保持类器官的干性。
附图说明
图1为本发明实施例4中采用本发明培养基质材料与采用Matrigel培养人源肠癌类器官5d的结果对比,其中图1-1为采用本发明培养基质材料,图1-2为采用Matrigel。
图2为本发明实施例5中采用本发明培养基质材料与采用Matrigel培养小鼠肺泡类器官9d的结果对比,其中图2-1为采用本发明培养基质材料,图2-2为采用Matrigel。
图3为本发明实施例6中采用本发明培养基质材料与采用Matrigel培养小鼠肝脏类器官9d的结果对比,其中图3-1为采用本发明培养基质材料,图3-2为采用Matrigel。
图4为本发明实施例6中采用本发明培养基质材料与采用Matrigel培养出的小鼠肝脏类器官在原代的HE染色对比,其中图4-1为采用本发明培养基质材料,图4-2为采用Matrigel。
图5为本发明实施例6中采用本发明培养基质材料与采用Matrigel培养出的小鼠肝脏类器官在传代3代内Lgr5标志物检测结果对比。
图6为本发明对比例1的培养结果。
图7为本发明对比例2的培养结果。
图8为本发明对比例3的培养结果,其中图8-1为采用本发明培养基质材料,图8-2为采用Matrigel。
图9为本发明对比例4的培养结果。
具体实施方式
在本发明的描述中,需要说明的是,实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步详细说明,所述是对本发明的解释而不是限定。
实施例1
本实施例提供一种类器官培养基质材料的制备方法,包括以下步骤:
(1)将一型胶原、四型胶原、层粘黏蛋白、透明质酸、肝素用1%醋酸溶液溶解,得到胶原溶液,置于冰盒上保存;
(2)将磷酸二氢钠、EGF、FGF、A83-01、Y27632加入至高糖DMEM/减血清DMEM混合营养液中,混合均匀后混合均匀后加入待培养细胞,再与所述胶原溶液混合均匀,用0.1MNaOH调节pH至7.5既得,其中,高糖DMEM/减血清DMEM混合营养液中高糖DMEM和减血清DMEM的体积比为5:1,各组分在细胞培养基中的终浓度为:一型胶原12mg/ml,层粘黏蛋白3.2mg/ml,四型胶原0.1mg/ml,磷酸二氢钠1%,透明质酸1mg/ml,肝素0.9mg/ml,A83-01 0.9ng/ml,Y27632 15uM/ml,EGF 10ng/ml,FGF 100ng/ml。
实施例2
本实施例提供一种类器官培养基质材料的制备方法,包括以下步骤:
(1)将一型胶原、四型胶原、层粘黏蛋白、透明质酸、肝素用1%醋酸溶液溶解,得到胶原溶液,置于冰盒上保存;
(2)将磷酸二氢钠、EGF、FGF、A83-01、Y27632加入至高糖DMEM/减血清DMEM混合营养液中,混合均匀后再与所述胶原溶液混合均匀,用0.1M NaOH调节pH至7.5既得,其中,高糖DMEM/减血清DMEM混合营养液中高糖DMEM和减血清DMEM的体积比为5:1,各组分在细胞培养基中的终浓度为:一型胶原18mg/ml,层粘黏蛋白1.5mg/ml,四型胶原1mg/ml,磷酸二氢钠0.1%,透明质酸5mg/ml,肝素0.5mg/ml,A83-01 1.9ng/ml,Y27632 8uM/ml,EGF 100ng/ml,FGF 10ng/ml。
实施例3
本实施例提供一种类器官培养基质材料的制备方法,包括以下步骤:
(1)将一型胶原、四型胶原、层粘黏蛋白、透明质酸、肝素用1%醋酸溶液溶解,得到胶原溶液,置于冰盒上保存;
(2)将磷酸二氢钠、EGF、FGF、A83-01、Y27632加入至高糖DMEM/减血清DMEM混合营养液中,混合均匀后再与所述胶原溶液混合均匀,用0.1M NaOH调节pH至7.5既得,其中,高糖DMEM/减血清DMEM混合营养液中高糖DMEM和减血清DMEM的体积比为5:1,各组分在细胞培养基中的终浓度为:一型胶原15mg/ml,层粘黏蛋白2mg/ml,四型胶原0.5mg/ml,磷酸二氢钠0.5%,透明质酸3mg/ml,肝素0.6mg/ml,A83-01 1.2ng/ml,Y27632 10uM/ml,EGF 50ng/ml,FGF 50ng/ml。
实施例4
本实施例提供一种人肠癌类器官的培养方法,采用实施例1的培养基质材料,并与常规Matrigel培养方法进行比较,具体如下:
(1)取新鲜人肠癌组织,消化后将所得细胞悬液吹打均匀,并平均分为两份,离心后弃去上清液,分别用实施例1的培养基质材料与Matrigel分别种胶滴,在37℃二氧化碳培养箱中培养。
(2)培养5d后的结果见图1,从图1对比的结果可以看出,采用实施例1的培养基质材料可以获得良好的类器官形态和结构,并且生长速度较快,说明实施例1的培养基质材料可以替代Matrigel用于人肠癌类器官的培养。
实施例5
本实施例提供一种小鼠肺泡类器官的培养方法,采用实施例2的培养基质材料,并与常规Matrigel培养方法进行比较,具体如下:
(1)取新鲜小鼠肺泡组织,消化后将所得细胞悬液吹打均匀,并平均分为两份,离心后弃去上清液,分别用实施例2的培养基质材料与Matrigel分别种胶滴,在37℃二氧化碳培养箱中培养。
(2)培养9d后的结果见图2,从图2对比的结果可以看出,采用实施例2的培养基质材料可以获得良好的类器官形态和结构,并且生长速度较快,说明实施例2的培养基质材料可以替代Matrigel用于小鼠肺泡类器官的培养。
实施例6
本实施例提供一种小鼠肝脏类器官的培养方法,采用实施例3的培养基质材料,并与常规Matrigel培养方法进行比较,具体如下:
(1)取新鲜小鼠肝脏组织,消化后将所得细胞悬液吹打均匀,并平均分为两份,离心后弃去上清液,分别用实施例3的培养基质材料与Matrigel分别种胶滴,在37℃二氧化碳培养箱中培养。
(2)培养9d后的结果见图3,从图3对比的结果可以看出,采用实施例3的培养基质材料可以获得良好的类器官形态和结构,并且生长速度较快,说明实施例3的培养基质材料可以替代Matrigel用于小鼠肝脏类器官的培养。
此外,将获得的两种小鼠肝脏原代类器官HE染色和传代三代内Lgr5标志物qPCR检测结果对比。结果如图4和图5所示。从图4可以看出,实施例6和Matrigel培养的小鼠肝脏类器官在组织结构上基本一致,类器官都是呈现空泡状,壁膜上细胞呈现狭长状态,少数细胞团聚的呈现圆润状态。从图5可以看出,实施例6的培养基质材料培养和传代的小鼠肝脏类器官Lgr5的稳定性较Matrigel更高。
对比例1
本对比例提供一种人肠癌类器官的培养方法,采用的培养基质材料中不含一型胶原组分,其他同实施例1的培养基质材料。培养方法同实施例4,培养结果如图6所示,细胞较多贴壁,培养获得类器官结构和形态均比较差。此外,在培养过程中,观察到本对比例的培养基质材料在培养箱中发生胶滴散开现象,细胞较多贴壁,因而导致了最终的类器官细胞状态差。
对比例2
本对比例提供一种小鼠肝脏类器官的培养方法,采用的培养基质材料中不含四型胶原组分,其他同实施例3的培养基质材料。培养方法同实施例6,培养结果如图7所示,细胞较多贴壁,培养获得类器官结构和形态较差。此外,在培养过程中,观察到本对比例的培养基质材料在培养箱中发生胶滴散开现象,细胞较多贴壁,因而导致了最终的类器官细胞状态差。
对比例3
本对比例提供一种小鼠肝脏类器官的培养方法,采用的培养基质材料中不含A83-01,其他同实施例3的培养基质材料。培养方法同实施例6,培养得到的类器官传代至P3,结果如图8所示(图8-1提供了实施例6的类器官传代至P3的结构形态图)。从图中可以看出,本对比例较多类器官状态较差,类器官形态皱缩不饱满,细胞不透亮,生长速率也远低于实施例6的结果。
对比例4
本对比例提供一种小鼠肝脏类器官的培养方法,采用的培养基质材料中不含EGF,其他同实施例3的培养基质材料。培养方法同实施例6,培养结果如图9所示。从图中可以看出,本对比例的类器官生长速度低于实施例6的培养结果。
综上,本发明的类器官培养基质材料在人源肠癌、小鼠肺泡、小鼠肝脏等类器官的培养中,细胞增殖速率高于Matrigel作为基质材料培养时的细胞增殖速率。并且,本发明的类器官培养基质材料在类器官的培养和传代过程中,可以更好的保持类器官的干性。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (3)
1.一种类器官培养基质材料的制备方法,其特征在于:包括以下步骤:
(1)将一型胶原、四型胶原、层粘黏蛋白、透明质酸、肝素用体积浓度为1-4%的醋酸溶液溶解,得到胶原溶液;
(2)将磷酸二氢钠、生长因子、A83-01、Y27632加入至高糖DMEM/减血清DMEM混合营养液中,所述高糖DMEM/减血清DMEM混合营养液中高糖DMEM和减血清DMEM的体积比为(3~5):1;所述生长因子为EGF和FGF,混合均匀后再与所述胶原溶液混合均匀,用浓度为0.1-0.4M的NaOH溶液调节pH至7.2~8.3,既得所述类器官培养基质材料,其中各组分的终浓度为:一型胶原12-18mg/ml,层粘黏蛋白1.5-3.2mg/ml,四型胶原0.1-1mg/ml,磷酸二氢钠0.1-1%,透明质酸1-5mg/ml,肝素0.5-0.9mg/ml,A83-01 0.9-1.9ng/ml,Y276328-1 5uM/ml,EGF 10-100ng/ml,FGF 10-100ng/ml;所述类器官为小鼠肝脏类器官、小鼠肺类器官、小鼠胰腺类器官、人肠癌类器官中之一。
2.权利要求1所述的制备方法获得的类器官培养基质材料在类器官培养中的应用,所述类器官为小鼠肝脏类器官、小鼠肺类器官、小鼠胰腺类器官、人肠癌类器官中之一。
3.一种类器官的培养方法,其特征在于:包括:是采用权利要求1所述的制备方法获得的类器官培养基质材料,该方法包括:取待培养组织,进行处理后,采用所述类器官培养基质材料种胶滴,并在特定条件下培养,所述类器官为小鼠肝脏类器官、小鼠肺类器官、小鼠胰腺类器官、人肠癌类器官中之一。
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