CN116590232A - 一种甲状腺癌类器官、培养基及培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种甲状腺癌类器官、培养基及培养方法。甲状腺癌类器官培养基包括基础培养和特异性添加因子，特异性添加因子包括如下终浓度的组分：B27，1‑5×；L‑谷氨酰胺，0.5‑5mM；EGF，10‑100ng/ml；FGF10，1‑50ng/ml；R‑spondin 1，50‑500ng/ml；Forskolin，1‑50μM；促甲状腺激素，10‑100ng/ml；SB 505124，1‑10μM；SB 203580，1‑10μM。本发明提供的甲状腺癌类器官培养基适合甲状腺癌类器官的培养，含有的forskolin可以显著促进甲状腺癌类器官的形成和生长；本发明的类器官培养基的各个组分产生协同作用，使培养得到的甲状腺癌类器官维持了原发组织的形态结构和基因特征。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种甲状腺癌类器官、培养基及培养方法。
背景技术
甲状腺癌是一种起源于甲状腺滤泡上皮或滤泡旁上皮细胞的恶性肿瘤，也是头颈部最为常见的恶性肿瘤。尽管大部分甲状腺癌经手术、术后放射性碘以及甲状腺激素抑制治疗可达到缓解，但部分患者在其自然病程或经过治疗后呈现放射性碘难治性状态。放射性碘难治性、转移性或晚期甲状腺癌患者生存率明显下降，是目前甲状腺癌临床诊治的难点和热点。
目前，肿瘤的个体化精准医疗缺乏合适的临床前评价模型，2D肿瘤细胞系和PDX模型由于存在很多缺陷，难以成为临床前抗肿瘤药物的疗效评价的最佳选择。类器官是衍生于干细胞或前体细胞的器官特异性细胞集合，类器官属于三维(3D)细胞培养物，包含其代表器官的一些关键特性。此类体外培养系统包括一个自我更新干细胞群，可分化为多个器官特异性的细胞类型，与对应的器官拥有类似的空间组织并能够重现对应器官的部分功能，从而提供一个高度生理相关系统。由于类器官能更好地模拟体内环境，因此十分适用于分子和细胞生物学分析，其处于动物和细胞水平之间，能够为肿瘤研究、药物筛选和再生医学等方面提供更好的解决方案。因此，类器官模型在各种器官生理病理的基础研究、精准医疗、药物筛选和开发、基因治疗、再生医学等领域具有巨大的应用前景。
虽然多种肿瘤组织使用不同的方法、不同的培养条件下可在体外成功培养成为类器官，但是目前关于甲状腺癌类器官的培养研究及报道较少。
发明内容
有鉴于此，有必要针对上述问题，提供一种甲状腺癌类器官、培养基及培养方法。
为实现上述目的，本发明采取以下的技术方案：
第一方面，本发明提供一种甲状腺癌类器官培养基，包括基础培养基和特异性添加因子，所述特异性添加因子包括如下终浓度的组分：
B27，0.5-5×；
L-谷氨酰胺，0.5-10mM；
EGF，5-100ng/ml；
FGF10，1-100ng/ml；
R-spondin 1，50-1000ng/ml；
Forskolin，1-100μM；
促甲状腺激素，10-100ng/ml；
SB 505124，1-10μM；
SB 203580，1-10μM。
进一步的，所述特异性添加因子还包括Y-33075，其在培养基中的终浓度为1-100nM。
进一步的，所述基础培养基为DMEM/F12。
进一步的，所述特异性添加因子包括如下终浓度的组分：
B27，1-2.5×；
L-谷氨酰胺，1-5mM；
EGF，20-60ng/ml；
FGF10，10-50ng/ml；
R-spondin 1，100-500ng/ml；
Forskolin，20-50μM；
促甲状腺激素，20-80ng/ml；
SB 505124，2-8μM；
SB 203580，2-8μM。
进一步的，所述甲状腺癌类器官培养基的制备方法为将特异性添加因子添加到基础培养基中，混合均匀。
第二方面，本发明提供一种甲状腺癌类器官的培养方法，包括以下步骤：
1)将新鲜的甲状腺癌手术切除标本或活体组织进行预处理获取细胞团，然后离心去除上清后备用；
2)将上述的甲状腺癌类器官培养基与基质胶混合得到混合液，用混合液重悬步骤1)获取的细胞团得到细胞悬液，将细胞悬液于培养皿中种胶滴；
3)将培养皿放入CO2培养箱内静置，轻晃胶滴无明显流动后倒扣，待其充分凝固；
4)向培养皿中加入上述的甲状腺癌类器官培养基，置于恒温培养箱在37℃，5％CO2浓度下培养；每2～3天更换一次培养基，培养3～10天。
进一步的，步骤1)所述预处理的方法包括洗涤、切碎、组织块消化、红细胞裂解以及过滤去除杂质。
进一步的，步骤1)所述细胞团的细胞数量为3～100个。
进一步的，步骤2)中甲状腺癌类器官培养基与基质胶的混合比例为1:0.8～3，重悬过程中混合液中细胞浓度为105-108个/ml。
进一步的，步骤2)中一个胶滴为10-100μl细胞悬液。
进一步的，步骤3)中静置时间为1-20min。
进一步的，步骤3)中倒扣时间为10-60min。
第三方面，本发明提供一种使用上述甲状腺癌类器官培养基或采用上述甲状腺癌类器官的培养方法培养得到的甲状腺癌类器官。
本发明的有益效果为：
本发明提供的甲状腺癌类器官培养基含有甲状腺癌类器官培养所需的最少组分，组分不需要细胞培养中最常见的组分牛血清白蛋白(FBS)，节约成本的同时降低了FBS中带来的细胞毒性和抑制物；本发明提供的甲状腺癌类器官培养基适合甲状腺癌类器官的培养，其含有的forskolin可以显著促进甲状腺癌类器官的形成和生长；本发明的类器官培养基的各个组分产生协同作用，使培养得到的甲状腺癌类器官维持了原发组织的形态结构和基因特征。
附图说明
图1为本发明实施例4培养得到的甲状腺癌类器官光学显微镜图；
图2为本发明实施例5培养得到的甲状腺癌类器官光学显微镜图；
图3为本发明实施例6培养得到的甲状腺癌类器官光学显微镜图；
图4为本发明对比例1培养得到的甲状腺癌类器官光学显微镜图；
图5为本发明对比例2培养得到的甲状腺癌类器官光学显微镜图；
图6为本发明对比例3培养得到的甲状腺癌类器官光学显微镜图；
图7为本发明对比例4培养得到的甲状腺癌类器官光学显微镜图；
图8为本发明对比例5培养得到的甲状腺癌类器官光学显微镜图。
图9为本发明对比例6培养得到的胰腺癌类器官光学显微镜图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案作进一步清楚、完整地描述。需要说明的是，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例采用的B27购自赛默飞世尔科技有限公司。
本发明实施例采用的L-谷氨酰胺购自上海源培公司。
本发明实施例采用的EGF购自Sigma-Aldrich公司。
本发明实施例采用的FGF10购自Sigma-Aldrich公司。
本发明实施例采用的R-spondin 1购自Sigma-Aldrich公司。
本发明实施例采用的Forskolin购自Sigma-Aldrich公司。
本发明实施例采用的促甲状腺激素购自Sigma-Aldrich公司。
本发明实施例采用的SB 505124购自美国MedChemExpress公司。
本发明实施例采用的SB 203580购自美国MedChemExpress公司。
在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
一种甲状腺癌类器官培养基，包括基础培养基和特异性添加因子，所述特异性添加因子包括如下终浓度的组分：
B27，1×；
L-谷氨酰胺，0.5mM；
EGF，10ng/ml；
FGF10，1ng/ml；
R-spondin 1，50ng/ml；
Forskolin，1μM；
促甲状腺激素，10ng/ml；
SB 505124，1μM；
SB 203580，1μM。
所述基础培养基为DMEM/F12。
所述甲状腺癌类器官培养基的制备方法为将特异性添加因子添加到基础培养基中，混合均匀。
实施例2
一种甲状腺癌类器官培养基，包括基础培养基和特异性添加因子，所述特异性添加因子包括如下终浓度的组分：
B27，5×；
L-谷氨酰胺，5mM；
EGF，100ng/ml；
FGF10，50ng/ml；
R-spondin 1，500ng/ml；
Forskolin，50μM；
促甲状腺激素，100ng/ml；
SB 505124，10μM；
SB 203580，10μM；
Y-33075，100nM。
所述基础培养基为DMEM/F12。
所述甲状腺癌类器官培养基的制备方法为将特异性添加因子添加到基础培养基中，混合均匀。
实施例3
一种甲状腺癌类器官培养基，包括基础培养基和特异性添加因子，所述特异性添加因子包括如下终浓度的组分：
B27，1.5×；
L-谷氨酰胺，2.5mM；
EGF，20ng/ml；
FGF10，20ng/ml；
R-spondin 1，400ng/ml；
Forskolin，40μM；
促甲状腺激素，50ng/ml；
SB 505124，5μM；
SB 203580，5μM。
所述基础培养基为DMEM/F12。
所述甲状腺癌类器官培养基的制备方法为将特异性添加因子添加到基础培养基中，混合均匀。
实施例4
一种甲状腺癌类器官的培养方法，包括以下步骤：
1)将新鲜的甲状腺癌手术切除标本进行预处理获取3～100个细胞的细胞团，离心去除上清备用；所述预处理的方法包括洗涤、切碎、组织块消化、红细胞裂解以及过滤去除杂质；
2)将实施例1的甲状腺癌类器官培养基与基质胶混合得到混合液，甲状腺癌类器官培养基与基质胶的混合比例为1:0.9；用混合液重悬步骤1)获取的细胞团得到细胞悬液，重悬过程中混合液中细胞浓度为2×107个/ml；将细胞悬液于培养皿中种胶滴，一个胶滴为30μl细胞悬液；
3)将培养皿放入CO2培养箱内静置15min，轻晃胶滴无明显流动后倒扣60min，待其充分凝固；
4)向培养皿中加入实施例1的甲状腺癌类器官培养基，置于恒温培养箱在37℃，5％ CO2浓度下培养；每2天更换一次培养基，培养4天后，培养得到的甲状腺癌类器官如图1所示。
实施例5
一种甲状腺癌类器官的培养方法，包括以下步骤：
1)将新鲜的甲状腺癌活体组织进行预处理获取3～100个细胞的细胞团，离心去除上清备用；所述预处理的方法包括洗涤、切碎、组织块消化、红细胞裂解以及过滤去除杂质；
2)将实施例2的甲状腺癌类器官培养基与基质胶混合得到混合液，甲状腺癌类器官培养基与基质胶的混合比例为1:2.5；用混合液重悬步骤1)获取的细胞团得到细胞悬液，重悬过程中混合液中细胞浓度为4×106个/ml；将细胞悬液于培养皿中种胶滴，一个胶滴为80μl细胞悬液；
3)将培养皿放入CO2培养箱内静置2min，轻晃胶滴无明显流动后倒扣30min，待其充分凝固；
4)向培养皿中加入实施例2的甲状腺癌类器官培养基，置于恒温培养箱在37℃，5％ CO2浓度下培养；每2天更换一次培养基，培养10天后，培养得到的甲状腺癌类器官如图2所示。
实施例6
一种甲状腺癌类器官的培养方法，包括以下步骤：
1)将新鲜的甲状腺癌活体组织进行预处理获取3～100个细胞的细胞团，离心去除上清备用；所述预处理的方法包括洗涤、切碎、组织块消化、红细胞裂解以及过滤去除杂质；
2)将实施例3的甲状腺癌类器官培养基与基质胶混合得到混合液，甲状腺癌类器官培养基与基质胶的混合比例为1:1.5；用混合液重悬步骤1)获取的细胞团得到细胞悬液，重悬过程中混合液中细胞浓度为5×107个/ml；将细胞悬液于培养皿中种胶滴，一个胶滴为50μl细胞悬液；
3)将培养皿放入CO2培养箱内静置5min，轻晃胶滴无明显流动后倒扣30min，待其充分凝固；
4)向培养皿中加入实施例3的甲状腺癌类器官培养基，置于恒温培养箱在37℃，5％ CO2浓度下培养；每2天更换一次培养基，培养6天后，培养得到的甲状腺癌类器官如图3所示。
对比例1
一种甲状腺癌类器官培养基，与实施例3的区别在于特异性添加因子中不含有Forskolin，其余均相同。采用实施例6的培养方法培养6天后，培养得到的甲状腺癌类器官如图4所示，甲状腺癌类器官生长缓慢，甲状腺癌类器官偏小，说明Forskolin对甲状腺癌类器官生长至关重要。
对比例2
一种甲状腺癌类器官培养基，与实施例3的区别在于特异性添加因子中不含有促甲状腺激素，其余均相同。采用实施例6的培养方法培养6天后，培养得到的甲状腺癌类器官如图5所示，甲状腺癌类器官生长缓慢，甲状腺癌类器官偏小，说明促甲状腺激素对甲状腺癌类器官生长至关重要。
对比例3
一种甲状腺癌类器官培养基，与实施例3的区别在于特异性添加因子中不含有L-谷氨酰胺，其余均相同。采用实施例6的培养方法培养，培养得到的甲状腺癌类器官如图6所示，甲状腺癌类器官生长缓慢，甲状腺癌类器官偏小，说明L-谷氨酰胺有利于甲状腺癌类器官生长。
对比例4
一种甲状腺癌类器官培养基，与实施例3的区别在于特异性添加因子中不含有SB505124，其余均相同。采用实施例6的培养方法培养，培养得到的甲状腺癌类器官如图7所示，甲状腺癌类器官逐渐凋亡，说明SB 505124对甲状腺癌类器官生长至关重要。
对比例5
一种甲状腺癌类器官培养基，与实施例3的区别在于特异性添加因子中不含有SB203580，其余均相同。采用实施例6的培养方法培养，培养得到的甲状腺癌类器官如图8所示，甲状腺癌类器官逐渐凋亡，说明SB 203580对甲状腺癌类器官生长至关重要。
对比例6
使用实施例3的甲状腺癌类器官培养基，采用实施例6的培养方法培养胰腺癌类器官，培养得到的胰腺癌类器官如图9所示，胰腺癌类器官逐渐凋亡，说明本发明培养基不能用于胰腺癌类器官生长，本发明培养基对甲状腺癌类器官的培养具有专属性。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种甲状腺癌类器官培养基，其特征在于，包括基础培养和特异性添加因子，所述特异性添加因子包括如下终浓度的组分：
B27，1-5×；
L-谷氨酰胺，0.5-5mM；
EGF，10-100ng/ml；
FGF10，1-50ng/ml；
R-spondin 1，50-500ng/ml；
Forskolin，1-50μM；
促甲状腺激素，10-100ng/ml；
SB 505124，1-10μM；
SB 203580，1-10μM。
2.根据权利要求1所述甲状腺癌类器官培养基，其特征在于，所述特异性添加因子还包括Y-33075，其在培养基中的终浓度为1-100nM。
3.根据权利要求1所述甲状腺癌类器官培养基，其特征在于，所述基础培养基为DMEM/F12。
4.根据权利要求1所述的甲状腺癌类器官培养基，其特征在于，所述特异性添加因子包括如下终浓度的组分：
B27，1.5×；
L-谷氨酰胺，2.5mM；
EGF，20ng/ml；
FGF10，20ng/ml；
R-spondin 1，400ng/ml；
Forskolin，40μM；
促甲状腺激素，50ng/ml；
SB 505124，5μM；
SB 203580，5μM。
5.根据权利要求1所述的甲状腺癌类器官培养基，其特征在于，所述甲状腺癌类器官培养基的制备方法为将特异性添加因子添加到基础培养基中，混合均匀。
6.一种甲状腺癌类器官的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将新鲜的手术切除标本或活体组织进行预处理获取细胞团，离心去除上清备用；
2)将权利要求1～5任意一项所述的甲状腺癌类器官培养基与基质胶混合得到混合液，用混合液重悬步骤1)获取的细胞团得到细胞悬液，将细胞悬液于培养皿中种胶滴；
3)将培养皿放入CO2培养箱内静置，轻晃胶滴无明显流动后倒扣，待其充分凝固；
4)向培养皿中加入将权利要求1～5任意一项所述的甲状腺癌类器官培养基，置于恒温培养箱在37℃，5％CO2浓度下培养；每2～3天更换一次培养基，培养3～10天。
7.根据权利要求6所述的甲状腺癌类器官的培养方法，其特征在于，步骤1)所述预处理的方法包括洗涤、切碎、组织块消化、红细胞裂解以及过滤去除杂质。
8.根据权利要求6所述的甲状腺癌类器官的培养方法，其特征在于，步骤1)所述细胞团的细胞数量为3～100个。
9.根据权利要求6所述的甲状腺癌类器官的培养方法，其特征在于，步骤2)中甲状腺癌类器官培养基与基质胶的混合比例为1:0.8～3；重悬过程中混合液中细胞浓度为105～108个/ml。
10.一种甲状腺癌类器官，其特征在于，采用权利要求1～5任意一项所述甲状腺癌类器官培养基或使用权利要求6～9任意一项所述甲状腺癌类器官的培养方法培养获得。
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| CN202310469106.5A CN116590232A (zh) | 2023-04-26 | 2023-04-26 | 一种甲状腺癌类器官、培养基及培养方法 |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116836916A (zh) * | 2023-08-31 | 2023-10-03 | 四川大学华西医院 | 用于预测分化型甲状腺癌摄碘能力的类器官、系统及方法 |
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- 2023-04-26 CN CN202310469106.5A patent/CN116590232A/zh active Pending
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| CN116836916B (zh) * | 2023-08-31 | 2023-11-21 | 四川大学华西医院 | 用于预测分化型甲状腺癌摄碘能力的类器官、系统及方法 |
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