CN115011560A - 一种脑胶质瘤类器官、培养基及培养方法 - Google Patents

一种脑胶质瘤类器官、培养基及培养方法 Download PDF

Info

Publication number
CN115011560A
CN115011560A CN202210724752.7A CN202210724752A CN115011560A CN 115011560 A CN115011560 A CN 115011560A CN 202210724752 A CN202210724752 A CN 202210724752A CN 115011560 A CN115011560 A CN 115011560A
Authority
CN
China
Prior art keywords
culture medium
organoid
culture
brain glioma
glioma
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202210724752.7A
Other languages
English (en)
Inventor
陈泽新
朱宇
邹欢
黄敏
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Accurate International Biotechnology Guangzhou Co ltd
Original Assignee
Accurate International Biotechnology Guangzhou Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Accurate International Biotechnology Guangzhou Co ltd filed Critical Accurate International Biotechnology Guangzhou Co ltd
Priority to CN202210724752.7A priority Critical patent/CN115011560A/zh
Publication of CN115011560A publication Critical patent/CN115011560A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/13—Nerve growth factor [NGF]; Brain-derived neurotrophic factor [BDNF]; Cilliary neurotrophic factor [CNTF]; Glial-derived neurotrophic factor [GDNF]; Neurotrophins [NT]; Neuregulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/72—Transferases (EC 2.)
    • C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
    • C12N2509/10—Mechanical dissociation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及一种脑胶质瘤类器官、培养基及培养方法，包括基础培养基和特异性添加因子，所述特异性添加因子包括以下终浓度的组分：不含维生素A的B27，0.1‑5×；N2，0.1‑5×；N‑acetylcysteine，0.2‑5mM；EGF:10‑500ng/ml；NGF:10‑1000ng/ml；GlutaMax，0.1‑5×；Y27632，5‑50μM；Nicotinamide，0.5‑50mM；青霉素链霉素混合液，0.1‑5×；前述的百分浓度表示质量浓度。本发明可对人脑胶质瘤组织进行体外培养，在培养过程中，形成从细胞构成及空间结构均近似于体内肿瘤的类器官。本发明培养基含有脑胶质瘤细胞培养所需的最少组分，用于培养脑胶质瘤组织，形成的类器官维持了原发组织的形态结构和基因特征。本发明与传统类器官培养方法相比，大大降低了生长因子和基质胶的用量，极大程度上节约了培养成本。

Description

一种脑胶质瘤类器官、培养基及培养方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种脑胶质瘤类器官、培养基及培养方法。
背景技术
目前，小鼠是医学研究中最重要的模型动物，小鼠的基因与人类相似度达95％，拥有人类相似的免疫系统及易于进行基因工程与细胞工程的改造，这些优点决定了小鼠模型在生物学医学科学研究中得天独厚的优势。然而，即便小鼠动物模型有诸多的优势，却依然存在建模流程繁杂、建模时间长、操作难度大、硬件要求高和建模成本高昂等特点。
类器官是由诱导的多能干细胞、胚胎干细胞或成体组织驻留的祖细胞体外培养形成的三维细胞团结构。类器官是二维培养和活体模型之间的重要桥梁，其较单层细胞培养模型更具生理学相关性，同时比活体模型更容易操纵利基成分、信号通路和基因组编辑。类器官的价值在于它们能够自组织成最小的生物单位，表现出与原始组织相似的功能和复杂性。类器官的可操作性预示着类器官将为广泛的基础研究提供出色的模型系统，包括表达谱研究和体内难以获得的稀有细胞谱系的分析。同时，可将类器官移植体内进行功能评估。此外，也可从患者自身组织或诱导的多能干细胞产生类器官可用于研究缺乏动物模型的罕见疾病。在再生医学中，类器官技术有望替代严重受损的器官，如1型糖尿病患者的胰腺。
脑胶质瘤是预后较差的肿瘤类型之一，患者的平均生存期不超过一年，且难以进行R0切除手术，且脑胶质瘤目前尚无有效药物对其进行控制。患者只能在复发后进行开颅手术减轻肿瘤负荷。此外，目前脑胶质瘤尚无明确的治疗相关靶点，因此通过基因检测难以进行精准靶向治疗方案的确定。综上所述，一种新的脑胶质瘤个体化用药的技术手段势在必行。类器官技术可以通过直接观察肿瘤细胞在体外对药物的反应，判断药物能否对肿瘤形成杀伤，被视为下一代的个体化精准医学检测技术。
发明内容
有鉴于此，有必要针对上述问题，提供一种脑胶质瘤类器官、培养基及培养方法。
为解决现有技术存在的问题，本发明的技术方案为：
一方面，本发明提供一种脑胶质瘤类器官培养基，包括基础培养基和特异性添加因子，所述特异性添加因子包括以下终浓度的组分：
不含维生素A的B27，0.1-5×；
N2，0.1-5×；
N-acetylcysteine，0.2-5mM；
EGF:10-500ng/ml；
NGF:10-1000ng/ml；
GlutaMax，0.1-5×；
Y27632，5-50μM；
Nicotinamide，0.5-50mM；
青霉素链霉素混合液，0.1-5×；
前述的百分浓度表示质量浓度。
进一步的，所述特异性添加因子还包括以下终浓度的组分：非必需氨基酸(NEAAs)1-5×。
优选的，所述特异性添加因子包括以下终浓度的组分：
不含维生素A的B27，1×；
N2，1×；
N-acetylcysteine，0.5mM；
非必需氨基酸(NEAAs)1×；
EGF:50ng/ml；
NGF:50ng/ml；
GlutaMax，1×；
Y27632，20μM；
Nicotinamide，5mM；
青霉素链霉素混合液，3×；
前述的百分浓度表示质量浓度。
进一步的，所述基础培养基由Neural basal与Advanced DMEM/F12混合组成。
优选的，所述Neural basal与Advanced DMEM/F12按照6-27:3(v/v)的比例混合。
进一步的，所述培养基的制备方法为：将特异性添加因子加入到基础培养基中混合均匀既得。
第二方面，本发明提供一种脑胶质瘤类器官的培养方法，包括以下步骤：
1)将新鲜的脑胶质瘤组织进行预处理，用含1％双抗的生理盐水进行数次洗涤、去除血块等杂质，并充分切碎；
2)将组织块进行消化，获取细胞团，离心去除上清备用；
3)取适量的权利要求1-6任一项所述的培养基，按每1-5×105细胞使用2ml培养基重悬细胞，得到细胞悬液；
4)用移液器将细胞悬液滴加到细胞培养装置中，在温度为37℃，CO2浓度为5％的环境下进行培养；
5)每隔2-3天更换一次液体培养基，培养3-5天可获得脑胶质瘤类器官。
进一步的，所述步骤2)中将组织块通过含胶原酶与分散酶的复合消化液进行消化。
进一步的，所述步骤4)中补充1％-5％基质胶到细胞悬液中并混匀。
第三方面，本发明提供一种脑胶质瘤类器官，是采用权利要求7-9任一项所述的培养方法获得。
本发明所具有的优点和有益效果：
①本发明可对人脑胶质瘤组织进行体外培养，在培养过程中，形成从细胞构成及空间结构均近似于体内肿瘤的类器官。
②本发明培养基含有脑胶质瘤细胞培养所需的最少组分，用于培养脑胶质瘤组织，形成的类器官维持了原发组织的形态结构和基因特征。
③本发明培养基及培养方法也适用于动物脑胶质瘤模型的体外培养。
④本发明培养基培养的脑胶质瘤类器官可以在体外长期扩增，大于5代。
⑤本发明所述培养基及培养方法与传统类器官培养方法相比，大大降低了生长因子和基质胶的用量，极大程度上节约了培养成本。
⑥本发明培养基配合本发明培养方法可将直径为20-40um的脑胶质瘤细胞团培养成器官。
⑦本发明培养基配合本发明培养方法可将直径为70-100um的脑胶质瘤细胞团培养成类器官。
⑧本发明培养基配合本发明培养方法，可将低至5000个细胞的新鲜细胞团培养成类器官。
⑨本发明培养基配合本发明培养方法，操作简单，人员操作影响较少，培养结果稳定。
⑩本发明所述培养基结合相应培养方法，可以高效、快速地对患者肿瘤组织来源的胶质瘤细胞进行类器官培养。
附图说明
图1为实施例6获得的人脑胶质瘤类器官普通光学显微镜下的图片；
图2为实施例7获得的小鼠脑胶质瘤类器官普通光学显微镜下的图片；
图3为实施例8获得的人脑胶质瘤类器官普通光学显微镜下的图片；
图4为实施例9获得的人脑胶质瘤类器官普通光学显微镜下的图片；
图5为实施例10获得的人脑胶质瘤类器官普通光学显微镜下的图片；
图6为对比例1获得的人脑胶质瘤类器官普通光学显微镜下的图片；
图7为对比例2在普通光学显微镜下的图片；
图8为对比例3普通光学显微镜下的图片；
图9为对比例4普通光学显微镜下的图片。
具体实施方式
本发明实施例采用的不含维生素A的B27，购自Gibco；
本发明实施例采用的N2，购自Gibco；
本发明实施例采用的N-acetylcysteine，购自Sigma-Aldrich；
本发明实施例采用的非必需氨基酸(NEAAs)，购自Gibco；
本发明实施例采用的EGF，购自Novoprotein；
本发明实施例采用的NGF，购自Novoprotein；
本发明实施例采用的GlutaMax，购自Gibco；
本发明实施例采用的Y27632，购自Selleck；
本发明实施例采用的Nicotinamide，购自Selleck；
本发明实施例采用的Neural basal，购自Gibco；
本发明实施例采用的Advanced DMEM/F12，购自Gibco。
在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
实施例1
本实施例提供一种人脑胶质瘤类器官培养基，包括基础培养基和特异性添加因子。
所述基础培养基由Neural basal与Advanced DMEM/F12按照体积比为6:3的比例混合。
所述特异性添加因子包括以下终浓度的组分：
不含维生素A的B27，1×；
N2，1×；
N-acetylcysteine，0.5mM；
非必需氨基酸(NEAAs)1×；
EGF:50ng/ml；
NGF:50ng/ml；
GlutaMax，1×；
Y27632，20μM；
Nicotinamide，5mM；
青霉素链霉素混合液，3×；
前述的百分浓度表示质量浓度。
该培养基的制备方法为：根据前述的培养基组成配料，将特异性添加因子加入到基础培养基中混合均匀既得。
实施例2
本实施例提供一种小鼠脑胶质瘤类器官培养基，包括基础培养基和特异性添加因子。
所述基础培养基由Neural basal与Advanced DMEM/F12按照体积比为7:3的比例混合。
所述特异性添加因子包括以下终浓度的组分：
不含维生素A的B27，1×；
N2，1×；
N-acetylcysteine，1mM；
非必需氨基酸(NEAAs)1.5×；
EGF:20ng/ml；
NGF:10ng/ml；
GlutaMax，1×；
Y27632，10μM；
Nicotinamide，5mM；
青霉素链霉素混合液，1×；
前述的百分浓度表示质量浓度。
该培养基的制备方法为：根据前述的培养基组成配料，将特异性添加因子加入到基础培养基中混合均匀既得。
实施例3
本实施例提供一种人脑胶质瘤类器官培养基，包括基础培养基和特异性添加因子。
所述基础培养基由Neural basal与Advanced DMEM/F12按照体积比为15:3的比例混合。
所述特异性添加因子包括以下终浓度的组分：
不含维生素A的B27，1×；
N2，1×；
N-acetylcysteine，0.2mM；
非必需氨基酸(NEAAs)1×；
EGF:100ng/ml；
NGF:10ng/ml；
GlutaMax，1×；
Y27632，5μM；
Nicotinamide，0.5mM；
青霉素链霉素混合液，1×；
前述的百分浓度表示质量浓度。
该培养基的制备方法为：根据前述的培养基组成配料，将特异性添加因子加入到基础培养基中混合均匀既得。
实施例4
本实施例提供一种人脑胶质瘤类器官培养基，包括基础培养基和特异性添加因子。
所述基础培养基由Neural basal与Advanced DMEM/F12按照体积比为27:3的比例混合。
所述特异性添加因子包括以下终浓度的组分：
不含维生素A的B27，5×；
N2，5×；
N-acetylcysteine，5mM；
非必需氨基酸(NEAAs)5×；
EGF:500ng/ml；
NGF:1000ng/ml；
GlutaMax，5×；
Y27632，50μM；
Nicotinamide，50mM；
青霉素链霉素混合液，5×；
前述的百分浓度表示质量浓度。
该培养基的制备方法为：根据前述的培养基组成配料，将特异性添加因子加入到基础培养基中混合均匀既得。
实施例5
本实施例提供一种人脑胶质瘤类器官培养基，包括基础培养基和特异性添加因子。所述基础培养基由Neural basal与Advanced DMEM/F12按照体积比为6:3的比例混合。
所述特异性添加因子包括以下终浓度的组分：
不含维生素A的B27，0.1×；
N2，0.1×；
N-acetylcysteine，1mM；
非必需氨基酸(NEAAs)1×；
EGF:10ng/ml；
NGF:100ng/ml；
GlutaMax，0.1×；
Y27632，10μM；
Nicotinamide，10mM；
青霉素链霉素混合液，0.1×；
前述的百分浓度表示质量浓度。
该培养基的制备方法为：根据前述的培养基组成配料，将特异性添加因子加入到基础培养基中混合均匀既得。
实施例6
本实施例提供一种人脑胶质瘤类器官的培养方法，是采用实施例1的培养基，包括以下步骤：
1)将新鲜的人脑胶质瘤组织进行预处理，用含1％双抗的生理盐水进行数次洗涤、去除血块等杂质，并充分切碎；
2)将组织块通过含胶原酶与分散酶的复合消化液进行消化、经过40μm与20μm滤器过滤，获取直径20um-40um的细胞团，离心去除上清备用。
3)取适量的实施例1所述的培养基，按每1-5×105细胞使用2ml培养基重悬细胞，得到细胞悬液；
4)用移液器将细胞悬液滴加到30mm超低粘附培养皿中，补充3％基质胶；将30mm超低粘附培养皿置于摇床上，启动摇床，摇床转速为100rpm。然后将30mm超低粘附培养皿置于恒温培养箱中，在37℃，5％CO2浓度下培养；
5)每隔2天更换一次液体培养基，培养5天，获得脑胶质瘤类器官。图1为本实施例获得的人脑胶质瘤类器官普通光学显微镜下的图片。类器官培养形态为致密的球状结构，平均直径大于100μm，边缘较致密。
实施例7
本实施例提供一种小鼠脑胶质瘤类器官的培养方法，是采用实施例2的培养基，包括以下步骤：
1)将新鲜的小鼠脑胶质瘤组织进行预处理，用含1％双抗的生理盐水进行数次洗涤、去除血块等杂质，并充分切碎；
2)将组织块通过含胶原酶与分散酶的复合消化液进行消化、经过100μm与70μm滤器过滤，获取直径70um-100um的细胞团，离心去除上清备用。
3)取适量的实施例2所述的培养基，按每1-5×105细胞使用2ml培养基重悬细胞，得到细胞悬液；
4)用移液器将细胞悬液滴加到6孔超低粘附培养板中，补充5％基质胶，将6孔超低粘附培养板置于摇床上，启动摇床，摇床转速为200rpm。然后将6孔超低粘附培养板置于恒温培养箱中，在37℃，5％CO2浓度下培养。
5)每隔3天更换一次液体培养基，培养3天，获得脑胶质瘤类器官。图2为本实施例获得的小鼠脑胶质瘤类器官普通光学显微镜下的图片。如图可见小鼠脑胶质瘤类器官为致密的细胞团，边缘光滑，平均直径大于100μm。
实施例8
本实施例提供一种人脑胶质瘤类器官的培养方法，是采用实施例3的培养基，包括以下步骤：
1)将新鲜的人脑胶质瘤组织进行预处理，用含1％双抗的生理盐水进行数次洗涤、去除血块等杂质，并充分切碎；
2)将组织块通过含胶原酶与分散酶的复合消化液进行消化、经过100μm与70μm滤器过滤，获取直径70um-100um的细胞团，离心去除上清备用。
3)取适量的实施例1所述的培养基，按每1-5×105细胞使用2ml培养基重悬细胞，得到细胞悬液；
4)用移液器将细胞悬液滴加到生物反应器中，补充1％基质胶；生物反应器启动搅拌功能，转速为50rpm。然后将生物反应器温度调整为37℃，CO2浓度为5％。
5)每隔2天更换一次液体培养基，培养4天，获得脑胶质瘤类器官。图3为本实施例获得的人脑胶质瘤类器官普通光学显微镜下的图片。如图可见脑胶质瘤类器官为致密的细胞团，边缘光滑，平均直径大于100μm。
实施例9
本实施例提供一种人脑胶质瘤类器官的培养方法，是采用实施例4的培养基，以及实施例6的培养方法，获得脑胶质瘤类器官。图4为本实施例获得的人脑胶质瘤类器官普通光学显微镜下的图片。如图可见脑胶质瘤类器官为致密的细胞团，边缘光滑，平均直径大于100μm。
实施例10
本实施例提供一种人脑胶质瘤类器官的培养方法，是采用实施例5的培养基，以及实施例6的培养方法，获得脑胶质瘤类器官。图5为本实施例获得的人脑胶质瘤类器官普通光学显微镜下的图片。如图可见脑胶质瘤类器官为致密的细胞团，边缘光滑，平均直径大于100μm。
对比例1
本对比例提供一种脑胶质瘤类器官培养基，该培养基与实施例1的区别在于：采用的基础培养基为Neural basal培养基，其他同实施例1。
使用上述培养基按照实施例6方法进行人脑胶质瘤类器官培养，培养时间为5天，获得人脑胶质瘤类器官，图6为本对比例获得的人脑胶质瘤类器官普通光学显微镜下的图片。
与采用实施例6的方法获得的类器官(图1)进行比较，结果表明：基础培养基仅为Neural Basal时，类器官可以形成团状结构，但尺寸较小。
对比例2
本对比例提供的一种脑胶质瘤类器官培养基，该培养基与实施例1的区别在于：本实施例的特异性添加因子中缺少EGF与NGF，其他同实施例1。
使用上述培养基按照实施例6方法进行人脑胶质瘤类器官培养，培养时间为5天，没有获得人脑胶质瘤类器官，图7为本对比例获得的普通光学显微镜下的图片。
对比例3
本对比例提供一种人脑胶质瘤类器官的培养方法，是采用实施例1的培养基，本对比例与实施例6的区别在于：
步骤4)没有“启动摇床”这一步骤，其余同实施例6。如图8所示，为本对比例普通光学显微镜下的图片，脑胶质瘤细胞分散，无法形成类器官形态。
对比例4
本对比例为一种人肺癌类器官的培养方法，采用实施例1所述的培养基，
采用实施例6所述的培养方法，如图9所示，细胞在5天内全部凋亡，没有获得人肺癌类器官。
对比例5
本对比例提供一种人脑胶质瘤类器官培养基，该培养基与实施例1的区别在于：采用的基础培养基Neural basal与Advanced DMEM/F12按照质量比为50：3混合，其他同实施例1。
使用上述培养基和实施例1培养基按照实施例6方法进行人脑胶质瘤类器官培养，培养时间为5天，获得人脑胶质瘤类器官，统计显微镜下4倍镜下3个视野脑胶质瘤类器官的数量和平均尺寸如表1所示，实施例1在类器官数量和大小上明显优于对比例5。
表1
分组 实施例1 对比例5
类器官数量 85 37
平均大小 243uM 87uM
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种脑胶质瘤类器官培养基，其特征在于：包括基础培养基和特异性添加因子，所述特异性添加因子包括以下终浓度的组分：
不含维生素A的B27，0.1-5×；
N2，0.1-5×；
N-acetylcysteine，0.2-5mM；
EGF:10-500ng/ml；
NGF:10-1000ng/ml；
GlutaMax，0.1-5×；
Y27632，5-50μM；
Nicotinamide，0.5-50mM；
青霉素链霉素混合液，0.1-5×；
前述的百分浓度表示质量浓度。
2.根据权利要求1所述的一种脑胶质瘤类器官培养基，其特征在于：所述特异性添加因子还包括以下终浓度的组分：非必需氨基酸(NEAAs)1-5×。
3.根据权利要求2所述的一种脑胶质瘤类器官培养基，其特征在于：所述特异性添加因子包括以下终浓度的组分：
不含维生素A的B27，1×；
N2，1×；
N-acetylcysteine，0.5mM；
非必需氨基酸(NEAAs)1×；
EGF:50ng/ml；
NGF:50ng/ml；
GlutaMax，1×；
Y27632，20μM；
Nicotinamide，5mM；
青霉素链霉素混合液，3×；
前述的百分浓度表示质量浓度。
4.根据权利要求1所述的一种脑胶质瘤类器官培养基，其特征在于：所述基础培养基由Neural basal与Advanced DMEM/F12混合组成。
5.根据权利要求4所述的一种脑胶质瘤类器官培养基，其特征在于：所述Neural basal与Advanced DMEM/F12按照6-27:3(v/v)的比例混合。
6.根据权利要求1-5任一项所述的一种脑胶质瘤类器官培养基，其特征在于：所述培养基的制备方法为：将特异性添加因子加入到基础培养基中混合均匀既得。
7.一种脑胶质瘤类器官的培养方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)将新鲜的胶质瘤组织进行预处理，用含1％双抗的生理盐水进行数次洗涤、去除血块等杂质，并充分切碎；
2)将组织块进行消化、获取细胞团，离心去除上清备用；
3)取适量的权利要求1-6任一项所述的培养基，按每1-5×105细胞使用2ml培养基重悬细胞，得到细胞悬液；
4)用移液器将细胞悬液滴加到细胞培养装置中，在温度为37℃，CO2浓度为5％的环境下进行培养；
5)每隔2-3天更换一次液体培养基，培养3-5天可获得脑胶质瘤类器官。
8.根据权利要求7所述的一种脑胶质瘤类器官的培养方法，其特征在于：所述步骤2)中将组织块通过含胶原酶与分散酶的复合消化液进行消化。
9.根据权利要求7所述的一种脑胶质瘤类器官的培养方法，其特征在于：所述步骤4)中补充1％-5％基质胶到细胞悬液中并混匀。
10.一种脑胶质瘤类器官，其特征在于：是采用权利要求7-9任一项所述的培养方法获得。
CN202210724752.7A 2022-06-23 2022-06-23 一种脑胶质瘤类器官、培养基及培养方法 Pending CN115011560A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210724752.7A CN115011560A (zh) 2022-06-23 2022-06-23 一种脑胶质瘤类器官、培养基及培养方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210724752.7A CN115011560A (zh) 2022-06-23 2022-06-23 一种脑胶质瘤类器官、培养基及培养方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115011560A true CN115011560A (zh) 2022-09-06

Family

ID=83076861

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210724752.7A Pending CN115011560A (zh) 2022-06-23 2022-06-23 一种脑胶质瘤类器官、培养基及培养方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115011560A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115820537A (zh) * 2022-11-28 2023-03-21 创芯国际生物科技(广州)有限公司 一种颅咽管瘤类器官、培养基及培养方法
CN116515754A (zh) * 2023-03-17 2023-08-01 创芯国际生物科技(广州)有限公司 一种脂肪肉瘤类器官、培养基及培养方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111065732A (zh) * 2017-09-11 2020-04-24 Imba-莫利库尔生物技术研究所 肿瘤类器官模型
CN111383774A (zh) * 2020-03-13 2020-07-07 北京市神经外科研究所 用于筛选脑胶质瘤治疗方案的系统
US20200348287A1 (en) * 2017-07-26 2020-11-05 The Regents Of The University Of California Functional cortical organoids, methods of making, and uses thereof
CN114214266A (zh) * 2021-11-18 2022-03-22 创芯国际生物科技(广州)有限公司 一种凝胶组合物、生物支架凝胶及其制备方法和应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20200348287A1 (en) * 2017-07-26 2020-11-05 The Regents Of The University Of California Functional cortical organoids, methods of making, and uses thereof
CN111065732A (zh) * 2017-09-11 2020-04-24 Imba-莫利库尔生物技术研究所 肿瘤类器官模型
CN111383774A (zh) * 2020-03-13 2020-07-07 北京市神经外科研究所 用于筛选脑胶质瘤治疗方案的系统
CN114214266A (zh) * 2021-11-18 2022-03-22 创芯国际生物科技(广州)有限公司 一种凝胶组合物、生物支架凝胶及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
董研博等: "类器官研究进展及应用", 《中国药理学与毒理学杂志》 *
邵云香等: "大脑类器官在胶质母细胞瘤中的应用进展", 《国际神经病学神经外科学杂志》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115820537A (zh) * 2022-11-28 2023-03-21 创芯国际生物科技(广州)有限公司 一种颅咽管瘤类器官、培养基及培养方法
CN115820537B (zh) * 2022-11-28 2023-12-12 创芯国际生物科技(广州)有限公司 一种颅咽管瘤类器官、培养基及培养方法
CN116515754A (zh) * 2023-03-17 2023-08-01 创芯国际生物科技(广州)有限公司 一种脂肪肉瘤类器官、培养基及培养方法
CN116515754B (zh) * 2023-03-17 2024-01-30 创芯国际生物科技(广州)有限公司 一种脂肪肉瘤类器官、培养基及培养方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Hawrot et al. [53] Long-term culture of dissociated sympathetic neurons
US7122371B1 (en) Modular cell culture bioreactor
CN115011560A (zh) 一种脑胶质瘤类器官、培养基及培养方法
US20050014255A1 (en) Stem cells for clinical and commercial uses
CN111575237B (zh) 一种乳腺癌无支架类器官专用培养基及培养方法
CN1389565A (zh) 人神经干细胞的培养方法
CN109536446A (zh) 单核细胞增殖剂、单核细胞增殖用培养基、及单核细胞的制造方法
CN111903603B (zh) 用于构建胆管癌异种移植模型的移植体及其制备方法和用途
CN113278586A (zh) 一种用于培养甲状腺癌类器官的培养基和培养方法
CN112852709B (zh) 小鼠肺类器官培养方法
CN101735979B (zh) 体外扩增造血干细胞和前体细胞的方法
CN110551688B (zh) 一种诱导体细胞重编程为造血干/祖细胞且促进造血干/祖细胞体外扩增的组合物及其应用
CN116590232A (zh) 一种甲状腺癌类器官、培养基及培养方法
CN112592883B (zh) 一种小鼠胰腺类器官培养基及其应用
WO2022247848A1 (zh) 毛囊间充质干细胞的制备方法以及应用
CN111849904B (zh) 神经母细胞瘤类器官的培养基、培养方法及移植体
CN113073078B (zh) 脐带来源间充质干细胞制备的通用型血小板制剂及方法
CN115558633A (zh) 一种利用微基质胶球快速培养类器官的方法
CN115161282A (zh) 一种小鼠脑微血管内皮细胞与周细胞联合提取培养方法
CN110607279B (zh) 一种原代肿瘤细胞的3d培养体系及其培养方法和应用
CN114317442A (zh) 一种建立乳腺类器官或/和乳腺癌类器官的培养基及方法和应用
CN115820537B (zh) 一种颅咽管瘤类器官、培养基及培养方法
Mandalam et al. Ex vivo hematopoietic cell expansion for bone marrow transplantation
CN116555181A (zh) 一种胰腺癌类器官、培养基及培养方法
CN115161261A (zh) 一种人胆管胆囊细胞3d培养的培养基与培养方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination