CN115161261A - 一种人胆管胆囊细胞3d培养的培养基与培养方法 - Google Patents

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Abstract

一种人胆管胆囊细胞3D培养的培养基与培养方法，培养基由基础培养基和特异性添加因子组成，特异性添加因子中Wnt3A 10～500ng/ml，R‑spondin50～5000ng/ml。培养方法为：(1)将人源的肝组织、胆囊组织或胆管组织预处理，切成组织块；(2)消化和过滤；离心去除上清液；(3)采用人胆管胆囊细胞3D培养的培养基进行重悬，冰上取基质胶与细胞悬液混合；(4)滴到培养皿中；(5)培养箱内静置后倒扣，胶滴凝固后静置；(6)加人胆管胆囊细胞3D培养的培养基，培养箱培养；(7)定期更换培养基，培养3～5天获得类器官。本发明可根据不同应用目的进行多种培养操作，简化了培养操作，并使得培养结果具有较高的稳定性。

Description

一种人胆管胆囊细胞3D培养的培养基与培养方法
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，特别涉及一种人胆管胆囊细胞3D培养的培养基与培养方法。
背景技术
如何准确的认识人类疾病是科学家一直深思的重大课题，临床上发生的很多疾病之所以没有得到有效的治疗，主要的原因就是因为缺乏对疾病的发生原因和机制的了解。目前，小鼠是医学研究中最重要的模型动物，小鼠的基因与人类相似度达95％，拥有人类相似的免疫系统及易于进行基因工程与细胞工程的改造，这些优点决定了小鼠模型在生物学医学科学研究中得天独厚的优势。然而，即便小鼠动物模型有诸多的优势，却依然存在建模流程繁杂、建模时间长、操作难度大、硬件要求高和建模成本高昂等特点。
类器官是由诱导的多能干细胞、胚胎干细胞或成体组织驻留的祖细胞体外培养形成的三维细胞团结构。类器官是二维培养和活体模型之间的重要桥梁，其较单层细胞培养模型更具生理学相关性，同时比活体模型更容易操纵利基成分、信号通路和基因组编辑。类器官的价值在于它们能够自组织成最小的生物单位，表现出与原始组织相似的功能和复杂性。类器官的可操作性预示着类器官将为广泛的基础研究提供出色的模型系统，包括表达谱研究和体内难以获得的稀有细胞谱系的分析；同时，可将类器官移植体内进行功能评估。此外，也可从患者自身组织或诱导的多能干细胞产生类器官可用于研究缺乏动物模型的罕见疾病。在再生医学中，类器官技术有望替代严重受损的器官，如1型糖尿病患者的胰腺。
胆管与胆囊是肝胆是胆汁运输与储存的主要场所，胆管胆囊疾病，包括炎症及肿瘤等均对人类健康具有重要影响，胆管是肝脏中重要的干细胞来源，胆管的培养对体外构构建及诱导肝脏培养具有重要意义。目前胆管和胆囊细胞的体外培养工艺主要为多能干细胞诱导培养，但该培养方法会使来源供体的生物学特征，尤其是表观遗传特征和翻译后修饰特征发生重大改变，无法代表个体生物学特点。因此，原代来源的胆管胆囊细胞的培养无论对科研还是临床应用都具有极大潜在意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种人胆管胆囊细胞3D培养的培养基与培养方法，高效、快速地对原代肝组织、胆囊组织或胆管组织进行3D培养，在体外形成胆管、胆囊干细胞微球。
本发明的人胆管胆囊细胞3D培养的培养基由基础培养基Advanced DMEM/F12和特异性添加因子组成，特异性添加因子在基础培养基中的浓度为：B27 1～5×，N2 1～5×，N-acetylcysteine 0.2～5mM，GlutaMax 1～5×，EGF 10～100ng/ml，Wnt3A 10～500ng/ml，R-spondin 50～5000ng/ml，Noggin 50～500ng/ml，HGF 50～500ng/ml，FGF7 50～500ng/ml，Y27632 5～50μM，Nicotinamide 5～50mM，青霉素链霉素混合液1～5×。
上述的人胆管胆囊细胞3D培养的培养基中，R-spondin为R-spondinl、R-spondin2或R-spondin3，优选R-spondin3。
优选地，所述的Wnt3A的浓度为100ng/ml。
本发明的人胆管胆囊细胞3D培养的培养方法之一按以下步骤进行：
(1)将人源的肝组织、胆囊组织或胆管组织进行预处理，然后切成组织块；
(2)将组织块进行消化和过滤，获得的固相，固相中的细胞团的直径为15～100um；将固相离心去除上清液，剩余细胞沉淀；
(3)采用人胆管胆囊细胞3D培养的培养基对细胞沉淀进行重悬，制成细胞悬液；用预冷的枪头在冰上取基质胶与细胞悬液混合，制备成细胞-胶混合液；
(4)用移液器将细胞-胶混合液滴到培养皿中，形成30～50ul/滴的胶滴；
(5)将接种胶滴后的培养皿放入CO2培养箱内静置3～5min，然后倒扣，至胶滴凝固后静置至少30min；
(6)向培养皿中加入1～5ml的人胆管胆囊细胞3D培养的培养基，然后置于恒温培养箱在37℃和CO2的体积浓度为5％条件下培养；
(7)每隔2～3天更换一次人胆管胆囊细胞3D培养的培养基，培养3～5天获得类器官；其中，当原料为肝组织或胆管组织时，培养后获得胆管类器官；当原料为胆囊组织时，培养后获得胆囊类器官。
本发明的人胆管胆囊细胞3D培养的培养方法之二按以下步骤进行：
(1)将人源的肝组织、胆囊组织或胆管组织进行预处理，然后切成组织块；
(2)将组织块进行消化和过滤，获得的固相，固相中的细胞团的直径为15～100um；将固相离心去除上清液，剩余细胞沉淀；
(3)采用人胆管胆囊细胞3D培养的培养基对细胞沉淀进行重悬，制成细胞悬液；将细胞悬液直接种植于超地粘附培养板或培养皿中；
(4)向超地粘附培养板或培养皿中加入1～5ml的人胆管胆囊细胞3D培养的培养基，然后置于恒温培养箱在37℃和CO2的体积浓度为5％条件下培养；
(5)每隔2～3天更换一次人胆管胆囊细胞3D培养的培养基，培养3～5天获得3D微球；其中，当原料为肝组织或胆管组织时，培养后获得胆管微球；当原料为胆囊组织时，培养后获得胆囊微球。
上述方法之一或之二的步骤(1)中，预处理是采用生理盐水洗涤，去除血块；所述的生理盐水中含青霉素链霉素混合液，青霉素链霉素混合液占生理盐水质量的1％。
上述方法之一或之二的步骤(2)中，离心的速度为1500～2000rpm，时间为5min。
上述方法之一的步骤(3)中，基质胶与细胞悬液的混合比例按质量比为1.5∶1。
上述方法之一中，人胆管胆囊细胞3D培养的培养基中R-spondin为R-spondin3，其浓度为1000ng/ml。
上述方法之二中，人胆管胆囊细胞3D培养的培养基中R-spondin为R-spondin3，其浓度为800ng/ml。
本发明培养基具体特点如下：
本发明可对人源的肝脏、胆囊、胆管等多种组织进行体外培养，在培养过程中，保留胆管与胆囊上皮细胞成分，自动筛选去除成肝细胞、免疫细胞等成分，形成从细胞构成及空间结构均近似于胆管及胆囊的类器官或3D微球；培养基含有胆管胆囊上皮细胞培养所需的最少组分，用于培养胆管及胆囊正常组织，形成的胆管胆囊细胞球或类器官维持了原发组织的形态结构和基因特征。
本发明所述培养基及培养方法可以实现人的类器官与微球体外培养；培养基培养的胆管胆囊微球或类器官可以在体外长期扩增，大于5代；可将直径为20～40um的肝、胆管及胆囊细胞团培养成胆管胆囊微球或类器官；可将直径为70～100um的肝、胆管及胆囊细胞团培养成胆管胆囊微球或类器官；可将低至5000个细胞的新鲜细胞团培养成类器官。
本发明即可用于凝胶包埋法培养胆管与胆囊类器官，也可以通过低粘附培养皿或培养板培养成胆囊与胆管微球，可以根据不同应用目的进行多种培养操作。本产品制定了标准化的胆囊与胆管类器官与微球培养配方，实验人员使用标准化的培养基，在培养过程中无须额外添加细胞因子或其他成分，降低了实验过程中的人为因素影响与实验误差，简化了培养操作，并使得培养结果具有较高的稳定性。
附图说明
图1为本发明实施例4中的胆管上皮类器官明场显微照片图；
图2为本发明实施例5中的胆囊上皮类器官明场显微照片图；
图3为本发明实施例6中的胆囊微球明场显微照片图；
图4为对比例1的胆管类器官明场显微照片图；
图5为实施例4和对比例1的胆管类器官数量大小比较曲线图；其中，■为实施例4，□为对比例1；
图6为对比例2的胆囊类器官明场显微照片图；
图7为实施例5和对比例2的胆管类器官数量大小比较曲线图；其中，■为实施例5，□为对比例2；
图8为对比例3的胆囊微球明场显微照片图。
具体实施方式
实施例1
3D培养的培养基由Advanced DMEM/F12和特异性添加因子组成，特异性添加因子在基础培养基中的浓度为：不含维生素A的B27 1×，N21×，N-acetylcysteine 1mM，GlutaMax 1×，EGF 50ng/ml，Wnt3A 100ng/ml，R-spondin3 1000ng/ml，Noggin 100ng/ml，HGF 50ng/ml，FGF7 100ng/ml，Y27632 5μM，Nicotinamide 10mM，青霉素链霉素混合液1×；
培养方法为：
将人源的胆管组织进行预处理，然后切成组织块；，预处理是采用生理盐水洗涤，去除血块；所述的生理盐水中含青霉素链霉素混合液，青霉素链霉素混合液占生理盐水质量的1％；
将组织块进行消化和过滤，获得的固相，固相中的细胞团的直径为15～100um；将固相离心去除上清液，剩余细胞沉淀；离心的速度为1500～2000rpm，时间为5min；
采用人胆管胆囊细胞3D培养的培养基对细胞沉淀进行重悬，制成细胞悬液；用预冷的枪头在冰上取基质胶与细胞悬液混合，制备成细胞-胶混合液；基质胶与细胞悬液的混合比例按质量比为1.5∶1；
用移液器将细胞-胶混合液滴到培养皿中，形成30～50ul/滴的胶滴；
将接种胶滴后的培养皿放入CO2培养箱内静置3～5min，然后倒扣，至胶滴凝固后静置至少30min；
向培养皿中加入1～5ml的人胆管胆囊细胞3D培养的培养基，然后置于恒温培养箱在37℃和CO2的体积浓度为5％条件下培养；
每隔2～3天更换一次人胆管胆囊细胞3D培养的培养基，培养3～5天获得胆管类器官。
实施例2
3D培养的培养基同实施例1，不同点在于：特异性添加因子在基础培养基中的浓度为：N-acetylcysteine 0.5mM，EGF 10ng/ml，Noggin 50ng/ml，HGF 100ng/ml；，FGF7120ng/ml；
培养方法同实施例1，不同点在于：
(1)将人源的胆囊组织进行预处理；
(2)培养获得胆囊类器官。
实施例3
3D培养的培养基同实施例1，不同点在于：特异性添加因子在基础培养基中的浓度为：N-acetylcysteine 0.5mM，EGF 10ng/ml，Wnt3A 50ng/ml，R-spondin 3 800ng/ml，Noggin 50ng/ml，HGF 100ng/ml；
培养方法为：
将人源的肝组织进行预处理，然后切成组织块；预处理是采用生理盐水洗涤，去除血块；所述的生理盐水中含青霉素链霉素混合液，青霉素链霉素混合液占生理盐水质量的1％；
将组织块进行消化和过滤，获得的固相，固相中的细胞团的直径为15～100um；将固相离心去除上清液，剩余细胞沉淀；离心的速度为1500～2000rpm，时间为5min；
采用人胆管胆囊细胞3D培养的培养基对细胞沉淀进行重悬，制成细胞悬液；将细胞悬液直接种植于超地粘附培养板或培养皿中；
向超地粘附培养板或培养皿中加入1～5ml的人胆管胆囊细胞3D培养的培养基，然后置于恒温培养箱在37℃和CO2的体积浓度为5％条件下培养；
每隔2～3天更换一次人胆管胆囊细胞3D培养的培养基，培养3～5天获得3D胆囊微球。
实施例4
3D培养的培养基同实施例1；
将人肝组织进行预处理，用含1％青霉素链霉素混合液的生理盐水进行数次洗涤、去除血块等杂质，并充分切碎；
将组织块进行消化、过滤，获取直径15～100um的细胞团，离心去除上清备用；
用3D培养的培养基重悬细胞，用预冷的枪头在冰上取基质胶与细胞悬液混合，制备成细胞-胶混合液；
用移液器将细胞-胶混合液滴到60mm培养皿中，形成30～50ul/滴的胶滴；
将接种胶滴后的培养皿放入CO2培养箱内静置5min，小心倒扣，待其充分凝固30min；
培养皿中加入3ml的3D培养的培养基，然后置于恒温培养箱在37℃，5％cO2(v/v)浓度下培养；
每隔2～3天更换一次液体培养基，培养3～5天可获得胆管上皮类器官，明场显微照片如图1所示。
实施例5
3D培养的培养基同实施例2；
将人胆囊织进行预处理，用含1％青霉素链霉素混合液的生理盐水进行数次洗涤、去除血块等杂质，并充分切碎；
将组织块进行消化、过滤，获取直径15～100um的细胞团，离心去除上清备用；
用3D培养的培养基重悬细胞，用预冷的枪头在冰上取基质胶与细胞悬液混合，制备成细胞-胶混合液；
用移液器将细胞-胶混合液滴到60mm培养皿中，形成30-50ul/滴的胶滴；
将接种胶滴后的培养皿放入CO2培养箱内静置5min，小心倒扣，待其充分凝固30min；
培养皿中加入3ml的3D培养的培养基，然后置于恒温培养箱在37℃，5％CO2(v/v)浓度下培养；
每隔2～3天更换一次液体培养基，培养3～5天可获得胆囊上皮类器官，明场显微照片如图2所示。
实施例6
3D培养的培养基同实施例3；
将新鲜的人源胆囊组织的进行预处理，用含1％双抗的生理盐水进行数次洗涤、去除血块等杂质，并充分切碎；
将组织块进行消化、过滤，获取直径40～70um的细胞团，离心去除上清备用；
细胞使用3D培养的培养基重悬，接种至3cm超地粘附培养皿中
培养皿中补充3D培养的培养基，然后置于恒温培养箱在37℃，5％CO2浓度下培养。
每隔2～3天更换一次液体培养基，培养3～5天可获得胆囊微球，明场显微照片如图3所示。
对比例1
3D培养的培养基同实施例4，不同点在于：培养基中不含有R-spondin3成分；
培养方法同实施例4，其培养结果显示胆管类器官形成数量少且尺寸极小，明场显微照片如图4所示，与实施例4的类器官数量大小比较结果如图5所示。
对比例2
3D培养的培养基同实施例5，不同点在于：培养基中不含有Wnt3A成分；
培养方法同实施例5，其培养结果显示胆囊类器官数量极少且尺寸极小，(明场显微照片如图6所示，与实施例5的类器官数量大小比较结果如图7所示。
对比例3
3D培养的培养基同实施例6，不同点在于：培养基中不含有R-Spondin3成分；
培养方法同实施例6；培养结果显示细胞无法聚团形成微球，明场显微照片如图8所示。

Claims (9)

1.一种人胆管胆囊细胞3D培养的培养基，其特征在于由基础培养基Advanced DMEM/F12和特异性添加因子组成，特异性添加因子在基础培养基中的浓度为：B27 1～5×，N21～5×，N-acetylcysteine 0.2～5mM，GlutaMax 1～5×，EGF 10～100ng/ml，Wnt3A 10～500ng/ml，R-spondin 50～5000ng/ml，Noggin 50～500ng/ml，HGF 50～500ng/ml，FGF7 50～500ng/ml，Y27632 5～50μM，Nicotinamide 5～50mM，青霉素链霉素混合液1～5×。
2.根据权利要求1所述的人胆管胆囊细胞3D培养的培养基，其特征在于所述的R-spondin为R-spondin1、R-spondin2或R-spondin3，优选R-spondin3。
3.一种人胆管胆囊细胞3D培养的培养方法，其特征在于按以下步骤进行：
(1)将人源的肝组织、胆囊组织或胆管组织进行预处理，然后切成组织块；
(2)将组织块进行消化和过滤，离心去除上清液，剩余细胞沉淀；
(3)采用人胆管胆囊细胞3D培养的培养基对细胞沉淀进行重悬，制成细胞悬液；用预冷的枪头在冰上取基质胶与细胞悬液混合，制备成细胞-胶混合液；
(4)用移液器将细胞-胶混合液滴到培养皿中，形成30～50ul/滴的胶滴；
(5)将接种胶滴后的培养皿放入CO2培养箱内静置3～5min，然后倒扣，至胶滴凝固后静置至少30min；
(6)向培养皿中加入1～5ml的人胆管胆囊细胞3D培养的培养基，然后置于恒温培养箱在37℃和CO2的体积浓度为5％条件下培养；
(7)每隔2～3天更换一次人胆管胆囊细胞3D培养的培养基，培养3～5天获得类器官；其中，当原料为肝组织或胆管组织时，培养后获得胆管类器官；当原料为胆囊组织时，培养后获得胆囊类器官。
4.一种人胆管胆囊细胞3D培养的培养方法，其特征在于按以下步骤进行：
(1)将人源的肝组织、胆囊组织或胆管组织进行预处理，然后切成组织块；
(2)将组织块进行消化和过滤，获得的固相，固相中的细胞团的直径为15～100um；将固相离心去除上清液，剩余细胞沉淀；
(3)采用人胆管胆囊细胞3D培养的培养基对细胞沉淀进行重悬，制成细胞悬液；将细胞悬液直接种植于超地粘附培养板或培养皿中；
(4)向超地粘附培养板或培养皿中加入1～5ml的人胆管胆囊细胞3D培养的培养基，然后置于恒温培养箱在37℃和CO2的体积浓度为5％条件下培养；
(5)每隔2～3天更换一次人胆管胆囊细胞3D培养的培养基，培养3～5天获得3D微球；其中，当原料为肝组织或胆管组织时，培养后获得胆管微球；当原料为胆囊组织时，培养后获得胆囊微球。
5.根据权利要求3或4所述的人胆管胆囊细胞3D培养的培养方法，其特征在于步骤(1)中，预处理是采用生理盐水洗涤，去除血块；所述的生理盐水中含青霉素链霉素混合液，青霉素链霉素混合液占生理盐水质量的1％。
6.根据权利要求3或4所述的人胆管胆囊细胞3D培养的培养方法，其特征在于步骤(2)中，离心的速度为1500～2000rpm，时间为5min。
7.根据权利要求3所述的人胆管胆囊细胞3D培养的培养方法，其特征在于步骤(3)中，基质胶与细胞悬液的混合比例按质量比为1.5∶1。
8.根据权利要求3所述的人胆管胆囊细胞3D培养的培养方法，其特征在于所述的人胆管胆囊细胞3D培养的培养基中R-spondin为R-spondin3，其浓度为1000ng/ml。
9.根据权利要求4所述的人胆管胆囊细胞3D培养的培养方法，其特征在于所述的人胆管胆囊细胞3D培养的培养基中R-spondin为R-spondin3，其浓度为800ng/ml。
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