CN111961642B - 一种小鼠肝脏类器官模型及其建立方法和应用 - Google Patents

一种小鼠肝脏类器官模型及其建立方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种小鼠肝脏类器官模型及其建立方法和应用，该建立方法包括以下步骤：取小鼠肝脏组织，依次进行清洗、剪切、消化及过滤处理，获得小鼠肝脏干细胞；将小鼠肝脏干细胞依次进行原代培养、增殖培养和分化培养，既得。采用上述方法获得的肝脏类器官模型应用在药理学、药效学和毒理学分析中。本发明中肝脏类器官模型建立方法与常规方法相比，一方面大大缩短了培养周期：从取材到模型的获得，时间周期约为14～20天，而常规的培养方法耗时30天，明显提高了模型应用的可行性。另一方面，本发明方法明显提高了小鼠肝脏类器官培养的成功率并加快原代培养中类器官的生长速度。

Description

一种小鼠肝脏类器官模型及其建立方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种小鼠肝脏类器官模型及其建立方法和应用。
背景技术
药物性肝毒性是目前新药最关键的安全性指标，永生化肝细胞系和动物模型目前仍是药物代谢和毒性测试的“金标准”，但它们的实用性和长期培养能力十分有限，很大地限制了研究的广度和深度。基于动物模型的肝脏毒理实验，成本高，实验周期长，无法进行快速高通量检测分析。在肝毒性研究和临床前药物开发中，迫切需要能够开展高通量分析的体外模型来进行药物功效和毒性试验。小鼠是常用药物安全性评价模型，建立小鼠肝脏体外类器官研究模型，部分替代动物实验，能够极大提高基础研究和新药开发的效率。
发明内容
本发明旨在提供一种小鼠肝脏类器官模型及其建立方法和应用以解决上述问题。类器官(Organoid)是一种利用干细胞在体外3D条件下制备，能够模拟原生器官结构和功能的一类三维“微器官模型”。由于与对应的人类器官拥有高度相似的组织学特征，并能重现该器官的生理功能，类器官可作为多种疾病的体外模型，在干细胞与发育、再生医学、疾病研究、药物开发和肿瘤治疗等多个领域具有广泛的应用前景。相比传统的二维培养模型，类器官代表着一种能够概括整个生物体生理过程的创新技术，具有更接近生理细胞组成和行为、更稳定的基因组。本发明的目的是直接从成体组织中获得肝脏类器官，同时富集更多动物肝组织，比如小鼠中干细胞富集区的胆管样结构。在此模型的建立过程中，不仅省略了从诱导多能干细胞向终末分化细胞的发育过程，使得操作更为简便，成本更低，耗时更短，而且利用成体干细胞建立的肝脏类器官模型包括一个自我更新干细胞群，可分化为与来源器官特异性的细胞类型，是一个生理高度相关系统，相对于现有的细胞系模型和动物模型建立方法，更加具有应用价值。本发明的技术方案为：
第一个方面，本发明提供一种小鼠肝脏类器官模型的建立方法，包括以下步骤：取小鼠肝脏组织，依次进行清洗、剪切、消化及过滤处理，获得小鼠肝脏干细胞；将小鼠肝脏干细胞依次进行原代培养、增殖培养和分化培养，既得。
在一些实施例中，所述清洗处理包括：采用含1％双抗的生理盐水反复数次，直至剔除明显的脂肪组织。
在一些实施例中，所述消化处理包括：①将剪切好的组织分散在生理盐水中，离心去上清后往沉淀中加入胶原酶、分散酶与DNaseI，于37℃震荡消化 30min，加入含1％双抗的生理盐水终止消化，静置，收集细胞沉淀；②继续往细胞沉淀内加入胶原酶、分散酶与DNaseI，于37℃震荡消化30min，加入含1％双抗的生理盐水终止消化，静置沉淀，分别收集上清和细胞沉淀；③继续往细胞沉淀内加入胶原酶、分散酶与DNaseI，于37℃震荡消化30min，加入含1％双抗的生理盐水终止消化，静置沉淀，收集上清并与步骤②的上清合并。
在一些实施例中，所述过滤处理包括：将消化处理获得的消化液经100μm 的滤网过滤，收集滤液；将收集的滤液经40μm的滤网过滤，收集滤渣。
在一些实施例中，所述原代培养包括：将过滤处理获得的肝脏干细胞加入Advanced DMEM/F12培养基重悬，然后加入Matrigel胶混合均匀，待混合胶体凝固后加入原代提取培养基，于37℃、5％CO2浓度下培养5～10天，期间每间隔3～4天更换一次培养基。
在一些实施例中，所述原代提取培养基包括：Advanced DMEM/F12培养基、不含Vit-A的B27、N2、EGF、Gastrin、HGF、N-acetylcysteine、R-spondin 1、 FGF10、Nicotinamide、Noggin、Wnt3a、Y-27632、Glutamax、青霉素链霉素混合液、HEPES。优选地，各成分的含量为：不含Vit-A的B27，1-2X；N2，0.5-2 X；EGF，10-15ng/ml；Gastrin，10-15nM；HGF，50-60ng/ml；N-acetylcysteine， 1-2mM；R-spondin 1，100-120ng/ml；FGF10，100-110ng/ml；Nicotinamide， 10-20mM；Noggin，195-205ng/ml；Wnt3a，250-260ng/ml；Y-27632，10-20μM； Glutamax，1-2X；青霉素链霉素混合液，1-2X；HEPES，1-2mM。
在一些实施例中，所述增殖培养包括：在经原代培养的细胞混合液中加入胰酶，于37℃消化3min，转移至预冷的Advanced DMEM/F12中，离心弃上清，收集细胞沉淀制成胶滴，待其凝固后加入增殖培养基，于37℃、5％CO2浓度下培养2～4天。
在一些实施例中，所述增殖培养基包括：Advanced DMEM/F12培养基、不含Vit-A的B27、N2、EGF、Gastrin、HGF、N-acetylcysteine、R-spondin 1、FGF10、 Nicotinamide、BMP7、Glutamax、青霉素链霉素混合液、HEPES。优选地，各成分的含量为：不含Vit-A的B27，1-1.5X；N2，1-2X；EGF，10-15ng/ml； Gastrin，10-15nM；HGF，50-55ng/ml；N-acetylcysteine，1-1.5mM；R-spondin 1，100-105ng/ml；FGF10，100-110ng/ml；Nicotinamide，10-15mM；BMP7， 100-110ng/ml；Glutamax，1-2X；青霉素链霉素混合液，1-2X；HEPES，1-2mM。
在一些实施例中，所述分化培养包括：在经增殖培养的细胞混合液中去除增殖培养基，加入分化培养基，于37℃、5％CO2浓度下培养7～10天。
在一些实施例中，所述分化培养基包括：Advanced DMEM/F12培养基、不含Vit-A的B27、N2、EGF、Gastrin、N-acetylcysteine、A-8301、FGF19、DAPT、 BMP7、Dexamethasone、Glutamax、青霉素链霉素混合液、HEPES。优选地，各成分的含量为：不含Vit-A的B27，1-2X；N2，1-2X；EGF，10-15ng/ml； Gastrin，10-15nM；N-acetylcysteine，1-2mM；A-8301，10-1100nM；FGF19， 100-110ng/ml；DAPT，10-20uM；BMP7，100-110ng/ml；Dexamethasone，1000-1100nM；Glutamax，1-2X；青霉素链霉素混合液，1-2X；HEPES，1-2mM。
第二个方面，本发明提供一种利用上述方法获得的小鼠肝脏类器官模型。
在一些实施例中，所述小鼠肝脏类器官模型的结构至少包括：管状结构、空泡结构和致密结构。
第三个方面，本发明提供一种上述小鼠肝脏类器官模型在药理学、药效学和毒理学分析中的应用。
本发明的有益效果是：
①本发明中小鼠肝脏类器官模型建立方法与常规方法相比，一方面大大缩短了培养周期：从取材到模型的获得，时间周期约为14～20天，而常规的培养方法耗时30天，明显提高了模型应用的局限性。另一方面，本发明方法明显提高了小鼠肝脏类器官培养的成功率并加快原代培养中类器官的生长速度。
②本发明方法直接从小鼠成体组织中获得肝脏类器官，省略了从诱导多能干细胞向终末分化细胞的发育过程，操作简便，成本低，耗时短。
③本发明利用小鼠成体干细胞建立的肝脏类器官模型包括一个自我更新干细胞群，可分化为与来源器官特异性的细胞类型，是一个生理高度相关系统，相对于细胞系模型功能单一、动物模型成本高，周期长的特点，更加具有应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例1培养得到的小鼠肝脏类器官光学显微镜图。
图2为本发明实施例2培养得到的小鼠肝脏类器官光学显微镜图。
图3为本发明实施例2培养得到的小鼠肝脏类器官组织形态结构图。
图4为本发明对比例1中培养得到的小鼠类器官光学显微镜图。
图5为本发明对比例3中培养得到的小鼠类器官光学显微镜图。
具体实施方式
本发明实施例采用的不含Vit-A的B27购自Gibco。
本发明实施例采用的N2购自Gibco。
本发明实施例采用的Gastrin购自Tocris。
本发明实施例采用的HGF购自Novoprotein。
本发明实施例采用的N-acetylcysteine购自Sigma。
本发明实施例采用的R-spondin 1购自Peprotech。
本发明实施例采用的FGF10购自Peprotech。
本发明实施例采用的EGF购自Peprotech。
本发明实施例采用的Nicotinamide购自Sigma。
本发明实施例采用的Noggin购自Novoprotein。
本发明实施例采用的Wnt3a购自Peprotech。
本发明实施例采用的Y-27632购自Sigma。
本发明实施例采用的Glutamax购自Sigma。
本发明实施例采用的BMP7购自Peprotech。
本发明实施例采用的A-8301购自Sigma。
本发明实施例采用的DAPT购自Sigma。
本发明实施例采用的青霉素-链霉素混合液购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
实施例1
本实施例提供一种小鼠肝脏类器官模型的建立方法，包括以下步骤：
1)样本清洗：用含1％双抗的生理盐水对小鼠肝脏组织进行数次清洗，剔除明显的脂肪组织。
2)样本剪切：将组织剪成约1mm^3小块，显微镜下观察是否有细胞漏出。
3)组织消化：①用生理盐水将剪切好的组织收集到15mL离心管，离心去上清，往沉淀加入胶原酶、分散酶与DNaseI，37℃震荡消化30min，加入1％双抗的生理盐水终止消化，静置沉淀，尽量吸去上清，收集细胞沉淀；②继续往沉淀内加入胶原酶、分散酶与DNaseI，37℃震荡消化30min，加入1％双抗的生理盐水终止消化，静置沉淀，尽量收集上清于50mL离心管1中；③继续往沉淀内加入胶原酶、分散酶与DNaseI，37℃震荡消化30min，加入1％双抗的生理盐水终止消化，静置沉淀，继续收集上清于50mL离心管1中。
4)过滤：①将步骤3)收集的上清经100μm的滤网过滤，收集滤液；②将收集的滤液经过40μm的滤网过滤，收集滤渣，用100μL Advanced DMEM/F12 培养基重悬滤渣。
5)制胶：取120ul Matrigel胶(4℃融化过夜)，与细胞悬液充分混匀，滴到6cm平皿内，每滴约30ul，静置2min，倒扣在细胞培养箱内。
6)原代培养：待充分凝固后加入原代提取培养基(不含Vit-A的B27，1X； N2，1X；EGF，10ng/ml；Gastrin，10nM；HGF，50ng/ml；N-acetylcysteine， 1mM；R-spondin 1，100ng/ml；FGF10，100ng/ml；Nicotinamide，10mM； Noggin，200ng/ml；Wnt3a，250ng/ml；Y-27632，10μM；Glutamax，1X；青霉素链霉素混合液，1X；HEPES，1mM。以上成分均溶于Advanced DMEM/F12 培养基中)，于37℃、5％CO2浓度下培养5天，期间每间隔3天更换一次原代提取培养基。
7)增殖培养：加入0.25％胰酶3ml，将培养皿中胶滴吹散，37℃消化3分钟，转移至含有10ml预冷的Advanced DMEM/F12中，离心弃上清，收集细胞沉淀制成胶滴，静置2min，倒扣在细胞培养箱内。待凝固后加入增殖培养基(不含Vit-A的B27，1X；N2，1X；EGF，10ng/ml；Gastrin，10nM；HGF，50ng/ml； N-acetylcysteine，1mM；R-spondin 1，100ng/ml；FGF10，100ng/ml；Nicotinamide， 10mM；BMP7，100ng/ml；Glutamax，1X；青霉素链霉素混合液，1X；HEPES， 1mM。以上成分均溶于Advanced DMEM/F12培养基中)，于37℃、5％CO2浓度下培养3天。
8)分化培养：去除增殖培养基，加入分化培养基(不含Vit-A的B27，1X； N2，1X；EGF，10ng/ml；Gastrin，10nM；N-acetylcysteine，1mM；A-8301， 1000nM；FGF19，100ng/ml；DAPT，10uM；BMP7，100ng/ml；Glutamax， 1X；青霉素链霉素混合液，1X；HEPES，1mM。以上成分均溶于Advanced DMEM/F12培养基中)，于37℃、5％CO2浓度下培养10天，期间每3天更换一次分化培养基，共培养10天。在光学显微镜下的类器官形态结构如图1所示，类器官壁变厚，但仍为空泡状结构。
实施例2
本实施例提供一种小鼠肝脏类器官模型的建立方法，并同时采用建立的肝脏类器官进行地塞米松对肝细胞药效的考察，具体包括以下步骤：
1)样本清洗：用含1％双抗的生理盐水对小鼠肝脏组织进行数次清洗，剔除明显的脂肪组织。
2)样本剪切：将组织剪成约1mm^3小块，显微镜下观察是否有细胞漏出。
3)组织消化：①用生理盐水将剪切好的组织收集到15mL离心管，离心去上清，往沉淀加入胶原酶、分散酶与DNaseI，37℃震荡消化30min，加入1％双抗的生理盐水终止消化，静置沉淀，尽量吸去上清，收集细胞沉淀；②继续往沉淀内加入胶原酶、分散酶与DNaseI，37℃震荡消化30min，加入1％双抗的生理盐水终止消化，静置沉淀，尽量收集上清于50mL离心管1中；③继续往沉淀内加入胶原酶、分散酶与DNaseI，37℃震荡消化30min，加入1％双抗的生理盐水终止消化，静置沉淀，继续收集上清于50mL离心管1中。
4)过滤：①将步骤3)收集的上清经100μm的滤网过滤，收集滤液；②将收集的滤液经过40μm的滤网过滤，收集滤渣，用100μL Advanced DMEM/F12 培养基重悬滤渣。
5)制胶：取120ul Matrigel胶(4℃融化过夜)，与细胞悬液充分混匀，滴到6cm平皿内，每滴约30ul，静置2min，倒扣在细胞培养箱内。
6)原代培养：待充分凝固后加入原代提取培养基(不含Vit-A的B27，1X；N2，1.5X；EGF，12ng/ml；Gastrin，12nM；HGF，55ng/ml；N-acetylcysteine， 1.5mM；R-spondin 1，105ng/ml；FGF10，105ng/ml；Nicotinamide，12mM； Noggin，200ng/ml；Wnt3a，260ng/ml；Y-27632，20μM；Glutamax，2X；青霉素链霉素混合液，2X；HEPES，2mM。以上成分均溶于AdvancedDMEM/F12 培养基中)，于37℃、5％CO2浓度下培养5天，期间每间隔3天更换一次原代提取培养基。
7)增殖培养：加入0.25％胰酶3ml，将培养皿中胶滴吹散，37℃消化3分钟，转移至含有10ml预冷的Advanced DMEM/F12中，离心弃上清，收集细胞沉淀制成胶滴，静置2min，倒扣在细胞培养箱内。待凝固后加入增殖培养基(不含Vit-A的B27，1.5X；N2，1.5X；EGF，15ng/ml；Gastrin，15nM；HGF，55 ng/ml；N-acetylcysteine，1.5mM；R-spondin 1，105ng/ml；FGF10，110ng/ml； Nicotinamide，15mM；BMP7，110ng/ml；Glutamax，2X；青霉素链霉素混合液，2X；HEPES，2mM。以上成分均溶于Advanced DMEM/F12培养基中)，于37℃、5％CO2浓度下培养3天。
8)分化培养：去除增殖培养基，加入分化培养基(不含Vit-A的B27，1X； N2，1.5X；EGF，15ng/ml；Gastrin，15nM；N-acetylcysteine，2mM；A-8301， 1050nM；FGF19，110ng/ml；DAPT，20uM；BMP7，105ng/ml；Dexamethasone， 1100nM；Glutamax，2X；青霉素链霉素混合液，2X；HEPES，2mM。以上成分均溶于Advanced DMEM/F12培养基中)，在此基础上添加地塞米松至终浓度为3uM，于37℃、5％CO2浓度下培养10天，期间每3天更换一次分化培养基，培养至第10天可获得进行地塞米松处理的肝脏类器官。在光学显微镜下的形态结构如图2所示，呈立体的、具有致密结构的状态，地塞米松可进一步诱导细胞形态转变，使细胞形态接近于肝细胞。将培养得到类器官进行石蜡包埋后切片，对切片进行HE染色的结果如图3所示，类器官具有致密结构，细胞形态接近于肝实质细胞，说明地塞米松对肝脏类器官的分化起到促进作用。
对比例1
本对比例没有分化培养过程，其他同实施例2。所获得的类器官结果如图4 所示，类器官呈圆形或椭圆形空泡，明显有别于分化后的形态。
对比例2
本对比例提供的原代培养基、增殖培养基、分化培养基全部为Advanced DMEM/F12，其他同实施例1。实验结果未成功获得肝脏类器官，培养4天后细胞死亡，说明细胞因子对于维持细胞干性非常关键。
对比例3
本对比例提供的分化培养基替换为与增殖培养基同样的组成，其他同实施例1。所获得的类器官结果如图5所示，类器官呈圆形或椭圆形空泡，明显有别于分化后的形态。
综上，本发明的分段培养建立肝脏类器官模型的方法一方面大大缩短了培养周期：从取材到模型的获得，时间周期约为14～20天，较比现有的肝脏类器官建立方法缩短了至少5天，并且通过本发明建立的肝脏类器官模型，可以对药物进行药效、药理和毒理学评价。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (6)

1.一种小鼠肝脏类器官模型的建立方法，其特征在于：包括以下步骤：取小鼠肝脏组织，依次进行清洗、剪切、消化及过滤处理，获得小鼠肝脏干细胞；将小鼠肝脏干细胞依次进行原代培养、增殖培养和分化培养；
所述原代培养包括：将过滤处理获得的小鼠肝脏干细胞加入Advanced DMEM/F12培养基重悬，然后加入Matrigel胶混合均匀，待混合胶体凝固后加入原代提取培养基，于37℃、5％CO2浓度下培养5～10天，期间每间隔3～4天更换一次培养基；所述原代提取培养基的组成为：Advanced DMEM/F12培养基、不含Vit-A的B27、N2、EGF、Gastrin、HGF、N-acetylcysteine、R-spondin 1、FGF10、Nicotinamide、Noggin、Wnt3a、Y-27632、Glutamax、青霉素链霉素混合液、HEPES；
所述增殖培养采用的增殖培养基的组成为：Advanced DMEM/F12培养基、不含Vit-A的B27、N2、EGF、Gastrin、HGF、N-acetylcysteine、R-spondin 1、FGF10、Nicotinamide、BMP7、Glutamax、青霉素链霉素混合液、HEPES；
所述分化培养包括：在经增殖培养的细胞混合液中去除增殖培养基，加入分化培养基或者分化培养基和地塞米松，于37℃、5％CO2浓度下培养7～10天；所述分化培养基的组成为：Advanced DMEM/F12培养基、不含Vit-A的B27、N2、EGF、Gastrin、N-acetylcysteine、A-8301、FGF19、DAPT、BMP7、Dexamethasone、Glutamax、青霉素链霉素混合液、HEPES。
2.根据权利要求1所述的一种小鼠肝脏类器官模型的建立方法，其特征在于：所述消化处理包括：①将剪切好的组织分散在生理盐水中，离心去上清后往沉淀中加入胶原酶、分散酶与DNaseI，于37℃震荡消化30min，加入含1％双抗的生理盐水终止消化，静置，收集细胞沉淀；②继续往细胞沉淀内加入胶原酶、分散酶与DNaseI，于37℃震荡消化30min，加入含1％双抗的生理盐水终止消化，静置沉淀，分别收集上清和细胞沉淀；③继续往细胞沉淀内加入胶原酶、分散酶与DNaseI，于37℃震荡消化30min，加入含1％双抗的生理盐水终止消化，静置沉淀，收集上清并与步骤②的上清合并。
3.根据权利要求1所述的一种小鼠肝脏类器官模型的建立方法，其特征在于：所述原代提取培养基各成分的含量为：不含Vit-A的B27，1-2×；N2，0.5-2×；EGF，10-15ng/ml；Gastrin，10-15nM；HGF，50-60ng/ml；N-acetylcysteine，1-2mM；R-spondin 1，100-120ng/ml；FGF10，100-110ng/ml；Nicotinamide，10-20mM；Noggin，195-205ng/ml；Wnt3a，250-260ng/ml；Y-27632，10-20μM；Glutamax，1-2×；青霉素链霉素混合液，1-2×；HEPES，1-2mM。
4.根据权利要求1所述的一种小鼠肝脏类器官模型的建立方法，其特征在于：所述增殖培养包括：在经原代培养的细胞混合液中加入胰酶，于37℃消化3min，转移至预冷的Advanced DMEM/F12中，离心弃上清，收集细胞沉淀制成胶滴，待其凝固后加入增殖培养基，于37℃、5％CO2浓度下培养2～4天。
5.根据权利要求4所述的一种小鼠肝脏类器官模型的建立方法，其特征在于：所述增殖培养基各成分的含量为：不含Vit-A的B27，1-1.5×；N2，1-2×；EGF，10-15ng/ml；Gastrin，10-15nM；HGF，50-55ng/ml；N-acetylcysteine，1-1.5mM；R-spondin 1，100-105ng/ml；FGF10，100-110ng/ml；Nicotinamide，10-15mM；BMP7，100-110ng/ml；Glutamax，1-2×；青霉素链霉素混合液，1-2×；HEPES，1-2mM。
6.根据权利要求1所述的一种小鼠肝脏类器官模型的建立方法，其特征在于：所述分化培养基各成分的含量为：不含Vit-A的B27，1-2×；N2，1-2×；EGF，10-15ng/ml；Gastrin，10-15nM；N-acetylcysteine，1-2mM；A-8301，10-1100nM；FGF19，100-110ng/ml；DAPT，10-20uM；BMP7，100-110ng/ml；Dexamethasone，1000-1100nM；Glutamax，1-2×；青霉素链霉素混合液，1-2×；HEPES，1-2mM。
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