CN105473706A - 肾祖细胞 - Google Patents

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Abstract

提供了一种用于同时生产肾单位祖细胞和输尿管上皮祖细胞的方法，其包括使间介中胚层细胞与以下物质接触的步骤：成纤维细胞生长因子9和/或成纤维细胞生长因子20，和任选的选自以下的一种或多种：骨形态形成蛋白7；肝素；Wnt激动剂；视黄酸；和RA拮抗剂。可以操作Wnt激动剂、视黄酸和/或RA拮抗剂的浓度，以有利于肾单位祖细胞和输尿管上皮祖细胞的相对生产。所述间介中胚层细胞最终经由后原条阶段从人多能干细胞衍生出。所述肾单位祖细胞和输尿管上皮祖细胞可能具有最终用途诸如用于肾修复和再生、肾的生物打印和筛查化合物的肾毒性。

Description

肾祖细胞
技术领域
本发明涉及肾发育。更具体地，本发明涉及从人多能干细胞生产肾单位祖细胞和最终生产输尿管祖细胞的体外方法。
背景技术
由于全球晚期肾病的患病率上升至8％1，迫切需要肾再生策略。肾是通过输尿管芽(UB)的形成以及该芽与邻近的IM-衍生的后肾间充质(MM)之间的相互作用而从间介中胚层(IM)分化出的中胚层器官2。肾单位源自从MM衍生出的肾单位祖细胞群3。IM本身从后原条衍生出4。尽管肾的发育起源被较好地理解2，然而人肾中的肾单位形成在出生之前完成5。因此，不存在能够替代丧失的肾单位的出生后干细胞。
人多能干细胞对于基于细胞的肾脏疾病治疗的产生而言具有巨大潜力。但是，关于如何生产所述必需细胞类型(其产生肾单位和肾的其它结构)的理解的缺乏，已经阻碍作为临床用细胞的来源和作为诸如肾脏疾病的治疗剂的人多能干细胞的实现。
发明内容
本发明的发明人已经使用正常胚胎发生过程中所用的生长因子在完全化学成分确定的单层培养条件下成功地指导人多能干细胞穿过后原条和间介中胚层(IM)的分化。该分化方案导致输尿管芽(UB)和后肾间充质(MM)的同步诱导，所述后肾间充质(MM)在体外形成自组织结构，包括肾单位形成。这样的hESC-衍生的组分表现出广阔的离体肾潜力，从而证实基于多能干细胞的肾再生的潜力。
因此，本发明的一个方面提供了一种生产肾单位祖细胞和输尿管上皮祖细胞的方法，所述方法包括以下步骤：使间介中胚层(IM)细胞与以下物质接触：成纤维细胞生长因子9(FGF9)和/或成纤维细胞生长因子20(FGF20)；和任选的一种或多种选自以下的试剂：骨形态形成蛋白7(BMP7)；肝素；Wnt激动剂；视黄酸(RA)、类似物或激动剂；和RA拮抗剂；以由此从所述IM细胞生产肾单位祖细胞和输尿管上皮祖细胞。
在一个实施方案中，所述IM细胞是从后原条细胞衍生出或分化出。
在一个实施方案中，所述后原条细胞是从人多能干细胞(hPSC)衍生出或分化出。hPSC的非限制性例子包括人胚胎干细胞(hESC)和诱导的人多能干细胞(iPSC)。
在一种优选形式中，该方面提供了一种方法，其包括以下相继步骤：
(i)使hPSC与促进hPSC分化成后原条细胞的一种或多种试剂接触；
(ii)使所述后原条细胞与促进后原条细胞分化成IM细胞的一种或多种试剂接触；和
(iii)使IM细胞与FGF9接触，所述FGF9是单独的或与以下一种或多种组合：BMP7；RA；RA拮抗剂；Wnt激动剂；和/或FGF20；和肝素；以由此从所述IM细胞生产肾单位祖细胞和输尿管上皮祖细胞。
在步骤(ii)处的一种或多种试剂优选地包括FGF9。在一个特定实施方案中，FGF9存在于步骤(ii)和(iii)的至少一部分或完全贯穿其中。在一个特别优选的实施方案中，Wnt激动剂诸如CHIR99021存在于步骤(i)中。
在一个实施方案中，所述方法进一步包括鉴别存活的肾单位祖细胞和/或输尿管上皮祖细胞的步骤。
在某些实施方案中，鉴别存活的肾单位祖细胞和/或输尿管上皮祖细胞包括，测量或检测作为存活的肾单位和/或输尿管上皮祖细胞的标志物的多种核酸和/或蛋白的共表达。
在另一个方面，本发明提供了根据前述方面的方法生产的分离的、富集的或纯化的肾单位和/或输尿管上皮祖细胞。
在另一个方面，本发明提供了一种生产肾或肾细胞或组织的方法，所述方法包括以下步骤：从前述方面的肾单位祖细胞和/或输尿管上皮祖细胞分化出肾或肾细胞或组织，以由此生产所述肾或肾细胞或组织。
在某些实施方案中，所述肾单位祖细胞和/或输尿管上皮祖细胞可以用作生物打印或生物工程改造全肾和肾组织的来源，所述全肾和肾组织用于肾移植或治疗慢性肾脏疾病。
在其它实施方案中，所述肾单位祖细胞和/或输尿管上皮祖细胞可以用于整个器官去细胞化的肾的重新细胞化，以由此建立重构的或替代性的肾。
在其它实施方案中，所述肾单位祖细胞和/或输尿管上皮祖细胞可以用作肾疾病和病况的细胞疗法的来源。
在另一个方面，本发明提供了一种确定一种或多种化合物的肾毒性的方法，所述方法包括以下步骤：使所述一种或多种化合物与前述方面的分离的或纯化的肾单位祖细胞和/或输尿管上皮祖细胞或从其分化出或以其它方式得到的肾细胞或组织接触，以由此确定所述一种或多种化合物是否是肾毒性的。
在一个实施方案中，该方面提供了将肾单位祖细胞和/或输尿管上皮祖细胞生物打印成用于肾毒性筛查的肾类器官。
附图说明
图1.后原条和间介中胚层从人胚胎干细胞的连续分化.a,从内细胞团至肾谱系的发育阶段的示意图。在每个阶段中显示的基因代表该阶段的特异性标志物。b,FACS分析(GFP和前向散射(FSC))显示了在3天培养以后用不同比例的BMP4/激活素A(ng/mL)或8μMCHIR99021诱导的MIXL1-GFP阳性的后原条细胞的百分比。hESC，开始细胞；无GF，用基础培养基培养3天。c,d,对于通过qRT-PCR分析评估的BMP4和激活素A(ng/mL)的每种比例，SOX17、BRACHYURY(T)和MIXL1在第3天时的相对表达(c)。不同浓度的CHIR99021的相同qRT-PCR分析(d)。误差棒是标准差(n＝3个实验)。e,从hESC至IM使用的分化方案的示意图。f,在第6天时的RT-PCR，显示了从第2天至第6天在有或没有200ng/mlFGF9存在下IM的标志物(PAX2、LHX1、OSR1)的表达。g,从第2天至第6天在有或没有200ng/mlFGF9存在下在第6天时PAX2蛋白阳性的细胞的百分比的定量。经由BMP4/激活素A(B/A)和CHIR99021(CHIR)的两个分化方案超过了80％诱导效率。误差棒是标准差(n＝5个场，共来自3个实验)。h，使用BMP4/激活素A(B/A)或CHIR99021(CHIR)经由后原条诱导在第6天时PAX2(红色)和LHX1(绿色)蛋白的存在和共表达(比例尺＝100μm)。i，qRT-PCR显示了从第2天至第6天整个FGF9的浓度梯度在第6天时IM(PAX2、LHX1)、PM(TBX6)和LPM(FOXF1)的标志物的表达。误差棒是标准差(n＝3个实验)。j,qRT-PCR显示了从第2天至第6天在有FGF9以及NOG或BMP4存在下在第6天时中胚层标志物的表达变化。误差棒是标准差(n＝3个实验)。k,在第6天时的IF，显示了用PAX2(红色)标记的主要IM群体和用TBX6(绿色)标记的不重叠的PM(比例尺＝100μm)。
图2.后原条诱导.a,用BMP4/激活素A(30/10ng/ml)诱导以后多能标志物OCT4和NANOG的时程定量RT-PCR，显示了多能基因表达随时间的减小。误差棒是标准差(n＝3个实验)。b,在使用CHIR99021进行后原条诱导之前(hESC)和之后(第2天)，ES细胞标志物NANOG和ECAD的IF(比例尺＝100μm)。c,在使用CHIR99021进行后原条诱导之后(第2天)，后原条的标志物T和MIXL1(GFP)的IF。将MIXL1检测为由MIXL1内源性启动子驱动的GFP表达(比例尺＝100μm)。d,如果用3种不同比例的BMP4和激活素A(ng/mL)，在培养以后随时间诱导的自发OSR1表达的水平。用3种不同比例的BMP4和激活素A3天，hESC形成胚状体，然后在无生长因子条件下自发地分化至第14天。这证实了在用高BMP4和低激活素A(30/10)诱导的细胞中改善的OSR1表达。OSR1标记了IM和LPM。
图3.FGF信号传递对IM蛋白的诱导的影响.a,在有或没有FGF信号传递抑制剂PD173074存在下从第2天至第6天用BMP4/激活素A(至第2天)和FGF2(200ng/ml)、FGF8(200ng/ml)、FGF9(200ng/ml)或无生长因子(无GF)处理第6天时hESC培养物上的PAX2蛋白的IF(比例尺＝200μm)。b,在与IF(a)相同的方案的第6天，检查PAX2、LHX1和OSR1的相对表达水平的定量RT-PCR。带阴影的柱显示了FGF抑制剂PD173074的添加的影响。误差棒是标准差(n＝3个实验)。c,在用BMP4/激活素A(+FGF9(B/A))或8μMCHIR99021(+FGF9(CHIR))处理至第2天、随后从第2天至第6天用200ng/mLFGF9或无生长因子(无GF)处理的第6天时hESC培养物上的IM标志物PAX2以及LPM和IM二者的标志物OSR1的IF。仅第二抗体对照用作阴性对照(仅2°Ab)(比例尺＝100μm)。d,该表显示了在用8μMCHIR99021处理至2天、随后从第2天至第6天用200ng/mLFGF9处理的第6天完全PAX2-和PAX2+细胞(全部)或与LHX1-和LHX1+细胞一起在hESC培养物上的百分比。误差是标准差(n＝5个场，共来自3个实验)。
图4.BMP信号传递对早期中胚层的外侧-内侧模式形成的影响。a,从第2天至第6天用或不用BMP4(5或50ng/mL)或BMP拮抗剂NOG(25或250ng/mL)在有200ng/mLFGF9存在下在第6天时DAPI(蓝色)和PAX2(红色)的IF(比例尺＝200μm)。b,研究该BMP/NOG梯度在第6天时对PM(PARAXIS和TBX6)和LPM(FOXF1和OSR1)标志物的表达的影响的qRT-PCR。误差棒是标准差(n＝3个实验)。
图5.说明在早期肾发育阶段中不同祖细胞群和衍生细胞群体的预期基因表达的示意图。PS，原条；IM，间介中胚层；MM，后肾间充质；NP，肾单位祖细胞/肾发生间充质；RV，肾囊泡；DT，远曲小管；PT，近曲小管；Pod，足细胞；ND，输尿管；UB，输尿管芽/输尿管上皮；CD，集尿管；MET，间质至上皮转变。所有基因用斜体指示。带阴影的框指示邻近的经标记的基因的表达的时机和持续时间。在每个细胞类型旁边指示具体基因标记DT、PT和Pod。已知发生在UB和NP之间的分化的相互诱导，被来自UB的FGF9(肾发生间充质存活)和Wnt9b(MET)，和来自NP的GDNF(输尿管分支)的表达支持。
图6.来自体外hES细胞的输尿管祖细胞和后肾祖细胞的逐步时间诱导。a,用于诱导肾发育的最初的hESC指导的分化方案(BMP4:激活素A/FGF9/FGF9:BMP7:RA)的示意图。在线下面的数字指示分化的天数。b,基因从第0天至第17天的时程RT-PCR，代表了分化成肾的每个阶段。这些包括后原条(MIXL1、LHX1)、IM(LHX1、PAX2、OSR1)、MM(OSR1、SIX2、WT1.GDNF、HOXD11)和UE(PAX2、CRET、HOXB7)的基因。包括PAX6以确保不存在外胚层定型的证据。NC，没有DNA模板的阴性对照。c,从第6天至第17天的时程IF，显示了PAX2(红色)和ECAD(绿色)双阳性的上皮结构(上图)和包围这些上皮结构的WT1(红色)阳性群体(下图)的形成(比例尺＝200μm)。d,在定向分化时程中存在于hESC培养物内的WT1+或SIX2+细胞的比例的定量。这些蛋白的共表达标记了MM/肾单位祖细胞(NP)群体，而WT1蛋白也在随后分化的肾单位中表达。误差棒是标准差(n＝3个实验)。e,分化的第14天揭示了MM(ECAD-SIX2+)在ECAD+UE周围的存在(比例尺＝200μm)。f,用于诱导肾发育的替代性的hESC定向分化方案(CHIR99021/FGF9)的示意图。在线下面的数字指示分化的天数。g,经由使用CHIR99021/FGF9的分化从第0天至第18天的时程RT-PCR，代表了在(b)中指示的分化成肾的每个阶段。h,关于在(c)中指定的蛋白，经由使用CHIR99021/FGF9的分化从第0天至第18天的时程IF(比例尺＝200μm)。i,使用CHIR99021/FGF9分化以后在(d)中描述的定量。误差棒是标准差(n＝5个场，共来自3个实验)。j,在第14天包围ECAD+UE结构的SIX2+浓缩的间充质细胞的存在(比例尺＝100μm)。k,在第17天时的IF显微术，显示了在第17天时邻近PAX2+GATA3-MM的区域的PAX2+GATA3+UE(比例尺＝50μm)。
图7.RA对输尿管上皮形成的积极作用。a,在分化的第12天时的EdU掺入测定。30min的EdU暴露揭示，不仅PAX2+前上皮结构、而且PAX2阴性细胞正在增殖中。白色箭头指示PAX2+细胞中的EdU掺入(比例尺＝100μm)。b,在使用BMP4/激活素A的后原条诱导以后第6天时的IM细胞，其用FGF9与不同的RA浓度一起培养11天。UE标志物PAX2+ECAD+的IF表明，以RA剂量依赖性的方式诱导UE结构(比例尺＝200μm)。c,使用BMP4:激活素A/FGF9/FGF9:BMP7:RA方案在分化的第22天时的RT-PCR揭示了指示分化成成熟肾细胞类型的基因的表达，所述基因包括SYNPO、NPHS1和WT1(对于足细胞)；AQP2和SCNNB1(对于远端小管或集尿管)，以及AQP1和SLC3A1(对于近端小管)。NC，没有DNA模板的阴性对照。g,使用BMP4/激活素A的第22天分化的IF，显示了两种关键足细胞标志物的共表达：裂孔隔膜蛋白SYNPO(绿色)和细胞核WT1(红色)。细胞核也被DAPI(蓝色)染色(比例尺＝50μm)。
图8.CHIR99021/FGF9指导的分化以后肾潜力的评估和hESC的肾单位诱导的证据。a,使用CHIR99021/FGF9至第6天的最初诱导、随后用FGF9(与不同的RA浓度一起或不用生长因子(无GF))的另外5天以后，在分化的第12天时hESC-衍生的细胞。PAX2和ECAD蛋白的IF表明，以RA剂量依赖性的方式诱导UE结构(比例尺＝200μm)。b,主要肾标志物(SIX2、HOXD11、HOXB7、FOXD1)、多能标志物(OCT4)和生殖腺/肾上腺皮质标志物(SOX9、SF1、GATA6)的qRT-PCR。将使用BMP4/激活素A(B/A)或CHIR99021(CHIR)方案在分化的第18天时的基因表达水平相对于GAPDH归一化，然后与未分化的hESC中的水平对比。使用人胎儿肾RNA作为阳性对照。误差棒是标准差(n＝3个实验)。c,IF表明，在诱导的第12天，一些WT1+MM细胞(红色)也是HOXD11+(绿色)。HOXD11是后肾区域的一种特异性标志物，所述后肾区域包括MM和肾间质(HOXD11+WT1-)(比例尺＝200μm)。d,使用WT1(红色)的相位差和IF，分化(CHIR99021/FGF9)的第18天以后培养物的低放大率视野。WT1+间充质的簇包围UE，正如在胚胎肾中可见到的(比例尺＝200μm)。e,WT1+和SIX2+间充质(红色)在第18天紧密地包围ECAD+UE(绿色)(比例尺＝50μm)。f,在第18天的IF共焦显微术显示PAX2+ECAD+UE被早期肾单位/RV包围，正如通过JAG1和CDH6的存在所评估的。被虚线包围的区域是PAX2+GATA3+ECAD+UE结构。用方括号指示的区域放大在右侧邻近图中(比例尺＝25μm)(放大的比例尺＝10μm)。
图9.H9hES细胞系和iPS细胞系朝向肾谱系的分化。
a,b,在H9hESC(a)和CRL2429C11iPS细胞(b)上的DAPI(蓝色)、PAX2(红色)或SIX2(红色)在分化的第6天和第14天的免疫荧光(比例尺＝200μm)。
图10.hESC-衍生的肾祖细胞向小鼠肾细胞的重新聚集体中的掺入。a,肾潜力的重新聚集测定的示意图。将胚胎第12.5-13.5天小鼠肾解离成单个细胞，并与第12-13天的hESC-衍生的诱导肾细胞组合，沉淀在过滤膜上，并在空气-培养基界面处培养4天。hESC-衍生的细胞与小鼠肾细胞的比例是4-96。b,使用组成性地表达GFP的未分化hESC(ENVY细胞系)作为阴性对照的重新聚集测定，显示了未分化的hESC-衍生的大囊腔(cyst)形成(绿色)(比例尺＝200μm)。c,分化第13天，hESC-衍生的小鼠E12.5-13.5肾细胞的重新聚集测定。通过人线粒体抗体(HuMt)或人细胞核抗体(HuNu)(绿色)，检测所有掺入的hES细胞-衍生的细胞。白色箭头指示在小鼠肾结构中掺入的人细胞。PAX2+和CALB+小管代表UE。CDH6+和JAG1+结构代表肾囊泡。SIX2+和WT1+非上皮细胞代表MM/NP。所有图像显示了使用CHIR99021/FGF9方案分化的hESC的掺入，但是不包括向CALB+UE和SIX2+MM中的掺入，在该情况下，使用BMP4:激活素A/FGF9/FGF9:BMP7:RA方案分化hESC(比例尺＝50μm)。
图11.3D培养环境对自组构事件的影响。a,重新铺板(replating)测定的示意图。将在第6天的IM细胞收获，并以高密度或低密度重新铺板。然后，将细胞培养12天(6天用200ng/mLFGF9，然后另外6天不用生长因子)。以高密度铺板的细胞形成均匀的细胞层，而以低密度铺板的细胞形成隆起的集落(domedcolony)。b,将在第6天时诱导的IM细胞重新铺板以在第18天形成单层或隆起的集落。将细胞用ECAD(对于UE)和WT1(对于MM)染色。在隆起的集落内看到更高级的结构，可能是由于相互诱导的细胞群体的接近(比例尺＝100μm)。
图12.分化的hESC的3D培养以后自组构的证据。a,用于3D培养的方法的示意图。将分化(CHIR99021/FGF9)的第18天以后的hESC-衍生的细胞收获并解离成单个细胞，沉淀，然后用10％FCS/DMEM在过滤膜上在空气-培养基界面处培养。4天培养以后，将沉淀物石蜡包埋并切片(比例尺＝200μm)。b,3D培养的沉淀物的石蜡包埋切片的IF显示多种关键蛋白的表达(hESC-衍生的细胞)。ECAD(绿色)说明了上皮的存在。PAX2+上皮代表UE，而PAX2+非上皮指示MM及其衍生物。AQP2与ECAD的共表达代表UE的衍生物(集尿管)的形成。这里显示的WT1染色标记了MM/NP。MM/NP的上皮衍生物包括肾囊泡(被JAG1标记)和近端小管(被AQP1和SLC3A1标记)。作为对照，将小鼠胚胎第13.5天肾细胞解离，并沉淀，然后在分析之前以与hESC-衍生的细胞相同的方式培养(E13.5mEK细胞)(比例尺＝25μm)。
图13.证明了微生物反应器可以用于向肾单位祖细胞和/或输尿管上皮分化所需的精确生长因子浓度的阶乘优化。该微生物反应器包括27行的10孔，对每行进行3种不同生长因子(FGF9、BMP7和视黄酸)的独特组合。读出是E-钙粘着蛋白(蓝色,上皮)、GATA3(绿色,输尿管上皮)和WT1(红色,形成肾单位的间充质)的免疫荧光。
图14.阶段1分化的优化，如通过后续诱导阶段结束以后这些培养物的最终分化所评估的。在阶段1中增加CHIR99021会增加E-钙粘着蛋白阳性的(绿色)输尿管上皮的量，在6μMCHIR99021时具有上皮与肾单位祖细胞(用针对WT1的抗体标记为红色)的最佳比例。呈现的培养物已经培养至第18天。
图15.简图描绘了从多能性至后原条的阶段1分化的优化的结论。该结论是，最初的CHIR99021诱导的浓度和持续时间可能随各个开始细胞而变化，并且这需要针对最佳的肾分化进行优化。
图16.简图描绘了其它优化步骤的目的和包括RA信号传递的拮抗剂以确保适当尾部后肾间充质群体的产生的原理。简言之，在发育胚胎中存在RA信号传递的梯度，使得活性在头端处最高，而在尾部尾芽内RA的降解所用的酶的产生会减小在胚胎的该端处的RA信号传递。恒肾(后肾)产生在后肢的水平，并因此可能是在相对较低的RA活性地带中，而引起输尿管芽的上皮更早地产生，并因此产生在相对更高RA活性的地带。
图17.通过分化的阶段2和3的变异对肾单位祖细胞诱导的优化的简图表示。这包括包含视黄酸受体活性的拮抗剂AGN193109(以1μM或5μM添加)以及低水平的CHIR99021(1μM)。
图18.定量PCR结果显示了从分化的第4天添加CHIR99021和/或AGN193109对后肾间质标志物Hoxd11和Six2的表达的影响，如在分化的第12天或第18天所评估的。
图19.定量PCR结果显示了从分化的第4天添加CHIR99021和/或AGN193109对其它帽间充质/肾单位祖细胞标志物(Six1、Six2、Eya1、WT1)的表达的影响，如在分化的第18天所评估的。
图20.人iPSC细胞系C11向含有肾单位祖细胞和输尿管上皮的肾类器官的定向分化。与hESC系HES3的分化所用的方案对比，以图形的方式显示了分化所用的方案。这包括CHIR99021的另外2天。图像显示了培养的第20天以后得到的类器官。WT1+间充质(红色)包围分支输尿管上皮(绿色)。
图21.人iPSC细胞系C32向含有肾单位祖细胞和输尿管上皮的肾类器官的定向分化。图像显示了培养的第18天以后得到的类器官。WT1+间充质(红色)包围分支输尿管上皮(绿色)。
具体实施方式
本发明至少部分地基于特定体外培养条件的鉴别，所述体外培养条件被定制以促进肾单位祖细胞和输尿管上皮祖细胞从间介中胚层(IM)的同步的、同时的分化。更具体地，FGF9+肝素单独的或与一种或多种试剂的组合能够促进间介中胚层分化成肾单位祖细胞和输尿管上皮祖细胞，所述试剂包括骨形态形成蛋白7(BMP7)、视黄酸(RA)、RA拮抗剂；Wnt激动剂；和/或FGF20+肝素。更进一步，所述体外培养方法提供了用于将人胚胎干细胞分化经过后原条、IM和后肾间质阶段以产生肾单位祖细胞和输尿管上皮祖细胞的系统。有利地，可以操纵某些分子诸如RA、RA拮抗剂和/或Wnt激动剂的存在或不存在，以相对于输尿管上皮祖细胞优先促进肾单位祖细胞的产生，或反之亦然。
将肾单位祖细胞和输尿管上皮祖细胞同时诱导，指导在体内的相互分化，且能够发育成不同的管状上皮结构，包括输尿管树和肾单位祖细胞间充质，在该过程中，所述上皮结构替代输尿管尖部以维持肾单位祖细胞。因此提出，可以指导根据本发明生产的hESC-衍生的输尿管上皮和/或肾单位祖细胞以从输尿管隔室和间质隔室分化成肾细胞。此外，因此可以开发这些细胞的‘自组构’能力以促进肾修复，诸如通过肾生物工程。如上所述“自组构的”肾单位祖细胞、从其衍生出的肾单位或肾类器官也可以适合于肾毒性试验，所述试验已经被以前不能生产适合于试验的细胞所阻碍。
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的相同含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料都可以用于实践或检验本发明，仍描述了优选的方法和材料。
如本文中使用的，除了上下文另外要求以外，术语“包含”和该术语的变体诸如“包括”和“含有”无意排除其它添加剂、组分、整数或步骤。
应当理解，不定冠词“一个(a)”和“一种(an)”不应读作单独的不定冠词或以其它方式读作排除超过一种或超过一个所述不定冠词所指的单独对象。例如，“一个”细胞包括一个细胞、一个或多个细胞和多个细胞。
为了本发明的目的，“分离的”是指这样的物质：其已经从它的天然状态取出，或已经以其它方式进行人工操作。分离的物质(例如，细胞)可以实质上或基本上不含在它的天然状态通常伴随它的组分，或可以经过操作从而与在它的天然状态通常伴随它的组分一起处于人造状态。
“富集的”或“纯化的”是指，与在富集或纯化之前的先前状态相比，在特定状态(例如富集的或纯化的状态)具有更高的发生率、表现或频率。
术语“分化(differentiate)”、“分化(differentiating)”和“分化的(differentiated)”是指细胞从发育途径的较早或最初阶段进展至发育途径的较晚或更成熟的阶段。应当理解，在该背景下，“分化的”不意味着或暗示所述细胞完全分化和已经丧失多能性或沿着所述发育途径或沿着其它发育途径进一步前进的能力。分化可以伴有细胞分裂。
“祖细胞”是这样的细胞：其能够沿着一个或多个发育途径分化，具有或没有自我更新。通常，祖细胞是偏能的或寡能的，且能够至少有限的自我更新。
如本领域中将充分理解的，细胞的分化的阶段或状态可以特征在于多个标志物中的一个的表达和/或不表达。在该背景下，“标志物”是指这样的核酸或蛋白：其由细胞、细胞群体、谱系、隔室或子集的基因组编码，其表达或表达模式在发育过程中变化。通过本领域已知的任何技术，可以检测或测量核酸标志物表达，所述技术包括核酸序列扩增(例如聚合酶链式反应)和核酸杂交(例如微阵列、RNA印迹杂交、原位杂交)，尽管不限于此。通过本领域已知的任何技术，可以检测或测量蛋白标志物表达，所述技术包括流式细胞计量术、免疫组织化学、免疫印迹法、蛋白阵列、蛋白图谱绘制(例如2D凝胶电泳)，尽管不限于此。
本发明的一个方面提供了一种生产肾单位祖细胞和输尿管上皮祖细胞的方法，所述方法包括以下步骤：使间介中胚层(IM)细胞与以下物质接触：BMP7；视黄酸(RA)；RA拮抗剂；Wnt激动剂；成纤维细胞生长因子9(FGF9)和/或FGF20；和肝素；以由此从所述IM细胞生产肾单位祖细胞和输尿管上皮祖细胞。
本文中提及的“视黄酸”或“RA”包括视黄酸的所有形式(例如包括所有反式RA和9-顺式RA)、具有与RA类似的生物活性的类似物和/或视黄酸受体(RAR)激动剂。各种不同的RA类似物和RAR激动剂(包括对RARα、β或γ非选择性的和选择性的激动剂)是商购可得的，诸如得自R&DSystems和TocrisBioscience。
具体提及的“RA拮抗剂”包括视黄酸受体(RAR)拮抗剂和通过RAR抑制、阻断或阻止RA信号传递的任意其它分子。RAR拮抗剂的非限制性例子包括AGN193109、LE135、ER50891、BMS493、BMS453和MM11253，尽管不限于此。该定义不排除以下可能性：所述RA拮抗剂也或可替换地模仿经由RAR对信号传递的阻断以免于结合另一种配体。
本文中使用的“Wnt激动剂”是这样的分子：其在经典Wnt信号传递途径的背景下抑制GSK3(例如GSK3-β)，但是在其它非经典Wnt信号传递途径的背景下优选地不抑制。Wnt激动剂的非限制性例子包括CHIR99021、LiClSB-216763、CAS853220-52-7和可商购得自诸如SantaCruzBiotechnology和R&DSystems等来源的其它Wnt激动剂。该定义不应当解读作绝对排除以下可能性：Wnt激动剂模仿GSK3β活性的一种或多种其它抑制剂。
还应当理解，成纤维细胞生长因子诸如FGF9和FGF20可以是可互换的，尽管FGF9是优选的。通常包括肝素来促进或增强成纤维细胞生长因子诸如FGF2、FGF9和/或FGF20的生物活性。
将在下文中更详细地描述以下每一种的优选浓度：FGF9、BMP7、视黄酸(RA)；RA拮抗剂；Wnt激动剂；FGF20和肝素。还将提及控制或操作某些分子诸如RA激动剂或类似物、RA拮抗剂和/或Wnt激动剂的存在或不存在，以相对于输尿管上皮祖细胞优先促进肾单位祖细胞的产生，或反之亦然。
本文中使用的“肾单位祖细胞”是从后肾间充质衍生出的祖细胞，其可以通过最初的间充质至上皮转变而分化成所有肾单位区段(除了集尿管以外)，包括肾单位上皮诸如连接段、远曲小管(DCT)细胞、远端直小管(DST)细胞、近端直小管(PST)区段1和2、PST细胞、足细胞、肾小球内皮细胞、Henle的上升环和/或Henle的下降环，尽管不限于此。肾单位祖细胞还能够自我更新。
后肾间充质特有的或代表性的标志物的非限制性例子包括WT1、SIX1、SIX2、SALL1、GDNF和/或HOXD11，尽管不限于此。肾单位祖细胞特有的或代表性的标志物的非限制性例子包括WT1、SIX1、SIX2、CITED1、PAX2、GDNF、SALL1、OSR1和HOXD11，尽管不限于此。
“输尿管上皮祖细胞”是指从中肾管或它的衍生物输尿管芽衍生出、可得到或起源的上皮祖细胞，其可以发育成肾组织和/或结构诸如集尿管。
输尿管上皮祖细胞的特征性或代表性标志物的非限制性例子包括HOXB7、cRET、GATA3、CALB1、E-钙粘着蛋白和PAX2，尽管不限于此。
如在上文中所述，在有单独的FGF9或与一种或多种试剂组合的FGF9存在下，从间介中胚层(IM)细胞分化出肾单位祖细胞和输尿管上皮祖细胞，所述一种或多种试剂包括BMP7、视黄酸(RA)、激动剂或类似物、RA拮抗剂诸如AGN193109和/或FGF20，且优选肝素。
“间介中胚层(IM)”细胞是指这样的胚胎中胚层细胞：其从后原条产生，且可以最终发育成泌尿生殖系统，包括输尿管和肾以及其它组织诸如生殖腺。间介中胚层特有的或代表性的标志物的非限制性例子包括PAX2、OSR1和/或LHX1。
还应当理解，IM细胞的生产不意味着暗示，IM细胞是没有其它细胞类型存在的纯的或均一的IM细胞群体。因此，提及的“IM细胞”或“IM细胞群体”是指，所述细胞或细胞群体包含IM细胞。
适当地，通过使后原条细胞与如将在下文中更详细地描述的促进后原条细胞分化成IM细胞的一种或多种试剂接触，生产根据本发明的IM细胞。
优选地，通过使后原条细胞与促进后原条细胞分化成IM细胞的一种或多种试剂接触，生产IM细胞。
通常，所述一种或多种试剂包括成纤维细胞生长因子9(FGF9)，和任选的RA拮抗剂诸如AGN193109和/或一种或多种其它FGF诸如FGF2和/或FGF20。
“后原条(PPS)”细胞是指这样的细胞：其可得自或在功能上和/或表型上对应于在哺乳动物胚胎发育的早期阶段在囊胚中形成的原条结构的后端的细胞。所述后原条会建立两侧对称性、决定原肠胚形成的位点和开始胚层形成。通常，后原条是中胚层(即假定中胚层)的祖细胞，且前原条是内胚层(即假定内胚层)的祖细胞。后原条特有的或代表性的标志物的非限制性例子包括Brachyury(T)。前原条特有的或代表性的标志物的一个非限制性例子是SOX17。后原条和前原条二者都可以表达MIXL1。
还应当理解，后原条细胞的生产不意味着暗示，所述后原条细胞是没有其它细胞类型存在的纯的或均一的后原条细胞群体。因此，提及的“后原条细胞”或“后原条细胞群体”是指，所述细胞或细胞群体包含后原条细胞。
适当地，根据本发明，通过使hPSC细胞与如将在下文中更详细地描述的促进hPSC细胞分化成后原条细胞的一种或多种试剂接触，生产后原条细胞。
通常，所述一种或多种试剂包括骨形态形成蛋白4(BMP4)、激活素A和/或Wnt激动剂诸如CHIR99021。
术语“人多能干细胞”和“hPSC”表示展示出多能性的从人组织衍生出、可得到或起源的细胞。hPSC可以是人胚胎干细胞或人诱导的多能干细胞。
人多能干细胞可以衍生自内细胞团，或使用得自许多胎儿或成年体细胞类型的Yamanaka因子重新程序化。使用体细胞细胞核转移，可能制备hPSC。
术语“人胚胎干细胞”、“hES细胞”和“hESC”表示从人胚胎或胚泡衍生出、可得到或起源的细胞，其是自我更新的和多能的或全能的，具有产生存在于成熟动物中的所有细胞类型的能力。人胚胎干细胞(hESC)可以分离自例如从人体内预植入胚胎、体外受精的胚胎、或扩大至胚泡期的单细胞人胚胎得到的人胚泡。
术语“诱导的多能干细胞”和“iPSC”表示从任意类型的人成年体细胞可衍生出、可得到或起源的细胞，其通过外源基因(诸如转录因子，包括OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC的优选组合)的表达而重新程序化为多能状态。hiPSC表现出与hESC等同的多能性水平，但是可以从自体疗法的患者衍生出，在分化和细胞递送之前经过或不经过同时基因校正。
更一般而言，本文中公开的方法可以应用于从任何患者或hPSC衍生出的任何多能干细胞，随后使用基因编辑或使用基因编辑校正过的突变体hPSC进行修饰以产生突变体模型。基因编辑可以是借助于CRISPR、TALEN或ZF核酸酶技术。
从前述内容应当理解，本发明的一种优选的广阔形式会提供一种方法，其包括以下相继步骤：
(i)使hPSC与促进hPSC分化成后原条细胞的一种或多种试剂接触；
(ii)使后原条细胞与促进后原条细胞分化成间介中胚层细胞的一种或多种试剂接触；和
(iii)使间介中胚层细胞与FGF9和任选的以下一种或多种接触：BMP7；视黄酸；RA拮抗剂诸如AGN193109；Wnt激动剂诸如CHIR99021；FGF20；和肝素；以由此从间介中胚层细胞生产后肾间充质细胞和输尿管上皮祖细胞。
这些相继步骤将在下文中如下描述。
(i)使hPSC分化成后原条
如将从前述内容明白的，在没有血清存在的合适培养基(诸如APEL分化培养基(Ng等人,2008,Nat.Protoc.3:768)，尽管不限于此)中使hPSC与BMP4、激活素A和/或CHIR99021接触，以由此生产后原条细胞，其适当地包含后原条细胞。所述hPSC可以是hESC或iPSC。
适当地，BMP4是在约5-40ng/mL的浓度，且激活素A是在约3-40ng/mL的浓度。在一个实施方案中，所述BMP4的浓度是约20-35ng/mL，或更优选约30ng/mL。在一个实施方案中，所述激活素A的浓度是约5-30ng/mL，或更优选10ng/mL。适当地，最佳相对活性比率是在3:1至1:6的BMP4:激活素A的范围内。优选地，最佳相对活性比率是在3:1至1:1的BMP4:激活素A的范围内。
在某些实施方案中，Wnt激动剂诸如CHIR99021可以是在约0.5-50μM范围内的浓度，优选约4-30μM，更优选约5-20μM，或有利地是约8μM。在某些实施方案中，CHIR99021在没有BMP4和激活素A存在下单独存在。
可以将所述干细胞群体在含有BMP4、激活素A和/或Wnt激动剂(诸如CHIR99021)的培养基中培养36-120小时。
在某些非限制性的实施方案中，可以使细胞与BMP4、激活素A和/或CHIR99021接触比hESC所需的时间更长的时间。作为例子，可以使细胞诸如iPSC与BMP4、激活素A和/或CHIR99021接触多达96-120小时。
可以每24-48小时更换培养基。
尽管不希望受理论约束，如本文中公开的使hPSC与BMP4、激活素A和/或Wnt激动剂(诸如CHIR99021)接触会导致原条(PS)(包括后原条)的形成。这是朝向中胚层和内胚层组织的产生的一个最初步骤。通常，hPSC的分化是朝向混合的细胞群体，该群体包括表达后原条(即假定中胚层)特有的标志物的细胞和表达前原条(即假定内胚层)特有的标志物的细胞。
后原条(假定中胚层)特有的标志物的非限制性例子包括Brachyury(T)。
前原条(假定内胚层)特有的标志物的一个非限制性例子是SOX17。
(ii)使后原条细胞分化成间介中胚层(IM)
适当地，在没有血清存在的合适培养基(诸如APEL分化培养基)中使后原条细胞或包含后原条细胞的混合原条群体与一种或多种成纤维细胞生长因子(FGF)(至少包括FGF9和任选的FGF2和/或FGF20)和/或视黄酸(RA)拮抗剂接触。
通常，所述视黄酸信号传递拮抗剂是视黄酸受体(RAR)抑制剂或拮抗剂诸如AGN193109。
适当地，FGF2、FGF9和/或FGF20是在约100-400ng/mL的浓度。在一个优选的实施方案中，FGF2、FGF9和/或FGF20是在约150-300ng/ML的浓度，或有利地是约200ng/mL。在一个实施方案中，所述RA拮抗剂(例如AGN193109)的浓度是约0.1-10μM，或更优选地是0.5-5μM。
使所述细胞与FGF9(单独的，或与FGF2和/或FGF20一起)和/或RA拮抗剂(例如AGN193109)接触至少约96小时，但是不超过约190-200小时。优选地，使所述细胞与FGF9(单独的，或与FGF2和/或FGF20一起)和/或RA拮抗剂(例如AGN193109)接触约96小时。
可以每40-48小时更换培养基。
在一个实施方案中，使所述后原条细胞(其通常表达后原条(假定中胚层)和前原条(假定内胚层)特有的标志物)与FGF9(单独的，或与FGF2和/或FGF20一起)接触会导致所述细胞向表达间介中胚层(IM)特有的标志物的细胞群体分化。间介中胚层特有的标志物的非限制性例子包括PAX2、LHX1和OSR1。
(iii)使间介中胚层(IM)分化成肾单位祖细胞和输尿管上皮祖细胞
适当地，在没有血清存在的合适培养基(诸如APEL分化培养基)中在使后原条细胞与FGF2、FGF9和/或FGF20接触以后，使得到的IM细胞与FGF9(单独的，或与BMP7、RA、RA拮抗剂、FGF20、Wnt激动剂和/或肝素中的一种或多种组合)接触。
适当地，FGF9是在约20ng至1μg/mL的浓度。在一个优选的实施方案中，FGF9是在约50-500ng/mL的浓度，更优选约100-300ng/mL，或有利地是约200ng/mL。通常，包括约0.1-10μg/mL的浓度的肝素，优选约0.3-5μg/mL、0.5-2μg/mL，或有利地是约1μg/mL。
在一个实施方案中，FGF20是在约20ng至1μg/mL的浓度。在一个优选的实施方案中，FGF20是在约50-500ng/mL的浓度，更优选约100-300ng/mL，或有利地是约200ng/mL。
应当理解，FGF20可以替换或补充FGF9，因为这些试剂具有类似的生物活性。
在一个实施方案中，BMP7是在约25-75ng/mL的浓度。在一个优选的实施方案中，BMP7是在约35-60ng/mL、45-55ng/mL的浓度，或有利地是约50ng/mL。
在一个实施方案中，RA是在约10pM至1μM的浓度。在一个优选的实施方案中，RA是在约30pM至0.5μM的浓度，更优选约50pM至0.2μM，或有利地是约0.1μM。尽管不限制本发明，初步的数据提示，较高浓度的RA会促进输尿管上皮祖细胞的比例的相对增加，并且较低浓度的RA会促进输尿管上皮祖细胞的比例的相对下降。
在一个实施方案中，RA拮抗剂诸如AGN193109是在约50pM至10μM的浓度。在一个优选的实施方案中，AGN193109是在约0.01μM至5μM的浓度，更优选约0.1μM至5μM，或有利地是约1μM。尽管不限制本发明，初步的数据提示，较高浓度的AGN193109会促进后肾间充质细胞的比例的相对增加。
在一个实施方案中，Wnt激动剂(诸如CHIR99021)以在约0.1μM至10μM范围内的浓度存在，优选约0.2μM至5μM，或更优选地在约1-2μM。
尽管不限制本发明，初步的数据提示，Wnt激动剂会促进从IM细胞产生的肾单位祖细胞的相对增加。优选地，使细胞与FGF9(单独的，或与BMP7、RA、Wnt激动剂、RA拮抗剂和/或FGF20+肝素中的一种或多种)接触至少72小时，但是不超过360小时。优选地，使所述细胞接触约160-220小时，或更优选地约190-200小时。
可以每48-72小时更换培养基。
通常，使间介中胚层细胞与FGF9(单独的，或与以下一种或多种一起：BMP7、RA、RA拮抗剂；Wnt激动剂和/或FGF20，优选肝素，如在本文中公开)接触，使间介中胚层细胞分化成后肾间充质和输尿管上皮细胞谱系的细胞。所述后肾间充质谱系包括在FGF9和肝素中培养约72小时以后最佳地生产的肾单位祖细胞。还提出，可以选择RA类似物或激动剂和/或RA拮抗剂的存在、不存在和/或浓度，以操作通过该方法生产的输尿管上皮相对于通过该方法生产的后肾间充质的相对量。如前所述，RA会促进以后肾间充质为代价的输尿管上皮形成，而RA拮抗剂诸如AGN193109会促进以输尿管上皮为代价的后肾间充质形成。Wnt激动剂(诸如CHIR99021)也可以促进以输尿管上皮为代价的后肾间充质的存活和/或形成。
后肾间充质谱系细胞或其细胞特有的或代表性的标志物的非限制性例子包括WT1、SIX1、SIX2、SALL1、GDNF和/或HOXD11，尽管不限于此。
肾单位祖细胞特有的或代表性的标志物的非限制性例子包括WT1、SIX2、CITED1、PAX2、GDNF、SALL1和HOXD11，尽管不限于此。
输尿管上皮谱系细胞特有的或代表性的标志物的非限制性例子包括HOXB7、GATA3、CALB1、E-钙粘着蛋白、PAX2和/或cRET，尽管不限于此。
基于WT1、SIX2、CITED1、PAX2、GDNF、SALL1和HOXD11的共表达，从hPSC细胞培养开始来开始该方法以后11-15天，或有利地14天(第11天至第15天的范围)，可能最大程度上制备肾单位祖细胞。
基于HOXB7、cRET、E-钙粘着蛋白和PAX2的共表达，从hPSC培养开始来开始该方法以后至少10天或有利地14天，可以最大程度上制备输尿管上皮祖细胞。
在该方法的一种优选形式中，FGF9存在于本文描述的步骤(ii)和(iii)的至少一部分或完全贯穿其中。更优选地，Wnt激动剂(诸如CHIR99021)存在于本文描述的步骤(i)的至少一部分。
因此，一种特别优选的方法包括以下相继步骤：
(a)使人多能干(hPCS)细胞与CHIR99021接触以促进hPSC细胞分化成后原条细胞；
(b)使所述后原条细胞与FGF9(单独的，或与RA拮抗剂诸如AGN193109一起)接触，以促进后原条细胞分化成IM细胞；和
(c)使所述IM细胞与FGF9和肝素(单独的，或与RA拮抗剂诸如AGN193109一起)接触，以由此从所述IM细胞生产肾单位祖细胞和输尿管上皮祖细胞。
根据该优选形式，可能促进在约18-20天的总培养期中从最初的hES细胞群体开始的肾分化。
考虑到前述内容，提及的蛋白试剂(诸如BMP4、BMP7、激活素A、FGF2、FGF9和FGF20)应当理解为包括任何哺乳动物起源的天然的或重组的或化学合成的蛋白，所述哺乳动物起源包括人、小鼠和大鼠，尽管不限于此。此外，这些蛋白可以包括化学修饰、糖基化、脂质化、标记诸如生物素和另外的氨基酸序列诸如表位标签或融合配偶体，正如本领域众所周知的。通常，前述蛋白可以商业上得到和/或通过常规实验室或制备规程制备为重组的或化学合成的蛋白。
在另一个方面，本发明提供了根据本文中公开的方法生产的分离的或纯化的肾单位祖细胞和/或输尿管上皮祖细胞。
应当理解，肾单位祖细胞和/或输尿管上皮祖细胞可以在上文描述的适当培养阶段以后得到，且在某些任选的实施方案中，可以根据表面标志物的共表达进一步富集或纯化。细胞富集或纯化可以是通过本领域已知的任何技术或方法，包括流式细胞技术细胞分选(例如FACS)、通过磁性免疫珠子(例如DynabeadsTM)实现的正或负细胞选择、淘选、密度分离、补体介导的裂解等，尽管不限于此。
肾再生和移植
慢性肾脏疾病是一种严重医学病况，其每年影响3100万美国人和170万澳大利亚人。患者可以在他们变成有症状之前丧失他们的肾功能的90％，从而导致肾功能衰竭和透析或肾移植。在美国，晚期肾病的医疗支出在2010年的估计值为280亿美元。
因此，本发明的一个方面提供了一种生产肾或肾细胞或组织的方法，所述方法包括以下步骤：从分离的或纯化的肾单位和/或输尿管上皮祖细胞分化肾或肾细胞或组织，以由此生产所述肾或肾细胞或组织。
本发明提供了一种生产输尿管上皮和后肾间充质谱系或隔室的细胞的方法。优选地，这些细胞被同时诱导和指导彼此在体内的分化。这些细胞能够发育成不同的管状上皮结构，包括输尿管树和肾单位祖细胞间充质。因此提出，根据本发明生产的hPSC细胞-衍生的输尿管上皮和/或肾单位祖细胞可以从输尿管和肠系膜间质隔室定向分化成肾细胞。
在适当的条件下，所述肾单位祖细胞可以能够分化成任何肾单位节段(除了集尿管以外)，包括肾单位上皮诸如连接段、远曲小管(DCT)细胞、远端直小管(DST)细胞、近端直小管(PST)区段1和2、PST细胞、足细胞、肾小球内皮细胞、Henle的上升环和/或Henle的下降环，尽管不限于此。
此外，因此可以利用这些细胞的‘自组构’的能力来促进肾修复，诸如借助于肾组织或器官生物工程。
应当理解，该方面的方法的一个实施方案可以包括，将分离的或纯化的肾单位和/或输尿管上皮祖细胞过继转移或移植进人中，以由此生产所述肾或肾细胞或组织。
根据该实施方案，分离的或纯化的肾单位和/或输尿管上皮祖细胞向肾或肾细胞或组织的分化发生在体内。
该方面的方法的另一个实施方案可以包括，在体外将分离的或纯化的肾单位和/或输尿管上皮祖细胞至少部分地分化成肾或肾细胞或组织，或这些的祖细胞。适当地，将所述至少部分地体外分化成肾、或肾细胞或组织、或其祖细胞的细胞过继转移或移植进人中。
根据任一个或两个实施方案，所述肾、肾细胞或组织可以促进或有助于肾、其细胞或组织的再生。
一个实施方案提供了分离的肾单位祖细胞和/或输尿管上皮祖细胞用于生产经工程改造的或人造的肾的用途。例如，可以将分离的肾单位祖细胞和/或输尿管上皮祖细胞掺入支架(诸如去细胞化的人肾、聚酯羊毛状物或可生物降解的聚合物支架)内，以由此生产再生的肾小管结构。
本发明的另一个实施方案提供了从分离的肾单位祖细胞和/或输尿管上皮祖细胞分化出的肾细胞或组织在用于辅助或促进肾透析的装置中的用途。例如，通过将肾细胞或它们的祖细胞接种进反应器中以生产用于与透析平行使用的‘肾辅助装置’，可以制造生物人工肾。
也预见到“生物打印的”肾或其它含有肾单位的器官、类器官或器官样结构，其使用从本文描述的分离的肾单位祖细胞和/或输尿管上皮祖细胞分化出或以其它方式得到的肾细胞或组织。
仅仅作为示例，与Invetech联合的Organovo已经开发出器官打印机，其使用水凝胶支架来以期望的取向放置人细胞以重新建立人器官。从本文描述的分离的肾单位祖细胞和/或输尿管上皮祖细胞分化出或以其它方式得到的肾细胞或组织可以与机器(诸如上面提及的Organovo机器)一起使用，以开发“生物打印的”人肾类器官或肾。
还应当理解，本文描述的分离的肾单位祖细胞和/或输尿管上皮祖细胞的定向分化可以提供用于细胞疗法的经纯化的、分化的肾细胞亚型的潜在来源。
例如，在某些遗传学上遗传的肾病况中的基因校正以后，本文描述的分离的肾单位祖细胞和/或输尿管上皮祖细胞可以用于制备肾细胞或组织。例如，基因校正以后肾组织从本文描述的分离的肾单位祖细胞和/或输尿管上皮祖细胞的再生，可以辅助或促进单基因肾病症的校正，所述单基因肾病症包括奥尔波特综合征(COL4A3突变)和多囊肾疾病(PKD1、PKD2和其它)。
在一个特定实施方案中，从具有遗传性肾病的患者衍生出、得到或起源的iPSC系可以用于在体外修复基因突变。这样的细胞可以根据本发明的方法使用，然后施用给患者用于自体细胞疗法。
肾毒性筛查
还应当理解，本文描述的分离的肾单位祖细胞和/或输尿管上皮祖细胞的定向分化可以提供用于肾毒性筛查的纯化的、分化的肾细胞、肾类器官或肾组织亚型的潜在来源。
用于体外药物试验的原代人肾细胞的可用性的缺乏，使目的在于预防疾病的干预(包括基于药物和细胞的疗法)的开发变得困难。
因此，本发明的另一个方面提供了一种确定一种或多种化合物的肾毒性的方法，所述方法包括以下步骤：使所述一种或多种化合物与本文描述的肾单位祖细胞和/或输尿管上皮祖细胞(要么作为类器官，要么在分离和纯化以后)或从其分化出或以其它方式得到的肾细胞或组织接触，以由此确定所述一种或多种化合物是否是肾毒性的。
优选地，使用类器官或从分离的或纯化的肾单位祖细胞或从肾单位祖细胞衍生出的肾细胞或组织，进行所述方法。
许多有用的药物具有肾毒性的副作用，例如，诸如通过直接管效应(例如氨基糖苷抗生素、顺铂、放射造影介质、NSAID、ACE抑制剂)、间质性肾炎(例如β内酰胺抗生素、锂、CsA、抗癫痫药物诸如苯妥英)或肾小球肾炎。因此，可能有利的是，使用从本文描述的分离的或纯化的肾单位祖细胞分化出或以其它方式得到的确定的、特定的肾细胞和组织类型试验新的或现有的药物。在上文中描述的“生物打印的”肾或生物打印的肾类器官也可以适用于肾毒性筛查。
通过体外肾细胞功能的任何适当试验，包括降低的肌酸酐清除率或生物标志物表达，诸如通过得自Qiagen的HumanNephrotoxicityRT2ProfilerTMPCRArray或者得自Eurofins的HighContentAnalysis(HCA)MultiplexedNephrotoxicityAssay(尽管不限于此)，可以评估或测量肾毒性。
参考下述非限制性实施例，可以容易地理解本发明和付诸实践。
实施例
材料和方法
hESC培养和分化
在补充了20％KnockOut血清替代物(LifeTechnologies)、100μMMEMNEAA(LifeTechnologies)、110μM2-巯基乙醇(LifeTechnologies)、1x青霉素/链霉素(LifeTechnologies)、1xGlutamax(LifeTechnologies)和10ng/mLbFGF(R&Dsystems)的F12/DMEM(LifeTechnologies)中在辐照的MEF饲养细胞上常规地培养HES3(MIXL1GFP/wt)细胞。在开始分化的前一天，将细胞以12,000-15,000个细胞/cm2铺板在Matrigel包被的96-孔板上。过夜培养以后，将细胞暴露于以前建立的无血清培养基APEL中的30ng/mLBMP4(R&Dsystems)和10ng/mL激活素A(R&Dsystems)或8μMCHIR99021保持2-3天，然后暴露于APEL培养基中的200ng/mLFGF9和1μg/mL肝素保持4天以诱导IM细胞。在BMP4/激活素A诱导的情况下，随后将细胞暴露于200ng/mLFGF9、50ng/mLBMP7、0.1μMRA和1μg/mL肝素保持4-11天。在CHIR99021诱导的情况下，将细胞暴露于200ng/mLFGF9和1μg/mL肝素保持6天，然后在APEL基础培养基中培养另外6天。每2天更换培养基。
荧光素活化的细胞分选
从未分化的或分化的hESC制备细胞混悬液。将hESC用TripLESelect(LifeTechnologies)在37℃收获5min，并使用细尖移液器解离。已经将细胞穿过40μm尼龙网过滤以后，将它们以2x106个细胞/ml的最终密度再悬浮于含有0.5％FCS和1mMEDTA的PBS中。将碘化丙啶(Sigma)以50mg/ml的终浓度加入以标记死细胞。用FACSAria(BectonDickinson)进行FACS分析。基于碘化丙啶从图中排除死细胞。将所有FACS分析成功地重复超过3次，并显示代表性结果。
免疫细胞化学
将细胞用4％的低聚甲醛在PBS中的溶液在4℃固定10min，随后用PBS洗涤。然后，将细胞用1％BSA、0.2％奶、0.3％TritonX/PBS在室温封闭1小时，并与第一抗体一起在4℃温育过夜。将第二抗体在室温温育1小时。使用下述抗体和稀释度：兔抗-PAX2(1:200,#71-6000,ZymedLaboratoriesInc.),山羊抗-OSR1(1:75,#sc-67723,SantaCruzBiotechnology),山羊抗-LHX1(1:75,#sc-19341,SantaCruzBiotechnology),小鼠抗-TBX6(1:200,AF4744,R&Dsystems),山羊抗-SOX17(1:200,#AF1924,R&Dsystems),兔抗-SIX2(1:200,#11562-1-AP,Proteintech),小鼠抗-ECAD(1:200,#610181,BDBiosciences),兔抗-WT1(1:100,#sc-192,SantaCruzBiotechnology),小鼠抗-HOXD11(1:200,#SAB1403944,Sigma-Aldrich),山羊抗-GATA3(1:200,AF2605,R&Dsystems),兔抗-JAG1(1:200,#ab7771,Abcam),兔抗-CDH6(1:100,#HPA007047,SigmaAldrich)和山羊抗-SYNPO(1:200,#sc-21537,SantaCruzBiotechnology)。第二抗体是：Alexa-488-缀合的山羊抗-兔,Alexa-594-缀合的驴抗-兔,Alexa-488-缀合的驴抗-山羊和Alexa-594-缀合的山羊抗-小鼠(1:250,LifeTechnologies)。使用NikonTi-U显微镜或ZeissLSM510MetaUV共焦显微镜获取图像。将所有IF分析成功地重复超过3次，并显示代表性结果。
免疫荧光
将沉淀物用4％PFA在4℃固定10min，包埋在石蜡中，并以7μm厚度切片。将切片用绵羊血清在室温封闭1小时，然后使用AntigenUnmaskingSolution(Vectorlabs)进行抗原回收。将第一抗体在4℃温育过夜，并将第二抗体在室温温育1小时。使用下述抗体和稀释度：兔抗-CALB1(1:200,#C2724,Sigma-Aldrich),兔抗-AQP1(1:200,sc-20810,SantaCruzBiotechnology),兔抗-AQP2(1:200,AB3274,Millipore),兔抗-SLC3A1(1:100,16343-1-AP,Proteintech)和兔抗-人特有的线粒体(HuMt)(1:800,#ab92824,Abcam)。将包埋在OCT化合物(Sakura)中的冷冻切片用于抗-人特有的细胞核(HuNu)(1:800,#MAB1281,Merck)染色。使用OlympusBX-51显微镜或ZeissLSM510MetaUV共焦显微镜获取图像。将所有IF分析成功地重复超过3次，并显示代表性结果。
基因表达分析
使用RNeasy微试剂盒(QIAGEN)从细胞提取总RNA，并使用SuperScriptIII逆转录酶(LifeTechnologies)从>100ngRNA合成cDNA。用SyberGreen(AppliedBiosystems)通过ABIPRISM7500实时PCR仪进行定量RT-PCR(qRT-PCR)分析。将所有绝对数据首先相对于GAPDH归一化，然后相对于对照样品归一化(Δ-Δ-Ct方法)。按照生产商的说明书使用OneTaqDNA聚合酶(NEB)进行常规RT-PCR分析。将所有RT-PCR分析成功地重复超过3次，并显示代表性图像。列出了用于RT-PCR和qRT-PCR的引物的序列(表1和表2)。
诱导的细胞的比例的定量
为了定量PAX2+、LHX1+、SOX17+、SIX2+或WT1+阳性的分化细胞的比例，将细胞用每种抗体与核染剂DAPI一起进行免疫荧光染色。使用OlympusBX-51显微镜(10倍物镜)，在每个实验的1或2个代表性视野(来自3个独立实验的共3-5个代表性视野，共计1-1.5x103个细胞)中使用ImageJ手工地计数分化细胞与总细胞的比率。
3D培养物
在分化的第12天至第13天，使用TripLEselect(LifeTechnologies)将hESC-衍生的诱导肾细胞收获和解离成单个细胞。将10x105个细胞在400g离心2min以形成沉淀物，然后放在具有0.4μm微孔的13mm直径的过滤膜(#7060-1304Whatman)上，所述过滤膜具有10μg/cm2的胶原IV(BectonDickinson)包被物。将过滤器在10％FCS/DMEM的培养基上漂浮4天。
重新聚集测定
如前所述进行重新聚集测定5,29。简而言之，用胶原IV(BectonDickinson)以10μg/cm2包被过滤膜。为了制备要重组的胚胎肾细胞，将得自12.5-13.5dpc小鼠的胚胎肾用Accutase(LifeTechnologies)在37℃消化10min，并通过手工抽吸进行解离。已经穿过100μm尼龙网过滤细胞以后，将4-10x105个胚胎肾细胞与4％的hESC-衍生的细胞重组，然后在400g离心2min以形成沉淀物。将沉淀物放在如上制备的过滤膜上，并与10％FCS/DMEM培养基一起培养4天。
结果
我们已经确定了hESC分化成发育肾的关键细胞隔室的三阶段框架，包括标记或排除特定最终结果的基因6(图1a)。使用激活素A7和在小鼠中指定前原条(内胚层)与后原条(中胚层)的BMP4和激活素A的相对梯度8,9，可以从小鼠ES细胞(mESC)诱导原条，即中胚层和内胚层的祖细胞群体。还已经将经典Wnt信号传递报告为小鼠和人ESC中的原条的诱导物7,10。由于IM最初从后原条产生，我们首先检查了hESC是否以与小鼠类似的方式对这些形态发生素做出应答。我们以前已经证实，20/100(ng/mL)的BMP4/激活素A会从报道hESC细胞系MIXL1GFP/wt诱导GFP+原条，其中GFP被敲入MIXL1基因座(原条的一种稳健标志物)中11。使用单层培养中的该报道细胞系，我们针对最佳分化试验了BMP4和激活素A的几种组合(5/200、20/100、30/10、30/0和0/0ng/mL)或不同浓度的经典Wnt信号传递激动剂CHIR99021(5、7、9μM)。在化学成分确定的无血清培养条件下进行所有体外实验12。MIXL1、T(后原条)和SOX17(前原条)的对比表达提示，高BMP4/低激活素A(30/10)或高CHIR99021(>7μM)对于后原条而言是最佳的(图1c,d；图2a-c)。在两种条件下，大约90％的细胞变成GFP+(图1b)。
分化的第二阶段是从原条诱导IM。原肠胚形成以后，确定的中胚层可以产生IM、轴旁中胚层(PM)和侧板中胚层(LPM)。探究多能细胞的肾分化的先前研究已经依赖于OSR1作为IM和甚至MM形成的确定标志物13。但是，OSR1表达在躯干中胚层中观察到并延伸进LPM14。最初的原条诱导(BMP4/激活素A(30/10),3天)以后的自发分化显示OSR1表达(图2d)，但是通过RT-PCR或免疫荧光(IF)没有发现更确定的IM标志物PAX2和LHX1的证据14-16。这指示需要其它生长因子以适当地指导下一阶段。FGF信号传递是一种可能的要求。FGF8从原条表达直到后躯干中胚层，且FGF9在IM和PM中表达17 , 18。在FGF2/BMP719或FGF920中的培养支持MM体外存活。因此，我们试验了3个FGF家族成员FGF2、FGF8和FGF9的从后原条诱导IM的能力。将hESC诱导的后原条用200ng/mLFGF2、8或9处理4天，然后经由IF和qRT-PCR进行分析(图1e)。在有FGF2或FGF9存在、但是没有FGF8存在下，将OSR1、PAX2和LHX1与>80％的细胞PAX2+共表达，从而提示有差别的IM诱导(图1f-h)。响应于FGF2或FGF9的PAX2和LHX1诱导被PD173074显著抑制，所述PD173074是FGFR1和FGFR3的一种化学抑制剂(图3a,b)。FGF9的IM诱导是剂量依赖性的(在200ng/ml最佳)，并抑制LPM标志物FOXF1(图1i)和OSR1(图3b)。在用BMP4/激活素A或CHIR99021、随后用FGF9的最初诱导以后，观察到PAX2和OSR1蛋白的细胞共定位，LHX1和PAX2蛋白共定位在79.5％(±4.7％标准差；n＝5)的细胞中(图3c,d)。因此，FGF信号足以有效地指定在后原条以后的IM。在早期中胚层发育中，BMP信号传递是调节外侧-内侧模式形成的关键形态发生素。低BMP4会诱导IM，而高BMP4会诱导LPM，且NOG(noggin)介导的BMP信号传递的拮抗作用是PM所必需的21。我们使用BMP4和NOG以及FGF9在体外再现了该模式形成(图1j)。在这里，FOXF1被NOG有效地抑制，而IM标志物PAX2和LHX1的诱导仅在有单独FGF9或低NOG存在下持续(图1j；图4a,b)。尽管PM标志物TBX6以与IM标志物类似的方式起作用(图4b)，但是表达较低。IF揭示，TBX6+细胞是微小群体，其完全排除PAX2+IM细胞(图1k)。所述原条还可以分化成内胚层，但是，IF表明仅0.244％(±0.099％标准差；n＝5)的细胞是确定内胚层标志物SOX17阳性的，从而证实分化成中胚层的特异性。
在哺乳动物中，IM分化成肾、生殖腺和肾上腺。形成的第一个结构是输尿管(ND)，沿着它从同一个生肾索形成3个成对的排泄器官(按照从头至尾的次序前肾、中肾和后肾)。仅后肾(代表最终的恒肾)在出生后持续。在后肾的形成中的关键因素是关键细胞组分之间的相互诱导事件(图5)。MM通过GDNF的产生而驱动输尿管芽(UB)/输尿管上皮(UE)的生长晕。UE通过FGF9的产生而促进MM的存活，并通过Wnt信号传递而诱导肾单位形成。形成后，每个肾单位延长并分裂以形成许多在功能上不同的包含肾单位的细胞类型(图5)。基于视黄酸(RA)可以促进输尿管上皮生长晕的证据22，以前已经证实RA和BMP7会从mESC诱导肾谱系23且FGF9可以在体外维持小鼠肾单位祖细胞20，我们使用BMP4/激活素A从最初诱导后第6天至第17天加入200ng/mLFGF9、50ng/mLBMP7和0.1nMRA(图6a)。贯穿整个分化方案的RT-PCR(图6b)揭示了从原条(MIXL1、LHX1)至IM(OSR1、PAX2、LHX1)、然后至MM(SIX2、WT1、GDNF、HOXD11)的逐步分化。HOXD11的表达指示后肾而不是中肾24。重要的是，也观察到ND/UE基因(C-RET25和HOXB726)的同时诱导(图6b)。实际上，IF证实了从第14天开始ECAD+PAX2+上皮结构的形成(图6c)。RA以剂量依赖性的方式促进这些早期上皮结构的形成(图7b)，也支持了UE的鉴别22,27。该群体和周围的间充质证实了体外增殖的证据(图7a)。象在发育肾中一样，SIX2和WT1阳性的最初间质视野包围ECAD+UE结构(图6c,e)，该群体在第14天时发生率达到峰值(图6d)。WT1+细胞的百分比在该时间以后继续增加，可能反映了该蛋白在肾单位祖细胞和更分化的肾单位结构中的表达(图6c)。在第22天的RT-PCR揭示了基于足细胞(SYNPO、NPHS1和WT1)、近端小管(AQP1和SLC3A1)和集尿管基因(AQP2和SCNNB1)的表达进一步分化的证据(图7c)。IF证实了WT1和SYNPO蛋白的同时存在，从而提示足细胞的形成(图7d)，尽管早期肾单位标志物不是明显的。
这些数据提示肾发育所需的多个相互作用细胞隔室的协同分化。尽管以前的研究已经在诱导方案中使用RA和BMP7，然而我们的数据提示，这对于进一步分化而言可能不是最佳的。我们将此基于SIX2的瞬时表达、分散的间充质的存在和没有间质PAX2表达(发育肾中的MM的一个特征)的证据。在最初的CHIR99021诱导以后RA/FGF9的添加以在UE周围的浓缩PAX2+MM为代价产生了强烈的UE(图8a)。相反，单独的FGF9的延长的分化(注意到第12天以后所有因子的除去；图6f)也诱导PS、IM和MM/UE的逐步诱导，但是具有肾标志物的更快的诱导和MM基因(诸如SIX2)的更长期的表达(图6g,h,i)。另一种UE标志物GATA3在PAX2+UE中共表达，且更重要的是，MM似乎紧密浓缩在UE尖部周围，如在发育肾中所见(图6h,j,k)。关键是，该方案证实了间充质和UE中的PAX2表达的证据(图6k)，更加指示肾发生潜力。最后，HOXD11在WT1+和WT1-细胞中的表达证实了肾间质的额外存在(图8c)，其也被FOXD1的表达支持(图8b)。
在胚胎发生过程中，IM也产生生殖腺和肾上腺皮质。这些组织的标志物的表达水平不高于在人胎儿肾中所见(图8b)，从而提示这些可选的命运没有经过显著选择。使用H9hESC细胞系和人iPS细胞系CRL2429C11探究了该分化方案从一个hESC细胞系向另一个的可转移性(图9)。使用这些细胞系也观察到最初的后原条诱导、随后响应于FGF9的IM诱导和向前分化。
似乎是肾发育的所有必要细胞群体的形成提示这些细胞在彼此之间发信号以产生自组构组织的潜力。关键是，这必须包括肾单位的形成。为了进一步评估该现象发生的能力，我们最初使用我们的CHIR99021/FGF9诱导方案、随后从第12天至第18天撤去生长因子检查了这些假-2D培养物的自发分化(图8d-f)。到第18天时，伸长的ECAD+UE被三种MM标志物WT1、SIX2和PAX2阳性的间充质块包围(图8d-f)。该MM形成似乎是早期肾单位/肾囊泡(RV)的东西，如JAG1和CDH6蛋白所指示的(图8f；图5)。我们还观察到连接UE和RV的内腔的形成，如在肾单位成熟过程中在体内发生的(图8f,右下)。
肾单位形成通过分段、模式形成和分化的复杂过程而在RV后进展2，并表达限定从近端小管至远端小管的肾小球的每个肾单位段的身份和功能的特定标志物(图5)。为了试验向肾组织中的功能性整合，我们使用了以前表征的重新聚集测定，其代表试验群体的肾潜力的严谨测定7,28,29(图10a)。在该测定中，将小鼠胚胎肾解离成单个细胞，然后在肾分化的第12天至第13天与未分化的hESC(对照)或hESC重新聚集。作为重新聚集体培养4天以后，将这些切片并使用IF检查。使用针对人线粒体DNA的抗体，鉴别从hESC衍生出的细胞(图10c箭头)。使用CHIR99021/FGF9方案诱导hESC-衍生的细胞，所述CHIR99021/FGF9掺入发育肾的所有主要细胞隔室中，包括PAX2+CALB+UE(上图)、CDH6+JAG1+早期肾单位/RV(中图)和SIX2+WT1+肾单位祖细胞间充质(下图)，而使用仅掺入MM和UE中的BMP4:激活素A/FGF9/FGF9:BMP7:RA诱导hESC-衍生的细胞。这样的掺入不会发生在包括未分化的hES细胞的重新聚集中。相反，这导致肾发育的完全破坏和衬有hES-衍生的上皮的大囊泡的形成(图10b)。
在体内，肾以三维形成。分离的胚胎肾可以在空气-培养基界面处生长为类器官，从而响应于周围的MM成功地形成分支输尿管上皮和进行肾单位形成、模式形成和早期分段。进行hESC分化作为单层，其可以代表自组构和形态发生的不利环境。为了试验培养物的形状对自组构的影响，我们提起IM定型(第6天)以后分化的hESC培养物并在不同的细胞密度重新铺板(图11a)，随后按照CHIR99021/FGF9方案继续培养。在第18天，以较高密度重新铺板的培养物形成均匀的单层，而以较低密度重新铺板的那些培养物建立了许多遍布于平板的分离的小的隆起的类器官。尽管WT1+MM和ECAD+UE存在于两种条件下，较小的隆起的集落形成紧密堆积的且更高级的结构(图11b)，从而提示更3D的环境会增强自组构。
如果对于肾形态发生而言所有必要的细胞群体存在，则指向肾分化的hESC培养物应当能够在没有任何其它支持细胞存在下形成肾类器官。为了试验这方面，将分化至第18天的hESC培养物酶促地解离，然后在4天外植体培养之前通过离心进行沉淀(图12a)。这代表胚胎小鼠肾外植体培养的标准培养条件(不含生长因子的10％FCS/DMEM)。得到的沉淀物的组织学分析揭示了ECAD+小管，其显示UE标志物PAX2和AQP2或近端小管标志物AQP1和SLC3A1的共-IF。还观察到包围ECAD+UE的WT1+PAX2+MM的存在，这是JAG1+ECAD+RV形成的证据(图12bhESC-衍生的)。所有这些结构不能与通过正常小鼠胚胎肾的解离和重新聚集形成的相同结构区分(图12bE13.5mEK)，从而证实了在CHIR99021/FGF9指导的分化方案以后存在的细胞的真正自组构能力。分析得自三个独立实验的沉淀物，83％揭示了自组构结构(5/6的沉淀物)。在BMP4:激活素A/FGF9/FGF9:BMP7:RA以后没有观察到相同的分化水平。
本文中公开的方法促进了形成肾单位的间充质和输尿管上皮的同时诱导，这包括且源自这些发育中的细胞和组织之间的相互作用。细胞和组织类型在阶段2和3中在不同程度上形成，甚至对于单独的FGF9。其它因子诸如BMP7、RA和Wnt激动剂的添加将在间充质的相对丰度和产生的输尿管上皮方面改变该结果。
为了最佳地生产间充质和肾单位，阶段2中的FGF9足以模式化下一步，但是BMP7与FGF9一起在阶段3中的添加稍微改善间充质，但是更重要的是，使输尿管树具有更少的“片层样”。还提出，过多的FGF9最终不是最佳的。这已经在微生物反应器研究中进行了评估，其结果显示在图13中。
关于RA，增加RA会以间充质为代价增加输尿管上皮的生产(即生产更多不适当的GATA3+间充质)。
我们还进一步分析了CHIR99021的作用，并发现，在培养的前2天中存在得越多，生产的输尿管芽越多，6μM优于8μM(图14)。但是，较长时间的CHIR99021(4天相对于2天)会产生比片层更多的管状结构，所述片层最终具有更多间充质，其显示形成更多成熟足细胞标志物的能力。如在图15上总结的，每个细胞系可能也需要优化CHIR99021在阶段1中的浓度和持续时间。
另外，如果我们继续在阶段2和3中包括1μM的CHIR99021(在阶段1中使用的Wnt激动剂)和如果我们添加RA的拮抗剂(例如AGN193109)，会改善间充质的生产。这是因为，我们归纳(posterioris)间充质更象后肾(即产生恒肾)而不是中肾(即在发育过程中退化)。我们正在确定在增加的HOXD11表达(对后肾更特异性)和SIX2、SIX1、WT1、EYA1(即都在后肾中更高)方面的该更佳间充质结果。我们仍然在这些存在下生产了输尿管上皮，但是可能不象没有这些或有RA那样多。这总结在图16-19中。基于该另外的优化，提出不同的开始细胞(例如得自不同患者的不同hPSC)将在它们对剂量的应答和每个阶段的定时方面稍微变化，使得我们可能或多或少地需要将CHIR、RA或RA拮抗剂、FGF9和/或BMP7用于每一种。因而，不同患者细胞系的应答的优化可能随细胞系不同而发生。更重要的是，为研究在肾单位的关键基因中具有突变的患者细胞系，我们可能选择通过在阶段3中或在阶段2和3中使用CHIR99021和RA拮抗剂(诸如AGN193106)而使制备的间充质最大化(例如生产更多的后肾间充质)。相反，在影响集尿管的基因中具有突变的患者中，我们可能通过在阶段3中最初具有更少的CHIR99021和加入RA而使诱导的输尿管上皮最大化(例如生产更多的输尿管芽)。
图20和21显示的证据表明本文中公开的方法会作用于患者-衍生的iPSC以及hESC。显示了得自两个不同患者细胞系的数据。
长久以来已经记载了细胞在发育和创伤修复过程中‘自组构’的能力30。在‘自组构’过程中，不同的细胞类型呈现相对于彼此的独特模式，以建立存在于器官内的复杂结构。认为该过程涉及特异性的细胞-细胞识别，且可能需要适当的配体-受体信号传递和细胞-基质相互作用。最近的研究(其中已经在培养物中诱导hESC分化)已经揭示，象视杯、垂体或肠一样复杂的3D组织形态发生可以通过组分细胞的‘自组构’而发生31-33。这暗示复杂的细胞聚集体模式化或‘自组构’的复杂能力。几项先前的研究已经报道了hESC至IM、足细胞或近端小管的定向分化6,13,34,35。这些都没有报道UB和MM-衍生的结构的同时诱导或自组构的证据，尽管使用的生长因子方案是类似的。在我们的方案中存在几个关键差异。这是利用FGF9的第一个方案，所述FGF9最近已经被证实对于MM存活而言是关键性的。FGF9和FGF20的损失会导致肾缺如，且FGF9的缺失会使得MM不能支持继续发育20。我们将此视作我们的方案的一个关键性和决定性组分。其次，关于鉴别端点(特别是在IM的阶段)的基因/蛋白的组合的共表达的严谨要求，已经允许我们更确定地评价成功。另外，我们尚未为随后的分化分选亚群，由此允许周围的非靶细胞类型影响培养物整体。鉴于所述的PM和尾芽信号传递在肾发育的不同阶段的作用36,37，这可能已经促进肾的形成所需的所有通讯细胞类型的协同分化。
所述的hESC分化方法会产生相互诱导的肾祖细胞群体，其能够自组构以形成早期肾单位。这代表从多能细胞来源向肾组织产生的重大进步。但是，正常肾发育包括肾单位祖细胞的自我更新相对于它们向肾单位分化之间的小心平衡。这里描述的分化的hESC培养物显示许多RV的形成，但是肾单位祖细胞随时间显著损失，从而引起在Six2突变体小鼠中看到的过早祖细胞分化的表型3。这是一个关键挑战，并提示分化方案的改进范围，可能需要改变生长因子、细胞外基质和/或氧张力20,38,39以更充分地再生胚胎肾的那些。在生物反应器中向类器官培养物的阶段式迁移也可能促进更3D的环境。
总之，我们在这里报道了多能细胞向自组构肾的成功分化。从在肾发育中涉及的不同关键细胞群体开始的细胞协同诱导再次证实了复杂形态发生结构的建立对相互作用生境(niches)的要求。这样的群体在体外发生自组构的能力较好地体现了组织/器官生物工程的将来。我们可以从分化的hES细胞培养物(单独地)形成类器官的事实，打开了制备基于组织的肾毒性筛查、体外疾病模型或开发可移植的类器官以补充肾功能的可能性。它还提示为以后的纯化制备特定成熟肾细胞类型的可行性。
使用该方法制备的细胞的特定用途可以包括：
●制备微肾类器官或经纯化的肾细胞用于肾毒性筛查；
●制备微肾类器官或经纯化的肾细胞用于疾病建模，无论是一般化的还是根据患者；和/或
●制备微肾类器官或经纯化的肾细胞类型用于针对肾脏疾病的治疗性处理的药物筛选。
这些可以在微生物反应器中进行或在生物打印成较大格式屏幕以后进行。对于疾病建模或药物筛选，我们可能纯化个体细胞类型并以会提供基于具体疾病的有用信息的方式或形式培养它们。例如，我们可能分离UB和在基质胶培养物中培养以评估囊腔形成(例如针对疾病诸如肾消耗病)或分离MM以制备足细胞(例如针对疾病诸如Finnish肾病或奥尔波特综合征)。
细胞疗法和器官替代或修复的特定例子可以包括：
●制备肾细胞类型用于细胞疗法(急性肾损伤或慢性肾损伤)；
●制备肾细胞类型用于全器官替换生物工程，其可能需要将多个较小的肾连接到一起以形成替代‘器官’；和/或
●制备肾细胞类型用于去细胞化的支架的重新细胞化。
在本说明书中，目的已经是描述本发明的优选实施方案，而不是将本发明限于任何一个实施方案或特征的具体集合。因此，本领域技术人员会明白，考虑到本发明的公开内容，可以在举例说明的特定实施方案中做出多种改进和变化，而不脱离本发明的范围。
在本文中提及的所有计算机程序、算法、专利和科学文献通过引用并入本文。
表1：用于RT-PCR的引物的序列
正向(5'-3') 反向(5'-3')
PAX2 TATGCACTGCAAAGCAGACC GAAAGGCTGCTGAACTTTGG
LHX1 ATGCAACCTGACCGAGAAGT CAGGTCGCTAGGGGAGATG
OSR1 TTCAGCTAAAGCCCCAGAGA CGGCACTTTGGAGAAAGAAG
MIXL1 GGTACCCCGACATCCACTT TTCAGAGAGAGGGGAACAGG
T AGGTACCCAACCCTGAGGAG GATGGGTGAGGGGTGTGTAG
CRET CCGCACACGGCTGCATGAGA AAGGTGCCTGGGGGTCGGTT
HOXB7 CGATGCAGGGCTTGTACCCC GGCCTCGTTTGCGGTCAGTT
SIX2 GCCGAGGCCAAGGAAAGGGAGAA AGCAGTGCGGGGCTGGATGA
WT1 CGCACGGTGTCTTCAGAGGC CCTGTATGAGTCCTGGTGTGGGT
GDNF CTGCCTGGTGCTGCTCCACA AGCTGCAGCCTGCCGATTCC
HOXD11 CCACGGTCAACTCGGGACCT TTCCTACAGACCCCGCCGTG
PAX6 GGCAACCTACGCAAGATGGC TGAGGGCTGTGTCTGTTCGG
SYNPO TCTACCATGGCTACCTGCCT TTCCGGGTAGAGAAGGAGGG
NPHS1 GAGTATGAGTGCCAGGTCGG ATGGTGATGTCAGGTGCTGG
AQP1 GCCGTGACCTTGGTGGCTCA TGGCCGCTGGTCCACACCTT
AQP2 TCTGCTCCATGAGATCACGCCA ATCGGTGGAGGCGAAGATGCA
SCNNB1 CTTCACGAGCAGAGGTCATACC GGACCTCAGAACCATTCACGGT
SLC3A1 TACGGTTCTGGCTCACAAAGGG GCTCCGAGTATTGTGTGACCG
GAPDH CGAGATCCCTCCAAAATCAA GTCTTCTGGGTGGCAGTGAT
表2：用于qRTPCR的引物的序列
正向(5'-3') 反向(5'-3')
SOX17 ACGCCGAGTTGAGCAAGA TCTGCCTCCTCCACGAAG
T AGGTACCCAACCCTGAGGA GCAGGTGAGTTGTCAGAATAGGT
MIXL1 GGTACCCCGACATCCACTT GCCTGTTCTGGAACCATACCT
OSR1 GGACCTCTGCGGAACAAG TGCAGGGAAGGGTGGATA
PAX2 GCAACCCCGCCTTACTAAT AACTAGTGGCGGTCATAGGC
LHX1 ATGCAACCTGACCGAGAAGT CAGGTCGCTAGGGGAGATG
TBX6 CATCCACGAGAATTGTACCCG AGCAATCCAGTTTAGGGGTGT
PARAXIS GCGGGCAGTGCCAAGGGCG CCCTCACCTTCAAGCAGCTGC
FOXF1 GCGGCTTCCGAAGGAAATG CAAGTGGCCGTTCATCATGC
OCT4 AGCAAAACCCGGAGGAGT CCACATCGGCCTGTGTATATC
NANOG AAGGCCTCAGCACCTACCTA ATTGGAAGGTTCCCAGTCGG
SIX2 CGCCCATGTGGGTCAGTGGG AGCCGGGAGCGCTGTAGTCA
HOXD11 GCCAGTGTGCTGTCGTTCCC CTTCCTACAGACCCCGCCGT
HOXB7 GCCTACAAATCATCCGGCCA GGTTGGAAGCAAACGCACAA
FOXD1 GACTCTGCACCAAGGGACTG CCTCGAGCGCGCTAACATAG
SOX9 CCGAAAGCGGAGCTCGAAAC AGTTTCCGGGGTTGAAACTGG
SF1 GTGTACCAAGTGTGGAGGGG AGGTGCTTCACCCAGTTCAG
GATA6 CATGACTCCAACTTCCACCT ACTTGAGCTCGCTGTTCTCG
GAPDH AGCCACATCGCTCAGACAC GCCCAATACGACCAAATCC
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Claims (29)

1.一种生产肾单位祖细胞和输尿管上皮祖细胞的方法，所述方法包括以下步骤：使间介中胚层(IM)细胞与以下物质接触：成纤维细胞生长因子9(FGF9)和/或成纤维细胞生长因子20(FGF20)；和任选的选自以下的一种或多种：骨形态形成蛋白7(BMP7)；肝素；Wnt激动剂；视黄酸(RA)、类似物或激动剂；和RA拮抗剂；以由此从所述IM细胞生产肾单位祖细胞和输尿管上皮祖细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中FGF9和/或FGF20是在选自以下范围的浓度：约20ng至1μg/mL；约50-500ng/mL；约100-300ng/mL；和约200ng/mL。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中BMP7以选自以下范围的浓度存在：约25-75ng/mL；约35-60ng/mL；约45-55ng/mL；和约50ng/mL。
4.根据任意前述权利要求所述的方法，其中RA、类似物或激动剂会增加从IM细胞开始的输尿管上皮祖细胞的相对生产。
5.根据任意前述权利要求所述的方法，其中RA、类似物或激动剂以选自以下范围的浓度存在：约10pM至1μM；约30pM至0.5μM；约50pM至0.2μM；和约0.1μM。
6.根据任意前述权利要求所述的方法，其中所述RA拮抗剂会增加从IM细胞开始的肾单位祖细胞的相对生产。
7.根据任意前述权利要求所述的方法，其中所述RA拮抗剂以选自以下范围的浓度存在：约0.50pM至10μM；约0.01μM至5μM；约0.1μM至5μM；和约1μM。
8.根据任意前述权利要求所述的方法，其中所述Wnt激动剂会增加从IM细胞开始的肾单位祖细胞的相对生产。
9.根据任意前述权利要求所述的方法，其中所述Wnt激动剂以选自以下范围的浓度存在：约0.1μM至10μM；约0.2μM至5μM；和约1-2μM。
10.根据任意前述权利要求所述的方法，其中肝素以在约0.1-10μg/mL的范围内的浓度存在。
11.根据任意前述权利要求所述的方法，其中使所述间介中胚层(IM)细胞与单独的或者与以下一种或多种组合的FGF9接触约72-360小时：BMP7、RA、RA拮抗剂、Wnt激动剂、FGF20和/或肝素。
12.根据任意前述权利要求所述的方法，其中从所述IM细胞同步地或同时地生产所述肾单位祖细胞和输尿管上皮祖细胞。
13.根据任意前述权利要求所述的方法，其包括使后原条细胞与促进所述后原条细胞分化成所述IM细胞的一种或多种试剂接触。
14.根据权利要求13所述的方法，其包括使人多能干细胞(hPSC)与促进hPSC分化成所述后原条细胞的一种或多种试剂接触。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述hPSC是人胚胎干细胞或诱导的人多能干细胞。
16.根据任意前述权利要求所述的方法，其包括以下相继步骤：
(a)使人多能干(hPCS)细胞与促进hPSC细胞分化成后原条细胞的一种或多种试剂接触；
(b)使后原条细胞与促进后原条细胞分化成IM细胞的一种或多种试剂接触；和
(c)使IM细胞与单独的或者与以下一种或多种组合的FGF9接触：BMP7；RA；RA拮抗剂；Wnt激动剂；FGF20；和/或肝素，以由此从所述IM细胞生产肾单位祖细胞和输尿管上皮祖细胞。
17.根据权利要求13-16中的任一项所述的方法，其中与所述后原条细胞接触的所述一种或多种试剂包括单独的或者与FGF2和/或FGF20组合的成纤维细胞生长因子9(FGF9)。
18.根据权利要求17所述的方法，其中FGF9、FGF2和/或FGF20是在约100-400ng/mL的浓度。
19.根据权利要求14-18中的任一项所述的方法，其中与hPSC接触的所述一种或多种试剂包括BMP4、激活素A和/或Wnt激动剂。
20.根据权利要求19所述的方法，其中(i)BMP4是在约5-40ng/mL的浓度；(ii)激活素A是在约3-40ng/mL的浓度；和/或Wnt激动剂是在约0.5-50μM范围内的浓度。
21.根据权利要求16所述的方法，其包括以下相继步骤：
(a)使人多能干(hPCS)细胞与Wnt激动剂接触以促进hPSC细胞分化成后原条细胞；
(b)使所述后原条细胞与单独的或与RA拮抗剂一起的FGF9接触，以促进后原条细胞分化成IM细胞；和
(c)使IM细胞与单独的或者与以下一种或多种组合的FGF9接触：BMP7；RA；RA拮抗剂；Wnt激动剂；FGF20；和/或肝素，以由此从所述IM细胞生产肾单位祖细胞和输尿管上皮祖细胞。
22.根据任意前述权利要求所述的方法，其进一步包括鉴别存活的肾单位祖细胞和/或输尿管上皮祖细胞的步骤。
23.根据权利要求22所述的方法，其中鉴别存活的肾单位祖细胞和/或输尿管上皮祖细胞包括：测量或检测作为标志物的多种核酸和/或蛋白的共表达，所述标志物鉴别或区分存活的肾单位和/或输尿管上皮祖细胞。
24.根据权利要求1-23中的任一项所述的方法生产的分离的、富集的或纯化的肾单位祖细胞和/或输尿管上皮祖细胞。
25.一种生产肾或肾细胞或组织的方法，所述方法包括以下步骤：从权利要求24所述的分离的或纯化的肾单位和/或输尿管上皮祖细胞分化出肾或肾细胞或组织，以由此生产所述肾或肾细胞或组织。
26.根据权利要求24所述的分离的、富集的或纯化的肾单位祖细胞和/或输尿管上皮祖细胞，其用于生产肾或肾细胞或组织。
27.根据权利要求24所述的方法，其用于(i)生物打印或生物工程改造全肾和肾组织用于肾移植或治疗慢性肾脏疾病；(ii)整个器官去细胞化的肾的重新细胞化，以由此建立重构的或替代性的肾；或(iii)肾疾病和病症的细胞疗法。
28.一种确定一种或多种化合物的肾毒性的方法，所述方法包括以下步骤：使所述一种或多种化合物与权利要求26所述的分离的或纯化的肾单位祖细胞和/或输尿管上皮祖细胞、或从其分化出或以其它方式得到的肾细胞或组织接触，以由此确定所述一种或多种化合物是否是肾毒性的。
29.根据权利要求28所述的方法，其中通过使所述一种或多种化合物与肾类器官接触来执行所述方法。
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