CN110468095A - 一种肾上皮细胞及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及干细胞生物学领域,具体涉及一种肾上皮细胞及其制备方法和应用。首先公开一种肾上皮细胞,其表达CDH1+和PODXL+,还至少表达CDH2+和LTL+中的一种。第二个方面公开了一种制备肾上皮细胞的方法,包括以下步骤:多能干细胞向后部原条细胞分化、后部原条细胞向后中间中胚层分化、后中间中胚层向肾祖细胞分化、肾祖细胞向肾管状聚集前体分化、肾管状聚集前体向肾泡分化、肾泡向肾上皮细胞分化。本发明提供的制备方法分化效率高、分化效果稳定,适用于多种hPSC细胞株。分化得到的肾元祖细胞可以满足肾疾病模型建立、肾脏药物毒性的测试以及与肾脏疾病相关的药物筛选等科研实验需求。
Description
技术领域
本发明涉及干细胞生物学领域,具体涉及一种肾上皮细胞及其制备方法和应用。
背景技术
肾脏是人体内重要的器官,具有复杂的空间结构。作为泌尿系统的组成部分,肾脏的主要功能是调节体液的成分和体积,并清除代谢废物。成熟的肾脏会通过肾元对血液进行过滤并多次回收人体内需要的物质而最终产生尿液排出体外。此外肾脏还具有调节血压,维持体内酸碱平衡等功能。
将人多能干细胞(hPSC,包括人胚胎干细胞hESC和人诱导多能干细胞hiPSC)分化为肾祖细胞和肾脏类器官为研究人类肾脏发育、遗传性肾脏疾病、肾损伤、肾毒性测试以及肾脏再生等方向提供了一个新的体外研究平台。当前输尿管芽细胞及后肾间充质细胞的发育过程已经逐步明确,但肾脏组织中的其他类型细胞如内皮细胞和间质细胞的发育过程尚不清楚。通过研究hPSC向肾脏类器官的体外分化过程,可以帮助我们进一步加深对体内肾脏发育的了解。同时可通过各分化阶段的细胞来研究先天性肾脏异常,以及肾毒性药物的筛选。目前已有160多种具有明确突变的遗传性肾脏疾病。通过遗传性肾病患者的iPSC分化得到肾脏类器官,可以构建肾疾病模型,探究遗传性肾病的发病机制。结合CRISPR/Cas9基因编辑技术对iPSC引入目标突变,可以在保证其他遗传背景一致的情况下对突变型和亲本细胞株分化而来的类器官进行比较。肾元的逐渐损失,是导致慢性肾脏疾病(CKD)的发病一个重要原因。目前该病晚期的治疗手段主要为透析和肾脏移植。只在胚胎发育期,肾脏才会不断形成新的肾元,新生儿出生后肾脏的肾元数目不再增加。由患者来源的iPSC分化产生高质量无污染的肾元祖细胞并通过体外扩大培养或许可以作为免疫兼容的组织,使CKD病人能够再次产生新的肾元,从而达到对CKD的治疗效果。
与本发明最接近的文章有:Taguchi等报道了相对高效的60%左右的后肾间充质细胞(SIX2+细胞)的诱导效率,这些诱导出的后肾间充质细胞进一步分化为肾元结构。然而他们只得到后肾间充质细胞类型,没有收集管、肾间质和内皮细胞类型。Takasato等分化出的肾脏类器官不仅包括收集管和肾元也包括肾间质细胞和内皮细胞网络,但中间中胚层向肾脏类器官分化这一过程并不完全明晰,使用高剂量的FGF9进行分化诱导的成本也太过高昂,并且对于疾病模型的构建也未提及。Morizane等提出的分化方案成功获得90%左右SIX2+细胞,并进一步采取2D和3D两种培养方式分化出具有各段肾小管(包括近端小管、亨利氏环、远端小管)和肾小球足细胞的肾元结构并且能够对肾毒性药物作出应答,引起细胞凋亡。对于输尿管芽细胞,间质细胞及内皮细胞等肾脏中的其他细胞类型,该方案没有提及。
与本发明最接近的专利有:Method of differentiation of pluripotent stemcell for forming kidney organoids。该专利说明了一种将hPSC分化为血管化的肾脏类器官,该方案使用Wnt激动剂,FGF信号激活剂,肝素,视黄酸,RA拮抗剂等多种试剂诱导分化,成本过于高昂。
目前现有的各肾上皮细胞分化方案在分化方案在过程和原理上均有所不同,这些分化方案具有以下缺点:1)分化成本过高,分化周期长;2)培养基成分复杂来源不明确;3)分化效率低无法得到更多的肾上皮细胞。
发明内容
为了解决上述现有的技术问题,本发明提供了一种可快速、高效、简便地从hPSC定向分化为肾上皮细胞的新型制备方法。本发明提供的制备方法分化效率高、分化效果稳定,适用于多种hPSC细胞株,以及2D或3D诱导分化途径。通过本发明制备方法分化得到的肾元结构和肾脏类器官可用于肾疾病模型的建立、肾脏药物毒性的测试以及与肾脏疾病相关的药物筛选等。
本发明的技术方案与现有技术有以下不同:第一,本方案中调节各信号通路所用的小分子抑制剂以及细胞因子与现有技术不同,成分简单,具有更加高效且低成本的特性;第二,利用本发明分化得到成熟肾上皮细胞所用的时间比现有技术有所缩短,在一定程度上节省了时间成本;第三,本方案同时适用于2D或3D培养,根据本发明制备方法在2D培养下分化得到的肾上皮细胞结构,具有与体内肾元结构更加类似的装配结构;第四,本发明提供的3D培养方案可在各种规格培养瓶中进行,能更加高效地获得较多数量的肾脏类器官球体,并且肾上皮细胞的成熟时间提前了4-5天。
本发明有以下优点:第一,本发明提供的制备方法操作简单,能在更短的时间内通过3D分化得到具有成熟肾上皮细胞结构的肾脏类器官;第二,通过本发明提供的制备方法分化得到的肾元祖细胞效率达到90%以上;第三,本发明制备方法中提供的supplement(添加剂)成分明确,实现高效、低成本的分化;第四,本发明提供的制备方法能够适用于多种hPSC细胞株的分化。第五,本发明提供的肾祖细胞冻存液,能够有效冻存分化第7-8天得到的肾祖细胞。并且复苏后活率高,肾祖细胞标志性指标仍然表达,具有继续分化为肾上皮细胞的潜能。
具体的,本发明的技术方案如下:
本发明第一个方面公开了一种肾上皮细胞,其表达CDH1+和PODXL+,还至少表达CDH2+和LTL+中的一种。
本发明第二个方面公开了一种制备肾上皮细胞的方法,包括以下步骤:
S1:多能干细胞向后部原条细胞分化;
S2:后部原条细胞向后中间中胚层分化;
S3:后中间中胚层向肾祖细胞分化;
S4:肾祖细胞向肾管状聚集前体分化;
S5:肾管状聚集前体向肾泡分化;
S6:肾泡向肾上皮细胞分化。
优选的,在S1之前,还包括S0:多能干细胞的培养。
优选的,所述S1包括:
S11:将人多能干细胞的上清液吸除,加入肾上皮细胞分化完全培养基A诱导分化,所述肾上皮细胞分化完全培养基A包括Wnt信号通路激活剂、BMP4信号通路抑制剂和BMP4信号通路激活剂;
S12:每天更换培养基,培养4-5天。
优选的,所述S2包括:
S21:吸除后部原条细胞的上清液,加入肾上皮细胞分化完全培养基B诱导分化,所述肾上皮细胞分化完全培养基B包括TGF-β信号通路激活剂;
S22:每天更换培养基,培养2-3天。
优选的,所述S3包括:
S31:吸除后中间中胚层的上清液,加入肾上皮细胞分化完全培养基C诱导分化,所述肾上皮细胞分化完全培养基C包括FGF信号通路激活剂;
S32:每天更换培养基,培养2-3天。
更优选的,还包括步骤S33:将分化得到的肾祖细胞进行冻存。
在本发明的一些优选实施例中,S33中使用冻存液对肾祖细胞进行冻存,所述冻存液包括体积百分数分别为5-20%和0-10%的DMSO和重组人血白蛋白。
在本发明的一些具体实施例中,上述冻存液的组分如下表1所示。
表1
优选的,所述S4采用2D的方式培养,包括以下步骤:
S41:吸除肾祖细胞的上清液,加入肾上皮细胞分化完全培养基D诱导分化,所述肾上皮细胞分化完全培养基D包括FGF信号通路激活剂和Wnt信号通路激活剂;
S42:每天更换培养基,培养2-3天。
优选的,所述S4采用3D的方式培养,包括以下步骤:
将肾祖细胞消化,用含有Rock抑制剂的肾上皮细胞分化完全培养基D重悬,置于三维摇床上悬浮培养。
优选的,所述S5包括:
S51:吸除肾管状聚集前体的上清液,加入肾上皮细胞分化完全培养基C诱导分化,所述肾上皮细胞分化完全培养基C包括FGF信号通路激活剂;
S52:每天更换培养基,培养2-3天。
优选的,所述S6包括:
S61:吸除肾泡的上清液,加入肾上皮细胞分化基础培养基E诱导分化;
S62:每天更换培养基,培养5-7天。
更优选的,所述肾上皮细胞分化基础培养基E包括谷氨酰胺、人转铁蛋白和胰岛素。
本发明中制备上述的运动神经元的方法的流程图如图1所示,具体的,操作如下:
一、人多能干细胞向肾上皮细胞定向分化-2D
(一)Day-3-0:多能干细胞的培养
将聚合度达到70-80%的未分化的多能干细胞用Trypsin或Accutase消化成完全的单细胞,以一定密度重悬于适量体积的多能干细胞维持培养基中,加入一定浓度的Rock抑制剂,并接种在Matrigel板上,置于37℃,5%CO2浓度,饱和湿度的培养箱内培养。
Day-3-0实验优化:
1.实验中所用的多能干细胞经过严格的多能性验证(表达各种多能性标志物,并可在免疫缺陷型小鼠体内形成包含内、中、外三个胚层的畸胎瘤)。多能干细胞在其维持培养基中正常培养,所用的培养基E8或TeSR或其它类似培养基,经优化后使用Nova培养基进行培养,可稳定维持hPSC在体外的长期培养。
2.Rock抑制剂包括Y-27632、Blebbistatin、HA100等。优选的,Rock抑制剂是Y-27632,浓度为10μM;
3.hPSC的接种密度可以为1-10×104cells/cm2。
4.细胞消化液包括Trypsin、Accutase、EDTA和其他细胞消化液。优选的,采用Accutase进行细胞消化。消化细胞后细胞呈单细胞状态方便计数,且对细胞伤害小。
(二)Day 0-4:多能干细胞向后部原条细胞(Late primitive streak)分化
当hPSC的汇合度达到40-60%时将其维持培养基(E8或TeSR或其它类似培养基)吸除,加入500μL-1mL DPBS洗涤细胞一次,以0.2-0.8mL/cm2加入肾上皮细胞分化完全培养基A,置于37℃,5%CO2浓度,饱和湿度的培养箱内,连续培养4天。隔天更换培养基,之后每天更换培养基。
Day 0-4实验优化:
1.肾上皮细胞分化完全培养基A中包括Wnt信号激活剂和BMP信号调节剂。本发明优选抑制糖原合酶激酶3β(GSK-3β)来激活Wnt信号通络。抑制GSK-3β的有效抑制剂有:CHIR99021,SB216763,TWS119,LY2090314,Tideglusib,BIO-acetoxime等。本发明优化后选择CHIR99021,浓度为3-20μM。本发明中BMP信号调节剂包括BMP信号通路激活剂和抑制剂。BMP激活剂为激活BMP信号通路的物质,包括BMP4,BMP2B和BMP7等。BMP抑制剂为抑制BMP信号通路的物质,可选择Chordin、Noggin、Follistatin、LDN193189、Dorsomorphin等。本发明优化后选择BMP4来激活BMP信号通路,浓度为0-20ng/mL;选择LDN193189来抑制BMP信号通路,浓度为0-50nM。使用优化后的肾上皮细胞分化完全培养基A进行肾上皮细胞的诱导分化,第4天的细胞形态呈现致密成片的细胞团,细胞团平铺,且边缘光滑。
(三)Day 4-6:后部原条细胞向后中间中胚层(Posterior intermediatemesoderm)分化
人肾上皮细胞分化完全培养基A培养4天后,吸弃培养基,以0.2-0.8mL/cm2加入人肾上皮细胞分化完全培养基B,置于37℃,5%CO2浓度,饱和湿度的培养箱内,连续培养2天,每天更换新鲜的分化完全培养基B。
Day4-6实验优化:
1.人肾上皮细胞分化完全培养基B中添加剂B的主要成分为:TGF-β信号通路激活剂,常用的TGF-β信号通路激活剂有TGFβ-1、TGFβ-2、TGFβ-3、Activin A等,本发明优化后选择Activin A作为TGF-β的激活剂,浓度为5-50ng/mL。处理细胞2天,可以提高分化效率,控制分化成本,简化实验方案。
(四)Day6-8:后中间中胚层向后肾间充质细胞(Metanephric mesenchyme)分化
人肾上皮细胞分化完全培养基B培养2天后,吸弃培养基,按照0.2-0.8mL/cm2加入人肾上皮细胞分化完全培养基C,置于37℃,5%CO2浓度,饱和湿度的培养箱内,连续培养2天,每天更换新鲜的分化完全培养基C。第8天可分化得到后肾间充质细胞类型,该后肾间充质细胞又称肾祖细胞。在第7天或第8天将细胞消化后使用肾祖细胞冻存液将细胞消化后冻存与液氮罐中,复苏后的细胞可继续进行后续分化;亦或将day8肾祖细胞消化后转3D培养,得到3D肾脏类器官。具体实验方案见“二、人多能干细胞向肾上皮细胞定向分化-3D”。
Day6-8实验优化:
1.细胞消化液包括Trypsin(胰蛋白酶),Accutase(细胞消化液),EDTA和其他细胞消化剂。优选的,采用0.125-0.25%Trypsin进行细胞消化,同时需使用等体积Trypsininhibitor(胰蛋白酶抑制剂)终止消化。消化细胞后对细胞伤害小,可继续对细胞冻存或进行3D培养。
2.人肾上皮细胞分化完全培养基C中添加剂C的主要成分为:FGF信号通路激活剂。FGF信号通路激活剂有FGF2、FGF8、FGF9、FGF10、FGF20等。优选的,选择FGF9作为FGF信号通路的激活剂,浓度为5-50ng/mL。处理细胞2天,可以提高分化效率,控制分化成本,简化实验方案。
(五)Day8-10:后肾间充质细胞向肾管状聚集前体(Pre-tubular aggregate)分化
人肾上皮细胞分化完全培养基C培养2天后,吸弃培养基,按照0.2-0.8mL/cm2加入人肾上皮细胞分化完全培养基D,置于37℃,5%CO2浓度,饱和湿度的培养箱内,连续培养2天,每天更换新鲜的分化完全培养基D。
Day8-10实验优化:
1.培养基D中添加剂D的主要成分为:FGF信号通路激活剂和Wnt信号激活剂。FGF信号通路激活剂有FGF2、FGF8、FGF9、FGF10、FGF20等。优选的,选择FGF9来激活FGF信号通路,浓度为5-25ng/mL。
本发明提供的制备方法通过抑制糖原合酶激酶3β(GSK-3β)来激活Wnt信号通络。抑制GSK-3β的有效抑制剂有:CHIR99021、SB216763、TWS119、LY2090314、Tideglusib、BIO-acetoxime、NP031112、TWS119、CHIR-98014、AZD2858、AZD1080、SB415286等。本发明优化后选择CHIR99021来抑制GSK-3β,浓度为3-12uM。处理细胞2天,可以提高分化效率,控制分化成本,简化实验方案。
(六)Day10-13:肾管状聚集前体向肾泡(Renal vesicle)分化
人肾上皮细胞分化完全培养基D培养2天后,吸弃培养基,按照0.2-0.8mL/cm2加入人肾上皮细胞分化完全培养基C,置于37℃,5%CO2浓度,饱和湿度的培养箱内,连续培养3天,每天更换新鲜的分化完全培养基C。
Day10-13实验优化:
1.人肾上皮细胞分化完全培养基C中添加剂C的主要成分为:FGF信号通路激活剂。FGF信号通路激活剂有FGF2、FGF8、FGF9、FGF10、FGF20等。优选的,选择FGF9作为FGF信号通路的激活剂,浓度为5-50ng/mL。处理细胞2天,可以提高分化效率,控制分化成本,简化实验方案。
(七)Day13-20:肾泡向肾上皮细胞分化
吸弃培养基,按照0.2-0.8mL/cm2加入人肾上皮细胞分化基础培养基E,置于37℃,5%CO2浓度,饱和湿度的培养箱内,每天更换新鲜的分化基础培养基E。约5-7天可获得成熟的肾上皮细胞。得到的肾上皮细胞具有直观可见的缠绕形管状结构,可直接进行免疫荧光染色检测各标志物的表达,也可细胞裂解后进行RNA提取,通过qPCR的方式进行各标志物的检测。后续可以进行肾脏药物毒性的测试以及与肾脏疾病相关的药物筛选等。
Day13-20实验优化:
1.本方案使用的培养基E经过优化,加入一定浓度的Transferrin、insulin、GlutaMAX等蛋白添加物以及乙醇胺、丙酮酸钠、偏钒酸铵、亚硒酸钠、氯化锰等化合物,能够促进肾上皮细胞的成熟分化,可以维持肾上皮细胞的培养长达3个月。
二、人多能干细胞向肾上皮细胞定向分化-3D
Day1-8的具体实验方案参见“一、人多能干细胞向肾上皮细胞定向分化-2D”。
Day8-10:拟胚体(EB)的形成(肾祖细胞向肾管状聚集前体分化)
将2D方法培养至day8的肾祖细胞进行拟胚体形成实验。具体操作为:向day8肾祖细胞中加入0.2-0.8mL/cm2的细胞消化液,37℃孵育3-6min后,用枪轻柔吹打,将细胞悬液转移至1.5mL离心管,瞬时离心5-10s,吸弃上清。加入0.2-0.8mL/cm2含一定浓度Rock抑制剂的分化完全培养基D重悬细胞并转移至低吸附性的培养瓶中,置于三维摇床,37℃,5%CO2浓度,饱和湿度的培养箱内培养。细胞密度可以为0.1-5x106/mL;摇床的转速可以为10-20rpm;培养的时间可以为8-32小时。
Day8-10实验优化:
1.Rock抑制剂包括Y-27632、Blebbistatin、HA100等。优选的,Rock抑制剂是Y-27632,浓度为10uM。
2.细胞消化液包括Trypsin,Accutase,EDTA或其他细胞消化液。优选的,采用0.125-0.25%Trypsin进行细胞消化,同时需使用等体积Trypsin inhibitor终止消化,消化细胞后对细胞伤害小,可为3D培养提供较高活力的细胞;
3.低吸附性3D培养瓶包括T25 Flask,T75 Flask,T225 Flask以及其他低吸附性3D细胞培养瓶。亦或包被用于3D培养的低吸附性基质来防止细胞贴壁。优选的,使用Poly-Hema(多聚2-羟乙基甲基丙烯酸脂)对培养瓶进行包被使用,效果更好,EB可保持悬浮不贴壁。
Day10-13:肾管状聚集前体向肾泡(Renal vesicle)分化
人肾上皮细胞分化完全培养基D培养2天后,吸弃培养基,按照0.2-0.8mL/cm2加入人肾上皮细胞分化完全培养基C,置于37℃,5%CO2浓度,饱和湿度的培养箱内,连续培养3天。
Day10-13实验优化:
1.人肾上皮细胞分化完全培养基C中添加剂C的主要成分为:FGF信号通路激活剂。FGF信号通路激活剂有FGF2、FGF8、FGF9、FGF10、FGF20等。优选的,选择FGF9作为FGF信号通路的激活剂,浓度为5-50ng/mL。处理细胞2天,可以提高分化效率,控制分化成本,简化实验方案。
Day13-20:肾泡向肾上皮细胞分化
人肾上皮细胞分化完全培养基C培养3天后,吸弃培养基,按照0.2-0.8mL/cm2加入人肾上皮细胞分化基础培养基E,置于37℃,5%CO2浓度,饱和湿度的培养箱内,约2-4天可以获得肾上皮细胞结构明显的3D肾脏类器官。得到的3D肾脏类器官具有直观可见的缠绕形管状肾上皮细胞结构,可进行免疫荧光染色检测各标志物的表达,也可细胞裂解后进行RNA提取,通过qPCR的方式进行各标志物的检测,后续可以进行肾疾病模型建立、肾脏药物毒性的测试以及与肾脏疾病相关的药物筛选等。
Day13-20实验优化:
1.本方案使用的人肾上皮细胞分化基础培养基E经过优化,加入一定浓度的Transferrin、insulin、GlutaMAX等蛋白添加物以及乙醇胺、丙酮酸钠、偏钒酸铵、亚硒酸钠、氯化锰等化合物,能够促进肾上皮细胞的成熟分化,并维持肾上皮细胞结构稳定。
上述人肾上皮细胞分化基础培养基E的成分如表2所示。
表2
本发明中其他培养基成分见表3和表4。
表3
表4
在本发明的一具体实施例中,上述人多能干细胞通过专利CN 108085299A公开的方法进行制备。
应当理解,本领域技术人员还可以根据需要选择任意的人多能干细胞商业细胞系或细胞株来完成本发明,且均在本发明的保护范围之内。
对上述方法制备得到的肾上皮细胞进行检测,以下方法中任选一种:
方法一:使用RT-qPCR技术:证明分化得到的细胞为CDH2+/CDH1+/PODXL+/的肾上皮细胞。其中,CDH2为近端小管的标志性指标,CDH1为亨利氏环和远端小管的标志性指标,PODXL是肾小球祖细胞的标志性指标。
优选的,抽提RNA所用的试剂盒是RNAprep Pure Cell/Bacteria Kit,厂家为TIANGEN,货号是DP430;逆转录所用试剂盒是Reverse Transcriptase,厂家为Vazyme,货号是R223-01;RT-QPCR所用试剂盒是TransStart Top Green qPCR SuperMix,厂家为Transgen,货号是AQ131。
其中,RT-qPCR的引物序列如下:
CDH1-F:ATTTTTCCCTCGACACCCGAT(SEQ ID NO:1);
CDH1-R:TCCCAGGCGTAGACCAAGA(SEQ ID NO:2);
CDH2-F:TGCGGTACAGTGTAACTGGG(SEQ ID NO:3);
CDH2-R:GAAACCGGGCTATCTGCTCG(SEQ ID NO:4);;
PODXL-F:AGCTAAACCTAACACCACAAGC(SEQ ID NO:5);
PODXL-R:TGAGGGGTCGTCAGATGTTCT(SEQ ID NO:6)。
方法二:使用免疫荧光染色证明分化得到的细胞为LTL+/CDH1+/PODXL+的肾上皮细胞。其中,LTL是近端小管的标志性指标,CDH1为亨利氏环和远端小管的标志性指标,PODXL是肾小球祖细胞的标志性指标,DAPI是细胞核的染色。
优选的,免疫荧光的抗体信息:Lotus tetragonolobus lectin(LTL),Vectorlabs,#FL-1321;E-cadherin(CDH1),Abcam,#ab40772;PODXL,R&D Systems,#AF1658;Donkey anti-Goat IgG,cy3,#705-165-147;Donkey anti-Goat IgG,FITC,#705-095-147;Donkey anti-Rabbit IgG,cy3,#711-165-152。
进一步的,发明人发现上述方法制备得到肾上皮细胞可对顺铂产生肾毒性应答。其中,kim1为近端小管损伤的标志性指标,LTL是近端小管的标志性指标,DAPI是细胞核的染色。
在本发明的一具体实施例中,抗体信息如下:kim1,R&D Systerm,#AF1750;Lotustetragonolobus lectin(LTL),Vectorlabs,#FL-1321;Donkey anti-Goat IgG,cy3,#705-165-147。
进一步的,发明人发现上述方法制备得到肾上皮细胞经forskolin(腺苷酸环化酶激活剂)诱导后能够产生囊泡,并且使用Rapamycin(雷帕霉素)能够抑制囊泡的增大。在本发明的一具体实施例中,该实验产品信息包括:Forskolin,MedChen Express,#HY15371;Rpamycin,SIGMA,#V900930。
本发明第三个方面公开了一种肾上皮细胞,其由上述的方法制备而得。
本发明第四个方面公开了一种细胞群,富集有上述的肾上皮细胞。
本发明第五个方面公开了一种治疗肾脏疾病的药物,所述药物包含上述的肾上皮细胞。
在符合本领域常识的基础上,上述各优选条件,可任意组合,而不超出本发明的构思与保护范围。
本发明的关键技术包括以下几点:
本发明相对于现有技术具有如下的显著优点及效果:
1)本发明制备方法中提供的人肾上皮细胞分化基础培养基E成分明确,有效物质稳定不易降解,分化效率高。
2)分化过程中所用的试剂成分明确,使用小分子化合物更高效经济,使分化的结果更稳定;在保证分化效率的同时,本发明制备方法生长因子的用量低,极大地节省了科研成本。
3)本发明提供的肾上皮细胞制备方案中,可以以2D和3D的方式进行。
4)本发明提供的肾祖细胞冻存液,冻存肾祖细胞复苏后细胞活率高,且仍保留相关标志的表达,能继续分化为肾上皮细胞。
本发明相对于现有技术具有如下的显著优点及效果:
第一,本发明提供的制备方法经过多次试验优化,能在更短的时间内分化得到具有成熟肾上皮细胞结构的肾脏类器官。时间上相对于现有技术缩短了近一周,极大地节省了时间成本。
第二,通过本发明提供的制备方法分化得到的肾元祖细胞效率达到90%以上(参照附图5),大大提高了肾上皮细胞的产量;可以满足肾疾病模型建立、肾脏药物毒性的测试以及与肾脏疾病相关的药物筛选等科研实验需求。
第三,本发明制备方法中提供的4种添加剂经过多次筛选,确保成分明确,且能够实现更高效、低成本的分化,有效解决了现有技术分化成本高,操作复杂等问题。
第四,本发明提供的制备方法已经实现了在多种hPSC细胞株上的分化,具有更广泛的适应性。
第五,本发明提供的肾祖细胞冻存液,能够有效冻存分化第7-8天得到的肾祖细胞,并且复苏后活率高,肾祖细胞标志性指标仍然表达,具有继续分化为肾上皮细胞的潜能。
附图说明
图1显示本发明制备方法一个实施例的流程图。
图2显示2D分化培养的第0天(hPSC)、第4天、第6天、第8天、第13天、第20天的具体细胞形态。
图3显示3D分化培养的第13天、第15天的细胞形态。
图4为不同细胞株(包括:EGFP-ipsc,多囊肾病人的ipsc,健康人的ipsc)分化得到的肾上皮细胞。
图5为本发明实施例中对分化第7-8天得到的细胞进行SIX+细胞免疫荧光染色,以及流式细胞仪检测SIX2+表达效率。
图6显示用不同的冻存液对得的肾祖细胞冻存处理后,再复苏后肾祖细胞的细胞活率检测.
图7显示用不同的冻存液对得的肾祖细胞冻存处理后,再复苏后肾祖细胞SIX2流式细胞仪检测结果图。
图8显示使用RT-qPCR技术对分化第19天(D19)和第21天(D21)所得的肾上皮细胞进行检测,显示CDH2+/CDH1+/PODXL+的表达(图中NC是阴性对照组,CDH1和PODXL使用的NC为MSC,CDH2使用的NC是表皮细胞)。
图9显示使用免疫荧光染色技术对分化第20天所得的肾上皮细胞进行检测,显示LTL+/CDH1+/PODXL+的表达(图中BF指明场下拍摄)。
图10为本发明实施例中得到的肾上皮细胞对顺铂的药物毒性应答结果图。
图11为本发明实施例中得到的肾上皮细胞产生的囊泡,并且囊泡能够被雷帕霉素(Rapamycin)抑制图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的技术方案进行详细描述,但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法,按照常规方法和条件,或按照商品说明书选择。本发明所用试剂和原料均市售可得。
实施例1
本实施例公开了一种制备肾上皮细胞的方法,包括以下步骤:
S1:多能干细胞向后部原条细胞分化;
S2:后部原条细胞向后中间中胚层分化;
S3:后中间中胚层向肾祖细胞分化;
S4:肾祖细胞向肾管状聚集前体分化;
S5:肾管状聚集前体向肾泡分化;
S6:肾泡向肾上皮细胞分化。
具体的,流程图如图1所示,步骤如下:
(1)多能干细胞的培养(D-3-D0)
实验中所用的多能干细胞经过严格的多能性验证(表达各种多能性标志物,并可在免疫缺陷型小鼠体内形成包含内、中、外三个胚层的畸胎瘤)。多能干细胞在其维持培养基中正常培养,所用的培养基E8或TeSR或其它类似培养基。该实施例中人多能干细胞通过专利CN 108085299A公开的方法进行制备。
经优化后使用Nova培养基进行培养,可稳定维持hPSC在体外的长期培养。
上述维持培养基中加入Rock抑制剂。Rock抑制剂是Y-27632,浓度为10μM;
hPSC的接种密度可以为1-10×104cells/cm2。
本实施例采用Accutase进行细胞消化。消化细胞后细胞呈单细胞状态方便计数,且对细胞伤害小。
(2)多能干细胞向后部原条细胞分化(Day 0-4)
当hPSC的汇合度达到40-60%时将其维持培养基(E8或TeSR或其它类似培养基)吸除,加入500μL-1mL DPBS洗涤细胞一次,以0.2-0.8mL/cm2加入肾上皮细胞分化完全培养基A,置于37℃,5%CO2浓度,饱和湿度的培养箱内,连续培养4天。隔天更换培养基,之后每天更换培养基。
肾上皮细胞分化完全培养基A中包括Wnt信号激活剂和BMP信号调节剂。本实施例采用抑制糖原合酶激酶3β(GSK-3β)来激活Wnt信号通络。本发明选择CHIR99021作为抑制GSK-3β的抑制剂,且浓度为3-20μM。本发明中BMP信号调节剂包括BMP信号通路激活剂和抑制剂。BMP激活剂为激活BMP信号通路的物质,BMP抑制剂为抑制BMP信号通路的物质。本实施例选择BMP4来激活BMP信号通路,浓度为0-20ng/mL;选择LDN193189来抑制BMP信号通路,浓度为0-50nM。
使用优化后的肾上皮细胞分化完全培养基A进行肾上皮细胞的诱导分化,第4天的细胞形态呈现致密成片的细胞团,细胞团平铺,且边缘光滑。
(3)后部原条细胞向后中间中胚层分化(Day 4-6)
人肾上皮细胞分化完全培养基A培养4天后,吸弃培养基,以0.2-0.8mL/cm2加入人肾上皮细胞分化完全培养基B,置于37℃,5%CO2浓度,饱和湿度的培养箱内,连续培养2天,每天更换新鲜的人肾上皮细胞分化完全培养基B。
人肾上皮细胞分化完全培养基B中包含添加剂B,添加剂B的成分为:TGF-β信号通路激活剂。本实施例选择Activin A作为TGF-β的激活剂,浓度为5-50ng/mL。处理细胞2天,可以提高分化效率,控制分化成本,简化实验方案。
(四)后中间中胚层向肾祖细胞分化(Day6-8)
人肾上皮细胞分化完全培养基B培养2天后,吸弃培养基,按照0.2-0.8mL/cm2加入人肾上皮细胞分化完全培养基C,置于37℃,5%CO2浓度,饱和湿度的培养箱内,连续培养2天,每天更换新鲜的分化完全培养基C。第8天可分化得到肾祖细胞。
在第7天或第8天将细胞消化后使用肾祖细胞冻存液将细胞消化后冻存与液氮罐中,复苏后的细胞可继续进行后续分化。
采用0.125-0.25%Trypsin进行细胞消化,同时需使用等体积Trypsin inhibitor终止消化。消化细胞后对细胞伤害小,可继续对细胞冻存。
人肾上皮细胞分化完全培养基C中添加剂C的成分为:FGF信号通路激活剂。本实施例选择FGF9作为FGF信号通路的激活剂,浓度为5-50ng/mL。处理细胞2天,可以提高分化效率,控制分化成本,简化实验方案。
(五)后肾间充质细胞向肾管状聚集前体分化(Day8-10)
人肾上皮细胞分化完全培养基C培养2天后,吸弃培养基,按照0.2-0.8mL/cm2加入人肾上皮细胞分化完全培养基D,置于37℃,5%CO2浓度,饱和湿度的培养箱内,连续培养2天,每天更换新鲜的分化完全培养基D。
人肾上皮细胞分化完全培养基D中添加剂D的成分为:FGF信号通路激活剂和Wnt信号激活剂。本实施例选择FGF9来激活FGF信号通路,浓度为5-25ng/mL。本实施例通过抑制糖原合酶激酶3β(GSK-3β)来激活Wnt信号通络。选择CHIR99021来抑制GSK-3β,浓度为3-12uM。处理细胞2天,可以提高分化效率,控制分化成本,简化实验方案。
(六)肾管状聚集前体向肾泡分化(Day10-13)
人肾上皮细胞分化完全培养基D培养2天后,吸弃培养基,按照0.2-0.8mL/cm2加入人肾上皮细胞分化完全培养基C,置于37℃,5%CO2浓度,饱和湿度的培养箱内,连续培养3天,每天更换新鲜的分化完全培养基C。
人肾上皮细胞分化完全培养基C中添加剂C的成分为:FGF信号通路激活剂。选择FGF9作为FGF信号通路的激活剂,浓度为5-50ng/mL。处理细胞2天,可以提高分化效率,控制分化成本,简化实验方案。
(七)肾泡向肾上皮细胞分化(Day13-20)
吸弃培养基,按照0.2-0.8mL/cm2加入人肾上皮细胞分化基础培养基E,置于37℃,5%CO2浓度,饱和湿度的培养箱内,每天更换新鲜的分化基础培养基E。约5-7天可获得成熟的肾上皮细胞。得到的肾上皮细胞具有直观可见的缠绕形管状结构,可直接进行免疫荧光染色检测各标志物的表达,也可细胞裂解后进行RNA提取,通过qPCR的方式进行各标志物的检测。后续可以进行肾脏药物毒性的测试以及与肾脏疾病相关的药物筛选等。
本实施例中的人肾上皮细胞分化基础培养基E经过优化,加入一定浓度的Transferrin、insulin、GlutaMAX等蛋白添加物以及乙醇胺、丙酮酸钠、偏钒酸铵、亚硒酸钠、氯化锰等化合物,能够促进肾上皮细胞的成熟分化,可以维持肾上皮细胞的培养长达3个月。
上述肾祖细胞冻存液的组分如下表1所示。
表1
上述人肾上皮细胞分化基础E的成分如表2所示。
表2
本实施例中其他培养基成分见表3和表4。
表3
表4
其中分化培养的第0天(hPSC)、第4天、第6天、第8天、第13天、第20天的具体细胞形态见附图2。本实施例提供了一种可快速、高效、简便地从hPSC定向分化为肾上皮细胞的制备方法,培养基成分明确,分化时间短。
实施例2
本实施例公开了一种制备肾上皮细胞的方法,与实施例1唯一不同的是:步骤(五)“后肾间充质细胞向肾管状聚集前体分化(Day8-10)”采用3D方法培养。包括以下步骤:
将得到的肾祖细胞进行拟胚体(EB)形成实验,具体操作为:向分化得到的肾祖细胞中加入0.2-0.8mL/cm2的细胞消化液,37℃孵育3-6min后,用枪轻柔吹打,将细胞悬液转移至1.5mL离心管,瞬时离心5-10s,吸弃上清。加入0.2-0.8mL/cm2含一定浓度Rock抑制剂的分化完全培养基D重悬细胞并转移至低吸附性的培养瓶中,置于三维摇床,37℃,5%CO2浓度,饱和湿度的培养箱内培养。细胞密度可以为(0.1-5)x106/mL;摇床的转速可以为10-20rpm;培养的时间可以为8-32小时。
Rock抑制剂是Y-27632,浓度为10uM。
采用0.125-0.25%Trypsin进行细胞消化,同时需使用等体积Trypsin inhibitor终止消化,消化细胞后对细胞伤害小,可为3D培养提供较高活力的细胞;
低吸附性3D培养瓶包括T25 Flask,T75 Flask,T225 Flask以及其他低吸附性3D细胞培养瓶。亦或包被用于3D培养的低吸附性基质来防止细胞贴壁。使用Poly-Hema对培养瓶进行包被使用,效果更好,EB可保持悬浮不贴壁。3D分化培养的第13天、第15天的细胞形态见图3所示。
实施例3
本实施例公开了制备肾上皮细胞的方法,与实施例1唯一不同的是:多能干细胞的来源不同,分别为EGFP-iPSC、多囊肾病人的iPSC和健康人的iPSC。三种细胞株均能得到的典型的肾上皮细胞结构(见图3),说明本发明公开的分化方法具有对多种hPSC的普适性。
实施例4
本实施例将实施例1公开的方法中分化第7-8天得到的细胞进行SIX2免疫荧光染色和流式细胞仪检测,结果见图4,其中,免疫荧光抗体信息为SIX2,Proteintech,11562-1-AP。
实施例5
本实施例研究不同的冻存液对实施例1得到的肾祖细胞细胞活性和分化能力的影响,具体的,将肾祖细胞分别使用实施例1公开的肾祖细胞冻存液和市售的三种冻存液进行液氮冻存。将分别用四种冻存液冻存一周后的肾祖细胞进行复苏,计算细胞活率,结果如图6所示,从图6可以看出,使用实施例1公开的的肾祖细胞冻存液冻存的肾祖细胞复苏后细胞活率最高,其中细胞活率=活细胞数/总细胞数。
上述冻存液1为专利申请号为201610135615.4公开的细胞冻存液;冻存液2为专利申请号为201710932562.3公开的细胞冻存液;冻存液3为专利申请号为201610068837.9公开的细胞冻存液。
接着对复苏后的肾祖细胞进行SIX2流式细胞仪检测,结果见图7,从图7可以发现使用实施例1公开的的肾祖细胞冻存液冻存的肾祖细胞复苏后表达SIX2的细胞更多。
说明使用实施例1中的冻存液能够使肾祖细胞得到有效的保存,复苏后细胞活率高且仍保留相关标志的表达,能继续分化为肾上皮细胞。
实施例5
本实施例通过RT-qPCR技术对实施例1中分化第19天(D19)和第21天(D21)所得的细胞进行检测,结果如图8所示。其中,CDH2为近端小管的标志性指标,CDH1为亨利氏环和远端小管的标志性指标,PODXL是肾小球祖细胞的标志性指标。抽提RNA所用的试剂盒是RNAprep Pure Cell/Bacteria Kit,厂家为TIANGEN,货号是DP430;逆转录所用试剂盒是Reverse Transcriptase,厂家为Vazyme,货号是R223-01;RT-QPCR所用试剂盒是TransStart Top Green qPCR SuperMix,厂家为Transgen,货号是AQ131。
RT-qPCR中的引物序列如下:
CDH1-F:ATTTTTCCCTCGACACCCGAT(SEQ ID NO:1)
CDH1-R:TCCCAGGCGTAGACCAAGA(SEQ ID NO:2)
CDH2-F:TGCGGTACAGTGTAACTGGG(SEQ ID NO:3)
CDH2-R:GAAACCGGGCTATCTGCTCG(SEQ ID NO:4)
PODXL-F:AGCTAAACCTAACACCACAAGC(SEQ ID NO:5)
PODXL-R:TGAGGGGTCGTCAGATGTTCT(SEQ ID NO:6)。
实施例6
本实施例使用免疫荧光染色技术对实施例1中分化第20天得到的细胞进行检测,证明得到的细胞为LTL+/CDH1+/PODXL+的肾上皮细胞。具体数据见附图9。其中,LTL是近端小管的标志性指标,CDH1为亨利氏环和远端小管的标志性指标,PODXL是肾小球祖细胞的标志性指标,DAPI是细胞核的染色。免疫荧光的抗体信息:Lotus tetragonolobus lectin(LTL),Vectorlabs,#FL-1321;E-cadherin(CDH1),Abcam,#ab40772;PODXL,R&D Systems,#AF1658;Donkey anti-Goat IgG,cy3,#705-165-147;Donkey anti-Goat IgG,FITC,#705-095-147;Donkey anti-Rabbit IgG,cy3,#711-165-152;
实施例7
本实施例对实施例1中得到的肾上皮细胞进行药物毒性测试,发现实施例1得到的肾上皮细胞结构成熟,其中近端小管具有对顺铂的药物毒性应答反应。
使用的顺铂药物信息:Cisplatin,SIGMA,#P4394-25MG。使用基础培养基E培养肾上皮细胞24h后,固定细胞进行免疫荧光染色,实验结果见图10。其中,顺铂终浓度为10-50uM,Kim1是近端小管损伤的标志性指标,LTL是近端小管的标志性指标,DAPI是细胞核的染色。免疫荧光抗体信息:Lotus tetragonolobus lectin(LTL),Vectorlabs,#FL-1321;Kim 1,R&D system,#AF1750;Donkey anti-Goat IgG,cy3,#705-165-147。
本实施例说明实施例1得到的肾上皮细胞能够用于肾脏药物毒性的测试。
实施例8
本实施例对实施例1中得到的肾上皮细胞进行肾脏疾病相关的药物作用的研究。实验分为对照组(control)和药物组,对照组使用生理盐水对肾上皮细胞进行处理,药物组使用等量的Rapamycin对肾上皮细胞进行处理。结果见图11,实验发现Rapamycin对囊泡有抑制作用。实施例1制备得到的肾上皮细胞可用于与肾脏疾病相关的药物筛选等科研实验需要。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 安徽中盛溯源生物科技有限公司
<120> 一种肾上皮细胞及其制备方法和应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atttttccct cgacacccga 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcccaggcgt agaccaaga 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgcggtacag tgtaactggg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gaaaccgggc tatctgctcg 20
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
agctaaacct aacaccacaa gc 22
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tgaggggtcg tcagatgttc t 21
Claims (15)
1.一种肾上皮细胞,其表达CDH1+和PODXL+,还至少表达CDH2+和LTL+中的一种。
2.一种制备肾上皮细胞的方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1:多能干细胞向后部原条细胞分化;
S2:后部原条细胞向后中间中胚层分化;
S3:后中间中胚层向肾祖细胞分化;
S4:肾祖细胞向肾管状聚集前体分化;
S5:肾管状聚集前体向肾泡分化;
S6:肾泡向肾上皮细胞分化。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述S1包括:
S11:将人多能干细胞的上清液吸除,加入肾上皮细胞分化完全培养基A诱导分化,所述肾上皮细胞分化完全培养基A包括Wnt信号通路激活剂、BMP4信号通路抑制剂和BMP4信号通路激活剂;
S12:每天更换培养基,培养4-5天。
4.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述S2包括:
S21:吸除后部原条细胞的上清液,加入肾上皮细胞分化完全培养基B诱导分化,所述肾上皮细胞分化完全培养基B包括TGF-β信号通路激活剂;
S22:每天更换培养基,培养2-3天。
5.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述S3包括:
S31:吸除后中间中胚层的上清液,加入肾上皮细胞分化完全培养基C诱导分化,所述肾上皮细胞分化完全培养基C包括FGF信号通路激活剂;
S32:每天更换培养基,培养2-3天。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,还包括步骤S33:将分化得到的肾祖细胞进行冻存。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,S33中使用冻存液对肾祖细胞进行冻存,所述冻存液包括体积百分数分别为5-20%和0-10%的DMSO和重组人血白蛋白。
8.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述S4采用2D的方式培养,包括以下步骤:
S41:吸除肾祖细胞的上清液,加入肾上皮细胞分化完全培养基D诱导分化,所述肾上皮细胞分化完全培养基D包括FGF信号通路激活剂和Wnt信号通路激活剂;
S42:每天更换培养基,培养2-3天。
9.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述S4采用3D的方式培养,包括以下步骤:
将肾祖细胞消化,用含有Rock抑制剂的肾上皮细胞分化完全培养基D重悬,置于三维摇床上悬浮培养。
10.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述S5包括:
S51:吸除肾管状聚集前体的上清液,加入肾上皮细胞分化完全培养基C诱导分化,所述肾上皮细胞分化完全培养基C包括FGF信号通路激活剂;
S52:每天更换培养基,培养2-3天。
11.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述S6包括:
S61:吸除肾泡的上清液,加入肾上皮细胞分化基础培养基E诱导分化;
S62:每天更换培养基,培养5-7天。
12.根据权利要求11所述的方法,其特征在于,所述肾上皮细胞分化基础培养基E包括谷氨酰胺、人转铁蛋白和胰岛素。
13.一种肾上皮细胞,其由权利要求2-12中任意一项所述的方法制备而得。
14.一种细胞群,其特征在于,富集有权利要求1或13中所述的肾上皮细胞。
15.一种治疗肾脏疾病的药物,其特征在于,所述药物包含权利要求1或13中所述的肾上皮细胞。
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