CN108300695B - 一种人类多能干细胞向造血干细胞分化的方法及培养添加剂 - Google Patents

一种人类多能干细胞向造血干细胞分化的方法及培养添加剂 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种人类多能干细胞向造血干细胞分化的方法及培养添加剂。本发明研制了一种能够大幅增强人类多能干细胞向造血干细胞分化效率的培养液。本发明还提供了一种人类多能干细胞向造血干细胞分化的新方法。采用本发明提供的制备方法可以获得造血干细胞，与传统的基质细胞共培养法及拟胚体培养法相比，该方法可以高效获得表达CD34和CD43双阳性的造血干细胞，化学成分确定、无动物源成分，大大提高了制备细胞的安全性，且具有耗时短、分化效率高、成本较低等特点。采用本发明提供的制备方法可大规模生产人造血干细胞，质量稳定，安全性高，为组织工程、药物研发和细胞治疗提供大量细胞来源。

Description

一种人类多能干细胞向造血干细胞分化的方法及培养添加剂
技术领域
本发明涉及一种人类多能干细胞向造血干细胞分化的方法及培养添加剂。
背景技术
人类多能干细胞包括人类胚胎干细胞和人类诱导多能干细胞，能分化为人体内各种组织，可以用来制作疾病模型、进行药物毒性检验，并可通过细胞移植，取代损伤病变的细胞，促进机体创伤修复和治疗疾病。造血干细胞终身存在于人体，能够分化为血液系统的各类细胞，包括红细胞、粒细胞、巨噬细胞、单核细胞、小胶质细胞、树突细胞、B-淋巴细胞、T-淋巴细胞、NK-淋巴细胞等，在临床治疗血液类疾病、癌症等方面有重要价值。
目前诱导人类多能干细胞向造血干细胞分化的途径主要有：拟胚体分化法和基质细胞共培养法。这些方法也存在一些缺陷：拟胚体法一般需要消耗大量多能干细胞，其分化阶段的不一致导致其分化效率普遍较低且耗时较长；基质细胞共培养法效率不稳定，会引入动物源成分。例如与小鼠骨髓基质细胞OP9细胞共培养，会引入鼠源性成分，为诱导分化的造血干细胞的临床应用带来安全隐患。
发明内容
本发明的目的是提供一种人类多能干细胞向造血干细胞分化的方法及培养添加剂。
本发明提供了用于制备造血干细胞的试剂盒，包括培养液Ⅱ、培养液Ⅲ、培养液Ⅳ和培养液Ⅴ；
所述培养液Ⅱ为如下(a1)-(a6)中的任一种：
(a1)含有无胰岛素的B27添加剂和人骨形成蛋白4的培养液；
(a2)含有无胰岛素的B27添加剂和人骨形成蛋白4的培养液；所述无胰岛素的B27添加剂在培养液Ⅱ中的体积百分含量为1-2％；所述人骨形成蛋白4在培养液Ⅱ中的浓度为5-10ng/ml；
(a3)含有无胰岛素的B27添加剂和人骨形成蛋白4的培养液；所述无胰岛素的B27添加剂在培养液Ⅱ中的体积百分含量为2％；所述人骨形成蛋白4在培养液Ⅱ中的浓度为5ng/ml；
(a4)含有无胰岛素的B27添加剂、L-谷氨酰胺或其替代物、甘氨酸、L-丙氨酸、L-门冬氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、青霉素、链霉素、维生素C和人骨形成蛋白4的培养液；
(a5)含有无胰岛素的B27添加剂、L-谷氨酰胺或其替代物、甘氨酸、L-丙氨酸、L-门冬氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、青霉素、链霉素、维生素C和人骨形成蛋白4的培养液；所述无胰岛素的B27添加剂在培养液Ⅱ中的体积百分含量为1-2％；所述L-谷氨酰胺或其替代物在培养液Ⅱ中的浓度为0.5-1mM；所述甘氨酸在培养液Ⅱ中的浓度为750.0ng/ml；所述L-丙氨酸在培养液Ⅱ中的浓度为890ng/mL；所述L-门冬氨酸在培养液Ⅱ中的浓度为1320ng/mL；所述L-天冬氨酸在培养液Ⅱ中的浓度为1330ng/mL；所述L-谷氨酸在培养液Ⅱ中的浓度为1470ng/mL；所述L-脯氨酸在培养液Ⅱ中的浓度为1150ng/mL；所述L-丝氨酸在培养液Ⅱ中的浓度为1050ng/mL；所述青霉素在培养液Ⅱ中的浓度为50-100U/ml；所述链霉素在培养液Ⅱ中的浓度为50-100μg/ml；所述维生素C在培养液Ⅱ中的浓度为25-50ng/ml；所述人骨形成蛋白4在培养液Ⅱ中的浓度为5-10ng/ml；
(a6)含有无胰岛素的B27添加剂、L-谷氨酰胺或其替代物、甘氨酸、L-丙氨酸、L-门冬氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、青霉素、链霉素、维生素C和人骨形成蛋白4的培养液；所述无胰岛素的B27添加剂在培养液Ⅱ中的体积百分含量为2％；所述L-谷氨酰胺或其替代物在培养液Ⅱ中的浓度为1mM；所述甘氨酸在培养液Ⅱ中的浓度为750.0ng/ml；所述L-丙氨酸在培养液Ⅱ中的浓度为890ng/mL；所述L-门冬氨酸在培养液Ⅱ中的浓度为1320ng/mL；所述L-天冬氨酸在培养液Ⅱ中的浓度为1330ng/mL；所述L-谷氨酸在培养液Ⅱ中的浓度为1470ng/mL；所述L-脯氨酸在培养液Ⅱ中的浓度为1150ng/mL；所述L-丝氨酸在培养液Ⅱ中的浓度为1050ng/mL；所述青霉素在培养液Ⅱ中的浓度为100U/ml；所述链霉素在培养液Ⅱ中的浓度为100μg/ml；所述维生素C在培养液Ⅱ中的浓度为50ng/ml；所述人骨形成蛋白4在培养液Ⅱ中的浓度为5ng/ml；
所述培养液Ⅲ为如下(b1)-(b3)中的任一种：
(b1)含有GSK3抑制剂的培养液Ⅱ；
(b2)含有1-2μM GSK3抑制剂的培养液Ⅱ；
(b3)含有2μM GSK3抑制剂的培养液Ⅱ；
所述培养液Ⅳ为如下(c1)-(c6)中的任一种：
(c1)含有添加了胰岛素的B27添加剂、人血管内皮生成因子VEGF-165和人成纤维生长因子的培养液；
(c2)含有添加了胰岛素的B27添加剂、人血管内皮生成因子VEGF-165和人成纤维生长因子的培养液；所述添加了胰岛素的B27添加剂在培养液Ⅳ中的体积百分含量为1-2％；所述人血管内皮生成因子VEGF-165在培养液Ⅳ中的浓度为25-50ng/ml；所述人成纤维生长因子在培养液Ⅳ中的浓度为5-10ng/ml；
(c3)含有添加了胰岛素的B27添加剂、人血管内皮生成因子VEGF-165和人成纤维生长因子的培养液；所述添加了胰岛素的B27添加剂在培养液Ⅳ中的体积百分含量为2％；所述人血管内皮生成因子VEGF-165在培养液Ⅳ中的浓度为50ng/ml；所述人成纤维生长因子在培养液Ⅳ中的浓度为10ng/ml；
(c4)含有添加了胰岛素的B27添加剂、L-谷氨酰胺或其替代物、甘氨酸、L-丙氨酸、L-门冬氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、青霉素、链霉素、维生素C、人血管内皮生成因子VEGF-165和人成纤维生长因子的培养液；
(c5)含有添加了胰岛素的B27添加剂、L-谷氨酰胺或其替代物、甘氨酸、L-丙氨酸、L-门冬氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、青霉素、链霉素、维生素C、人血管内皮生成因子VEGF-165和人成纤维生长因子的培养液；所述添加了胰岛素的B27添加剂在培养液Ⅳ中的体积百分含量为1-2％；所述L-谷氨酰胺或其替代物在培养液Ⅳ中的浓度为0.5-1mM；所述甘氨酸在培养液Ⅳ中的浓度为750.0ng/ml；所述L-丙氨酸在培养液Ⅳ中的浓度为890ng/mL；所述L-门冬氨酸在培养液Ⅳ中的浓度为1320ng/mL；所述L-天冬氨酸在培养液Ⅳ中的浓度为1330ng/mL；所述L-谷氨酸在培养液Ⅳ中的浓度为1470ng/mL；所述L-脯氨酸在培养液Ⅳ中的浓度为1150ng/mL；所述L-丝氨酸在培养液Ⅳ中的浓度为1050ng/mL；所述青霉素在培养液Ⅱ中的浓度为50-100U/ml；所述链霉素在培养液Ⅱ中的浓度为50-100μg/ml；所述维生素C在培养液Ⅳ中的浓度为25-50ng/ml；所述人血管内皮生成因子VEGF-165在培养液Ⅳ中的浓度为25-50ng/ml；所述人成纤维生长因子在培养液Ⅳ中的浓度为5-10ng/ml；
(c6)含有添加了胰岛素的B27添加剂、L-谷氨酰胺或其替代物、甘氨酸、L-丙氨酸、L-门冬氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、青霉素、链霉素、维生素C、人血管内皮生成因子VEGF-165和人成纤维生长因子的培养液；所述添加了胰岛素的B27添加剂在培养液Ⅳ中的体积百分含量为2％；所述L-谷氨酰胺或其替代物在培养液Ⅳ中的浓度为1mM；所述甘氨酸在培养液Ⅳ中的浓度为750.0ng/ml；所述L-丙氨酸在培养液Ⅳ中的浓度为890ng/mL；所述L-门冬氨酸在培养液Ⅳ中的浓度为1320ng/mL；所述L-天冬氨酸在培养液Ⅳ中的浓度为1330ng/mL；所述L-谷氨酸在培养液Ⅳ中的浓度为1470ng/mL；所述L-脯氨酸在培养液Ⅳ中的浓度为1150ng/mL；所述L-丝氨酸在培养液Ⅳ中的浓度为1050ng/mL；所述青霉素在培养液Ⅱ中的浓度为50-100U/ml；所述链霉素在培养液Ⅱ中的浓度为50-100μg/ml；所述维生素C在培养液Ⅳ中的浓度为50ng/ml；所述人血管内皮生成因子VEGF-165在培养液Ⅳ中的浓度为50ng/ml；所述人成纤维生长因子在培养液Ⅳ中的浓度为10ng/ml；
所述培养液Ⅴ为如下(d1)-(d3)中的任一种：
(d1)含有TGFβ抑制剂的培养液Ⅳ；
(d2)含有5-10μMTGFβ抑制剂的培养液Ⅳ；
(d3)含有10μMTGFβ抑制剂的培养液。
所述培养液Ⅱ的组成如下：无胰岛素的B27添加剂、人骨形成蛋白4和细胞基础培养液。
所述培养液Ⅱ的组成如下：无胰岛素的B27添加剂、L-谷氨酰胺或其替代物、甘氨酸、L-丙氨酸、L-门冬氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、青霉素、链霉素、维生素C、人骨形成蛋白4和细胞基础培养液。
所述培养液Ⅲ的组成如下：GSK3抑制剂和培养液Ⅱ。
所述培养液Ⅳ的组成如下：胰岛素的B27添加剂、人血管内皮生成因子VEGF-165、人成纤维生长因子和细胞基础培养液。
所述培养液Ⅳ的组成如下：添加了胰岛素的B27添加剂、L-谷氨酰胺或其替代物、甘氨酸、L-丙氨酸、L-门冬氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、青霉素、链霉素、维生素C、人血管内皮生成因子VEGF-165、人成纤维生长因子和细胞基础培养液。
所述培养液Ⅴ的组成如下：TGFβ抑制剂和培养液Ⅳ。
以上任一所述细胞基础培养液具体可为RPMI 1640基础培养液。
以上任一所述GSK3抑制剂具体可为如下(e1)-(e4)中的任一种：
(e1)CHIR-99021；
(e2)B216763；
(e3)BIO；
(e4)TWS119。
以上任一所述TGFβ抑制剂具体可为SB431542。
以上任一所述L-谷氨酰胺或其替代物具体可为Glutamax。
以上任一所述人骨形成蛋白4(BMP4)的蛋白质序列见序列表的序列1。
以上任一所述血管生成因子(VEGF-165)的蛋白质序列见序列表的序列2。
以上任一所述人成纤维生长因子(bFGF)的蛋白质序列见序列表的序列3。
所述试剂盒还包括培养液Ⅵ；所述培养液Ⅵ为如下(f1)-(f3)中的任一种：
(f1)含有细胞因子组合的干细胞培养液；所述细胞因子组合包括干细胞因子、白细胞介素-3、白细胞介素-6、血小板生成素和FMS样酪氨酸激酶受体-3配体；
(f2)含有细胞因子组合的干细胞培养液；所述细胞因子组合包括干细胞因子、白细胞介素-3、白细胞介素-6、血小板生成素和FMS样酪氨酸激酶受体-3配体；干细胞因子在培养液Ⅵ中的浓度为50-100ng/ml；白细胞介素-3在培养液Ⅵ中的浓度为10-20ng/ml；白细胞介素-6在培养液Ⅵ中的浓度为10-20ng/ml；血小板生成素在培养液Ⅵ中的浓度为50-100ng/ml；FMS样酪氨酸激酶受体-3配体在培养液Ⅵ中的浓度为50-100ng/ml；
(f3)含有细胞因子组合的干细胞培养液；所述细胞因子组合包括干细胞因子、白细胞介素-3、白细胞介素-6、血小板生成素和FMS样酪氨酸激酶受体-3配体；干细胞因子在培养液Ⅵ中的浓度为50ng/ml；白细胞介素-3在培养液Ⅵ中的浓度为10ng/ml；白细胞介素-6在培养液Ⅵ中的浓度为10ng/ml；血小板生成素在培养液Ⅵ中的浓度为50ng/ml；FMS样酪氨酸激酶受体-3配体在培养液Ⅵ中的浓度为50ng/ml。
所述培养液Ⅵ的组成如下：细胞因子组合和干细胞培养液(干细胞培养液甲)。
所述干细胞培养液甲具体可为StemSpanTM SFEM培养液。
所述试剂盒还包括培养液Ⅰ；所述培养液Ⅰ为如下(g1)-(g6)中的任一种：
(g1)含有ROCK抑制剂的干细胞培养液；
(g2)含有5-10μM ROCK抑制剂的干细胞培养液；
(g3)含有5μM ROCK抑制剂的干细胞培养液；
(g4)含有Y27632的干细胞培养液；
(g5)含有5-10μM Y27632的干细胞培养液；
(g6)含有5μM Y27632的干细胞培养液。
所述培养液Ⅰ的组成如下：ROCK抑制剂和干细胞培养液(干细胞培养液乙)。
所述培养液Ⅰ的组成如下：Y27632抑制剂和干细胞培养液(干细胞培养液乙)。
所述干细胞培养液乙为TeSR-E8培养液。
所述试剂盒还包括干细胞培养液。所述干细胞培养液具体可为TeSR-E8培养液。
本发明还保护一种制备造血干细胞的方法，包括如下步骤：
(2)将人多能干细胞接种于以上任一所述的培养液Ⅱ中，培养0.5-1.5天；
(3)将步骤(2)的细胞转移至以上任一所述的培养液Ⅲ中，培养1.5-2.5天；
(4)将步骤(3)的细胞转移至以上任一所述的培养液Ⅳ中，培养1.5-2.5天；
(5)将步骤(4)的细胞转移至以上任一所述的培养液Ⅴ中，培养2天-4天。
所述方法还包括步骤(6)：将步骤(5)得到的细胞转移至以上任一所述的培养液Ⅵ中，培养5-7天。
所述步骤(2)前还包括步骤(1)：将人多能干细胞接种于以上任一所述的培养液Ⅰ中培养。
所述步骤(1)具体为：(a)将人多能干细胞接种于培养液Ⅰ中培养0.5-1.5天；(b)将步(a)的细胞转接至干细胞培养液(干细胞培养液乙)中培养0.5-1.5天。
以上任一所述细胞培养的条件为37℃、5％CO2。
以上任一所述细胞培养的培养皿可采用Marigel包被，具体为37℃包被2h。
本发明还保护以上任一所述试剂盒在制备造血干细胞中的应用。
所述应用中，以人多能干细胞为出发细胞制备造血干细胞。
以上任一所述人多能干细胞为商业化人胚胎干细胞系H1或人诱导多能干细胞CD34-iPSC。
所述人胚胎干细胞系H1具体可来自美国WiCell细胞库，编号：WA01。所述诱导多能干细胞CD34-iPSC为利用仙台病毒重编程试剂盒(Invitrogen，货号：A16517)诱导人脐带血造血干细胞(CD34阳性细胞)重编程获得。
本发明研制了一种能够大幅增强人类多能干细胞向造血干细胞分化效率的培养液添加剂，此种添加剂不含动物源成分、化学成分确定，有利于作为临床级别的干细胞分化培养体系。本发明还提供了一种人类多能干细胞向造血干细胞分化的新方法，与现有方法相比，能显著提高分化效率并降低分化成本。
采用本发明提供的制备方法可以获得造血干细胞，采用单层细胞培养法分化造血干细胞，阶段性的加入调控WNT和TGFβ信号通路的小分子及阶段性撤除胰岛素的分化方法，与传统的基质细胞共培养法及拟胚体培养法相比，该方法可以高效获得表达CD34和CD43双阳性的造血干细胞，化学成分确定、无动物源成分，大大提高了制备细胞的安全性，且具有耗时短、分化效率高、成本较低等特点。采用本发明提供的制备方法可大规模生产人造血干细胞，质量稳定，安全性高，为组织工程、药物研发和细胞治疗提供大量细胞来源。
附图说明
图1为人多能干细胞的形态图。
图2为H1细胞的形态变化图。
图3为CD34-iPSC为细胞的形态变化图。
图4为中胚层前体细胞分化效率的细胞流式检测结果。
图5为造血干细胞分化效率的细胞流式仪检测结果。
图6为内皮细胞及造血干细胞的免疫荧光染色结果。
图7为造血干细胞集落(CFU)形成结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
人胚胎干细胞系H1(简称H1细胞)：美国WiCell细胞库，编号：WA01。
诱导多能干细胞CD34-iPSC(简称CD34-iPSC细胞)：利用仙台病毒重编程试剂盒(Invitrogen，货号：A16517)诱导人脐带血造血干细胞(CD34阳性细胞)重编程获得。
DMEM培养液：Gibco公司，货号：11965092。
RPMI 1640基础培养液：ThermoFisher公司，货号：11875093。
TeSR-E8培养液：STEMCELL公司，货号：05990。
StemSpanTM SFEM培养基：STEMCELL公司，货号：09650。
E8-Y培养液为含有5-10μM ROCK抑制剂Y27632的TeSR-E8培养液；本发明的实施例中，ROCK抑制剂Y27632在E8培养液中的浓度为5μM。
M1培养液为含有1-2％(v/v)无胰岛素的B27添加剂(B27 minus insulin)、0.5-1mM Glutamax、0.5-1％(v/v)非必须氨基酸(NEAA)、50-100U/ml青霉素、50-100μg/ml链霉素、25-50ng/ml维生素C和5-10ng/ml人骨形成蛋白4(BMP4)的RPMI1640培养液。本发明的实施例中，M1培养液中各组分浓度为：2％(v/v)无胰岛素的B27添加剂(B27 minus insulin)，1mM Glutamax，1％(v/v)非必须氨基酸(NEAA)，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，50ng/ml维生素C，5ng/ml人骨形成蛋白4(BMP4)。
M2培养液为含有1-2％(v/v)B27添加剂(B27 supplement)、0.5-1mM Glutamax、0.5-1％(v/v)非必须氨基酸(NEAA)、50-100U/ml青霉素、50-100μg/ml链霉素、25-50ng/ml维生素C、25-50ng/ml人血管内皮生成因子(VEGF-165)和5-10ng/ml人成纤维生长因子(bFGF)的RPMI1640培养液。本发明的实施例中，M2培养液中各组分浓度为：2％(v/v)B27添加剂(B27 supplement)，1mM Glutamax，1％(v/v)非必须氨基酸(NEAA)，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，50ng/ml维生素C，50ng/ml人血管内皮生成因子(VEGF-165)，10ng/ml人成纤维生长因子(bFGF)。
非必须氨基酸(NEAA，100×)：Gibco公司，货号：11140050；本发明的实施例中，在M1培养液或M2培养液中各氨基酸浓度为：甘氨酸750.0ng/ml，L-丙氨酸890ng/mL，L-门冬氨酸1320ng/mL，L-天冬氨酸1330ng/mL，L-谷氨酸1470ng/mL，L-脯氨酸1150ng/mL，L-丝氨酸1050ng/mL。
含有细胞因子组合的StemSpanTM SFEM培养基：将干细胞因子(stem cell factor，SCF)、白细胞介素-3(IL-3)、白细胞介素-6(IL-6)、血小板生成素(TPO)和FMS样酪氨酸激酶受体-3配体加至StemSpanTM SFEM培养基中；上述细胞因子在StemSpanTM SFEM培养基中的浓度可为干细胞因子50-100ng/ml、白细胞介素-3 10-20ng/ml、白细胞介素-6 10-20ng/ml、血小板生成素50-100ng/ml、FMS样酪氨酸激酶受体-3配体50-100ng/ml。本发明的实施例中，上述细胞因子在StemSpanTM SFEM培养基中的浓度为干细胞因子50ng/ml、白细胞介素-3 10ng/ml、白细胞介素-6 10ng/ml、血小板生成素50ng/ml、FMS样酪氨酸激酶受体-3配体50ng/ml。
B27添加剂(B27 supplement)：Gibco公司，货号：17504-044。
无胰岛素的B27添加剂(B27 minus insulin)：Gibco公司，货号：A1895601。
Glutamax：Gibco公司，货号：35050061。
维生素C：Sigma Aldrich公司，货号：A4403。
ROCK抑制剂Y27632：TargetMol公司，货号：T1870。Y27632的结构式如下：
Figure GDA0003135785000000081
人骨形成蛋白4(BMP4)：R&D BioSystems公司，货号：314-BP；蛋白质序列见序列表的序列1。
血管生成因子(VEGF-165)：SinoBiological公司，货号为：11066-HNAH；蛋白质序列见序列表的序列2。
人成纤维生长因子(bFGF)：SinoBiological公司，货号为：10014-HNAE；蛋白质序列见序列表的序列3。
GSK3抑制剂CHIR-99021：Tocris Biosciences公司，货号为：4423/10。CHIR-99021的结构式如下：
Figure GDA0003135785000000082
TGFβ抑制剂SB431542：Selleck公司，货号为：S1067。SB431542的结构式如下：
Figure GDA0003135785000000083
干细胞因子(stem cell factor，SCF)：PeproTech公司，货号为：300-07。
白细胞介素-3(IL-3)：PeproTech公司，货号为：200-03。
白细胞介素-6(IL-6)：PeproTech公司，货号为：200-06。
血小板生成素(TPO)：PeproTech公司，货号为：300-018。
FMS样酪氨酸激酶受体-3配体：PeproTech公司，货号为：300-19。
细胞消化液Accutase：Merk Millipore公司，货号为：SF006。
0.25％Trypsin：Gibco公司，货号为：25200056。
Matrigel：BD Biosciences公司，货号为：356231。
PE标记的FLK1抗体：R&D公司，货号为：FAB357P-025。
PE标记的CD43抗体：eBioscience公司，货号为：12-0439-42。
FITC标记的CD31抗体：Miltenyi公司，货号为：555445。
APC标记的CD34抗体：Miltenyi公司，货号为：555824。
PE标记的IgG抗体：eBioscience公司，货号为：12-4714-42。
抗人CD31抗体：Abcam公司，货号为：ab24590。
抗人CD34抗体：BD Biosciences公司，货号为：555820。
抗人CD43抗体：eBioscience公司，货号为：14-0439-82。
DyLight 488标记的二抗：Thermo公司，货号为：R37120。
DyLight 549标记的二抗：Thermo公司，货号为：R37121。
甲基纤维素MethoCult GF+4435半固体培养基：STEMCELL公司，货号为：H4435。
实施例1、人多能干细胞向造血干细胞分化
本实施例中采用的人多能干细胞为两种，分别是H1细胞和CD34-iPSC细胞。
1、将人多能干细胞接种于6孔板中(每孔2.5×105个细胞)，采用TeSR-E8培养液，37℃培养至细胞汇合度为70％-80％。
2、完成步骤1后，取所述六孔板，吸去培养上清，加入预热至37℃的PBS缓冲液洗涤2次。此时，H1细胞和CD34-iPSC细胞的形态图见图1(比例尺100微米)。
3、完成步骤2后，取所述六孔板，每孔加入1ml细胞消化液Accutase，37℃静置3-5min，然后加入适量RPMI 1640基础培养液终止消化，离心收集细胞。
4、将步骤3收集的细胞接种于培养皿(培养皿已采用Marigel 37℃包被2小时)中，接种密度为2.0×104个/cm2－4.0×104个/cm2，采用E8-Y培养液，于37℃、5％CO2培养箱中培养1天。
5、完成步骤4后，取所述培养皿，弃培养上清，更换为新鲜的TeSR-E8培养液，于37℃、5％CO2培养箱中培养1天。
6、完成步骤5后，取所述培养皿，弃培养上清，更换为M1培养液，于37℃、5％CO2培养箱中培养1天。
7、完成步骤6后，取所述培养皿，弃培养上清，更换为含有2μMGSK3抑制剂CHIR-99021的M1培养液，于37℃、5％CO2培养箱中培养2天。
8、完成步骤6后，取所述培养皿，弃培养上清，先加入适量0.25％Trypsin消化至单细胞状态，然后加入含10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养液终止消化，离心收集细胞(细胞B)。
9、将步骤8收集的细胞接种于培养皿(培养皿已采用Marigel 37℃包被2h)中，接种密度为2.5×104个/cm2－5.0×104个/cm2，采用M2培养液，于37℃、5％CO2培养箱中培养2天(每天更换新鲜的M2培养液)，得到细胞C。
10、完成步骤9后，取所述培养皿，加入TGFβ抑制剂SB431542，TGFβ抑制剂SB431542在培养体系中的浓度为10μM，于37℃、5％CO2培养箱中培养2-4天，可以逐渐看到有集落状细胞开始出现，呈现悬浮状态，为细胞D。
11、完成步骤10后，取所述培养皿，收集细胞中CD34和CD43双阳性的细胞，转移至含有细胞因子组合的StemSpanTM SFEM培养基中，于37℃、5％CO2培养箱中培养5-7天，得到细胞E，其表面表达成熟造血干细胞标志物CD45。
上述培养过程中，观察人多能干细胞的形态变化(第0天为步骤6中加入培养液M1的时刻)。部分人多能干细胞的形态变化见图2(H1细胞，比例尺50微米)和图3(CD34-iPSC细胞，比例尺100微米)。结果表明，人多能干细胞的形态逐渐转变为血管内皮细胞的形态，再进一步经历血管-造血的过渡产生悬浮的CD34和CD43阳性的造血干细胞。
实施例2、多能干细胞向造血干细胞分化过程中细胞的检测
一、细胞B的检测
1、取实施例1中步骤8得到的细胞B，采用含5％(v/v)胎牛血清的PBS缓冲液重悬细胞得到细胞悬浮液(含1×105个细胞)。
2、向步骤1的细胞悬浮液中加入PE标记的FLK1抗体(同时设置采用PE标记的IgG抗体替代PE标记的FLK1抗体的阴性对照)，室温避光孵育20分钟(期间每隔5分钟混匀一次)；然后用含5％(v/v)胎牛血清的PBS缓冲液洗涤2次，离心收集细胞。
3、完成步骤2后，采用500μL含5％(v/v)胎牛血清的PBS缓冲液重悬细胞，采用流式细胞仪检测。
采用H1细胞得到的中胚层前体细胞的检测结果见图4。
结果表明，采用培养液M1培养的细胞B，60％以上的细胞表面均表达中胚层前体细胞特异性表达的蛋白FLK1。
二、细胞C、D及E不同阶段的流式细胞检测
1、取实施例1中步骤9得到的细胞C、步骤10得到的细胞D和步骤11得到的细胞E，采用含5％(v/v)胎牛血清的PBS缓冲液重悬细胞得到细胞C悬浮液(含1×105个细胞)、细胞D悬浮液(含1×105个细胞)和细胞E悬浮液(含1×105个细胞)、。
2、向步骤1的细胞悬浮液中分别加入PE标记的CD43抗体，FITC标记的CD31抗体和APC标记的CD34抗体，室温避光孵育20分钟(期间每隔5分钟混匀一次)；然后用含5％(v/v)胎牛血清的PBS缓冲液洗涤2次，离心收集细胞。
3、完成步骤2后，采用500μL含5％(v/v)胎牛血清的PBS缓冲液重悬细胞，采用流式细胞仪检测。
采用H1细胞得到的不同阶段的细胞检测结果见图5。结果表明，采用培养液M2培养的细胞C和D，分别出现在第5天和第8天，而采用StemSpanTM SFEM培养的细胞E富集在分化18-19天。其中，第5天有50％以上的细胞表面均表达血管内皮细胞特异性表达的蛋白CD31。而第8天有约20％的细胞表达造血干细胞的特异标志物CD34和CD43。在第19天则有45％左右的细胞表达成熟造血干细胞的表面标志物CD45。
三、细胞D的免疫荧光检测
1、取实施例1中步骤10得到的细胞D，用4％多聚甲醛室温固定10分钟，然后吸去4％多聚甲醛，用PBS缓冲液洗涤3次(目的为除去残存的多聚甲醛)。
2、完成步骤1后，先加入含0.25％(v/v)Triton X-100的PBS缓冲液，室温静置20分钟；再加入含5％(v/v)BSA的PBS缓冲液室温封闭1h。
3、完成步骤2后，分别加入(体积比1：100)抗人CD31抗体、抗人CD34抗体及抗人CD43抗体，室温孵育2小时，然后用PBST(含0.1％吐温-20的PBS缓冲液)缓冲液洗涤3次。
4、完成步骤3后，分别加入Dylight488及549(体积比1：500)标记的二抗，室温孵育1h，然后用PBST缓冲液洗涤3次。
5、完成步骤4后，加入(体积比1：1000)DAPI，室温孵育20分钟，然后用PBST缓冲液洗涤3次。在荧光显微镜下观察细胞染色情况。
荧光显微镜下采用H1细胞得到的细胞D的染色情况见图6(比例尺50微米)。结果表明，细胞D为造血干细胞。
以上结果表明，培养液M2可以高效的将人多能干细胞诱导分化为造血干细胞。
四、细胞D的CFU克隆形成实验检测。
1、将1×104个实施例1中步骤10得到的细胞D重悬在100μl含有2％(v/v)B27添加剂的RPMI1640基础培养液中，得到细胞悬浮液。
2、将步骤1的细胞悬浮液与3mL甲基纤维素MethoCult GF+4435半固体培养基均匀混合，加入到6孔板的一个孔内，37℃、5％CO2培养箱中培养14天。
3、完成步骤2后，采集不同细胞的生成的血液集落图像。
采用H1细胞得到的细胞D的CFU集落生成实验结果见图7(比例尺100微米)。结果表明，细胞D具有形成红细胞集落，巨噬细胞集落，粒细胞集落，粒细胞-巨噬细胞集落等的能力，表明其为造血干细胞。
以上结果表明，采用培养液M1及M2可以高效的将人多能干细胞诱导分化为造血干细胞。
上述方法中，GSK3抑制剂CHIR-99021可替换为其他GSK3抑制剂(B216763、BIO或TWS119)，均可取得相同效果。
<110> 清华大学
<120> 一种人类多能干细胞向造血干细胞分化的方法及培养添加剂
<160> 3
<210> 1
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 1
Met Ser Pro Lys His His Ser Gln Arg Ala Arg Lys Lys Asn Lys Asn
1 5 10 15
Cys Arg Arg His Ser Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn
20 25 30
Asp Trp Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr Gln Ala Phe Tyr Cys His Gly
35 40 45
Asp Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala
50 55 60
Ile Val Gln Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Ser Ile Pro Lys Ala
65 70 75 80
Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp
85 90 95
Glu Tyr Asp Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Glu Met Val Val Glu
100 105 110
Gly Cys Gly Cys Arg
115
<210> 2
<211> 191
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 2
Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly
20 25 30
Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln
35 40 45
Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu
50 55 60
Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu
65 70 75 80
Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro
85 90 95
Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His
100 105 110
Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys
115 120 125
Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Lys Ser Val
130 135 140
Arg Gly Lys Gly Lys Gly Gln Lys Arg Lys Arg Lys Lys Ser Arg Tyr
145 150 155 160
Lys Ser Trp Ser Val Tyr Val Gly Ala Arg Cys Cys Leu Met Pro Trp
165 170 175
Ser Leu Pro Gly Pro His Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg
180 185 190
<210> 3
<211> 147
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 3
Met Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly
1 5 10 15
His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe
20 25 30
Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser
35 40 45
Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val
50 55 60
Ser Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp
65 70 75 80
Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys Cys Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe
85 90 95
Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr
100 105 110
Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly
115 120 125
Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser
130 135 140
Ala Lys Ser
145

Claims (6)

1.用于制备造血干细胞的试剂盒，包括培养液Ⅱ、培养液Ⅲ、培养液Ⅳ和培养液Ⅴ；
所述培养液Ⅱ为由无胰岛素的B27添加剂、L-谷氨酰胺或其替代物、甘氨酸、L-丙氨酸、L-门冬氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、青霉素、链霉素、维生素C和人骨形成蛋白4组成的培养液；所述无胰岛素的B27添加剂在培养液Ⅱ中的体积百分含量为2%；所述L-谷氨酰胺或其替代物在培养液Ⅱ中的浓度为1 mM；所述甘氨酸在培养液Ⅱ中的浓度为 750.0ng/ml；所述L-丙氨酸在培养液Ⅱ中的浓度为890ng/mL；所述L-门冬氨酸在培养液Ⅱ中的浓度为1320 ng/mL；所述L-天冬氨酸在培养液Ⅱ中的浓度为1330 ng/mL；所述L-谷氨酸在培养液Ⅱ中的浓度为1470 ng/mL；所述L-脯氨酸在培养液Ⅱ中的浓度为1150 ng/mL；所述L-丝氨酸在培养液Ⅱ中的浓度为1050 ng/mL；所述青霉素在培养液Ⅱ中的浓度为100U/ml；所述链霉素在培养液Ⅱ中的浓度为100μg/ml；所述维生素C在培养液Ⅱ中的浓度为50ng/ml；所述人骨形成蛋白4在培养液Ⅱ中的浓度为5ng/ml；
所述培养液Ⅲ为由CHIR-99021和所述培养液Ⅱ组成；所述CHIR-99021在培养液Ⅲ中的浓度为2μM；
所述培养液Ⅳ为由添加了胰岛素的B27添加剂、L-谷氨酰胺或其替代物、甘氨酸、L-丙氨酸、L-门冬氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、青霉素、链霉素、维生素C、人血管内皮生成因子VEGF-165和人成纤维生长因子组成的培养液；所述添加了胰岛素的B27添加剂在培养液Ⅳ中的体积百分含量为2%；所述L-谷氨酰胺或其替代物在培养液Ⅳ中的浓度为1mM；所述甘氨酸在培养液Ⅳ中的浓度为750.0ng/ml；所述L-丙氨酸在培养液Ⅳ中的浓度为890ng/mL；所述L-门冬氨酸在培养液Ⅳ中的浓度为1320 ng/mL；所述L-天冬氨酸在培养液Ⅳ中的浓度为1330 ng/mL；所述L-谷氨酸在培养液Ⅳ中的浓度为1470 ng/mL；所述L-脯氨酸在培养液Ⅳ中的浓度为1150 ng/mL；所述L-丝氨酸在培养液Ⅳ中的浓度为1050ng/mL；所述青霉素在培养液Ⅱ中的浓度为50-100U/ml；所述链霉素在培养液Ⅱ中的浓度为50-100μg/ml；所述维生素C在培养液Ⅳ中的浓度为50ng/ml；所述人血管内皮生成因子VEGF-165在培养液Ⅳ中的浓度为50ng/ml；所述人成纤维生长因子在培养液Ⅳ中的浓度为10ng/ml；
所述培养液Ⅴ为由SB431542和所述培养液Ⅳ组成；所述SB431542在所述培养液Ⅴ中的浓度为10μM。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括培养液Ⅵ；所述培养液Ⅵ为由细胞因子组合和干细胞培养液组成；所述细胞因子组合由干细胞因子、白细胞介素-3、白细胞介素-6、血小板生成素和FMS样酪氨酸激酶受体-3配体组成；干细胞因子在培养液Ⅵ中的浓度为50ng/ml；白细胞介素-3在培养液Ⅵ中的浓度为10ng/ml；白细胞介素-6在培养液Ⅵ中的浓度为10ng/ml；血小板生成素在培养液Ⅵ中的浓度为50ng/ml；FMS样酪氨酸激酶受体-3配体在培养液Ⅵ中的浓度为50ng/ml；所述干细胞培养液为StemSpan™ SFEM培养液。
3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括培养液Ⅰ；
所述培养液Ⅰ为由Y27632和干细胞培养液组成；所述Y27632在所述培养液Ⅰ中的浓度为5μM；所述干细胞培养液为TeSR-E8培养液。
4.一种制备造血干细胞的方法，包括如下步骤：
（1）将人多能干细胞接种于权利要求1中所述的培养液Ⅱ中，培养0.5-1.5天；
（2）将步骤（1）的细胞转移至权利要求1中所述的培养液Ⅲ中，培养1.5-2.5天；
（3）将步骤（2）的细胞转移至权利要求1中所述的培养液Ⅳ中，培养1.5-2.5天；
（4）将步骤（3）的细胞转移至权利要求1中所述的培养液Ⅴ中，培养2天-4天；
所述人多能干细胞为人胚胎干细胞系H1或诱导多能干细胞系CD34-iPSC。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述方法还包括步骤（5）：将步骤（4）得到的细胞转移至权利要求2中所述的培养液Ⅵ中，培养5-7天。
6.权利要求1至3中任一所述试剂盒在制备造血干细胞中的应用。
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