CN116368220A - 用于大规模制造多能干细胞来源的细胞的封闭制造工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明在多能干细胞的领域。特别地，所述发明涉及用于多能干细胞向预选细胞类型诸如例如心肌细胞或内皮细胞分化的(封闭系统)诱导的方法。如本文所公开的方法特别有用于扩大源自多能干细胞的细胞、特别是源自多能干细胞的(人)心肌细胞和/或内皮细胞的生产。

Description

用于大规模制造多能干细胞来源的细胞的封闭制造工艺
背景技术
背景说明包括可能有用于理解本发明的信息。这并不是承认本文提供的任何信息是现有技术或与目前要求保护的发明相关，或者明确或隐含引用的任何出版物是现有技术。
在整个医学领域，基于干细胞的应用的疗法被认为是有前途的。尤其是具有增殖和分化潜力的多能干细胞(PSCs)的可用性被认为是临床中细胞治疗(也称为细胞疗法、细胞替代疗法或基于细胞的疗法)的有前途的发展。例如诱导性多能干细胞和胚胎多能干细胞等多能干细胞，由于其多能性，能够分化成用于预期治疗用途的目标细胞。例如，从此类多能干细胞离体获得的神经元细胞、视网膜细胞、肺细胞、肝细胞、胰腺细胞、心血管细胞、或免疫系统的细胞用于细胞治疗的可用性将是最受欢迎的。
这样的多能干细胞来源的细胞的潜在治疗用途的一个实例是使用心肌细胞、内皮细胞、成纤维细胞和/或这些细胞的任何组合来替代不可逆损伤的心肌以治疗心肌梗塞(参见，例如，Cell&Gene Therapy Insights 2020；6(1),177–191DOI:10.18609/cgti.2020.023)。
这样的多能干细胞来源的细胞的治疗用途的另一个实例可以是使用携带靶向肿瘤的抗原受体的同种异体或自体免疫细胞治疗癌症。其它实例可以是(诱导性)多能干细胞来源的淋巴细胞用于过继细胞免疫疗法的用途(参见，例如，Curr Hematol MaligRep.2019；14(4):261–268doi:10.1007/s11899-019-00528-6)。
潜在的治疗用途，例如上文例示的一种，需要大量的多能干细胞来源的细胞。例如，在心肌梗塞中，可能有超过10亿个心肌细胞受到不可逆损伤。利用当前可用的方案，这仍然需要时间和材料上的巨大投资以能够在临床良好生产规范(clinical GoodManufacturing Practice,cGMP)条件下制造足够量的细胞。
对于其它适应症，例如眼睛的疾病，较少量的细胞足以治疗一名患者，但是制造足够的细胞用于全球患者群体仍然需要扩大制造工艺以达到需求能力。
一个主要缺点在于，本领域已知的用于将(诱导性)iPSC分化成一种以上的预选的期望的细胞类型(例如肝细胞)的方法依赖于在小培养皿或烧瓶中最多产生每皿几百万个细胞的劳动密集型工艺，这使得制造足够的细胞用于治疗成为细胞疗法领域的头号挑战。
因此，为了满足工业上可应用的可扩大的制造工艺的需求，需要该领域提供可扩大的方法，并且所述方法可以与临床良好生产规范(cGMP)相容。只有在此类方法可用的情况下，才有可能生产大量的多能干细胞，并且更重要的是，大量的(预选的)多能干细胞来源的分化细胞，包括上述提及的那些。因此，高度期望以允许多能干细胞来源的分化细胞的安全、不受干扰、可控、可预测、较低操作强度和较低劳动强度的生产的方式扩大现有的培养、分化和制造工艺。
在本领域中充分确立的是，通过将多能干细胞暴露于特定的培养条件或方案，使用包含特定小分子和其它引导(steering)化合物(的组合)的培养基，可以诱导和控制多能干细胞向不同谱系的细胞分化(参见，例如，Breckwoldt等.Nat Protoc.2017Jun；12(6):1177-1197.doi:10.1038/nprot.2017.033或Induced Pluripotent Stem Cells–Methodsand Protocols(Turksen and Nagy)；doi:10.1007/978-1-4939-3055-5)。包含小分子或引导化合物(的组合)以例如激动或拮抗在细胞分化的特定阶段中引导分化的特定途径。这意指在分化过程中在正确的时间调节正确的途径在该领域中被认为是重要的。类似地，认为拮抗或抵消在分化的特定阶段期间所需的途径的途径不被激活或被拮抗是重要的。事实上，这并不罕见，例如，需要在分化的第一阶段期间被拮抗以分化成预选细胞类型的途径，在分化的后期阶段期间不起作用，并且不应该再被拮抗，或者甚至应该在分化的后期阶段期间被激动，因为这可能在分化的后期阶段期间负面地影响分化(参见例如，欧洲专利文献EP3433355)。
小规模的细胞分化的方法是通过如下来进行的：在生物安全柜中操纵细胞并在培养箱中培养，通过人工操作来进行利用其它培养基的培养基替换(例如，用包含用于相同途径的第二例如拮抗性引导化合物的第二培养基替换包含第一例如激动性引导化合物的第一培养基)。然而，该领域正在寻找将人工操作减少到最低的培养系统。即，人工操作难以规模化、非常昂贵并且带来污染和破坏培养物的无菌性的重大风险。
同时，非常需要提高制造的可重复性和一致性。人工培养系统中的工艺参数的实时调整是劳动密集型的，因此难以实施。因此，该领域正在寻找可被监控并且可以在适当的地方进行调整的制造系统。
同时，该领域正在寻求扩展从多能干细胞获得的分化细胞的制造规模。然而，基于多个烧瓶的横向扩展(Scale out)策略是极其劳动密集型的并且费时的。为了提供大量的细胞，需要数百个烧瓶，这在收获细胞和将细胞作为单批次进行下游处理方面面临着重大挑战。。此外，存在每个培养瓶的细胞质量的显著差异的风险(参见，例如，Assou等(2018)Stem Cells 36,814–821)。
因此，已经在该领域开始多项举措以提供能够扩大多能干细胞培养的新方法。然而，此类系统的局限性在于，在培养期间，例如在进行细胞分化的下一阶段之前，所述系统仍然需要离心步骤、过滤步骤和/或洗涤步骤，诸如，例如WO2009/072003中所述。
现有技术中描述的在生物反应器中培养多能干细胞的方法主要涉及在培养中维持/支持干细胞群体。在这样的方法中，培养通过连续搅拌来维持，其中一旦如此频繁地人工更换培养细胞的培养基，有破坏系统的无菌性的风险。描述用于培养多能干细胞的搅拌罐式生物反应器的其它先前描述的方法利用灌注系统用于封闭系统中的培养基更换。这样的灌注系统的缺点在于存在过滤器堵塞的风险，特别是如果在培养期间必须更换大量的培养基。
重要的是，扩大多能干细胞来源的细胞制造通常需要向多能干细胞和/或多能干细胞来源的细胞提供一系列的不同的培养基。在这种获得分化细胞的过程中，一系列的培养基包含制备和/或诱导细胞定向分化的(不同的)化合物的组合。然而，利用封闭系统培养的本领域目前已知的方法限于维持或产生多能干细胞，并且目前没有以可控的方式和在封闭培养系统中生产大量的多能干细胞来源的分化细胞的可靠、可预测、易于操作的培养方法，并且细胞疗法的应用中的这一瓶颈在本领域中被广泛认可。
鉴于此，高度期望培养和生产大量的(预选的)干细胞来源的分化细胞的新方法。特别地，在本领域中明显需要可靠、有效并且可重复的方法，并且所述方法允许制造大量的不同类型的多能干细胞来源的分化细胞。
因此，本发明的技术问题可为提供满足任何前述需求的此类方法。所述技术问题通过权利要求和下文中表征的实施方案而得到解决。
附图说明
参考附图在下文中进一步描述本发明的实施方案，其中：
图1：根据本发明的示意性制造设置的实例。用于制造iPSC分化细胞的封闭系统，包括4℃的培养基储存袋、37℃的破碎罐(break tank)、和收集袋。泵与管道相连以将培养基泵入和泵出生物反应器。可单独供给NaHCO3用于pH控制。生物反应器可以具有用于pH的在线校正的pH探针(未示出)。可以使用无菌焊接将培养基袋连接至系统。
具体实施方式
定义
本公开的一部分包含受版权保护的材料(例如，但不限于，本提交文件的图、装置照片、或任何其它方面，其版权保护在任何司法管辖区都可用或可能可用的)。版权所有者不反对任何人对出现在专利局专利文件或记录中的专利文件或专利公开进行拓制，但在其它方面保留所有版权。
说明书和权利要求书通篇中使用了与本发明的方法、组合物、用途和其它方面相关的各种术语。除非另有说明，否则这些术语被赋予了它们在本发明所属技术领域中通常的含义。其它明确定义的术语将以与本文提供的定义一致的方式来解释。尽管在试验本发明的实践中可以使用类似于或等同于本文所述的那些的任何方法和材料，但是本文描述了优选的材料和方法。
出于本发明的目的，下文中定义了以下术语。
除非上下文中另外明确说明，否则，如本文所用，单数形式的术语“一”、“一个”和“该”包括复数个指示物。因此，例如，提及“一个细胞”包括两个以上的细胞的组合等。
如本文所用，术语“约”和“近似”，在指代可测量值如量、持续时间等时，意指包括自所述可测量值±20％、±10％、更优选±5％、甚至更优选±1％、还更优选±0.1％的变化，以这种方法，变化适于执行所公开的方法。
如本文所用，术语“和/或”是指其中一种以上的规定的情况可能单独发生或与至少一种规定的情况组合发生、多至与所有规定的情况组合发生的情况。
如本文所用，术语“至少”特定值是指该特定值以上。例如，“至少2”被理解为与“2以上”相同，即2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15等。如本文所用，术语“至多”特定值是指该特定值以下。例如，“至多5”被理解为与“5以下”相同，即5、4、3、…-10、-11等。
如本文所用，“包含”或“要包含”被解释为包含性的并且开放式的，而非排除性的。具体地，该术语及其变体意指包括指定的特征、步骤或组分。这些术语不应被解释为排除其它特征、步骤或组分的存在。它还包括更限制性的“由……组成”。
如本文所用，“常规技术”或“技术人员已知的方法”是指实施本文公开的方法中所用的常规技术的方法对技术人员来说将是显而易见的情况。分子生物学、生物化学、细胞培养、基因组学、测序、医学治疗、药理学、免疫学和相关领域中的常规技术的实践是本领域技术人员众所周知的，并且在各种手册和参考文献中进行了讨论。
如本文所用，“示例性”是指“用作实例、示例、或说明”，并且不应该被解释为排除本文公开的其它配置。
如本文所用，与细胞有关的“聚集体”、“聚集”和“聚集的”是指几种主要类型的细胞组织之一，即一个细胞与另一个细胞或多个细胞的连接或聚类(clustering)。此外，它不包括通常被称为“粘附”的细胞与基质的连接。细胞的聚集是基于细胞-细胞相互作用。这样的相互作用可以通过细胞表面蛋白在细胞之间形成，并且通常存在于许多生物系统中，例如组织、器官等。细胞的聚集可以通过搅拌或混合包含(多能干)细胞的培养基而体外诱导或维持。当停止搅拌或混合分散的细胞的水性悬浮液时，细胞聚集体比单细胞更可能快速下沉至培养容器的底部(沉降)。聚集体可以由一种细胞类型组成、或者可以包含不同的细胞类型。聚集体的构成可以是恒定的、或者可以改变。例如，最初，聚集体可以主要由多能干细胞组成，然而，在细胞培养期间，(部分)的多能干细胞可以向一种以上的预选细胞类型分化，例如心肌细胞(例如心房和/或心室)。在一些实施方案中，在用于体外制造一种以上的预选细胞类型的培养系统中引入的细胞是以聚集体的形式引入的。在一些实施方案中，在用于体外制造一种以上的预选细胞类型的培养系统中引入的细胞不是聚集体的形式，和/或优选地是单细胞的形式。在本文公开的方法的该优选实施方案中，聚集体在培养容器中混合培养基期间形成。在所述方法的进一步优选实施方案中，在所述方法中，多能干细胞以单细胞悬浮液的形式引入，在用于多能干细胞的增殖的培养基中培养(不具有或具有一次以上的根据本发明的培养基替换)，从而允许多能干细胞在培养容器中增殖并形成聚集体，并且随后在用于多能干细胞向一种以上的预选细胞类型分化的培养基中培养(不具有或具有一次以上的根据本发明的培养基替换)。特别地，在本发明的方法的此类实施方案中，可以获得期望的结果(例如，关于数量、相对数量、引入的细胞相对于获得的细胞的比等)。
如本文所用，“预选细胞类型”是指预选为要用本文公开的方法获得的细胞类型的某种类型的细胞。这样的预选细胞类型可以是例如心血管细胞、心肌细胞、内皮细胞、造血谱系细胞、造血祖细胞、从造血祖细胞分化的细胞、单核细胞、(共同)骨髓祖细胞、(共同)淋巴祖细胞、巨噬细胞、T细胞、B细胞、NK细胞、树突状细胞、神经元细胞、视网膜细胞、肺细胞、肝细胞、胰腺细胞、或属于生血内皮的细胞。除非另有说明，否则术语“预选细胞类型”包括任何“预选细胞类型”谱系细胞，并且可应用于“预选细胞类型”个体发育的任何阶段的细胞。例如，“预选细胞类型”可以包括“预选细胞类型”(谱系受限)前体或祖细胞(不是多能干细胞)(即，在没有去分化或重编程的情况下能够产生包括“预选细胞类型”的子代的细胞，例如，未成熟的“预选细胞类型”细胞或胎儿“预选细胞类型”细胞)和成熟的“预选细胞类型”细胞(成体样“预选细胞类型”细胞)。优选地，“预选细胞类型”细胞是胎儿、未成熟或成熟(成体样)“预选细胞类型”细胞。这样的“预选细胞类型”的细胞可以表达“预选细胞类型”谱系的典型标志物并且是本领域众所周知的。根据本发明的“预选细胞类型”细胞是通过分化从多能干细胞体外获得的。体外分化是通过本文公开的方法进行的。术语“预选细胞类型”也可以指用本文公开的方法获得的多于一种的预选细胞类型。例如，在某些实施方案中，“预选细胞类型”可以指T细胞以及淋巴祖细胞，或者可以指心房心肌细胞和心室心肌细胞。优选地，预选细胞类型是人预选细胞类型。
例如，除非另有说明，否则如本文所用，“心肌细胞(cardiomyocytes,cardiacmyocyte)”是指任何心肌细胞谱系细胞，并且可应用于心肌细胞个体发育的任何阶段的细胞。例如，心肌细胞可以包括心肌细胞前体或祖细胞(不是多能干细胞)(即，在没有去分化或重编程的情况下能够产生包括心肌细胞的子代的细胞，例如，未成熟的心肌细胞或胎儿心肌细胞)和成熟的心肌细胞(成体样心肌细胞)。心肌细胞包括心房型心肌细胞、心室型心肌细胞、和结节型(nodal type)心肌细胞。优选地，心肌细胞是胎儿、未成熟或成熟(成体样)心肌细胞。与成熟心肌细胞同样的，心肌细胞祖细胞可以表达心肌细胞谱系的典型标志物，包括但不限于心肌肌钙蛋白I(cTnI)、心肌肌钙蛋白T(cTnT)、肌球蛋白重链(MHC)、GATA-4、Nkx2.5、N-钙粘蛋白、β1肾上腺素受体(β1-AR)、ANF、转录因子的MEF-2家族、肌酸激酶MB(CK-MB)、肌红蛋白或心房利钠因子(ANF)。根据本发明的心肌细胞通过多能干细胞的分化而体外获得。体外分化是通过本文公开的方法进行的。
同样地，“内皮细胞”是指从祖细胞至成熟的任何发育阶段的内皮细胞。内皮细胞是指一种薄的、扁平的细胞，一层细胞排列在体腔、血管和淋巴管的内表面，构成内皮。与成熟内皮细胞同样的，内皮祖细胞可以表达内皮谱系的典型标志物，包括但不限于CD31、CD144(VE-钙粘蛋白)、CD54(I-CAM1)、vWF、VCAM、CD106(V-CAM)、VEGF-R2(参见，例如，Orlova等.Arteriosclerosis,Thrombosis,and Vascular Biology.2014；34:177–186)。根据本发明的内皮细胞获自体外分化的多能干细胞。体外分化优选通过实施例中公开的方法来进行。
同样地，除非另有说明，否则造血谱系细胞是指任何造血谱系细胞，并且可应用于造血个体发育的任何阶段的细胞，包括祖细胞。造血祖细胞(HPC)是指保持有丝分裂并且可以产生更多祖细胞或前体细胞或者可以分化成终末命运造血细胞谱系的细胞。HPC的人标志物包括:CD31、CD34、CD43、CD133、CD235a、CD41和CD45，其中CD41+表示巨核细胞祖细胞、CD235a+红细胞祖细胞、CD34+CD45+早期淋巴/骨髓谱系祖细胞、CD56+NK谱系祖细胞、CD3+T细胞、和CD19+CD20+B细胞。
同样地，除非另有说明，否则神经元谱系细胞是指任何神经元谱系细胞，并且可应用于神经元个体发育的任何阶段的细胞，包括祖细胞。神经祖细胞(NPC)是指保持有丝分裂并且可以产生更多祖细胞或前体细胞或者可以分化成终末命运神经元细胞谱系的细胞。NPC的人标志物包括：Sox2、Pax6和巢蛋白。成熟神经元对神经元核(NeuN)、微管蛋白β3类III(TUBB3)和微管相关蛋白2(MAP2)呈阳性。
如本文所用，“封闭培养系统”是指封闭/密封的包括培养容器和添加的组分的培养系统。所述封闭和/或密封的系统通常在使用前和密封后进行灭菌，从而保持其无菌性。在培养容器的使用期间，仅最低限度地、优选不破坏系统的完整性，从而保持系统的无菌性。例如，系统的完整性可以通过提起帽或盖、打开阀或管等来破坏)。如本文所用，术语“封闭系统”优选是指包括培养生物反应器或培养容器及其组分的封闭培养系统，包括，例如用于混合包含在培养容器中的培养基的部件和用于收集和替换(部分的)培养基而不破坏无菌性的部件。所述生物反应器用于制造、维持、培养、生长、分化、和操纵细胞培养物，而不破坏封闭系统的无菌性的完整性。在本文公开的方法中使用的封闭系统允许收集和替换培养基和/或培养基中的(单细胞)。还可以在封闭培养系统中培养/制造细胞的过程中收集培养基的样品用于进程内(in-process)收集和分析。可以使用无菌连接器或使用无菌管焊接将装有培养基的袋子连接至系统(例如，焊接机如
Figure BDA0004138308860000091
IIB terumo、biowelder Satorius和/或连接器如kleenpak presto无菌连接器(pall)、Millipore的Lynx S2S、SartoriusStedim Biotech的Opta SFT-1、GE的ReadyMate DAC、或Saint-Gobain的Pure-Fit SC)。
如本文所用，“培养”、“培育”、“生长”或其变体当针对一种以上的细胞时，是指在各种类型的培养基中繁殖、扩增或维持细胞群体的方法步骤。常规方法和技术是分子生物学、生物学、生物化学、基因组学、细胞培养等领域的技术人员众所周知的。尽管术语“培养”通常被理解为包括细胞的增殖或分裂，但它也包括在培养基中分化细胞的方法。如本文所用，术语还包括利用本文公开的方法体外制造从多能干细胞分化的预选细胞类型的目的。
术语“培养基”还包括、并且优选包括适用于人或动物细胞的长期体外细胞培养的培养基。此类培养基包含足够的组分以允许细胞在例如至少一天、优选至少两天、三天、四天、五天、六天以上的更长的时间内生长、增殖和/或分化。“成分确定的培养基(definedculture medium)”是指适用于人或动物细胞的体外细胞培养的(生长)培养基，其中所有的化学组分是已知的。这样的成分确定的培养基不包含或基本上不包含任何不确定(ill-defined)的营养源和/或其它不确定的因子。培养基优选可以是无血清的。本文所述的培养基可包含一种以上的化合物，故意包含所述化合物以引导增殖和/或分化，即通过使培养容器中的细胞与培养基接触，例如在接触的持续时间内，包含在培养基中的化合物例如通过激动或拮抗这些细胞中的特定(代谢)途径，在细胞向一种以上的预选细胞类型分化的特定阶段期间引导例如分化。
如本文所用，“培养容器”是指生物反应器、罐、烧瓶或适用于细胞培养的任何其它装置。如本文所用的培养容器的体积可以是从几mL至数百升的任何体积，优选地，培养容器的体积为2–150升、或2–100升、或2–50升，和/或允许在这样体积的培养基中培养。优选地，培养容器的体积为至少2、3、5、8、10、20、50升和/或具有允许在至少2、3、5、8、10、20、50升的培养基中培养的体积。如本文所提供的，培养容器可以具有不同的配置。换言之，容器可以是立式容器、立式轮式反应器或袋式反应器或技术人员已知的任何其它生物反应器。
如本文所用，“分化(differentiating,differentiation)”涉及细胞沿谱系内的发育途径进一步向下进展。多能干细胞的分化可以通过存在于培养基中并且指导此类干细胞在谱系内的分化的化合物来诱导。如上所述，在细胞分化的不同阶段，提及不同的化合物(组合)，在本文中也称为引导化合物。分化典型地由细胞基因与细胞的化学和物理环境的相互作用来控制，通常通过涉及嵌入细胞表面的蛋白质的信号通路来控制。可选地，分化可以通过诱导分化的基因的异位表达而被进一步引导。
在本发明中，分化是多能干细胞在向细胞谱系内的终末分化细胞进展中经历的生物学过程。有效的分化过程表征为高分化效率(表达感兴趣的细胞；即预选细胞类型的标志物的细胞的数量)和高产量(在该过程中获得的细胞数量)。为了获得如此高产量的预选细胞类型，令人惊讶地发现，在同一过程中伴随地分化和增殖是有益的。还令人惊讶地发现，在一些实施方案中，在本发明的方法中有益的是，将多能干细胞以单细胞悬浮液的形式引入，在用于多能干细胞的增殖的培养基中培养(不具有或具有一次以上的根据本发明的培养基替换)，从而允许多能干细胞在培养容器中增殖并形成聚集体，随后在用于多能干细胞向一种以上的预选细胞类型分化的培养基中培养(不具有或具有一次以上的根据本发明的培养基替换)。特别地，在本发明的方法的此类实施方案中，可以获得期望的结果(例如，关于数量、相对数量、引入的细胞相对于获得的细胞的比等)。
通过暴露于分化诱导培养基组合物并使用本文公开的方法，在多能干细胞中、优选人源的多能干细胞中，诱导利用根据本发明的方法向预选细胞类型分化的过程。(多能)干细胞可以分化成三种胚层(外胚层、内胚层和中胚层)中的任何一种，并且可以进一步分化成作为谱系受限祖细胞的细胞类型，其进而可以分化成更特定类型的细胞。此类谱系受限的祖细胞进而可以分化成进一步受限的细胞(例如，心脏祖细胞、内皮祖细胞、神经祖细胞、肺祖细胞、胰腺祖细胞、造血祖细胞等)，其进而可以分化成终末分化细胞(例如，心肌细胞、内皮细胞、神经元、星形胶质细胞、肝细胞、肺泡细胞、T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞、红细胞生成细胞等)。分化通常可以通过使用特定的分化标志物来检测。在本发明的上下文中，优选将(人)多能干细胞分化成预选分化细胞类型，并显示胎儿、但优选成熟或成体样表型。多能干细胞优选是诱导性(人)多能干细胞或胚胎干细胞，优选人多能干细胞。优选地，多能干细胞是人多能干细胞。
除了上述提及的多能干细胞以外，成体干细胞(adult stem cell)也可用于本文公开的方法。成体干细胞包括例如造血干细胞(HSCs)、乳腺干细胞、肠干细胞、间充质干细胞、内皮祖细胞、内皮祖细胞、神经干细胞、嗅成体干细胞、神经嵴干细胞、和睾丸干细胞(生殖细胞、精原干细胞)。因此，根据另一方面，本文公开的关于多能干细胞的发明也应用于成体干细胞的用途。
如本文所用，“胚胎干细胞”，缩写为“ES细胞”或ESC(或如果是人来源的为“hES细胞”或“hESCs’”)，是指来源于囊胚的内细胞团的干细胞。技术人员理解如何获得这样的胚胎干细胞，例如，如Chung(Chung等(2008)Stem Cell Lines,Vol 2(2):113-117)所描述的，其采用了一种不会导致破坏一个以上的供体胚胎的技术。各种ESC系已在NIH人类胚胎干细胞登记处(NIH Human Embryonic Stem Cell Registry)中列出。
如本文所用，“诱导性多能干细胞”或“iPSC”是指来源于非多能干细胞的细胞(即，来自相对于多能干细胞为分化的细胞)的多能干细胞。诱导性多能干细胞可以来源于多种不同的细胞类型，包括终末分化细胞。诱导性多能干细胞通常具有胚胎干细胞样形态，生长为具有大的核-质比、明确的边界和突出的细胞核的扁平的集落。此外，诱导性多能干细胞可以表达本领域普通技术人员已知的一种以上的关键多能性标志物。为了产生诱导性多能干细胞，体细胞可以例如被提供有本领域已知的重编程因子(例如Oct4、SOX2.KLF4、MYC、Nanog、Lin28等)以重编程体细胞以成为多能干细胞。
如本文所用，“多能性”是指具有分化成构成一种以上的组织或器官的所有细胞的潜能的(干)细胞的属性，例如，三种胚层中的任何一种：内胚层(例如内胃壁(interiorstomach lining)、胃肠道、肺)、中胚层(例如心脏、肌肉、骨骼、血液、泌尿生殖道)、或外胚层(例如表皮组织和神经系统)。
如本文所用，“多能干细胞”或“PSC”是指能够产生生物体的所有细胞类型并且可以产生哺乳动物的胚层如内胚层、中胚层和外胚层的细胞的干细胞，并且至少包括多能胚胎干细胞和诱导性多能干细胞。多能干细胞可以以不同的方式获得。例如，多能胚胎干细胞可以从胚胎的内细胞团获得。诱导性多能干细胞(iPSCs)可以来源于体细胞。多能干细胞也可以是已确立的细胞系的形式。多能干细胞可以携带基因操纵以使细胞更适用于细胞疗法。例如，细胞可以在HLA I类和II类基因座被编辑以变成免疫豁免的。细胞可以携带抗原受体用于靶向特定的细胞类型。细胞可以携带(诱导型)构建体以促进向所需细胞类型的分化，或者携带诱导型构建体以杀死细胞，作为移植后的安全措施。
如本文所用，“增殖(proliferating,proliferation)”涉及通过细胞分裂增加(生长)群体中的细胞的数量，即细胞经历有丝分裂。细胞增殖通常被理解为是由多种信号转导途径响应于环境、包括生长因子和其它丝裂原(mitogens)而协同激活的结果。细胞增殖也可以通过从细胞内或细胞外信号的作用释放和阻断或负面影响细胞增殖的机制来促进。/pct
如本文所用，“干细胞”是指通过其在单细胞水平上自我更新和分化以产生子代细胞的能力定义的未分化的细胞的群体，包括自我更新祖细胞、非更新祖细胞和终末分化细胞(Morrison等.(1997)Cell 88:287-298)。干细胞在培养中具有无限期分裂的能力。干细胞是可以体外稳定增殖和培养的细胞，并且是全能、多能(pluripotent)、诱导性多能、专能(multipotent)、寡能或单能细胞，在本文公开的方法中，干细胞优选(至少)为多能的，然而，根据本发明的其它方面，也预期用于本文公开的方法中的干细胞是专能、寡能或单能干细胞，优选专能干细胞。干细胞分为体细胞(成体)干细胞或胚胎干细胞。干细胞可以表征为存在特定标志物(例如，蛋白质、RNA等)并且不存在特定标志物。干细胞也可以通过体外和体内的功能性检测来鉴定，特别是与干细胞产生多种分化子代的能力相关的检测。
如本文所用，“未分化的”是指尚未发育出进一步分化的谱系受限祖细胞的特征的干细胞。如本领域技术人员将理解的，术语未分化和分化是彼此相对的。分化的和未分化的细胞通过本领域已良好确立的标准彼此区分，例如但不限于形态学特征(例如，大小、形状、体积、细胞核体积与细胞质体积的比)、表达特征(例如，存在(遗传)标志物)等。
详细说明
预期本文描述的任何方法、用途或组合物可以相对于本文描述的任何其它方法、用途或组合物来实施。在本发明的方法、用途和/或组合物的上下文中讨论的实施方案可以用于本文描述的任何其它方法、用途或组合物。因此，与一种方法、用途或组合物相关的实施方案也可以应用于本发明的其它方法、用途和组合物。
如本文所体现和广泛描述的，本发明涉及一种新的且令人惊讶的用于制造预选细胞类型的体外方法。所述方法用于诱导多能干细胞向这样的预选细胞类型分化和/或用于制造这样的预选的分化的多能干细胞来源的细胞(或不同类型的细胞)，优选在封闭培养系统中。所述方法允许大量制造这样的分化细胞。所述方法允许高的细胞输出相对于细胞输入比(例如，由细胞数量表示)。
本发明利用了这样的事实：与在生物反应器中生长的大多数细胞不同，多能干细胞(以及大多数成体干细胞)可以在悬浮培养期间形成聚集体，并且不需要像微载体那样的支持。本发明可以提供半自动培养方法以获得从多能干细胞获得的大量的分化细胞(通过诱导分化)。特别地，发现可以提供一种允许大规模生产多种多能干细胞来源的分化细胞的方法，并且所述方法可靠、可重复、并且不依赖于复杂的培养步骤和/或培养装置。使用本文公开的方法，可以产生大量的分化细胞，并且这种从干细胞的预选细胞类型的制造可以在相对较短的时间内并且使用相对简单和直接的方法完成，从而满足了针对体外生产从多能干细胞来源的(人)分化细胞的领域的实际需求。
对此，本发明提供一种用于体外制造从多能干细胞分化的预选细胞类型的方法，优选在封闭培养系统中，其中所述方法包括以下步骤：
a)提供多能干细胞和培养基；
b)将所述多能干细胞和培养基引入至培养容器中，优选地，其中所述培养容器是封闭培养系统的一部分，其中所述培养基是
i)用于增殖所述多能干细胞的培养基；或
ii)用于诱导所述多能干细胞向所述预选细胞类型分化的培养基；
c)混合所述培养容器中的培养基，从而允许细胞以细胞聚集体的形式生长和防止所述细胞聚集体的沉降；
d)停止混合所述培养容器中的培养基，从而允许所述细胞聚集体沉降；
e)收集所述培养容器中的部分培养基；
f)任选地，在步骤b)中使用用于增殖多能干细胞的培养基的情况下，在所述培养容器中引入用于增殖多能干细胞的另外的培养基，并重复步骤c)-e)；
g)将后续培养基引入至所述培养容器中，其中所述培养基是用于诱导细胞向预选细胞类型分化的培养基；
h)混合所述培养容器中的培养基，从而允许细胞以细胞聚集体的形式生长和防止所述细胞聚集体的沉降；
i)停止混合所述培养容器中的培养基，从而允许所述细胞聚集体沉降；
j)收集所述培养容器中的部分培养基，并对于后续培养基重复步骤g)-i)，或收集所述培养容器中的(部分的)培养基、收集所述培养容器中的所述细胞聚集体、或收集两者。
令人惊讶地发现，在去除或收集培养基的方法的步骤中，在将后续培养基引入培养容器之前，可以仅去除培养容器中的部分培养基。换言之，令人惊讶地发现，在向细胞提供新的培养基之前，不需要去除基本上所有的培养基。迄今为止，本领域技术人员的一般理解是，为了使分化方案起作用，在引入后续培养基之前，需要替换基本上所有的培养基。特别地，在依赖于使用不同培养基的分化方案中，培养基的这种完全替换被认为是必要的，所述不同培养基包含开启或关闭分化途径的化合物，例如多能干细胞的心脏分化期间的典型Wnt信号传导的情况。与这种通常理解相反，现在已经发现，在引入后续培养基之前，不需要替换基本上所有的培养基，该后续培养基可以具有不同的组成，例如通过包含或多或少的不同营养物，所述不同营养物例如指导细胞向预选细胞类型的进一步分化。事实上，本发明人观察到，通过在培养容器中保留至少(大)部分的先前的培养基，不仅避免了可能对细胞健康有害的额外步骤，而且提供了由此获得的分化干细胞的提高的存活率、细胞数量和性质。
不受理论的束缚，本发明人预期利用本发明的方法所获得的令人惊讶的效果至少部分地是因为使用本文公开的方法，细胞向期望的预选细胞类型(一种以上)的增殖和/或分化可以不被干扰地继续。本发明人认为，需要对细胞进行例如离心(沉淀)细胞以去除培养基、过滤细胞以去除培养基、洗涤细胞以去除培养基等此类处理的现有技术的方法，或者包括连续去除和替换培养基的现有技术的方法，可能导致细胞的不太理想的增殖和分化。
特别地，向特定分化细胞的分化由不同(信号传导)途径的微妙且平衡的参与组成，所述途径需要在分化的不同阶段被开启或关闭(例如，通过使用所述途径的特定激动剂或拮抗剂)，并且本发明人预期，通过在向细胞提供第二培养基之前从细胞中去除第一培养基(即，分离细胞和培养基)，或者通过洗涤细胞等，可能导致正在进行的细胞分化的(暂时)减慢、停止或甚至被干扰。本发明人认为，通过不去除基本上所有的培养基，分化过程保持不受干扰，或者至少受到较小程度的干扰。此外，本发明人认为，通过允许部分培养基保留在培养系统中，细胞在特定分化期间产生的额外因子有助于细胞的持续分化。本发明人认为，上述至少部分地解释了利用本发明的方法获得的令人惊讶的高细胞数。
此外，在一个优选实施方案中，在本发明的方法中，多能干细胞以单细胞悬浮液的形式引入至培养容器中，并在培养的同时形成聚集体。在一个优选实施方案中，以单细胞悬浮液的形式引入的细胞在用于诱导性多能干细胞的增殖的培养基中培养的同时形成聚集体。在另一实施方案中，以单细胞悬浮液的形式引入的细胞在用于诱导性多能干细胞的分化的培养基中培养的同时形成聚集体。在一个实施方案中，将单细胞悬浮液中的细胞引入至培养容器中，在用于增殖多能干细胞的培养基中。不受理论的束缚，认为通过将多能干细胞以未聚集细胞的悬浮液的形式引入至培养容器中，并在培养容器中的后续培养期间发生聚集体形成，在培养容器中获得最佳且同质的细胞聚集体群体，并提供改进的用于预选细胞类型的制造。
因此，发现可以从多能干细胞制造分化细胞(预选细胞类型的)，优选使用封闭培养系统，而不需要复杂的离心步骤，并且其中提供给封闭培养系统的多能干细胞任选地在同一个培养系统中以允许产生大量的此类分化细胞的方式增殖、分化成预选细胞类型。
此外，发现本文公开的方法是稳健的，因为其可用于获得多种分化细胞。令人惊讶地发现，所述方法足够稳健以允许在小规模(例如15mL)下进行优化，并随后扩大至使用几升的培养基的培养。令人惊讶地发现，使用本文公开的方法，通过在增加体积的培养容器中分化干细胞，扩大预选细胞类型的制造成为可能。本文公开的方法允许从干细胞高效制造预选细胞类型，并提供关于通过本文公开的方法获得的细胞数量相对于所提供的初始干细胞数量的高输出相对于输入比，并允许高细胞密度。例如，在一些实施方案中，初始干细胞密度为每毫升培养基约200000个细胞，而通过本文公开的方法获得的特定预选细胞类型的最终密度可以为每毫升培养基3000000个细胞以上(在该实例中，因子或比为15以上)。例如，在一些实施方案中，引入的细胞数量与获得的预选细胞数量之间的比至少为1:10、1:12、1:15、1:20、或1:25。考虑到关于预选细胞类型的现有技术，这样的数量是非常期望的、但是似乎是前所未有的。利用本文公开的方法，现在可以使用简单、可重复的方法步骤，以更高的每体积培养基的细胞密度、在更大体积的培养基中制造更多数量的预选细胞类型，这些步骤足够稳健，可以应用于从多能干细胞制造广泛的预选细胞类型，因此满足了本领域长期以来的需要。
此外，使用本文公开的方法，可以容易地控制培养参数，如pH、CO2、生物量、溶解氧和乳酸浓度(lactate concentration)。此类参数进而可以与所用的分化方案结合使用以获得预选细胞类型，以在培养期间增加或优化细胞密度，目的是使预选细胞类型的产量最大化。例如，基于培养期间培养基中的生物量、细胞密度和/或乳酸累积(lactatebuildup)，可以确定培养基收集和新鲜培养基添加的最佳时刻，进一步优化预选细胞类型的总体生产。
通过提供本文公开的方法，并且其中允许细胞群体、即细胞聚集体、在(每个)培养基收集步骤之间沉降，存在于培养容器中的培养基可以被容易地部分地收集，例如通过使用自培养基上部向下的抽吸，同时使细胞聚集体细胞群体和部分培养基不受影响。在添加后续(并且优选在组成上不同的)培养基后，诱导细胞分化的方法通过混合沉降的细胞群体而继续。
所述方法的一个独特优点是，所述系统还允许从培养系统中的聚集体收获单细胞、和分泌的蛋白质和/或外来体。为了实现这一点，停止混合培养容器中的培养基一段时间，并且进行细胞的沉降足够长的时间，以保持大多数的单细胞或蛋白质和/或外来体悬浮在培养基中，但是允许较大且较重的聚集体沉降。然后，通过抽吸来收获包括单细胞、分泌的蛋白和/或外来体的培养基。这对于由造血内皮形成并作为造血祖细胞(HPC)从培养基中作为单细胞的细胞聚集体分泌的造血谱系细胞特别有用。造血祖细胞(HPC)可以产生更多的祖细胞或前体细胞，或者可以分化成终末命运造血细胞谱系细胞如巨噬细胞、树突状细胞、T细胞或B细胞。这种分化可以在同一培养容器中进行，也可以在收获造血祖细胞后，在另一培养系统中进行。
尽管对于增殖的干细胞，发现聚集体的沉降与不期望的聚集体聚集/融合的高风险相关，这是因为聚集体在底面等处集中在一起，但是本发明人在本发明的方法中没有观察到这种缺陷，其中干细胞被诱导分化为预选细胞类型，并且其中仅部分地替换培养基。事实上，发现通过使用本发明的方法，获得的预选细胞类型细胞群体具有优异的细胞特征和细胞性质，例如(表达)标志物或生物活性。
进一步注意到，本发明的方法促进多能干细胞的细胞聚集体的分化，任选地作为所述方法的第一阶段，并且促进其增殖，优选在连续封闭培养系统中。在不需要任何(大量的)(人工的)人为干预的情况下，本发明提供了一种具有减少的交叉污染风险的、通过在封闭培养系统中诱导多能干细胞分化来制造预选细胞类型的方法。
封闭培养系统允许如本文所公开的方法，其中细胞可以被长期培育、培养、生长。在所述封闭系统中，允许多能干细胞形成细胞聚集体并向预选的分化细胞分化。所述系统允许无菌系统，减少人为干预，从而降低交叉污染的风险。
本文公开的方法包括以下步骤：a)提供多能干细胞和(第一)培养基和b)将多能干细胞和培养基引入至培养容器中，所述培养容器优选是封闭培养系统的一部分。可选地，培养基和/或干细胞已经存在于培养容器中，并将多能干细胞或培养基的任一者添加至培养容器中。
所述培养基可以是
i)(适用于)增殖多能干细胞的培养基；或
ii)(适用于)诱导多能干细胞向预选细胞类型分化的培养基。优选地，步骤a)中提供的培养基和步骤b)中引入的培养基是用于诱导多能干细胞向预选细胞类型(一种以上)分化的培养基。
例如，取决于所引入的多能干细胞的数量，可以决定首先允许多能干细胞增殖一定时间以获得期望数量的多能干细胞(聚集体)。在这种情况下，培养基可以是用于增殖多能干细胞的任何合适的培养基，例如市售可得的mTeSR1、StemMACSTMiPS-Brew XF、Essential 8、TeSR E8、mTeSR Plus和/或Nutristem培养基。在(优选)实施方案中，其中多能干细胞作为单细胞悬浮液引入，单细胞将在用于增殖干细胞的培养基中培养期间形成聚集体(聚集通常将在几小时内开始，例如2–3小时后)。
可选地，例如，在将足够数量的多能干细胞引入至培养容器中的情况下(例如，每毫升0,5–1,5百万个细胞以上)，可通过添加作为第一培养基的适用于起始或诱导多能干细胞向预选细胞类型分化的培养基而立即诱导多能干细胞向预选细胞类型分化。在(优选)实施方案中，其中多能干细胞作为单细胞悬浮液引入，单细胞将在用于诱导分化的培养基中培养期间形成聚集体。
取决于多能干细胞需要分化成的预选细胞类型，本领域技术人员知晓可适当地使用哪种培养基。在这方面注意到，不需要培养基提供多能干细胞向预选细胞类型的完全分化，但是如本文所解释的，也可以使用具有不同连续组成的培养基以起始、引导、促进和/或增强细胞向预选(分化)细胞类型的分化。
关于本发明的方法中限定的各个步骤，注意在步骤a)中，可以向培养系统提供本领域技术人员已知的任何种类的多能干细胞，包括诱导性多能干细胞。例如，尽管多能干细胞可以作为多能干细胞聚集体的群体提供，但是作为替代方案，也可以作为单细胞(例如分散在合适的培养基中)提供多能干细胞，并且一旦存在于培养容器中，允许这些细胞形成聚集体。所提供的多能干细胞可以是一种类型的多能干细胞、或者可以是不同类型的多能干细胞的混合物。
如上文已经提及的，注意到通过在提供促进培养容器中的细胞聚集体的分化的培养基之前向封闭培养系统提供增殖培养基，可以促进细胞聚集体的(进一步)增殖。
步骤a)中提供的细胞可以以包含单细胞、聚集体或两者的接种物提供，使得在步骤c)中开始培养之前，培养容器中的多能干细胞的初始细胞密度优选每毫升培养基1x104–1x 106个细胞。
在所述方法的步骤a)中提供之前，步骤a)的多能干细胞优选在例如培养烧瓶或生物反应器中预培养。在步骤a)之前，细胞可以例如在适用于培养(人)多能干细胞如(人)诱导性多能干细胞(iPSCs)或(人)胚胎干细胞(ESCs)的培养基中培养。在步骤a)中提供之前，细胞可以被洗涤，并且随后可以彼此分离和/或从培养烧瓶分离。
此外，步骤a)中提供的培养基可能已经包含多能干细胞的单细胞和/或聚集体，或者一旦培养基处于优选封闭的培养系统中，可将细胞添加至培养基。
在如本文公开的方法的步骤b)中，将培养基和多能干细胞引入至培养容器中，优选所述培养容器是封闭培养系统的一部分。根据本文公开的步骤b)引入至培养容器中的细胞是步骤a)中提供的细胞。类似地，根据步骤b)引入至培养容器中的培养基是步骤a)中提供的培养基。
有许多类型的封闭培养系统、培养容器或生物反应器适用于本文公开的方法。特别地，本文提供的生物反应器优选包含搅拌器机构或允许在培养期间混合包含细胞的培养基的其它部件。合适的系统的实例是定制的不锈钢/玻璃反应器或一次性系统，例如Ambr和Biostat(Sartorius)、PBS(PBS biotech)、Dasbox和Bioflo(Eppendorf)、Appiflex(Applikon)、Wave和Xuri(GE/Cytiva)，典型容积范围从几毫升多至数百升。
此外，本文公开的生物反应器可以包括氧气和CO2的控制、以及用于测量生物量、细胞密度、培养基的pH值、乳酸浓度和/或用于测量培养基中包含的以及培养容器中引入的溶解氧的量的探针。此类探针和控制是技术人员已知的。
在将合适的培养基和多能干细胞引入至培养容器中后，在本文公开的方法的步骤c)中开始培养。将理解，细胞的培养是在优选合适的缓冲的培养基中、在适合细胞培养的温度和/或适合增殖或分化的温度下进行的，这取决于培养基是i)用于增殖多能干细胞的培养基，还是ii)用于诱导多能干细胞向预选细胞类型分化的培养基。
如本领域技术人员所理解的，细胞培养基的参数如pH、温度、溶解氧浓度和渗透压将取决于细胞的类型。本领域技术人员已知如何提供最佳的pH、温度、溶解氧浓度和渗透压。
优选地，对于本文公开的方法，在培养期间，pH选择为6.9～7.5和/或温度选择为29～39℃和/或渗透压选择为260～400mOsm/kg。
在另一实施方案中，使用利用在线pH测量的碳酸氢盐缓冲的基础培养基。可以使用CO2来降低pH值和使用碱(碳酸氢盐或NaOH)提高pH值，来进行pH调节。同样，氧气优选被控制在生理相关范围内(3-21％)。
本文提供的方法的步骤c)包括混合含有步骤b)中引入培养容器中的细胞的培养基的步骤。混合通常由培养容器/培养系统的混合部件诱导。可以使用任何类型的混合部件，例如通过搅拌培养基来进行混合、或通过(轻轻)振荡培养容器来进行混合。
优选地，混合是连续的，尽管也预期了在继续所述步骤中的混合之前，含有细胞的培养基的混合可以在步骤c)(和/或步骤h)期间停止一小段时间，例如1至5分钟。
培养基的混合允许培养容器中的细胞以细胞聚集体的形式(继续)生长(同样地，在多能干细胞最初作为单细胞或细胞悬浮液引入的情况下，在这种情况下聚集体在培养过程中形成)。还发现培养基的混合允许(多能干)细胞在适合分化的培养基存在下向预选的细胞类型分化。
此外，培养基的混合防止了细胞聚集体的沉降和/或细胞聚集体的彼此粘附。取决于例如培养基中的细胞数量、和所用的培养基等，技术人员理解如何混合培养基使得细胞能够形成或保持细胞聚集体的形式、同时防止所述聚集体在培养/生长期间沉降。
本文公开的方法的步骤c)中的培养基的混合以及随后的细胞培养可以在本发明的范围内根据需要进行，和/或只要提供给培养容器的培养基支持细胞的培养即可。
在一个实施方案中，继续混合直至培养容器中的培养基不再支持培养容器中细胞的生长。在另一实施方案中，在停止混合之前，继续混合一定时间并允许细胞聚集体沉降(例如，如根据本发明的方法的步骤d)中所提供的)。例如，步骤c)中的混合可以持续至少1、2、4、6、8、12、24、36、48、72、96小时，例如1–72小时、2–60小时、或2–48小时。
在已经混合培养基期望的时间量以允许培养容器中的细胞以细胞聚集体的形式生长之后，在步骤d)中，停止混合培养容器中的培养基。通过停止混合培养基，允许培养基中的细胞聚集体沉降，优选通过重力沉降。
尽管预期可以选择步骤d)中停止混合培养基的任何时间段，但发现根据反应器的配置，可以容易地确定使聚集体沉降和/或使单细胞、分泌的蛋白和外来体漂浮在培养基中所需的时间。通常，在3升生物反应器(容器)中，使细胞聚集体沉降，即沉向培养容器的底部所需的时间为5分钟～240分钟，优选20分钟～60分钟。
在步骤e)中，从培养容器中收集部分培养基，例如通过(小心地)抽吸培养基。尽管其它培养基排出或收集部件可以用于从培养容器中收集部分培养基，但抽吸是最优选的选择。从细胞聚集体已经沉降的培养容器中收集培养基是以细胞聚集体受到最小干扰并保持沉降的方式收集培养基，例如通过从培养基的上层抽吸。优选进行部分培养基的去除，使得没有或仅有限的聚集体被从培养容器中去除。
可选地，代替通过抽吸去除培养基，也可以使用例如位于距离培养容器的底部的预定高度处的排水系统从培养容器中排出培养基。这样的高度可以例如取决于培养容器中沉降的细胞聚集体的层的厚度和/或要去除的培养基的量。
无论从培养容器中收集培养基的方式如何，注意到令人惊讶地发现，通过不从培养容器中收集所有的培养基并用新鲜的培养基替换它，而是通过在向培养容器中的剩余培养基添加后续的新鲜的培养基之前、仅从培养容器中收集部分培养基(由此其中部分先前培养基与后续培养基混合)，可以设计产生大量的分化良好型细胞并使用优选的封闭系统的稳健且可重复的制造工艺。
例如，在一个实施方案中，收集培养容器中至多95体积％、90体积％、85体积％或80体积％的培养基，以能够有效地切换培养基组成和/或收获(单)细胞或由细胞分泌至培养基中的物质。例如，在该实施方案中，在培养容器包含10升的培养基的情况下，从培养容器中收集最多9500、9000、8500或8000毫升的培养基。
同时发现，优选地，从培养容器中收集至少30体积％、40体积％、50体积％、60体积％或70体积％的培养基。因此，在一些实施方案中，在步骤e)(和/或步骤j))中，从培养容器中收集例如30体积％-95体积％、或40体积％-95体积％、或50-95体积％、或60-90体积％或60-80体积％、或70-90体积％、或70-80体积％的培养基。如技术人员将理解的，根据本发明的方法，在收集培养基的不同时刻之间，收集的培养基的量或百分比可以变化。例如，在第一次培养基收集期间，可以收集并替换培养容器中70体积％的培养基，然而，在后续培养基收集期间，可以收集并替换相同、更多或更少(例如50体积％或75体积％)。
同时，技术人员将理解，例如在步骤h)或i)之后并且优选在步骤j)之前，本发明的方法还可以包括额外的培养步骤(一个以上)，并且其中，在步骤i)之后，收集培养容器中基本上所有的培养基(例如大于95体积％，优选大于98体积％)并且用后续培养基(相同但不同体积)替换，然后在后续培养基(或者在该步骤重复多于一次的情况下的培养基)中培养细胞，并且优选地，随后收集培养容器中的培养基、收集培养容器中的细胞聚集体、或者收集两者。
技术人员还将理解，例如，实施本发明的方法至少一次直至步骤h)或i)之后，优选至少两次、三次以上，可以使用培养基替换/更新或培养的其它技术继续细胞培养，诸如，例如通过培养基灌注，并且其中连续或每几(例如2–5)小时更新一定(小)体积的培养基。换言之，在这样的实施方案中，首先利用根据本发明的方法并且如本文所述获得细胞，然后使用普通或其它培养基更换技术或培养技术如灌注(例如本领域已知的)使细胞继续生长，例如进一步分化。细胞的持续培养可在同一培养容器中进行，或者可以首先收集细胞或细胞聚集体并将其引入至新的培养装置、系统或容器中，并在其中进一步培养。例如，在巨噬细胞的情况下，本发明的方法可用于获得大量的且高质量的生血内皮细胞和/或单核细胞。然后，可以通过继续使用本文公开的方法，例如在相同的培养系统/培养容器中，或者通过使用普通或其它培养基更换技术或培养技术和方法，例如灌注，将这些细胞进一步分化为巨噬细胞。也可以决定收集细胞(或聚集体)并将它们转移至新的培养系统中，并允许转移的细胞继续生长或向在该实例中为巨噬细胞分化。
收集的培养基可被排出或可用于例如分离存在于所述培养基中的单细胞或用于收集可能存在于此类培养基中的其它物质，例如分泌的蛋白质、激素或、在优选实施方案中的外来体或其它类型的细胞外囊泡。
优选地，步骤e)和/或步骤j)中从培养容器中去除的培养基的量使得保留在培养容器中的培养基与在步骤f)或步骤g)(如下文中讨论的)中添加至培养容器中的新鲜培养基的比为1:1至1:15，例如1:3–1:10，例如1:4–1:8，例如1:1,5或1:2,5、或1:5。关于在收集培养容器中的部分培养基后添加的新鲜添加的培养基，注意到它的体积可以不同于所收集的培养基的体积。例如，在去除4升培养基的情况下，引入至培养容器中的新鲜培养基的体积可以是4升，但也可以多于4升或少于4升。添加至培养容器中的新鲜培养基的体积可以是例如从培养容器中收集的培养基体积的10-200％，例如50-150％。因此，添加新鲜培养基后的培养基的体积可以与先前培养基的体积相同、或者可以多于或少于先前培养基的体积(例如，在先前培养基为10升，并且在添加6新鲜培养基之前去除7升的情况下，添加新鲜培养基后的培养基的体积为9升，这比先前培养基的体积少1升)。
在一些优选实施方案中，本申请中描述的过程可以与补料策略(feedstrategies)组合实施以延迟该过程中的培养基更新。补料策略依赖于向生物反应器中添加小体积的高度浓缩的营养混合物以补偿被细胞完全代谢的营养物。这些补料策略允许将关键营养物保持在生理相关水平，并且可以帮助避免由于关键营养物浓度过高或过低而导致的毒性。因此，在一些实施方案中，所述方法包括例如在步骤c)和/或步骤h)期间向培养基中添加额外的组分或营养物。优选地，在这样的实施方案中，添加是在不停止混合和/或不(部分地)替换培养容器中存在的培养基的情况下进行的。
在从培养容器中收集部分培养基后，将新的新鲜培养基引入至培养容器中，以允许存在于培养容器中的细胞聚集体的另一轮混合和生长(增殖和/或分化)。
如上所述，在某些实施方案中，在诱导分化之前，可能首先期望允许本文公开的方法的步骤b)中引入的多能干细胞增殖，例如增加培养容器中的细胞总数。
在这种情况下，如上所述，适用于增殖多能干细胞的培养基用于上述讨论的步骤a)–e)中。如果需要，例如为了甚至进一步增加培养容器中的多能干细胞的总数，可以通过向培养容器中的细胞聚集体提供用于增殖培养容器中的多能干细胞(多能干细胞聚集体)的另外的培养基来重复步骤c)–e)。这样的另外的增殖培养基可以与第一增殖培养基相同或不同。
然而，如果不需要或不期望多能干细胞的另外的增殖周期，则可以跳过细胞的该另外的增殖周期。因此，提供了任选的步骤f)，其中在步骤b)中使用用于增殖多能干细胞的培养基的情况下，将用于增殖多能干细胞的另外的培养基引入至培养容器，之后重复步骤c)-e)。技术人员理解，原则上，这些任选的增殖步骤可以根据需要并且在多能干细胞在诱导细胞向预选(分化的)细胞类型分化的培养基中培养之前经常重复。然而，在实践中发现，重复步骤c)-e)以进一步增殖多能干细胞应该限制在不超过3个周期、优选2个周期(步骤c)–e))。
然而，根据另一实施方案，例如，在优选的实施方案中，在步骤b)中使用用于诱导多能干细胞向预选细胞类型分化的培养基的情况下，或者在步骤b)中使用用于增殖多能干细胞的培养基并且不需要或不期望使用用于增殖多能干细胞的培养基进行进一步增殖的情况下，在步骤g)中向培养容器中的细胞聚集体和剩余的先前培养基添加新鲜培养基。
在步骤g)中添加至细胞(和步骤e)后剩余的培养基)的后续培养基是用于诱导多能干细胞向预选细胞类型分化的培养基。因此，取决于本文公开的方法的步骤b)中使用的培养基，细胞聚集体现在被诱导向预选细胞类型分化、或者被进一步引导向预选的(分化的)细胞类型。
在步骤h)中，在混合用于细胞分化的培养基的情况下，允许细胞向预选细胞类型分化。
如已经对于步骤c)所解释的，优选地，混合是连续的，尽管也预期了在继续所述步骤中的混合之前，含有细胞的培养基的混合可以停止一小段时间，例如1至5分钟。
培养基的混合允许培养容器中的细胞以细胞聚集体的形式继续生长、以及分化。实际上，发现培养基的混合允许细胞在用于分化的合适的培养基的存在下向预选细胞类型分化。
令本发明人惊讶的是，发现在细胞向预选(分化的)细胞类型分化期间，细胞聚集体在过程结束时显示出良好的且提高的细胞总细胞计数(细胞数)，这表明在诱导/引导向预选细胞类型分化的条件下培养期间的细胞数的持续增长(产量)。同时所述方法显示了聚集体中细胞的同质分化(homogenous differentiation)(由此提供了预选细胞类型的同质细胞群体)。
换言之，使用本文公开的方法，既可以提高分化细胞(预选细胞类型)的产量，也可以提高所获得的分化细胞的质量，因为在可比的情况下，大部分的细胞向预选细胞类型分化，提供了分化细胞的相对同质的群体，在整个获得的细胞群体(预选细胞类型)中显示出可比的特征。
在一些实施方案中，步骤h)中的混合可以持续至少1、2、4、6、8、12、24、36或48小时，并且例如至多1周或2周，例如12-48小时、2-60小时或2-96小时。
在已经混合培养基期望的时间量以允许细胞在培养容器中生长和分化之后，在步骤i)中停止混合培养容器中的培养基。通过停止混合培养基，再次允许培养基中的细胞聚集体沉降，优选通过重力沉降。
如上文对于步骤d)已经解释的那样，同样地对于步骤i)，预期可以选择停止混合培养基的任何时间段。发现取决于反应器的配置，可以容易地确定使聚集体沉降和/或使大多数单细胞、分泌的蛋白和外来体漂浮在培养基中所需的时间。通常，在3升的生物反应器(容器)中，使细胞聚集体沉降，即沉向培养容器的底部所需的时间为5分钟～240分钟，优选20分钟～60分钟。发现如果允许沉降进行太长时间(例如超过480分钟)，这可能导致对细胞的损伤或导致增加的细胞死亡。技术人员将理解，通常也不需要如此长的沉降时间。
在步骤j)中，可以以如上文对于步骤e)已经描述的方式从培养容器中收集部分培养基。同样，无论从培养容器中去除培养基的方式如何，注意到令人惊讶地发现，当不是收集和替换所有的培养基，而是在向培养基添加后续的新鲜的培养基之前、仅从培养容器中收集部分培养基时(因此其中部分先前培养基与后续培养基混合)，可以获得期望量的分化良好型细胞。
在步骤j)的优选实施方案中，收集培养容器中至多95体积％、90体积％、85体积％、或80体积％的培养基，以能够有效地切换培养基组成和/或收获(单)细胞或由细胞分泌至培养基中的物质。例如，在培养容器包含10升培养基的情况下，从培养容器收集至多9500、9000、8500或8000毫升的培养基。同时发现，优选地，从培养容器中收集至少30体积％、40体积％、50体积％、60体积％、或70体积％的培养基。因此，在一些实施方案中，从培养容器中收集例如30体积％-95体积％、或40体积％～95体积％、或50-95体积％、或60-90体积％、或60-80体积％、或70-90体积％、或70-80体积％的培养基。
可将步骤j)的收集的培养基排出或用于例如分离存在于所述培养基中的单细胞或用于收集可能存在于此类培养基中的其它物质，例如分泌的蛋白质、激素、在优选实施方案中外来体或其它类型的细胞外囊泡。
优选地，步骤j)中从培养容器中去除的培养基的量使得在重复上述步骤g)–i)的情况下，保留在培养容器中的培养基与添加至培养容器中的新鲜培养基的比为1:1至1:15，例如1:3–1:10，例如1:4–1:8，例如1:1,5或1:2,5、或1:5。关于添加的新鲜添加的培养基，在重复上述步骤g)–i)的情况下，在收集培养容器中的部分培养基后，注意到其体积可能不同于所收集的培养基的体积。例如，在去除4升培养基的情况下，引入至培养容器的新鲜培养基的体积可以是4升、但也可以多于4升或少于4升。添加至培养容器中的新鲜培养基的体积可以是例如从培养容器中收集的培养基体积的10-200％，例如50-150％。因此，添加新鲜培养基后的培养基的体积可以与先前培养基的体积相同、或者可以少于或多于先前培养基的体积(例如，在先前培养基为10升，并且在添加6新鲜培养基之前去除7升的情况下，添加新鲜培养基后的培养基的体积为9升，这比先前培养基的体积少1升)。
可以根据需要或期望尽可能经常地重复步骤g)–i)，例如在细胞向预选细胞类型的分化需要使用几种不同的或相同的分化培养基的情况下，或者例如在从所收集的培养基中获得预选细胞或其它材料(例如，不是从聚集体自身)，并且进行多轮步骤g)–i)和收集培养基以获得增加数量的存在于培养基中的此类预选细胞(例如作为单细胞从聚集体分泌至培养基中)的情况下。
一旦在步骤i)之后，所获得的细胞已经充分地向预选细胞类型分化或分化成预选细胞类型，可以收集培养容器中的细胞聚集体和/或培养容器中的培养基中的细胞聚集体以用于进一步使用，如上文已经讨论的。培养基的细胞聚集体的收集和进一步处理可以通过技术人员已知的并且适合细胞聚集体和/或培养基目的的任何方法或程序来进行。
在本发明的一个优选实施方案中，除了可在步骤j)中从培养基/细胞聚集体中收集分化细胞以外，所述方法在任何步骤b)–j)期间既不包括离心步骤也不包括过滤步骤。步骤b)–j)期间的细胞培养(非收集)方法中的离心步骤和/或过滤步骤需要人工的或复杂的干预，因此，优选地，从本文公开的方法中排除。相反，本文公开的方法依赖重力来沉降细胞聚集体(例如，与在步骤e)和/或j)期间仅收集部分培养基相结合)。
在一个优选实施方案中，使用一种以上的后续培养基重复步骤g)-i)一次或多于一次。例如，可以重复步骤g)–i)一次、两次、三次、四次、五次以上。令人惊讶地发现，根据本发明的方法足够稳健并且足够温和，以允许细胞生长、收集所公开的培养基和添加新的培养基以允许细胞的进一步生长和分化的几个循环。
发现细胞聚集体大部分保持完整，细胞聚集体中的分化细胞保持高度存活，并且细胞的分化以相对同质的方式开始。换言之，通过提供其中重复步骤g)–i)一次以上的方法，本文公开的方法允许细胞的进一步且更好的分化。
在一些实施方案中，通过使用用于细胞的分化的后续培养基(所述培养基可以与用于细胞的分化的先前培养基相同或不同)重复步骤g)–i)，进一步促进来源于多能干细胞的细胞的进一步分化。
分化周期的这种重复增加了要获得的分化细胞的质量以及本方法的可扩展性。
在一些实施方案中，提供了本文公开的方法，其中在步骤b)中，将多能干细胞以单细胞悬浮液的形式引入，或者其中在步骤b)中，将多能干细胞以细胞聚集体的形式引入。事实上，尽管优选地，多能干细胞可以作为多能干细胞聚集体的群体提供，但是作为替代方案，也可以提供作为单细胞(例如分散在合适的培养基中)的多能干细胞，并且一旦存在于培养容器中，允许这些细胞形成聚集体。所提供的多能干细胞可以是一种或者可以是不同类型的多能干细胞的混合物。
在一些实施方案中，提供了本文公开的方法，其中在步骤b)中，培养基中的多能干细胞(作为单细胞和/或作为聚集体)的量为每ml培养基1x104–1x106个多能干细胞。换言之，在这样的实施方案中，在步骤c)中开始培养之前，培养容器中的多能干细胞的初始细胞密度为每毫升培养基1x104–1x106个细胞，优选地，细胞密度为每毫升培养基5x104–5x105个细胞。
发现为了获得高产量的预选细胞类型，期望多能干细胞的细胞密度不应过高，因为发现这影响所获得的细胞的产量和质量。例如，在以单细胞形式引入多能干细胞的情况下，培养基中的细胞密度必须使得最初形成的聚集体优选具有下文中所述的大小，当细胞密度过高(或过低)时，这可能无法实现。
在本文公开的方法的另一优选实施方案中，在步骤c)或步骤g)中诱导细胞分化之前，多能干细胞的细胞密度为每毫升培养基1x104–1x106个细胞，优选地，初始细胞密度为每毫升培养基5x104–5x105个细胞。换言之，在本文公开的方法中，向预选细胞类型分化的多能干细胞的细胞密度优选为每毫升培养基1x104–1x106个细胞，优选为每毫升培养基5x104–5x105个细胞。
在本文公开的方法的优选实施方案中，步骤b)中的细胞以细胞聚集体的形式引入，并且优选地，细胞聚集体的大小为10-150微米，优选地25-140微米，优选选自由20-80微米、30-60微米、90-140微米和100-120微米组成的组。
在本文公开的方法的优选实施方案中，其中步骤b)中的细胞以单细胞悬浮液的形式引入，例如在步骤c)期间，允许单细胞形成聚集体，其中所形成的聚集体的大小为10–150微米，优选25–140微米，优选选自由20–80微米、30–60微米、90–140微米、和100–120微米组成的组，优选在引入具有单细胞的细胞悬浮液和/或开始培养细胞/混合培养基后约24–72小时。
因此，还提供了根据本发明的方法，其中，当步骤b)中的细胞以单细胞悬浮液的形式引入时，其中允许细胞形成具有10–150微米的大小的聚集体，优选25–140微米，优选选自由20–80微米、30–60微米、90–140微米、和100–120微米组成的组。
发现这种大小的细胞聚集体允许利用本文公开的方法的预选细胞类型的最佳产量和质量，特别是在步骤b)中的细胞以单细胞悬浮液的形式引入的情况下。
在本文公开的方法的优选实施方案中，所制造的预选细胞类型的量是步骤b)中引入的多能干细胞的量的至少10倍，优选至少15倍、至少20倍、或至少25倍，优选10–100倍、15–80倍、或20–75倍。上述实施方案特别涉及在步骤j)中收集的从细胞聚集体收集的预选细胞类型。因此，在一些实施方案或方面中，提供了用于体外制造至少10倍于所用多能干细胞的量的、从所述量的多能干细胞分化的预选细胞类型的方法，优选在封闭培养系统中，其中所述方法包括上文和本文公开的步骤。优选地，所述方法用于细胞聚集体形式的预选细胞类型。
在预选细胞类型可在培养基中作为单细胞收集的实施方案中，例如在造血谱系细胞的情况下，所制造的预选细胞类型的量优选为在步骤b)中引入的多能干细胞的量的至少10–1000倍、20–1000倍、优选50–1000倍，例如至少20倍、30倍、50倍、80倍、100倍、250倍以上。因此，在一些实施方案或方面中，提供了用于体外制造至少50倍于所用多能干细胞的量的、从所述量的多能干细胞分化的预选细胞类型的方法，优选在封闭培养系统中，其中所述方法包括上文和本文公开的步骤。优选地，所述方法用于单细胞形式的预选细胞类型。
在一些实施方案中，所制造的预选细胞类型的量至少是在步骤b)或步骤g)中被诱导向预选细胞类型增殖的多能干细胞的量的上述倍数。
在本文公开的方法的优选实施方案中，步骤j)中收集的细胞聚集体的大小为小于1000微米，优选大小为10–1000微米、20–750微米、或50–500微米。在该实施方案中，聚集体的直径小于1mm，优选直径在10-1000μm范围内，优选50至500μm。聚集体的大小被认为是相关的，原因有两个。首先，发现增殖和/或分化开始时的聚集体大小可能影响分化效率。其次，在分化过程期间，细胞的数量应增加，这反映在更大的聚集体中。一旦聚集体变得过大，营养有效性(nutrient availability)变为速率限制步骤(rate limiting step)，导致坏死中心(necrotic core)和次优生物过程产量。此外，认为过大的聚集体提供了预选细胞类型的较不均匀的群体，这可能是由于聚集体内的局部效应。在本文公开的方法的一个方面，在聚集体形成期间，例如接种单细胞后的第一个24小时，可以使用旋转速度/搅拌的调节来优化聚集体大小。
在本文公开的方法的优选实施方案中，培养容器中的培养基的体积为至少1升，优选至少2升、3升、4升、5升、6升、7.5升或10升，优选其中培养容器中的培养基为1升～100升，优选5升～50升。
本方法现在允许在优选封闭的培养系统中制造预选细胞类型，所述培养系统具有增加的容积(从而支持高产量)，例如3、10、40或甚至100升。这是本文公开的方法的主要优点。
在本文公开的方法的优选实施方案中，制造了至少1X106个细胞/ml培养基，优选至少1.5X106个细胞/ml、2.0X106个细胞/ml、3.0X106个细胞/ml、或5.0X106个细胞/ml，例如至少1.5X106个细胞/ml、2.0X106个细胞/ml、3.0X106个细胞/ml、4.0X106个细胞/ml、5.0X106个细胞/ml、8.0X106个细胞/ml、12.0X106个细胞/ml或20.0X106个细胞/ml。
发现本文公开的方法是如此稳健，以至于可以持续所述方法直至制造1X106个细胞/ml培养基，优选至少1.5X106个细胞/ml、2.0X106个细胞/ml、3.0X106个细胞/ml、或5.0X106个细胞/ml，例如至少1.5X106个细胞/ml、2.0X106个细胞/ml、3.0X106个细胞/ml、4.0X106个细胞/ml、5.0X106个细胞/ml、8.0X106个细胞/ml、12.0X106个细胞/ml或20.0X106个细胞/ml。
因此，在优选实施方案中，所述方法包括继续进行直至制造出至少如此数量的细胞。通过产生如此数量的细胞，所述方法满足了在一个系统中能够产生大量的预选细胞类型的细胞并且所述细胞可用于细胞治疗的长期需求。
与上述相关，在本文公开的方法的优选实施方案中，制造至少1x109个预选细胞，优选制造至少10x109、25x109、100x109、200x109、或500x109个预选细胞。再次，发现本文公开的方法是如此稳健，以至于可以持续所述方法直至产生如此的细胞总数的预选细胞类型(例如至少1x109个预选细胞)。因此，在优选实施例中，所述方法包括继续进行直至制造出至少如此数量的细胞。通过产生如此数量的细胞，所述方法满足了在一个系统中能够产生大量的预选细胞类型的细胞并且所述细胞可用于细胞治疗的长期需求。
在本文公开的方法的优选实施方案中，省略了任选步骤f)和/或重复步骤g)–i)至少一次，优选至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25次。
优选地，在本文公开的方法中省略步骤f)。甚至更优选地，在本文公开的方法的步骤b)中，使用用于诱导多能干细胞向预选细胞类型分化的培养基，从而省略增殖多能干细胞的任何步骤。换言之，在步骤b)中，每体积培养基的数量或密度允许省略多能干细胞的任何增殖，并允许立即将多能干细胞向预选细胞类型诱导。
优选地，重复步骤g)–i)至少一次，优选至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25次。如技术人员所理解的，重复步骤g)–i)包括使用与先前使用的培养基相同或不同的培养基重复这些步骤，只要所述培养基允许细胞的进一步分化即可(其在本申请通篇中还应被理解为包括一旦细胞分化成预选细胞类型就维持细胞的分化状态的培养基)。例如，后续培养基可能仅在所包含的化合物和引导、诱导、增强和/或维持细胞的分化或分化状态的化合物方面不同，或者可能在其它成分(例如葡萄糖)方面不同，或者两者都不同。
发现本文公开的方法允许重复步骤g)–i)几次。这在细胞向预选细胞类型的分化需要不同的步骤或不同的培养基组成以获得预选细胞类型的情况下尤其有利。
在本文公开的方法的优选实施方案中，步骤c)或h)各自独立地进行至少12小时、1、2、3、4、5、6或7天，优选不超过10天，优选7天和/或其中步骤h)进行至少12小时、1、2、3、4、5、6或7天。
在步骤c)和/或h)中，在培养基的存在下培养细胞，在随后的步骤中，培养基被后续培养基替换或可以被后续培养基替换。培养基的替换可以以上述间隔进行(即，在步骤c)或h)期间在培养基中培养12小时、1、2、3、4、5、6或7天后，优选不超过10天，优选7天)。换言之，在本文公开的方法的后续步骤中部分替换培养基之前，每12小时、1、2、3、4、5、6或7天，优选不超过10天，优选7天，细胞优选与培养基接触至少一次。
在本文公开的方法的优选实施方案中，方法(步骤a)–j))在至少5、6、7、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20天、优选7～90天、10～60天、15–40天、或15–30天的时间段内进行。通过进行所述方法持续所提供的天数，所述方法提供了预选细胞类型的高产量。
鉴于以上所述，仅作为说明，在本文公开的方法的上下文中，预选细胞类型的制造可以例如如下进行：
情况A：在第一增殖培养基中使多能干细胞增殖2天，收集第一增殖培养基并提供第二增殖培养基(具有相同或不同的组成)，继续多能干细胞的增殖1天，收集第二增殖培养基并提供第一分化培养基，使细胞分化1天，收集第一分化培养基并提供第二分化培养基(具有相同或不同的组成)，继续细胞的分化1、2、3或4天，收集第二分化培养基并提供后续分化培养基(具有相同或不同的组成)，继续细胞的分化1、2、3或4天，收集后续分化培养基并提供下一个后续分化培养基(具有相同或不同的组成)，并重复收集分化培养基、提供下一个分化培养基(具有相同或不同的组成)并继续细胞的分化，直至或只要可以获得预选细胞类型。
情况B：向多能干细胞提供第一分化培养基，使细胞分化2天，收集第一分化培养基并提供第二分化培养基(具有相同或不同的组成)，继续细胞的分化一段时间，例如1、2、3或4天，收集第二分化培养基并提供后续分化培养基(例如具有相同的组成)，继续细胞的分化1、2、3或4天，收集后续分化培养基并提供下一个后续分化培养基(例如，具有相同的组成、但具有不同的pH)，并重复收集分化培养基、提供下一个分化培养基(具有相同或不同的组成)并继续细胞的分化，直至或只要可以获得预选细胞类型。
如本文所示，在一个优选实施方案中，提供了本文公开的方法，其中用于多能干细胞的增殖的不同培养基的组成是相同或不同的，和/或其中用于诱导(多能干)细胞向预选细胞类型分化的不同培养基的组成是相同或不同的。
通过提供不同的用于增殖或分化的培养基，可以在同一培养容器中提供多个分化周期或将增殖步骤和随后的一个以上的分化步骤相结合。
在一个优选实施方案中，提供了本文公开的方法，其中步骤b)或步骤g)中提供的培养基包含Rho-相关蛋白激酶抑制剂，诸如，例如Y-27632二盐酸盐或法舒地尔(Fasudil)。
在另一实施方案中，如上述已经讨论过的，提供了本文公开的方法，其中在步骤e)和/或j)中，收集培养容器中至多95体积％、90体积％、85体积％或80体积％的培养基。
同时发现，优选地，从培养容器中收集至少50体积％、60体积％或70体积％的培养基。因此，在一些实施方案中，从培养容器中收集例如50–95体积％、或60–90体积％、或70–90体积％的培养基。
优选地，从培养容器中去除的培养基的量使得在向培养系统提供新的新鲜培养基的情况下，保留在培养容器中的培养基与添加至培养容器中的新鲜培养基的比为1:1至1:15，例如1:3–1:10，例如1:4–1:8。
在另一实施方案中，提供了根据本发明的方法，其中所述预选细胞类型是心血管细胞、心肌细胞、内皮细胞、造血谱系细胞、造血祖细胞、从造血祖细胞分化的细胞、单核细胞、巨噬细胞、T细胞、B细胞、NK细胞、树突状细胞、神经元细胞、视网膜细胞、肺细胞、肝细胞、或胰腺细胞。
尽管本文公开的方法不特别限于向特定(分化的)细胞类型分化，但发现本发明的方法特别适合于以聚集体的形式和/或从培养基中以单细胞的形式(例如从细胞聚集体中分泌的)获得上述预选细胞类型。
技术人员理解，通过预先选择使用本文公开的方法、多能干细胞将向其分化的特定细胞类型，这也确定了适用于本文公开的所述方法的培养基(和所需化合物)的类型。
如上所述，令人惊讶地发现，本文公开的方法允许通过利用各种已知的分化方案向多种细胞类型分化，尽管根据本文公开的方法进行了调整。例如，可以使用所述方法，其中预选细胞是心血管细胞、心肌细胞、内皮细胞、造血谱系细胞、造血祖细胞、从造血祖细胞分化的细胞、单核细胞、巨噬细胞、T细胞、B细胞、NK细胞、树突状细胞、神经元细胞、视网膜细胞、肺细胞、肝细胞、或胰腺细胞。
在另一实施方案中，提供了本文公开的方法，其中所收集的部分培养基或所收集的培养基包含单细胞和/或非聚集细胞，优选地，其中这些单细胞或非聚集细胞选自由以下组成的组：造血谱系细胞、造血祖细胞、从造血祖细胞分化的细胞、单核细胞、巨噬细胞、T细胞、B细胞、NK细胞、或树突状细胞。本文所公开的方法也特别适用于造血分化过程中所见的含有聚集体和单细胞(作为要获得的预选细胞类型)二者的培养物。在这样的培养中，聚集体继续分泌/脱落(shed)造血细胞，这些造血细胞需要以规律的间隔从培养基中作为单细胞收获。当前的方法允许在所述方法的不同步骤期间不使用过滤方法和/或离心方法来从所收集的培养基中收集此类细胞。
在另一优选实施方案中，提供了本文公开的方法，其中用于诱导多能干细胞向预选细胞类型增殖分化并被引入至培养容器的培养基包含一种以上化合物，所述化合物通过抑制或激活早期发育所需的某些信号传导途径来诱导多能干细胞向预选细胞类型分化。
本发明的方法中使用的培养基，特别是用于分化的培养基可以例如包含信号传导激活剂或信号传导抑制剂。如本文所用，术语“激活剂”定义为增强或实现靶分子和/或信号传导途径的活性的化合物/分子，例如促进细胞向预选细胞类型分化。术语“激活剂”包括对特定信号传导途径具有直接激活作用的分子/化合物，也包括例如通过与负调节(例如抑制)所述途径的分子相互作用而间接激活的分子。激活剂也可以是要激活的信号传导途径(受体)的激动剂。
可用作激活剂的化合物/分子可以是任何化合物/分子，其可激活相应的途径、或抑制要激活的途径的抑制剂。
当与未添加激活剂(或在添加之前)的途径的活性相比较时，激活剂可以增强或增加要激活的途径10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％以上。
与本文所述的激活剂或信号传导/途径激活剂相反，如本文所用，“抑制剂”定义为降低或阻断靶分子和/或信号传导途径的活性的化合物/分子。术语“抑制剂”包括对特定信号传导途径具有直接减少/阻断作用的分子/化合物，也包括例如通过与例如正调节(例如激活)所述途径的分子相互作用而间接抑制的分子。抑制剂也可以是要抑制途径(受体)的拮抗剂。
可用作抑制剂的化合物/分子可以是任何化合物/分子，其可减少或阻断相应的途径、或抑制要抑制的信号传导(途径)的激活剂。示例性抑制剂可包括本文所述的合适的结合蛋白，其针对例如某种途径的激活剂。
当与未添加抑制剂的途径的活性相比较时，抑制剂可以降低或减少要抑制的途径10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90以上。当与未添加抑制剂(或添加前)的途径的活性相比，当该途径被100％抑制时，存在要被抑制的途径的阻断。
本发明的方法中使用的培养基可以例如包含活化素/TGF-β抑制剂。活化素/TGF-β信号传导途径是本领域已知的，并且例如描述于Heldin,Miyazono和ten Dijke(1997)"TGF-bold beta signaling from cell membrane to nucleus through SMAD proteins."Nature 390,465-471。简而言之，受体配体与异源四聚受体复合体结合，所述受体配体包括例如TGFB1、TGFB2、TGFB3、活化素A、活化素B、活化素AB和/或NODAL，所述异源四聚受体复合体包含两种I型受体激酶包括例如TGFBR2、ACVR2A和/或ACVR2B、和两种II型受体激酶包括例如TGFBR1(ALK5)、ACVR1 B(ALK4)和/或ACVR1 C(ALK7)。这种结合引发由R-smad包括例如SMAD2和/或SMAD3、和Co-smad包括例如SMAD4组成的异聚复合体的磷酸化和激活。因此，术语“活化素/TGF-β信号传导途径的激活剂”是指形成该信号传导途径的一部分的任何一种上述列举的分子的激活剂，而术语“活化素/TGF-β信号传导途径的抑制剂”是指形成该信号传导途径的一部分的任何一种上述列举的分子的抑制剂。此外，此类激活剂可以是ACVR2A和/或ACVR1 B(ALK4)受体的激动剂、或者是TGF RII受体和/或ALK5受体的激动剂。此类抑制剂可以是ACVR2A和/或ACVR1 B(ALK4)受体的拮抗剂、或者是TGF RII受体和/或ALK5受体的拮抗剂。原则上，此类活化素/TGF-β信号传导途径的抑制剂/激活剂是本领域技术人员已知的并且是市售可得的。
本发明预期活化素/TGF-β抑制剂是TGF-βI型受体活化素受体样激酶(一种以上)的抑制剂。本发明进一步预期活化素/TGF-β抑制剂抑制ALK5、ALK4和/或ALK7。活化素/TGF-β抑制剂的示例性但非限制性实例为A-83-01(3-(6-甲基-2-吡啶基)-N-苯基-4-(4-喹啉基)-1H-吡唑-1-硫代甲酰胺；CAS No.:909910-43-6)，D4476(4-[4-(2,3-二氢-1,4-苯并二氧杂环己-6-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]苯甲酰胺；CAS No.:301836-43-1)，GW788388(4-[4-[3-(2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]-2-吡啶基]-N-(四氢-2H-吡喃-4-基)-苯甲酰胺；CASNo.:452342-67-5)，LY364947(4-[3-(2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]-喹啉；CASNo.:396129-53-6)，R268712(4-[2-氟-5-[3-(6-甲基-2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]苯基]-1H-吡唑-1-乙醇，CAS No.:879487-87-3)，SB-431542(4-(5-苯并[1,3]二唑-5-基-4-吡啶-2-基-1H-咪唑-2-基)-苯甲酰胺水合物；CAS No.:CAS号301836-41-9)，SB-505124(2-(5-苯并[1,3]二唑-5-基-2-叔丁基-3H-咪唑-4-基)-6-甲基吡啶盐酸盐水合物；CAS No.:694433-59-5)，SD208(2-(5-氯-2-氟苯基)^-[(4-吡啶基)氨基]蝶啶；CAS No.:627536-09-8)，SB-525334(6-[2-叔丁基-5-(6-甲基-吡啶-2-基)-1H-咪唑-4-基]-喹喔啉；CAS No.:356559-20-1)和ALK5抑制剂II(CAS:446859-33-2)。因此，活化素/TGF-β抑制剂可以是SB-431542。
活化素/TGF-β抑制剂如SB-431542可以以约0.01μM～约1M的浓度使用，更优选约5μM～约15μM，最优选该量为约10μM。例如，SB-431542可以获得自Ascent Scientific。
典型Wnt信号传导途径是本领域技术人员已知的，并且例如描述于Logan和Nusse(Annu.Rev.Cell Dev.Biol.(2004)20:781-810)。简而言之，Wnt配体与卷曲受体(Frizzledreceptor)结合，引发多功能激酶GSK-3P从调节性APC/Axin/GSK-3p复合体解离。在缺少Wnt信号(关闭状态)的情况下，β-连环蛋白被由CK1和APC/Axin/GSK-3p复合体的协同磷酸化靶向，导致通过β-TrCP/SKP途径的泛素化和蛋白酶体降解。在存在Wnt配体(开启状态)存在的情况下，共受体LRP5/6与Wnt结合的Frizzled形成复合体。这导致Dishevelled(Dvl)的激活，取代了来自APC/Axin的GSK-3P。Wnt配体的转录效应是由β-连环蛋白的Rac1依赖性核转位和随后募集的LEF/TCF DNA结合因子作为转录的共激活因子而介导的。示例性Wnt配体包括例如Wnt1、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt7a、Wnt7b和/或Wnt11。
因此，本文所述的术语“典型Wnt信号传导激活剂”是指形成该信号传导途径的一部分的任何一种上述列出的分子的激活剂。示例性典型Wnt信号激活剂包括Norrin、R-spondin 2或WNT蛋白。然而，典型WNT信号传导激活剂也可以阻断Axin或APC。这可以通过例如经由siRNA或miRNA技术来实现。本发明还包括的典型WNT信号传导激活剂是GSK-3抑制剂。示例性GSK-3抑制剂包括CHIR 99021(6-[[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(5-甲基-1H-咪唑-2-基)-2嘧啶基]氨基]乙基]氨基]-3-吡啶甲腈；CAS No.:252917-06-9)，SB-216763(3-(2,4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2,5-二酮；CAS No.:280744-09-4)，6-溴靛玉红-3’-肟(CAS No.:CAS 667463-62-9)，泰德格鲁西(Tideglusib)(4-苄基-2-(萘-1-基)-1,2,4-噻二唑烷-3,5-二酮)，GSK-3抑制剂1(CAS No.:603272-51 -1)，AZD1080(CAS No.:612487-72-6)，TDZD-8(4-苄基-2-甲基-1,2,4-噻二唑烷-3,5-二酮；CAS No.:327036-89-5)，TWS1 19(3-[[6-(3-氨基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧]-苯酚；CAS No.:601514-19-6)，CHIR-99021(CAS No.:252917-06-9)，CHIR-98014(N6-[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(1H-咪唑-1-基)-2-嘧啶基]氨基]乙基]-3-硝基-2,6-吡啶二胺；CAS No.:252935-94-7)，SB 415286(3-[(3-氯-4-羟基苯基)-氨基]-4-(2-硝基苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮；CAS No.:264218-23-7)，LY2090314(3-(9-氟-2-(哌啶-1-羰基)-1,2,3,4-四氢-[1,4]二氮杂卓并[6,7,1-hi]吲哚-7-基)-4-(咪唑并[1,2-a]吡啶-3-基)-1H-吡咯-2,5-二酮；CAS No.:603288-22-8)，AR-A014418(N-(4-甲氧基苄基)-N’-(5-硝基-1,3-噻唑-2-基)脲；CAS No.:487021-52-3和/或IM-12(3-(4-氟苯基乙基氨基)-1-甲基-4-(2-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2,5-二酮；CAS No.:1129669-05-1)。因此，GSK-3抑制剂也可以是CHIR99021。
典型WNT信号传导激活剂如CHIR 99021可以以约0,01μΜ～约1M的浓度使用，更优选约0,1μΜ～约10μΜ、或约0,1μΜ～约5μΜ、更优选2～8μΜ，并且最优选地，所述量为4～6μΜ。CHIR 99021可以例如从Axon Medchem获得。
因此，本文所述的术语“典型WNT信号传导抑制剂”是指形成该信号传导途径的一部分的任何一种上述列举的分子的激活剂。示例性典型WNT信号传导抑制剂包括IWP-2、IWP-3、IWP-4、IWP-L6、XAV939和IWR-1-ENDO。典型WNT信号传导抑制剂如IWPL-6和XAV可以以约0,01μΜ～约1M的浓度使用，对于XAV939，更优选约0,1μΜ～约10μΜ、或约0,1μΜ～5μΜ，最优选地，所述量为1～10μΜ，对于IWP-L6，例如2～8μΜ、或3～7μΜ、和0,1μΜ～1μΜ，例如在0,15μΜ～0,50μΜ、或在0,20μΜ～0,30μΜ。
本发明的方法中使用的培养基可以另外地或可选地包含BMP信号传导抑制剂。BMP信号传导途径是本领域技术人员已知的，并且例如描述于Jiwang Zhanga,Linheng Lia(2005)BMP signaling and stem cell regulation Developmental Biology第284卷,第1期,2005年8月1日,第1-11页。
简而言之，BMP通过受体介导的细胞内信号传导发挥作用，并随后影响靶基因转录。在这个过程中需要两种类型的受体，称为I型和II型。虽然只有一种II型BMP受体(Bmprll)，但有三种I型受体：Alk2、Alk3(Bmprl a)和Alk6(Bmprl b)。BMP信号转导可以通过至少两条信号传导途径进行。典型BMP途径是由受体I介导的Smadl、Smad5或Smad8(R-Smad)的磷酸化来介导的。两个磷酸化的R-Smad与一个共用Smad4(co-Smad)形成一个异源三聚体复合体。Smad异源三聚体复合体可以移位至细胞核中，并可以与其它转录因子协同调节靶基因表达。BMP信号的平行途径是由TGFpi激活的酪氨酸激酶1(TAK1，一种MAPKKK)并通过丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)介导的，所述MAPK也涉及BMP和WNT途径之间的串扰(cross-talk)。BMP信号传导的抑制剂可以仅阻断/减少典型BMP途径。因此，BMP信号传导抑制剂可以是典型BMP信号传导抑制剂。一种对典型BMP信号传导途径有选择性的抑制剂是dorsomorphin。BMP信号传导抑制剂的示例性但非限制性实例包括chordin，noggin，DMH1(CAS 1206711-16-1)，K02288(3-[(6-氨基-5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-3-吡啶基]苯酚；CASNo.:1431985-92-0)，dorsomorphin(6-[4-(2-哌啶-1-基乙氧基)苯基]-3-吡啶-4-基吡唑并[1,5-a]嘧啶；CAS No.:866405-64-3)和LDN 193189(4-[6-[4-(1-哌嗪基)苯基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基]-喹啉盐酸盐，CAS No.:1062368-24-4)。BMP信号传导抑制剂也可以是dorsomorphin。
本发明的方法中使用的培养基可以另外地或可选地包含SHH途径激活剂。“Hedgehog信号传导途径”或“SHH途径”是本领域众所周知的，并且描述于例如Choudhry等人.(2014)"Sonic hedgehog signaling pathway:a complex network."Ann Neurosci.21(1):28-31。Hedgehog配体与受体结合，所述Hedgehog配体包括例如Sonic hedgehog、Indian hedgehog和/或Desert hedgehog，所述受体包括例如修补的(Patched)或修补-平滑的(patched-smoothened)受体复合体，这诱导下游信号级联。SHH信号传导的下游靶基因包括GLI1、GLI2和/或GLI3。因此，术语“Hedgehog信号传导途径的激活剂”也指形成该信号传导途径的一部分的任何一种上述列出的分子的激活剂。
Hedgehog信号传导(SHH)的示例性激活剂包括嘌呤胺(purmorphamine)(PMA；2-(1-萘氧基)-6-(4-吗啉基苯胺)-9-环己基嘌呤9-环己基-N-[4-(4-吗啉基)苯基]-2-(1-萘氧基)；CAS No.:483367-10-8)，SHH，平滑激动剂(SAG；3-氯-N-[反式-4-(甲基氨基)环己基]-N-[[3-(4-吡啶基)苯基]甲基]-苯并[b]噻吩-2-甲酰胺；CAS No.:912545-86-9)和Hh-Ag 1.5(3-氯-4,7-二氟-N-(4-(甲基氨基)环己基)-N-(3-(吡啶-4-基)苄基)苯并[b]噻吩-2-甲酰胺；CAS No.:612542-14-0)以及Gli-2。SHH-途径激活剂可以选自由嘌呤胺、SHH、SAG类似物和Gli-2组成的组。因此，SHH-途径激活剂可以是嘌呤胺。SHH途径激活剂也可以是重组或截短形式的SHH，其保留了SHH途径激活功能，例如SHH C24II。
SHH信号传导途径激活剂如嘌呤胺可以以约0,25μΜ～约1M的浓度使用，更优选约0,4μΜ～约0,5μΜ，最优选地，所述量为约0,5μΜ。SHH信号传导途径激活剂如SHH也可以以约50～约1000ng/ml使用。SHH信号传导途径激活剂如SHH C24II也可以以约10～约500ng/ml的浓度使用。SHH信号传导途径激活剂如SAG可以以约1～约100nM的浓度使用。SHH信号传导途径激活剂如Hh-Ag1.5也可以以约1～约50nM的浓度使用。
本发明的方法中使用的培养基可另外地或可选地包含选自由以下组成的组的蛋白质或类固醇激素生长因子：肾上腺髓质素(AM)、血管生成素(Ang)、自分泌运动因子、睫状神经营养因子(CNTF)、白血病抑制因子(LIF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、表皮生长因子(EGF)、EphrinA1、Ephrin A2、Ephrin A3、Ephrin A4、Ephrin A5、Ephrin B1、Ephrin B2、Ephrin B3、红细胞生成素(EPO)、成纤维细胞生长因子1(FGF1)、成纤维细胞生长因子2(FGF2)、成纤维细胞生长因子3(FGF3)、成纤维细胞生长因子4(FGF4)、成纤维细胞生长因子5(FGF5)、成纤维细胞生长因子6(FGF6)、成纤维细胞生长因子7(FGF7)、成纤维细胞生长因子8(FGF8)、成纤维细胞生长因子9(FGF9)、成纤维细胞生长因子10(FGF10)、成纤维细胞生长因子11(FGF11)、成纤维细胞生长因子12(FGF12)、成纤维细胞生长因子13(FGF13)、成纤维细胞生长因子14(FGF14)、成纤维细胞生长因子15(FGF15)、成纤维细胞生长因子16(FGF16)、成纤维细胞生长因子17(FGF17)、成纤维细胞生长因子18(FGF18)、成纤维细胞生长因子19(FGF19)、成纤维细胞生长因子20(FGF20)、成纤维细胞生长因子21(FGF21)、成纤维细胞生长因子22(FGF22)、成纤维细胞生长因子23(FGF23)、胎牛生长激素(FBS)、神经胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、Neurturin、Persephin、Artemin、生长分化因子-9(GDF9)、肝细胞生长因子(HGF)、肝癌衍生生长因子(HDGF)、胰岛素、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、胰岛素样生长因子-2(IGF-2)、IL-1、IL-2、IL-3、IL4、IL-5、IL6、IL7、角质细胞生长因子(KGF)、迁移促进因子(MSF)、巨噬细胞刺激蛋白(MSP)、也称为干细胞生长因子样蛋白(HGFLP)、肌肉生长抑制素(Myostatin,GDF-8)、神经调节蛋白1(NRG1)、神经调节蛋白2(NRG2)、神经调节蛋白3(NRG3)、神经调节蛋白4(NRG4)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)、神经营养因子-3(NT-3)、神经营养因子-4(NT-4)、胎盘生长因子(PGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、肾胺酶(RNLS)、T细胞生长因子(TCGF)、血小板生成素(TPO)，
转化生长因子α(TGF-α)、转化生长因子β(TGF-β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、血管内皮生长因子(VEGF)。
技术人员众所周知上述信号分子和途径、以及所述途径的抑制剂和/或激活剂在向各种细胞类型分化中的作用。技术人员还已知，为了向特定的预选细胞类型分化，可以在相同的培养基中或者在连续的培养基中使用上述提及的激活剂和抑制剂的组合。例如，可以在第一分化培养基中使用特定途径的抑制剂，然后在第二或下一分化培养基中使用相同途径的激活剂。
在本文公开的方法的另一实施方案中，步骤b)和/或g)、优选步骤g)中提供的培养基包含聚乙烯醇，优选在约0,1–10mg/ml培养基的范围内。发现在本发明的方法中，培养基中存在PVA是理想的，
在本文公开方法的另一实施方案中，提供了用于诱导细胞向预选细胞类型分化的培养基，其包含诱导细胞向预选细胞类型分化的一种以上的化合物，优选地，其中所述一种以上的化合物选自由以下组成的组：Wnt-途径激活剂、Wnt-途径抑制剂、活化素-途径激活剂、TGFβ-途径激活剂、BMP-途径激活剂、活化素-途径抑制剂、TGFβ-途径抑制剂、BMP-途径抑制剂和VEGF-途径激活剂。
在另一实施方案中，提供了本文公开的方法，其中诱导多能干细胞向预选细胞类型分化的一种以上的化合物选自由诱导多能干细胞向以下细胞分化的化合物组成的组：心血管细胞、心肌细胞、内皮细胞、造血谱系细胞、造血祖细胞、从造血祖细胞分化的细胞、单核细胞、巨噬细胞、T细胞、B细胞、NK细胞、树突状细胞、神经元细胞、视网膜细胞、肺细胞、肝细胞、或胰腺细胞。
在本文另一实施方案中，提供了本文公开的方法，其中用于诱导多能干细胞向预选细胞类型分化的培养基包含甲状腺激素和/或甲状腺激素类似物。如本文所用，术语“甲状腺激素”或“甲状腺激素类似物”是指甲状腺激素(也称为三碘甲状腺原氨酸(triiodothyronine(T3))以及T4和类似于甲状腺激素T3或模拟甲状腺激素T3的作用的其它化合物。非限制性实例包括甲状腺激素受体激动剂化合物如DITPA(也称为3,5-二碘甲状腺丙酸(3,5-diiodothyroproprionic acid)或DITPA)，GC-1化合物(其为来自Bristol-Myers Squibb的甲状腺激素受体β亚型(TRbeta)选择性激动剂)，RO化合物(其为来自RochePharmaceuticals的甲状腺激素受体β1亚型(TRbeta)选择性激动剂)，C023化合物(其为来自KaroBio的甲状腺激素α1亚型(TRalphal)选择性激动剂)，和KB21 15(其为来自KaroBio的甲状腺激素受体β亚型(THbeta)选择性激动剂)。
在另一实施方案中，用于分化的培养基包含葡萄糖和/或半乳糖。在另一实施方案中，培养基不包含葡萄糖和/或半乳糖。在一些实施方案中，培养基包含血清，在其它实施例中，培养基不含血清。
在另一实施方案中，用于分化的培养基是化学成分确定的。在另一实施方案中，所有组分为cGMP符合的。
在另一实施方案中，培养基被特别优化用于生物反应器，例如减少剪切应力和起泡。对于此目的特别有用的试剂是聚乙烯醇和Pluronic F68。
在另一实施方案中，提供了本文公开的方法，其中多能干细胞是诱导性多能干细胞，优选人多能干细胞、或人诱导性多能干细胞。
在另一实施方案中，提供了本文公开的方法，其中从细胞聚集体或从所收集的培养基中获得向预选细胞类型分化的细胞。
在另一实施方案中，造血谱系细胞如造血干细胞、造血祖细胞、单核细胞、巨噬细胞、T细胞、NK细胞、B细胞和/或树突状细胞作为单细胞从培养基中分离。
在另一实施方案中，从培养基中分离分泌的蛋白和/或分泌的外来体。认为，例如在心脏分化过程中产生的外来体对于心脏病的治疗特别有用，在肝脏分化过程中产生的外来体对于肝脏疾病等的治疗特别有用。
在一些实施方案中，利用本文公开的方法获得的预选细胞类型可用于细胞疗法。细胞疗法可以是再生医学的形式，其中移植细胞以恢复器官功能，或者是免疫疗法的形式，例如以治疗癌症。
在一些实施方案中，利用本文公开的方法获得的预选细胞类型可以以药学上可接受的量和药学上可接受的组合物配制。在一些实施方案中，这样的组合物可以包含盐、缓冲剂、防腐剂和任选的其它治疗剂。在一些实施方案中，药物组合物还可以包含合适的防腐剂。本文公开的组合物具有多种治疗用途，包括例如器官修复、癌症、自身免疫性疾病和传染性疾病的治疗。
因此，还提供了用于细胞疗法的药物组合物、或通过细胞疗法进行治疗的方法，其中所述细胞疗法包括向有需要的受试者提供预选细胞类型并且其中所述预选细胞类型已用本文限定和公开的方法制造的步骤，或者其中所述细胞疗法包括用本文限定或公开的方法制造预选细胞类型并向有需要的受试者提供预选细胞类型的步骤。
还提供了封闭培养系统在使多能干细胞向预选细胞类型分化中的用途，优选根据本文公开的方法。
最终，为优选封闭的培养系统提供至少1x109个预选细胞，优选至少10x109、25x109、100x109、200x109、或500x109个预选细胞，和/或包含至少1升，优选至少2升、3升、4升、5升、6升、7.5升、或10升培养基，优选1升～100升，优选5升～50升培养基，包含至少1X106个细胞/ml培养基，优选至少1.5X106个细胞/ml、2.0X106个细胞/ml、3.0X106个细胞/ml、或5.0X106个细胞/ml，例如至少1.5X106个细胞/ml、2.0X106个细胞/ml、3.0X106个细胞/ml、4.0X106个细胞/ml、5.0X106个细胞/ml、8.0X106个细胞/ml、12.0X106个细胞/ml或20.0X106个细胞/ml。
将理解，关于本文公开的实施方案的一个方面讨论的所有细节、实施方案和优选同样适用于本文公开的任何其它方面或实施方案，因此不需要分别地对于所有方面都详述所有这些细节、实施方案和优选。
现在已经大致描述了本发明，通过参考以下实施例将更容易理解本发明，这些实施例是以举例说明的方式提供的，并不旨在限制本发明。
实施例
实施例1封闭工艺中的大规模iPSC心肌细胞制造
提供聚苯乙烯
Figure BDA0004138308860000451
-2Chamber(Corning,cat.nr.3269)并且将游离iPSC培养物在mTeSR1(Stem cell technologies)/Matrigel(corning)中生长约3天，喂养至约70％生长汇合度。用100mL PBS(无Ca2+和Mg2+，温热至37℃)洗涤细胞两次。用每烧瓶60mL的预热的Accutase解离细胞，并在37℃下孵育不超过4分钟。轻击烧瓶的侧面以使细胞从表面脱落。通过用50mL移液管上下吸打来重悬细胞。将脱离的细胞转移至含有100ml的含10μMY-27632的mTeSR培养基的500mL锥形离心管中。用含有10μM Y-27632的100ml mTeSR冲洗烧瓶两次，并转移至离心管中。将管以250g离心10分钟，并在含有10μM Y27632的最终100mLStemBrew(Miltenyi)中重悬浮(合并沉淀)。使用血细胞计数器对细胞进行计数。制备接种物(接种物的最终体积为500mL，生物反应器中的最终细胞密度设定为200,000/mL)并通过空气压力将细胞悬浮液通过收获口添加至生物反应器(BioFlo Eppendorf)(含有具有10μMY27632的2.5L Stembrew)中。封闭培养系统(3L)运行72小时(15％ DO(溶解氧)，130rpm，37℃，pH 7.15-7.4，使用NaHCO3进行控制以避免培养基的酸化)。
通过在IMDM/F12培养基(Gibco)中混合以下来制备“CDM”：0.25％白蛋白、0.125％聚乙烯醇(Sigma-Aldrich)、1％化学成分确定的脂质浓缩物(Gibco)、0.5％pen/strep(Gibco)、0.001％微量元素B(Corning)、0.01％微量元素C(Corning)、2mM GlutaMAX(Gibco)、0.05mg/ml抗坏血酸(Sigma-Aldrich)、450microMα单硫代甘油(Sigma-aldrich)。通过向CDM培养基中添加1％ ITS-X(Gibco)、肌酸(5.7mM)、肉碱(2mM)、牛磺酸(2.5mM)和甲状腺激素(44.5nM)来制备“CDM-成熟”。
72小时后(第0天)，使生物量(细胞聚集体)沉降一小时。将条件培养基(2.2L)泵入收集瓶/袋中，并将含有5μM Chir99021以激活Wnt信号传导并起始分化的2.5L CDM泵入生物反应器/培养容器中。在开始添加新的培养基后立即开始搅拌。24小时后(第1天)，使生物质沉降一小时。然后，将2.5L的条件培养基泵入收集瓶/袋中。然后，将补充有5μMChir99021的2.5L CDM泵入生物反应器中。
24小时后(第2天)，使生物质沉降一小时。将条件培养基(2.5L)泵入收集瓶/袋中，并将含有5μM Xav939和0.25μM IWPL6以抑制Wnt信号传导的2.5L CDM泵入生物反应器中。
24小时后(第3天)，使生物质沉降一小时。将条件培养基(2.5L)泵入收集瓶/袋中，并将含有5μM Xav939和0.25μM IWPL6以抑制Wnt信号传导的2.5L CDM泵入生物反应器中。
在第4天，将用过的培养基泵入收集瓶/袋中。然后，将补充有0.1％ ITS-X(Gibco)的2.5L CDM泵入生物反应器中。在开始添加新的培养基后立即开始搅拌。
24小时后(第5天)，使生物质沉降一小时。将用过的培养基(2.5L)泵入收集瓶/袋中，并将补充有0.1％ ITS-X的2.5L CDM泵入生物反应器中。在第6、7、8、9、10、11、12和13天重复该步骤。任选地，将培养基改为CDM-成熟培养基，优选在第7天。
iPSC-CM的收获和冷冻保存
停止生物反应器(约3.3L培养基)，使典型大小为400-600μm(例如在第14天)的聚集体沉降30分钟。将约2.5L的培养基泵走，将剩余的生物质(约800mL)通过收获口(使用气体压力)收获至2L瓶中。将聚集体悬浮液从2L瓶中收集在收集管中。然后，通过流式细胞术分析来测定细胞的身份(identity)。用1x或10x TrypLETM选择酶(Life Technologies)解离细胞，用PBS洗涤，并用Inside Fix(Miltenyi)固定和透化。将样品与肌钙蛋白T(TNNT2)抗体或同型对照(Miltenyi稀释液，根据制造商说明)一起孵育。在NovocyteTM流式细胞仪(ACEA Biosciences)上分析样品，并与适当的同型对照(Miltenyi)进行比较。细胞总数为每mL～3-5M(百万)个细胞，并且对标志物肌钙蛋白T呈阳性的细胞>80％，表明iPSC至心肌细胞的转化为～15。聚集体作为基于酶的解离后的单细胞或作为聚集体在含有冷冻保护剂的适当的培养基中冷冻保存。
实施例2–产生内皮聚集体的封闭工艺
将iPSC以40,000/mL的密度在含有10μM Y-27632以促进聚集体形成的250mlStemMACSTMiPS-Brew XF(Miltenyi)中接种于生物反应器(Dasbox Eppendorf)中，使用NaHCO3将pH控制在pH 7.2和7.4的范围内。搅拌速度为200rpm(DO 15％，37℃)。72小时后(第0天)，使生物质(典型大小为50-70μm的聚集体)沉降1小时。将条件培养基(200mL)泵入收集瓶/袋中。
通过在IMDM/F12培养基(Gibco)中混合以下来制备“EDM’”：0.25％白蛋白、1％化学成分确定的脂质浓缩物(Gibco)、0.5％pen/strep(Gibco)、0.001％微量元素B(Corning)、0.01％微量元素C(Corning)、2mM GlutaMAX(Gibco)、0.05mg/ml抗坏血酸(Sigma-Aldrich)、450microMα单硫代甘油(Sigma-aldrich)。
通过向生物反应器添加含有10μM CHIR99021(Axon Medchem)+31.25ng/mL BMP4(R&D Systems)的200mL EDM来诱导分化。
分化72小时后，允许聚集体沉降，将200mL的条件培养基(200mL)泵入收集瓶/袋中，并添加200mL的含有62.5ng/mL VEGF和12.5μM SB431542(Tocris)的EDM。
分化120小时后，允许聚集体沉降，将200mL的条件培养基(200mL)泵入收集瓶/袋中，并添加200mL的含有62.5ng/mL VEGF和12.5μM SB431542(Tocris)的EDM。
分化168小时后，使聚集体沉降，将200mL的条件培养基(200mL)泵入收集瓶/袋中，将聚集体大小为200-500μm的剩余生物质(约50mL)通过收获口(使用气体压力)收获至用于冷冻保存的管中。
通过流式细胞术测定内皮标志物CD31和CD144的纯度，典型纯度为～60％内皮细胞，从iPSC至内皮细胞的转化率(产率)为～15。通过使用磁珠如Miltenyi CD31+微珠试剂盒进行分选，可以进一步提高纯度。
实施例3–产生单细胞单核细胞的封闭工艺
50-70μm的HiPSC聚集体在250mL生物反应器中在mTeSR1培养基(stemcelltechnologies)中产生，类似于上文所述。为了起始分化，允许聚集体沉降1小时。将200mL的条件培养基(200mL)泵入收集瓶/袋中。
通过将含有62.5ng/ml BMP4、62.5ng/ml VEGF、25ng/ml SCF的200mL mTeSR1添加至生物反应器来诱导分化。
分化48小时后，允许聚集体沉降，将200mL的条件培养基(200mL)泵入收集瓶/袋中，并将200mL的含有50ng/ml BMP4、50ng/ml VEGF、20ng/ml SCF的mTeSR1添加至生物反应器中。
分化96小时后，使聚集体沉降，将200mL的条件培养基(200mL)泵入收集瓶/袋分化，通过添加补充有IL3 25ng/ml和M-CSF 100ng/ml以促进培养基中的单核细胞的形成的XVIVO15(Lonza)基础培养基，继续直接单核细胞谱系的分化。在第11、18、25、32、39和46天重复该过程。在第32、39和46天，从收集瓶/袋中收获几批漂浮的CD11b、CD45、和CD14阳性单核细胞，并使用本领域技术人员已知的方法冷冻保存。>90％的单核细胞对于CD14、CD11b和C45呈阳性，转化率(产率)为1个干细胞至～12个单核细胞。
实施例4–产生单细胞HPC和单核细胞的封闭工艺
HiPSC聚集体在250mL生物反应器中产生，如上所述。为了起始分化，允许聚集体沉降1小时。将200mL的条件培养基(200mL)泵入收集瓶/袋中。
通过在IMDM/F12培养基中混合以下来制备HDM培养基：0.25％白蛋白、0.1％甲基纤维素(Sigma-Aldrich)、0.1％聚乙烯醇(Sigma-Aldrich)、1×GlutaMAX、1×抗坏血酸-2-磷酸酯(Sigma-Aldrich)、1％化学成分确定的脂质浓缩物(invitrogen)、1％ ITS-X、2-巯基乙醇(22nM)和无蛋白杂交瘤混合物II(4％)。STAGE I补充剂为：CHIR99021(最终浓度0.5μM；Tocris)、活化素A(最终浓度10ng/ml；R&D Systems)、BMP4(最终浓度20–40ng/ml；R&DSystems)、SCF(最终浓度20ng/ml)、VEGF(最终浓度20ng/ml)和bFGF(最终浓度5–10ng/ml)。STAGE II补充剂为：CHIR99021(0.5μM)、活化素A(10ng/ml)、BMP4(20ng/ml)、SCF(20ng/ml)、VEGF(20ng/ml)和bFGF(10ng/ml)。STAGE III补充剂为：CHIR99021(3μM)、SB-431542(3μM；Cayman Chemical)、BMP4(20ng/ml)、SCF(20ng/ml)、VEGF(20ng/ml)和bFGF(10ng/ml)。STAGE IV补充剂为：BMP4(20ng/ml)、VEGF(50ng/ml)、SCF(50ng/ml)、IGFII(20ng/ml)和bFGF(10ng/ml)。
通过向生物反应器中添加200mL HDM培养基+stage I补充剂来诱导分化。分化24小时后，使聚集体沉降，将200mL的条件培养基(200mL)泵入收集瓶/袋中，并添加200mL的含有stage II补充剂的HDM。
分化48小时后，使聚集体沉降，将200mL的条件培养基(200mL)泵入收集瓶/袋中，并添加200mL的含有stage III补充剂的HDM。
分化72小时后，使聚集体沉降，将200mL的条件培养基(200mL)泵入收集瓶/袋中，并添加200mL的含有stage III补充剂的HDM。
分化96小时后，使聚集体沉降，将200mL的条件培养基(200mL)泵入收集瓶/袋中，并添加200mL的含有stage IV补充剂的HDM。
分化144小时后，使聚集体沉降，将200mL的条件培养基(200mL)泵入收集瓶/袋中，并添加200mL的含有stage IV补充剂的HDM。
分化192小时后，使聚集体沉降，将200mL的条件培养基(200mL)泵入收集瓶/袋分化，并通过每3-7天添加补充有IL3 25ng/ml和M-CSF 100ng/ml的XVIVO15(lonza)基础培养基而继续直接向单核细胞谱系分化。从第21天开始，可以从培养基中收获表达>90％ CD14、CD45、CD11b的单个漂浮单核细胞，转化率(产率)为1个干细胞至～100个单核细胞。
可选地，为了促进CD34、CD45阳性造血祖细胞(HPCs)的形成，在196小时时将培养基切换为补充有由VEGF(50ng ml-1)、SCF(100ng ml-1)、bFGF(10ng ml-1)、FLT3L(10ng ml-1)和IL3(10ng ml-1)组成的混合物1(cocktail 1)的HDM，或补充有由TPO(10-25ng/ml)、SCF(10-25ng/ml)、Flt3L(10-25ng/ml)、IL-3(2-10ng/ml)、IL-6(2-10ng/ml)、SRI(0.75mM)、OSM(2-10ng/ml)、和EPO(2U/ml)组成的混合物2的HDM。
对于HPC和单核细胞工艺，使用上述方法，每3-7天更换培养基，直至第45天。从收集瓶中分离出单细胞用于进一步处理，并使聚集体沉降用于进一步培养。
实施例5–从hiPSC产生皮层神经元的封闭工艺
HiPSC聚集体在250mL生物反应器中在mTeSR1培养基(stem cell technologies)中产生，如上所述。为了起始分化，允许聚集体沉降1小时。将200mL的条件培养基(200mL)泵入收集瓶/袋中。
通过向生物反应器添加含有12.5μM活化素/TGF-b抑制剂SB431542(R&D Systems)和1.25μM BMP抑制剂LDN193189(Stemgent)的200mL mTeSR1来诱导分化。
通过混合15％ KSR(Invitrogen)、KO DMEM(Invitrogen)、2mM L-谷氨酰胺(Gibco)、1％非必需氨基酸(NEAA)(Gibco)、1％青霉素-链霉素(Gibco)和50μMβ-巯基乙醇(Gibco)来制备NDM培养基I。
通过混合DMEM/F12(Invitrogen)、1％ N2补充剂(Gibco)、2％不含维生素A的B27补充剂(Life Technologies)、1％ Glutamax(Gibco)、1％ NEAA(Gibco)、1％青霉素-链霉素(Gibco)来制备NDM培养基II。
分化24小时、48小时后，允许聚集体沉降，将200mL的条件培养基(200mL)泵入收集瓶/袋中，并将200mL的含有2μM XAV939、10μM SB431542(R&D Systems)和1,25μM BMP抑制剂LDN193189(Stemgent)的NDM培养基I添加至生物反应器。
分化72小时后，允许聚集体沉降，将200mL的条件培养基(200mL)泵入收集瓶/袋中，并将200mL的NDM培养基I、10μM SB431542(R&D Systems)和1,25μM BMP抑制剂LDN193189(Stemgent)添加至生物反应器。
分化第5天，允许聚集体沉降，将200mL的条件培养基(200mL)泵入收集瓶/袋中，并将200mL的含有10μM SB431542(R&D Systems)和1,25μM BMP抑制剂LDN193189(Stemgent)的NDM培养基I/II(68,75％/31,25％)添加至生物反应器。
分化第6天，允许聚集体沉降，将200mL的条件培养基(200mL)泵入收集瓶/袋中，并将200mL的含有10μM SB431542(R&D Systems)和1,25μM BMP抑制剂LDN193189(Stemgent)的NDM培养基I/II(43,75％/56,25％)添加至生物反应器。
分化第8天，允许聚集体沉降，将200mL的条件培养基(200mL)泵入收集瓶/袋中，并将200mL的NDM培养基I/II(18,75％/81,25％)添加至生物反应器。
分化第10、13和17天，允许聚集体沉降，将200mL的条件培养基(200mL)泵入收集瓶/袋中，并将200mL的NDM培养基II添加至生物反应器。
分化第20、23、27、30天，允许聚集体沉降，将200mL的条件培养基(200mL)泵入收集瓶/袋中，并将200mL的含有10ng/ml脑源性神经营养因子(BDNF)和10ng/ml胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)(二者均来自R&D systems)的NDM培养基II添加至生物反应器中。
实施例6
利用两种培养基更新策略在6天期间将iPSC聚集体分化为生血内皮，其中在第2、3、4和6天更新部分培养基(例如70体积％、80体积％和/或90体积％)或全部的培养基。在第6天测量细胞计数。其中在不同天数更新部分培养基的策略显示出增加的总细胞数，在该实验中增加超过117％(超过2倍)，并且感兴趣的细胞类型(CD34+,CD73-)增加了至少10％。不受理论的束缚，这些结果表明，与(基本上)完全替换相比，采用包括培养基的部分替换的策略的培养表现更好，这可能是由于减少的压力、减少的由于操作导致的细胞损失、或由细胞分泌的有益细胞因子。
现在已经充分描述了本发明，本领域技术人员将理解，在不脱离本发明的精神和范围且无需过度实验的情况下，可以在大范围的等效参数、浓度和条件下进行同样的操作。
尽管已经结合本发明的具体实施方案描述了本发明，但是应理解，它能够进一步修改。本申请旨在涵盖总体上遵循本发明的原理的本发明的任何变化、使用或改编，并且包括在本发明所属领域内的已知或常规实践的范围内的本公开的此类偏离，并且可以应用于如在所附权利要求的范围内的上述基本特征。
本文引用的所有参考文献，包括期刊文章或摘要、公开的或相应的专利申请、专利或任何其它参考文献，通过引用完整地并入本文，包括引用的参考文献中出现的所有数据、表格、图和文本。此外，本文引用的参考文献中引用的参考文献的全部内容也通过引用完整地并入。
对已知方法步骤、常规方法步骤、已知方法或常规方法的引用绝不是承认在相关领域中公开、教导或暗示了本发明的任何方面、描述或实施方案。
具体实施方案的前述描述将充分地揭示本发明的一般性质，使得其它人可以通过应用本领域技术内的知识(包括本文引用的参考文献的内容)，在不脱离本发明的一般概念、且无需过度的实验的情况下，容易地修改和/或使其适应于这些具体实施方案的各种应用。因此，基于本文给出的教导和教导，这样的适应和修改旨在处于所公开的实施方案的等同物的含义和范围内。应理解，本文的措辞或术语是为了描述的目的，而不是为了限制，使得本说明书的术语或措辞将由技术人员根据本文给出的教导和指导、结合本领域普通技术人员的知识来解释。

Claims (28)

1.一种用于体外制造从多能干细胞分化的预选细胞类型的方法，优选用于在封闭培养系统中体外制造从多能干细胞分化的预选细胞类型的方法，其中所述方法包括以下步骤：
a)提供多能干细胞和培养基；
b)将所述多能干细胞和所述培养基引入至培养容器中，优选地，其中所述培养容器是封闭培养系统的一部分，其中所述培养基是
i)用于增殖所述多能干细胞的培养基；或
ii)用于诱导所述多能干细胞向所述预选细胞类型分化的培养基；
c)混合所述培养容器中的培养基，从而允许所述细胞以细胞聚集体的形式生长和防止所述细胞聚集体的沉降；
d)停止混合所述培养容器中的培养基，从而允许所述细胞聚集体沉降；
e)收集所述培养容器中的部分培养基；
f)任选地，在步骤b)中使用用于增殖所述多能干细胞的培养基的情况下，在所述培养容器中引入用于增殖所述多能干细胞的另外的培养基，并重复步骤c)-e)；
g)将后续培养基引入至所述培养容器中，其中所述培养基是用于诱导所述细胞向所述预选细胞类型分化的培养基；
h)混合所述培养容器中的培养基，从而允许所述细胞以细胞聚集体的形式生长和防止所述细胞聚集体的沉降；
i)停止混合所述培养容器中的培养基，从而允许所述细胞聚集体沉降；
j)收集所述培养容器中的部分培养基，并对后续培养基重复步骤g)-i)，或者收集所述培养容器中的培养基、收集所述培养容器中的所述细胞聚集体、或收集两者。
2.根据权利要求1所述的方法，其中使用一种以上的后续培养基重复步骤g)–i)一次或多于一次。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤b)中，将所述多能干细胞以单细胞悬浮液的形式引入，或者其中在步骤b)中，将所述多能干细胞以细胞聚集体的形式引入。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤b)中，所述培养基中的多能干细胞的量在每ml培养基1x 104–1x 106个多能干细胞。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，当步骤b)中的细胞以细胞聚集体的形式引入时，所述细胞聚集体的大小为10–150微米，优选25–140微米，优选选自由20–80微米、30–60微米、90–140微米、和100–120微米组成的组。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所制造的预选细胞类型的量是步骤b)中引入的多能干细胞的量或者步骤b)或步骤g)中被诱导向预选细胞类型分化的步骤细胞的量的至少10倍，优选至少15倍、至少20倍、或至少25倍，优选10–100倍、15–80倍、或20–75倍。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤j)中收集的所述细胞聚集体的大小为小于1000微米，优选地，大小为10–1000微米、20–750微米、或50–500微米。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述培养容器中的培养基的体积为至少1升，优选至少2升、3升、4升、5升、6升、7.5升或10升，优选地，其中所述培养容器中的培养基为1升～100升，优选5升～50升。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中制造至少1X 106个细胞/ml培养基，优选至少1.5X 106个细胞/ml、2.0X 106个细胞/ml、3.0X 106个细胞/ml、4.0X 106个细胞/ml、5.0X 106个细胞/ml、8.0X 106个细胞/ml、12.0X 106个细胞/ml或200X 106个细胞/ml。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中制造至少1x 109个预选细胞，优选至少10x 109、25x 109、100x 109、200x 109、或500x 109个预选细胞。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中省略任选步骤f)和/或其中重复步骤g)–i)至少一次，优选至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25次。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤c)或h)各自独立地进行至少12小时、1、2、3、4、5、6或7天，优选不超过10天，优选不超过7天，和/或其中步骤h)进行至少12小时、1、2、3、4、5、6或7天。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法在至少5、6、7、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20天的时间段内进行，优选7～90天、10～60天、15～40天、或15～30天的时间段内进行。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中用于增殖所述多能干细胞的不同培养基的组成相同或不同，和/或其中用于所述细胞向所述预选细胞类型分化的不同培养基的组成相同或不同。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤e)和/或j)中，收集所述培养容器中至多95体积％、90体积％、85体积％、或80体积％的培养基，和/或其中在步骤e)和/或j)中，收集所述培养容器中至少50体积％、60体积％、或70体积％的培养基。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述预选细胞类型为心血管细胞、心肌细胞、内皮细胞、造血谱系细胞、造血祖细胞、从造血祖细胞分化的细胞、单核细胞、巨噬细胞、T细胞、B细胞、NK细胞、树突状细胞、神经元细胞、视网膜细胞、肺细胞、肝细胞、或胰腺细胞。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所收集的部分培养基或所收集的培养基包含单细胞和/或非聚集细胞，优选其中这些单细胞或非聚集细胞选自由以下组成的组：造血谱系细胞、造血祖细胞、从造血祖细胞分化的细胞、单核细胞、巨噬细胞、T细胞、B细胞、NK细胞、或树突状细胞。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤b)或任选地步骤g)中提供的培养基包含Rho相关蛋白激酶抑制剂。
19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤b)和/或g)、优选地步骤g)中提供的培养基包含聚乙烯醇。
20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中用于诱导所述细胞向所述预选细胞类型分化的培养基包含诱导所述细胞向所述预选细胞类型分化的一种以上的化合物，优选地，其中所述一种以上的化合物选自由以下组成的组：Wnt途径激活剂、Wnt途径抑制剂、活化素途径激活剂、TGFβ途径激活剂、BMP途径激活剂、活化素途径抑制剂、TGFβ途径抑制剂、BMP途径抑制剂、和VEGF途径激活剂。
21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中诱导所述(多能干)细胞向所述预选细胞类型分化的一种以上的化合物选自由诱导所述细胞向以下细胞分化的化合物组成的组：心血管细胞、心肌细胞、内皮细胞、造血谱系细胞、造血祖细胞、从造血祖细胞分化的细胞、单核细胞、巨噬细胞、T细胞、B细胞、NK细胞、树突状细胞、神经元细胞、视网膜细胞、肺细胞、肝细胞、或胰腺细胞。
22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中用于诱导所述(多能干)细胞向所述预选细胞类型分化的培养基包含甲状腺激素和/或甲状腺激素类似物。
23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞是诱导性多能干细胞、人多能干细胞、或人诱导性多能干细胞。
24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述预选细胞类型细胞从所述细胞聚集体获得、或从所收集的部分培养基获得、或从所收集的培养基获得。
25.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中体外制造的所述预选细胞类型用于细胞疗法。
26.封闭培养系统在体外制造从多能干细胞分化的预选细胞类型、优选根据前述权利要求中任一项所限定的方法体外制造从多能干细胞分化的预选细胞类型中的用途。
27.一种培养系统，优选封闭的培养系统，其包含至少1x 109个预选细胞，优选至少10x109、25x 109、100x 109、200x 109、或500x 109个预选细胞和/或包含至少1升，优选至少2升、3升、4升、5升、6升、7.5升、或10升培养基，优选为1升～100升，优选5升～50升培养基，包含至少1X 106个细胞/ml培养基，优选至少1.5X 106个细胞/ml、2.0X 106个细胞/ml、3.0X 106个细胞/ml、或5.0X 106个细胞/ml。
28.一种药物组合物，其用于细胞疗法，其中所述细胞疗法包括向有需要的受试者提供预选细胞类型并且其中所述预选细胞类型已经用前述方法权利要求中任一项所限定的方法制造的步骤，或者其中所述细胞疗法包括用前述方法权利要求中任一项所限定的方法制造预选细胞类型并向有需要的受试者提供所述预选细胞类型的步骤。
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