CN106754649A

CN106754649A - 利用人多能干细胞构建类肾器官的培养方法

Info

Publication number: CN106754649A
Application number: CN201710083715.1A
Authority: CN
Inventors: 肖枫林; 李清刚; 陈香美
Original assignee: Chinese PLA General Hospital
Current assignee: Chinese PLA General Hospital
Priority date: 2017-02-16
Filing date: 2017-02-16
Publication date: 2017-05-31

Abstract

本发明提供了一种利用人多能干细胞构建类肾器官的培养方法，该方法包括步骤：1)用基质胶作为细胞外基质，铺于细胞培养皿表面；2)去除基质胶，向细胞培养皿中加入无饲养层培养基，接种人多能干细胞，进行人多能干细胞的培养传代；3)细胞达到40～50％汇合度时，去除无饲养层培养基，加入含细胞因子的基础培养基，进行人多能干细胞的培养分化；4)收集细胞置于Transwell培养装置中，制作类肾器官。本发明还提供了按照上述方法制备得到的多细胞类肾器官。这种类肾器官由内皮与肾间质包绕完整分段的肾单位组成，而且其转录与人胚肾相似。

Description

利用人多能干细胞构建类肾器官的培养方法

技术领域

本发明是关于一种类肾器官的培养方法，具体地说，是关于一种利用人诱导多能干细胞(hiPSCs)构建类肾器官的方法。

背景技术

干细胞是能够分化为多种细胞类型的细胞。人诱导多能干细胞(hiPSCs)可以分化为多种细胞类型，现在已经可以直接分化形成脑、心、肠、肝、肺、肾等类器官。尽管在构建组织特异性单位与类器官方面已经取得显著成果，但在体外保存这种细胞聚集体仍是个巨大挑战。细胞培养需要氧气与养分，但体外构建的3D类器官缺乏血管系统，所以其寿命、大小和成熟度通常受限制。

人类的肾脏包含多达200万个负责血液滤过的上皮肾单位。为了满足排泄和PH值、电解质及体液平衡的调节等功能，再生肾脏需要诱导20多种不同的细胞类型。

目前，尚未有在体外利用人多能干细胞构建类肾器官的相关技术报道。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种体外构建类肾器官的技术。

一方面，本发明提供了一种利用人诱导多能干细胞(hiPSCs)构建类肾器官的培养方法，其是在体外利用人多能干细胞构建类肾器官。具体而言，本发明的方法包括以下步骤：

1)用基质胶作为细胞外基质，铺于细胞培养皿表面；

2)去除基质胶，向细胞培养皿中加入无饲养层培养基，接种人多能干细胞，进行人多能干细胞的培养传代；

3)细胞达到40～50％汇合度时定为第0天，去除无饲养层培养基，加入含细胞因子的基础培养基(STEMdiff APEL Medium)，进行人多能干细胞的培养分化；

4)收集细胞置于Transwell过滤器表面，制作类肾器官。

根据本发明的具体实施方案，本发明的利用人多能干细胞构建类肾器官的培养方法，步骤1)中，是用移液枪吸取所述的基质胶，移入细胞培养皿中，晃动摇匀，使基质胶均匀分布覆盖于培养皿底部，然后将基质胶覆盖的细胞培养皿在37℃下放置3～6小时或在2～8℃放置过夜，放置期间基质胶需始终保持完全覆盖皿底。具体地，以6孔板的1个孔为例，通常情况下，吸取1ml的基质胶即可均匀分布覆盖于培养皿底部。

根据本发明的具体实施方案，本发明的利用人多能干细胞构建类肾器官的培养方法，步骤1)中，所述基质胶为Basement Membrane Matrix或hESC qualified Matrigel。所述基质胶可商购获得，例如可购自北京赛贝生物技术有限公司、In Vitro Technologies等。

根据本发明的具体实施方案，本发明的利用人多能干细胞构建类肾器官的培养方法，步骤2)中，所述的无饲养层培养基为完全培养基。例如，可以是PSC-Easy完全培养基，具体地，其包括以下组分：基础培养基DMEM/F-12；添加剂：碳酸氢钠543μg/ml、硒酸钠14ng/ml、重组人胰岛素生长因子20ng/ml、重组人碱性成纤维细胞生长因子100ng/ml、重组人乳铁蛋白11μg/ml、抗坏血酸65μg/ml以及重组人转化生长因子2ng/mL。所述完全培养基可商购获得，例如可购自北京赛贝生物技术有限公司等。通常情况下，以6孔板的1个孔为例，可加入1～2ml的无饲养层培养基。

根据本发明的具体实施方案，本发明的利用人多能干细胞构建类肾器官的培养方法中，所述的人多能干细胞包括人诱导多能干细胞(hiPSCs)。

诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS cells)最初是日本科学家山中伸弥(Shinya Yamanaka)于2006年利用病毒载体将四个转录因子(Oct4,Sox2,Klf4和c-Myc)的组合转入分化的体细胞中，使其重编程而得到的类似胚胎干细胞和胚胎APSC多能细胞的一种细胞类型。通过采用导入外源基因的方法使体细胞去分化为多能干细胞，对于这类干细胞称之为诱导多能干细胞。

根据本发明的具体实施方案，本发明的利用人多能干细胞构建类肾器官的培养方法，步骤2)中，人多能干细胞接种前经过以下处理步骤：

根据需要进行解冻；或已经在连续的培养之中的人多能干细胞不需要解冻；

使用EDTA使人多能干细胞脱离原培养表面。

根据本发明的具体实施方案，本发明的利用人多能干细胞构建类肾器官的培养方法中，使用EDTA使人多能干细胞脱离原培养表面的过程可以按照如下操作进行：

以连续培养之中的细胞为例：用移液枪吸取trypsin EDTA(0.25％)(吸取量以6孔板的1个孔为例通常为1ml)，移入细胞培养皿中，在37℃下放置约3min。然后吸去trypsinEDTA，尽量吸尽，但注意不要把白色细胞克隆吸起。之后用移液枪吸取无饲养层培养基(吸取量以6孔板的1个孔为例通常为1ml)，移入细胞培养皿中，吹打细胞，吹打的动作轻柔、速度缓慢，总次数少于10次，即得到脱离原培养表面的人多能干细胞，可进一步将其接种于所述的细胞培养皿表面。

根据本发明的具体实施方案，本发明的利用人多能干细胞构建类肾器官的培养方法中，在将人多能干细胞接种于所述的细胞培养皿表面时，可以按照如下操作进行：

将人多能干细胞按照1:8至1:10的比例接种到新培养皿中，水平十字摇匀。显微镜下确认大部分细胞团块大小为4～20个细胞，细胞密度为10～20％。

根据本发明的具体实施方案，本发明的利用人多能干细胞构建类肾器官的培养方法中，以连续培养之中的细胞为例，传代接种的前提条件优选为：显微镜下观察旧培养皿中的细胞状态良好，细胞汇合度80～90％。

根据本发明的具体实施方案，本发明的利用人多能干细胞构建类肾器官的培养方法，步骤2)中，人多能干细胞培养温度为36℃～37.5℃，每天更换所述的无饲养层培养基1次，4天传代一次。

根据本发明的具体实施方案，本发明的利用人多能干细胞构建类肾器官的培养方法中，人多能干细胞传代培养达到40～50％汇合度时定为第0天，去除无饲养层培养基。

更具体地，本发明中，每一代细胞都是在细胞长至80～90％汇合度时进行传代，按照1:8至1:10的比例传代，在新培养皿中，传代后的子代细胞均是10～20％汇合度，2～3天后即可长至40～50％汇合度。

根据本发明的具体实施方案，本发明的利用人多能干细胞构建类肾器官的培养方法中，去除无饲养层培养基时，采用移液枪直接吸除，尽量吸尽，弃掉即可。

根据本发明的具体实施方案，本发明的利用人多能干细胞构建类肾器官的培养方法，步骤3)中所述的含细胞因子的基础培养基，第0天使用的是含8μM CHIR99021的基础培养基，第2天更换一次含8μM CHIR99021的基础培养基，第4天使用的是含有200ng/ml FGF9+1μg/ml肝素的基础培养基，每2天更换培养基(含有200ng/ml FGF9+1μg/ml肝素的基础培养基)。该过程中，培养温度始终保持在36℃～37.5℃。每次更换培养基时，培养基用量约为1～2ml(以6孔板的1个孔为例)。

根据本发明的具体实施方案，本发明的利用人多能干细胞构建类肾器官的培养方法，步骤4)中所述的步骤是人多能干细胞培养第7天进行。收集细胞置于Transwell过滤器表面的的具体操作包括以下步骤：

(4-1)使用EDTA使人多能干细胞脱离原培养表面，收集细胞；

(4-2)使用不含细胞因子的基础培养基重悬细胞，进行细胞计数并离心，在Transwell培养装置的下室中加入含5μM CHIR99021的基础培养基，将离心后的细胞球体置于Transwell上室(Transwell小室，Transwell chamber，Transwell insert，亦称Transwell嵌套、Transwell过滤器)进行培养。

更具体地，收集细胞的具体操作按照如下进行：

第7天，用移液枪吸取1ml trypsin EDTA(0.25％)，移入细胞培养皿中，在37℃下放置3min。然后吸去trypsin EDTA，尽量吸尽，去除残留的trypsin EDTA，但注意不要把白色细胞克隆吸起。用移液枪吸取1ml无饲养层培养基，移入细胞培养皿中，吹打细胞，吹打的动作轻柔、速度缓慢，总次数少于10次。将细胞收入15ml离心管中，进行离心(400g，3min)。去除培养基(尽量吸尽)至仅剩一个细胞球体。用1ml基础培养基重悬细胞。拿出10μl细胞悬液进行细胞计数。每个类肾体都有大约5×10⁵个细胞，等分所需的细胞悬液量进1.5mlEppendorf管。离心上述Eppendorf管400g，2～3min。将含5μM CHIR99021的基础培养基加入到Transwell培养装置的下室(例如6孔Transwell聚酯膜细胞培养板)中。Transwell小室附在培养基表面。以P1000或P200枪头的大口径端将细胞球体捡起，放在Transwell上室上培养。培养条件为36℃～37.5℃孵育。

根据本发明的具体实施方案，本发明的利用人多能干细胞构建类肾器官的培养方法，在将所述人多能干细胞置于Transwell上室进行培养1小时后将下室中的培养基换为含200ng/ml FGF9+1μg/ml肝素的基础培养基，每2天更换培养基(含200ng/ml FGF9+1μg/ml肝素的基础培养基)，第12天开始每2天更换为不含细胞因子的基础培养基，共培养18天以上。

本发明的利用人多能干细胞构建类肾器官的培养方法，能够在体外诱导人诱导多能干细胞(hiPSCs)形成复杂的多细胞类肾器官。

另一方面，本发明还提供了按照上述方法制备得到的多细胞类肾器官。这种类肾器官由内皮与肾间质包绕完整分段的肾单位组成，而且其转录与人胚肾相似。虽然在小管功能成熟、小球血管化以及相连的集合管上皮形成排尿的单一出口等方面还存在发展空间，但目前观察到的类肾器官的组织复杂性和功能化的程度支持其在药物毒性筛选、遗传性肾脏疾病模型或作为细胞治疗的特殊肾脏细胞类型的来源等方面的应用。

本发明的有益效果：

模拟肾脏功能和结构的类器官的应用，并不仅限于了解人类肾脏发育。类器官适用于研究遗传疾病的发病机制，因为患者来源的PSC可用于产生类器官。类器官同样适用于药物检验，因为PSC可根据患者队列和体外及体内移植后类器官的功能特征来分层。最后，类器官适用于再生医学，以替代或修复功能性组织单位。

附图说明

图1展示了按照本发明实施例1操作步骤连续培养人诱导多能干细胞(hiPSCs)18天后的克隆形态图。

图2展示了按照本发明实施例1操作步骤连续培养人诱导多能干细胞(hiPSCs)18天后的免疫荧光染色图。

图3展示了按照本发明实施例2操作步骤连续培养人诱导多能干细胞(hiPSCs)18天后的克隆形态图。

图4展示了按照本发明实施例2操作步骤连续培养人诱导多能干细胞(hiPSCs)18天后的免疫荧光染色图。

具体实施方式

为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现结合具体实施例对本发明的技术方案进行以下详细说明，应理解这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。各实施例中所使用的细胞均购自北京赛贝生物技术有限公司。hiPSCs信息：37岁男性尿液分离肾上皮细胞，仙台病毒重编程而来的。

实施例1

按照以下操作构建类肾器官(实施例中所有方法均以6孔板的1个孔为例进行说明)：

1)用基质胶作为细胞外基质，铺于细胞培养皿表面

用移液枪吸取1ml基质胶(Basement Membrane Matrix，购自北京赛贝生物技术有限公司)，移入细胞培养皿中，晃动摇匀，使基质胶均匀分布覆盖于培养皿底部，然后将基质胶覆盖的细胞培养皿在37℃下放置4小时，放置期间基质胶需始终保持完全覆盖皿底。

2)去除基质胶，向细胞培养皿中加入无饲养层培养基，接种人多能干细胞，进行人多能干细胞的培养传代

具体按照以下操作进行：

去除步骤1)中所用的新培养皿中的基质胶，加入2ml PSC-Easy完全培养基(购自北京赛贝生物技术有限公司，包括以下组分：基础培养基DMEM/F-12；添加剂：碳酸氢钠543μg/ml、硒酸钠14ng/ml、重组人胰岛素生长因子20ng/ml、重组人碱性成纤维细胞生长因子100ng/ml、重组人乳铁蛋白11μg/ml、抗坏血酸65μg/ml以及重组人转化生长因子2ng/mL)，置于37℃预热。

取出已经在连续的培养之中的人多能干细胞(hiPSCs，实验用原始细胞购自北京赛贝生物技术有限公司)的旧培养皿(显微镜下观察旧培养皿中的细胞状态良好，细胞汇合度80～90％)，清除皿中无饲养层培养基(吸除、弃掉)，用移液枪吸取1ml trypsin EDTA(0.25％)，移入细胞培养皿中，在37℃下放置3min。然后吸去trypsin EDTA，尽量吸尽，去除残留的trypsin EDTA，但注意不要把白色细胞克隆吸起。用移液枪吸取1ml无饲养层培养基，移入细胞培养皿中，吹打细胞，吹打的动作轻柔、速度缓慢，总次数少于10次。得到脱离原培养表面的人多能干细胞，按照1:8的比例接种到新培养皿中，水平十字摇匀。显微镜下确认大部分细胞团块大小约为15个细胞，细胞密度约为18％。置于36℃～37.5℃培养，每天更换所述的无饲养层培养基1次，4天传代一次。

3)细胞达到40～50％汇合度时定为第0天，去除无饲养层培养基，加入含细胞因子的基础培养基(STEMdiff APEL Medium)，进行人多能干细胞的培养分化

人多能干细胞传代培养达到40～50％汇合度时定为第0天(在新培养皿中，传代后的子代细胞均是10～20％汇合度，2～3天后即可长至40～50％汇合度)，去除无饲养层培养基(采用移液枪直接吸除，尽量吸尽，弃掉即可)。

在进行人多能干细胞的培养分化时，培养温度保持在36℃～37.5℃。其中所述的含细胞因子的基础培养基，第0天使用的是含8μM CHIR99021的基础培养基，第2天更换一次含8μM CHIR99021的基础培养基，第4天开始使用的是含有200ng/ml FGF9+1μg/ml肝素的基础培养基，每2天更换培养基(含有200ng/ml FGF9+1μg/ml肝素)。每次更换培养基时，培养基用量约为2ml。

4)收集细胞置于Transwell培养装置中继续培养，以制作类肾器官

步骤3)中人多能干细胞培养第7天，收集细胞置于Transwell培养装置中继续培养，具体操作如下：

第7天，用移液枪吸取1ml trypsin EDTA(0.25％)，移入细胞培养皿中，在37℃下放置3min。然后吸去trypsin EDTA，尽量吸尽，去除残留的trypsin EDTA，但注意不要把白色细胞克隆吸起。用移液枪吸取1ml无饲养层培养基，移入细胞培养皿中，吹打细胞，吹打的动作轻柔、速度缓慢，总次数少于10次。将细胞收入15ml离心管中，进行离心(400g，3min)。去除培养基(尽量吸尽)至仅剩一个细胞球体。用1ml基础培养基重悬细胞。拿出10μl细胞悬液进行细胞计数。每个类肾体都有大约5×10⁵个细胞，等分所需的细胞悬液量进1.5mlEppendorf管。离心上述Eppendorf管400g，2min。将1.2ml含5μM CHIR99021的基础培养基加入到6孔Transwell聚酯膜细胞培养板(polyester membrane cellculture inserts，24mm Transwell with 0.4μm pore polyester membrane insert,TCtreated,sterile，Sigma-Aldrich,#CLS3450-24EA)的下室中。Transwell小室(上室)附在培养基表面。以P1000或P200枪头的大口径端将细胞球体捡起，放在Transwell小室上。在36℃～37.5℃孵育细胞球体1h。1h后，除去含5μM CHIR99021的基础培养基，并使用1.2ml含200ng/ml FGF9+1μg/ml肝素的基础培养基。培养期间每2天更换含200ng/ml FGF9+1μg/ml肝素的基础培养基。第12天开始每2天更换为不含细胞因子的基础培养基，继续培养，共培养18天以上。

上述操作中，Transwell培养装置上室仅放置细胞球体，下室放置1.2ml含5μMCHIR99021的基础培养基，1小时后换为1.2ml含200ng/ml FGF9+1μg/ml肝素的基础培养基。本发明中，在下室加1.2ml培养基的目的是这个1.2ml的液面刚好可以接触到上室的多孔膜及细胞球体，为细胞提供养分。其他操作参照商家提供的说明书进行。

本实施例的方法构建的类肾器官，在每一个类肾体中，肾单位分为两部分，包括肾小管和肾小球。而且，类肾体表现出复杂的形态模式，肾小管在每个类肾体的底部，而肾小球在每个类肾体的顶部。图1展示了按照本实施例操作步骤连续培养人诱导多能干细胞(hiPSCs)18天后的克隆形态图。

构建类肾体后，使用免疫荧光染色方法进行细胞类型验证。染色结果显示红色为WT1，绿色为ECAD，蓝色为DAPI。图2展示了按照本实施例操作步骤连续培养人诱导多能干细胞(hiPSCs)18天后的免疫荧光染色图。在发育第18天，肾上皮细胞显示出肾小管(ECAD+)成分。在第18天，还能观察到由包曼氏囊与中央足细胞组成的早期肾小球(WT1+)。因此，在类肾体中有预期的肾脏成分形成、构型并开始成熟。

实施例2

1)用基质胶作为细胞外基质，铺于细胞培养皿表面

用移液枪吸取1ml的基质胶hESC qualified Matrigel(In VitroTechnologies,#FAL354277)，移入细胞培养皿中，晃动摇匀，使基质胶均匀分布覆盖于培养皿底部，然后将基质胶覆盖的细胞培养皿在2～8℃放置过夜，放置期间基质胶需始终保持完全覆盖皿底。

具体按照以下操作进行：

取出已经在连续的培养之中的人多能干细胞(hiPSCs，实验用原始细胞购自北京赛贝生物技术有限公司)的旧培养皿(显微镜下观察旧培养皿中的细胞状态良好，细胞汇合度80～90％)，清除皿中无饲养层培养基(吸除、弃掉)，用移液枪吸取1ml trypsin EDTA(0.25％)，移入细胞培养皿中，在37℃下放置3min。然后吸去trypsin EDTA，尽量吸尽，去除残留的trypsin EDTA，但注意不要把白色细胞克隆吸起。用移液枪吸取1ml无饲养层培养基，移入细胞培养皿中，吹打细胞，吹打的动作轻柔、速度缓慢，总次数少于10次。得到脱离原培养表面的人多能干细胞，按照1:10的比例接种到新培养皿中，水平十字摇匀。显微镜下确认大部分细胞团块大小约为6个细胞，细胞密度约为10％。置于36℃～37.5℃培养，每天更换所述的无饲养层培养基1次，4天传代一次。

在进行人多能干细胞的培养分化时，培养温度保持在36℃～37.5℃。其中所述的含细胞因子的基础培养基，第0天使用的是含8μM CHIR99021的基础培养基，第4天使用的是含有200ng/ml FGF9+1μg/ml肝素的基础培养基，每2天更换培养基(含有200ng/ml FGF9+1μg/ml肝素)。每次更换培养基时，培养基用量约为2ml。

第7天，用移液枪吸取1ml trypsin EDTA(0.25％)，移入细胞培养皿中，在37℃下放置3min。然后吸去trypsin EDTA，尽量吸尽，去除残留的trypsin EDTA，但注意不要把白色细胞克隆吸起。用移液枪吸取1ml无饲养层培养基，移入细胞培养皿中，吹打细胞，吹打的动作轻柔、速度缓慢，总次数少于10次。将细胞收入15ml离心管中，进行离心(400g，3min)。去除培养基(尽量吸尽)至仅剩一个细胞球体。用1ml基础培养基重悬细胞。拿出10μl细胞悬液进行细胞计数。每个类肾体都有大约5×10⁵个细胞，等分所需的细胞悬液量进1.5mlEppendorf管。离心上述Eppendorf管400g，3min。将1.2ml含5μM CHIR99021的基础培养基加入到6孔Transwell聚酯膜细胞培养板(polyester membrane cellculture inserts，24mm Transwell with 0.4μm pore polyester membrane insert,TCtreated,sterile，Sigma-Aldrich,#CLS3450-24EA)的下室中。Transwell小室(上室)附在培养基表面。以P1000或P200枪头的大口径端将细胞球体捡起，放在Transwell小室上。在36℃～37.5℃孵育细胞球体1h。1h后，除去含5μM CHIR99021的基础培养基，并使用1.2ml含200ng/ml FGF9+1μg/ml肝素的基础培养基继续培养。培养期间每2天更换含200ng/ml FGF9+1μg/ml肝素的基础培养基。第12天开始每2天更换为不含细胞因子的基础培养基，继续培养，培养18天以上。

本实施例的方法构建的类肾器官，在每一个类肾体中，肾单位分为两部分，包括肾小管和肾小球。而且，类肾体表现出复杂的形态模式，肾小管在每个类肾体的底部，而肾小球在每个类肾体的顶部。图3展示了按照本实施例操作步骤连续培养人诱导多能干细胞(hiPSCs)18天后的克隆形态图。

构建类肾体后，使用免疫荧光染色方法进行细胞类型验证。染色结果显示红色为WT1，绿色为ECAD，蓝色为DAPI。图4展示了按照本实施例操作步骤连续培养人诱导多能干细胞(hiPSCs)18天后的免疫荧光染色图。在发育第18天，肾上皮细胞显示出肾小管(ECAD+)成分。在第18天，还能观察到由包曼氏囊与中央足细胞组成的早期肾小球(WT1+)。因此，在类肾体中有预期的肾脏成分形成、构型并开始成熟。

最后说明的是：以上实施例仅用于说明本发明的实施过程和特点，而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，均应涵盖在本发明的保护范围当中。

Claims

1.一种体外利用人多能干细胞构建类肾器官的培养方法，该方法包括步骤：

1)用基质胶作为细胞外基质，铺于细胞培养皿表面；

3)细胞达到40～50％汇合度时，去除无饲养层培养基，加入含细胞因子的基础培养基，进行人多能干细胞的培养分化；

4)收集细胞置于Transwell培养装置中，制作类肾器官。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤1)中是用移液枪吸取所述的基质胶，移入细胞培养皿中，晃动摇匀，使基质胶均匀分布覆盖于培养皿底部，然后将基质胶覆盖的细胞培养皿在37℃下放置3～6小时或在2～8℃放置过夜，放置期间基质胶需始终保持完全覆盖皿底。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤1)中所述基质胶为Basement MembraneMatrix或hESC qualified Matrigel。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤2)中所述的无饲养层培养基为完全培养基。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述的人多能干细胞包括人诱导多能干细胞。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤2)中人多能干细胞接种前经过以下处理步骤：

解冻；或者，已经在连续的培养之中的人多能干细胞不需要解冻；

使用EDTA使人多能干细胞脱离原培养表面。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤2)中人多能干细胞培养温度为36℃～37.5℃，每天更换所述的无饲养层培养基1次，4天传代一次。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤3)中，细胞达到40～50％汇合度时定为第0天，所述的含细胞因子的基础培养基，第0天使用的是含8μM CHIR99021的基础培养基，第2天更换一次含8μM CHIR99021的基础培养基，第4天开始使用含有200ng/ml FGF9+1μg/ml肝素的基础培养基每2天更换培养基。

9.根据权利要求1或8所述的方法，其中，步骤4)中所述的步骤是于步骤3)中人多能干细胞培养至第7天进行；

收集细胞置于Transwell过滤器表面的操作包括以下步骤：

(4-1)使用EDTA使人多能干细胞脱离原培养表面，收集细胞；

(4-2)使用不含细胞因子的基础培养基重悬细胞，进行细胞计数并离心，在Transwell培养装置的下室中加入含5μM CHIR99021的基础培养基，将离心后的细胞球体置于Transwell上室进行培养；

在将所述人多能干细胞置于Transwell上室进行培养1小时后将下室中的培养基换为含200ng/ml FGF9+1μg/ml肝素的基础培养基，每2天更换培养基，第12天开始每2天更换为不含细胞因子的基础培养基，共培养18天以上。

10.一种类肾器官，其是按照权利要求1～9任一项所述方法培养得到的。