CN113073076B - 一种将多能干细胞分化为瓣膜内皮细胞与瓣膜间质细胞的分化方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种将多能干细胞分化为瓣膜内皮细胞与瓣膜间质细胞的分化方法，包括以下步骤：准备用于分化的培养瓶或培养皿；准备iPSCs；D0接种细胞；D1‑D4分化；D5‑D6分化；CD144阳性细胞磁珠分选；瓣膜内皮细胞及瓣膜间质细胞的培养与传代。本发明提供的将多能干细胞分化为瓣膜内皮细胞与瓣膜间质细胞的分化方法，可稳定高效的获得大量均一的瓣膜内皮细胞与瓣膜间质细胞，可满足组织工程瓣膜应用于临床对种子细胞的要求，而且本发明方案同样可用于胚胎干细胞的分化，可用于心脏瓣膜疾病发病基质的研究。

Description

一种将多能干细胞分化为瓣膜内皮细胞与瓣膜间质细胞的分 化方法

技术领域

本发明涉及细胞分化技术领域，尤其涉及一种将多能干细胞分化为瓣膜内皮细胞与瓣膜间质细胞的分化方法。

背景技术

目前，全球心脏病发病率逐年升高，患病人数不断增加，心脏瓣膜疾病的发病率也呈上升趋势，全球每年有超过30万例心脏瓣膜手术。心脏瓣膜手术的主要手术方式为瓣膜替换术，而目前临床上主要使用的两种瓣膜替代物：机械瓣与生物瓣均有其缺陷。机械瓣需要终身抗凝治疗，存在出血和血栓栓塞的风险；生物瓣使用寿命有限约为10-15年，许多病人面临二次换瓣的风险。目前普遍认为组织工程瓣膜是最有希望的理想瓣膜替代物，具有无需抗凝可终身使用的优点。

人心脏瓣膜主要由瓣膜基质、瓣膜内皮细胞与瓣膜间质细胞构成。组织工程瓣膜的构建是将种子细胞接种在瓣膜支架上进行体外培养，当形成新的细胞外基质及完整的细胞层后即可植入体内。但目前组织工程瓣膜并没有走上临床应用，主要问题是种子细胞获取困难的问题。以往大多研究采用从受体体内取一段自体血管(动脉/静脉)分离并培养其内皮细胞用来作为组织工程瓣膜的种子细胞接种在瓣膜支架上，这种方法可以避免免疫排斥问题，如中国发明专利CN200810126561.0公开了一种皮肤组织工程种子细胞及构建方法、腺病毒载体及用途，也可以避免免疫排斥问题，但严重损害受体自身血管，并且分离的血管内皮细胞增殖能力差，难以将细胞扩增至组织工程瓣膜种子细胞需要的3×107数量级，因此将自体血管内皮细胞作为组织工程瓣膜的种子细胞临床应用前景并不乐观。也有少数研究中心采用提取受体骨髓间充质干细胞分离培养，在体外诱导分化为内皮细胞作为组织工程瓣膜的种子细胞，但同样存在诱导分化效率低下难以获得可用于临床的种子细胞规模的问题。因此，开发一种可稳定高效获得无免疫排斥反应种子细胞的方案是突破组织工程瓣膜应用于临床瓶颈的关键。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的问题，而提出的一种将多能干细胞分化为瓣膜内皮细胞与瓣膜间质细胞的分化方法。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种将多能干细胞分化为瓣膜内皮细胞与瓣膜间质细胞的分化方法，包括以下步骤：

S1:准备用于分化的培养瓶或培养皿；

S2:准备iPSCs：iPSCs用mTeSR1培养基培养，培养皿底部铺matrigel，在细胞生长至80％-85％满时用Versene消化，消化完全后用mTeSR1中和消化液，离心，弃上清，用含Y27632的mTeSR1重悬细胞并计数；

S3:D0接种细胞：将iPSCs接种在S1中准备好的培养瓶或培养皿内，用含Y27632的mTeSR1培养，水平十字摇匀，放于培养箱中培养；

S4:D1-D4分化：将培养基更换成含有CHIR99021和BMP4的N2B27培养基，3天不换液；

S5:D5-D6分化：将培养基更换成含有VEGF-165与Forskolin的Stempro-34培养基，每天换液；

S6:CD144阳性细胞磁珠分选：在分化满6天后用CD144阳性的磁珠进行分选，分选阳性细胞即为瓣膜内皮细胞分选阴性细胞即为瓣膜间质细胞；

S7:瓣膜内皮细胞及瓣膜间质细胞的培养与传代：磁珠分选后的瓣膜内皮细胞与瓣膜间质细胞分别接种在铺了纤连蛋白的培养瓶里，用EGM-2培养基进行培养，隔天换液。

优选的是，所述S2具体为：将iPSCs用mTeSR1培养基培养，培养皿底部按照1:100的比例铺matrigel，在细胞生长至80％-85％满时用Versene消化，消化完全后用mTeSR1中和消化液并轻柔吹打下细胞，1000rpm离心，弃上清，用含10μMY27632的mTeSR1重悬细胞并计数。

优选的是，所述S3具体为：将iPSCs以4w-6w/cm2的密度接种在S1中准备好的培养瓶或培养皿，用含10μMY27632的mTeSR1培养，每T25培养瓶4mL培养基，水平十字摇匀，放于培养箱中培养1天。

优选的是，所述S4具体为：将培养基更换成含有6-8μM CHIR99021和25ng/mLBMP4的N2B27培养基，每T25培养瓶15-17mL培养基，3天不换液。

优选的是，所述S5具体为：将培养基更换成含有200ng/ml VEGF-165与1-3μMForskolin的Stempro-34培养基，每T25培养瓶10-12mL培养基，每天换液。

优选的是，所述S7具体为：磁珠分选后的瓣膜内皮细胞与瓣膜间质细胞分别以100w/cm2和75w/cm2的密度接种在铺了纤连蛋白的培养瓶里，用EGM-2培养基进行培养，隔天换液。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明方案采用患者自体皮肤或静脉血重编程为iPSCs，再将iPSCs在体外经过6天的条件分化，可稳定高效的获得大量均一的瓣膜内皮细胞与瓣膜间质细胞，可满足组织工程瓣膜应用于临床对种子细胞的要求；

2、本发明方案同样可用于胚胎干细胞的分化，分化细胞可用于心脏瓣膜疾病发病机制的研究。

附图说明

图1是本发明所述的将多能干细胞分化为瓣膜内皮细胞与瓣膜间质细胞的分化方法步骤流程图；

图2为实验所得iPSC和文献报道的iPSC形态对比图，图A为实验所得iPSC，图B为文献报道iPSC；

图3为iPSC在mRNA水平上多能干细胞标志物OCT4、Nanog、Sox2的表达结果；

图4为iPSC在蛋白水平上水平上多能干细胞标志物OCT4、Nanog的表达结果；

图5为将重编程获得的iPSC及iPSC分化的瓣膜内皮细胞与瓣膜间质细胞植入裸鼠皮下；

图6为iPSC分化所得瓣膜内皮细胞及瓣膜间质细胞与分离培养的人天然瓣膜内皮细胞与瓣膜间质细胞形态对比图；

图7、图8为使用流式细胞术证明iPSC经过6天的分化及经过磁珠分选后的结果；

图9为使用单细胞测序技术(scRNA-seq)对iPSC分化的瓣膜内皮细胞与人循环系统的所有内皮细胞进行相似性比较的结果对比图；

图10为使用单细胞测序技术(scRNA-seq)对iPSC分化的瓣膜间质细胞与人体分离的天然瓣膜间质细胞进行相似性比较的结果对比图；

图11为使用免疫荧光法在蛋白层面检测iPSC分化的瓣膜内皮细胞与人体分离培养的瓣膜内皮细胞表达结果；

图12为使用免疫荧光法在蛋白层面证明iPSC分化的瓣膜间质细胞与人体分离培养的瓣膜间质细胞表达结果；

图13为成管实验和摄取LDL实验的结果图；

图14为使用免疫荧光法检测iPSC分化所得瓣膜间质细胞与人体分离培养的瓣膜间质细胞生成Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的能力结果；

图15为iPSC分化所得瓣膜间质细胞与人体分离培养的瓣膜间质细胞在钙化培育基诱导结果；

图16为iPSC分化所得瓣膜内皮细胞接种于去细胞瓣膜支架上3周后结果。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

本发明可以有许多不同的形式实施，而不应该理解为限于在此阐述的实施例，相反，提供这些实施例，使得本公开将是彻底和完整的。在附图中，为了清晰起见，会夸大结构和区域的尺寸和相对尺寸。

如图1所示，本发明提供一种将多能干细胞分化为瓣膜内皮细胞与瓣膜间质细胞的分化方法，包括以下步骤：

S1:准备用于分化的培养瓶或培养皿；

S2:准备iPSCs：iPSCs用mTeSR1培养基培养，培养皿底部铺matrigel，在细胞生长至80％-85％满时用Versene消化，消化完全后用mTeSR1中和消化液并轻柔吹打下细胞，离心，弃上清，用含Y27632的mTeSR1重悬细胞并计数；

S3:D0接种细胞：将iPSCs接种在S1中准备好的培养瓶或培养皿内，用含MY27632的mTeSR1培养，水平十字摇匀，放于培养箱中培养；

S4:D1-D4分化：将培养基更换成含有CHIR99021和BMP4的N2B27培养基，3天不换液；

S5:D5-D6分化：将培养基更换成含有VEGF-165与Forskolin的Stempro-34培养基，每天换液；

S6:CD144阳性细胞磁珠分选：在分化满6天后用CD144阳性的磁珠进行分选，分选阳性细胞即为瓣膜内皮细胞分选阴性细胞即为瓣膜间质细胞；

S7:瓣膜内皮细胞及瓣膜间质细胞的培养与传代：磁珠分选后的瓣膜内皮细胞与瓣膜间质细胞分别接种在铺了纤连蛋白的培养瓶里，用EGM-2培养基进行培养，隔天换液。

进一步地，所述S2具体为：将iPSCs用mTeSR1培养基培养，培养皿底部按照1:100的比例铺matrigel，在细胞生长至80％-85％满时用Versene消化，消化完全后用mTeSR1中和消化液并轻柔吹打下细胞，1000rpm离心，弃上清，用含10μMY27632的mTeSR1重悬细胞并计数。

进一步地，所述S3具体为：将iPSCs以4w-6w/cm2的密度接种在S1中准备好的培养瓶或培养皿，用含10μMY27632的mTeSR1培养，每T25培养瓶4mL培养基，水平十字摇匀，放于培养箱中培养1天。

进一步地，所述S4具体为：将培养基更换成含有6-8μM CHIR99021和25ng/mLBMP4的N2B27培养基，每T25培养瓶15-17mL培养基，3天不换液。

进一步地，所述S5具体为：将培养基更换成含有200ng/ml VEGF-165与1-3μMForskolin的Stempro-34培养基，每T25培养瓶10-12mL培养基，每天换液。

进一步地，所述S7具体为：磁珠分选后的瓣膜内皮细胞与瓣膜间质细胞分别以100w/cm2和75w/cm2的密度接种在铺了纤连蛋白的培养瓶里，用EGM-2培养基进行培养，隔天换液。

以下结合具体实施例对此方案做进一步阐述：

实施例一：

第一部分：

将人外周血单核细胞重编程为iPSCs，并进行全能性检测与分化方案安全性检测。

使用北京诺为生物iPSC重编程试剂盒(货号611005)对5mL人外周血提取的单核细胞进行重编程得到iPSC。

对重编程获得的iPSCs进行检测与功能鉴定：

(1)如图2所示，重编程获得的iPSCs形态上与文献报道iPSCs的形态一致

(2)如图3所示，iPSC在mRNA水平上高表达多能干细胞标志物OCT4、Nanog、Sox2，并且随着分化的进行，干性指标显著下降，在iPSC分化所得瓣膜内皮细胞与瓣膜间质细胞中完全不表达，在mRNA水平证明了重编程所得的iPSC具有良好的干性，以及分化所得瓣膜内皮细胞与瓣膜间质细胞不具备干性；

(3)如图4，iPSC在蛋白水平上高表达多能干细胞标志物OCT4、Nanog，并且随着分化的进行，干性指标显著下降，在iPSC分化所得瓣膜内皮细胞与瓣膜间质细胞中完全不表达，在蛋白水平证明了重编程所得iPSC具有良好的干性，及分化所得瓣膜内皮细胞与瓣膜间质细胞不具备干性；

(4)如图5，将重编程获得的iPSC及iPSC分化的瓣膜内皮细胞及瓣膜间质细胞植入裸鼠皮下4周后发现，iPSC在裸鼠皮下形成畸胎瘤，而iPSC分化的瓣膜内皮细胞及瓣膜间质细胞不形成肿瘤，这在体内水平证明了重编程所得iPSC具有分化全能性与iPSC分化所得瓣膜内皮细胞与瓣膜间质细胞植入体内的安全性。

第二部分

将iPSC分化为瓣膜内皮细胞及瓣膜间质细胞，及对分化所得细胞进行鉴定与功能检测。

iPSC的培养与传代(以T25培养瓶为例，其他规格以此为标准进行调整)

(1)iPSC用多能干细胞专用培养基mTeSR1培养，每天换液，培养基用量为每个T25瓶4mL；

(2)iPSC用Vensene消化液进行消化，消化液用量为每个T25瓶2mL，在37℃消化时间为10-12分钟；

(3)培养iPSC的培养板或培养瓶需要提前铺好matrigel,具体操作为用4度Knockout DMEM按照1:100的比例稀释matrigel，按照3.5ml/T25的量铺在T25上，后放入细胞培养箱孵育30-60min使matrigel凝固，备用；

(4)传代用Y27632浓度为10uM；

(5)当iPSC长至85％满时即可进行传代,具体操作步骤为：吸弃培养基用3mLDPBS洗3次，洗去死细胞；加入2mL Vesene消化液放入细胞培养箱中消化10min；消化结束后加入2mLmTeSR1培养基中和消化液，并轻柔吹打使细胞与培养瓶分离；收集细胞悬液于15mL离心管，1000rpm 5min离心弃上清，用2mL含10μM的Y27632的mTeSR1培养基对iPSC进行重悬；吸弃铺好matrigel的T25培养瓶中的Knock out DMEM加入4mL含10μM的Y27632的mTeSR1培养基，按照1:15的比例将细胞悬液接种于培养瓶中，水平十字摇匀后放于细胞培养箱中进行培养；

(6)传代后第一天所用培养基为含10μM的Y27632的mTeSR1培养基，其目的是增加细胞的存活率，在第二天即更换为不含Y27632的mTeSR1培养基。

2、iPSC分化为瓣膜内皮细胞及瓣膜间质细胞。

(1)N2B27培养基的配制(1L体系)：

500ml DMEM/F12 medium

500ml Neurobasal medium,

20ml B27(1.94％)

10ml N2(0.97％)

1mlβ-Mercaptoethanol(0.097％)

用0.22uM的滤器过滤，4度可保存1个月。

(2)Stempro-34培养基配制(500mL体系)：

500ml StemPro-34medium

5ml Pen/Strep(1:100),

5ml Glutamax(1:100),

StemPro-34 Supplement

4度可保存1个月。

(3)准备iPSC：在细胞生长至80％-85％满时用Versene消化，消化完全后用mTeSR1中和消化液并轻柔吹打下细胞，1000rpm离心，弃上清，用含10μMY27632的mTeSR1重悬细胞并计数；

(4)D0接种细胞：将iPSC以4w-6w/cm2的密度接种铺好REFmatrigel的培养板，用用含10μMY27632的mTeSR1培养，每T25培养瓶4mL培养基，水平十字摇匀，放于培养箱中培养1天；

(5)D1-D4分化至侧板中胚层(LPM)阶段：将培养基更换成含有6-8μMCHIR99021和25ng/mLBMP4的N2B27培养基，每T25培养瓶15-17mL培养基，3天不换液；

(6)D5-D6分化：将培养基更换成含有200ng/ml VEGF-165与1-3μM Forskolin的Stempro-34培养基，每T25培养瓶10-12mL培养基，每天换液；

(7)CD144阳性细胞磁珠分选：在分化满6天后用CD144阳性的磁珠进行分选，分选阳性细胞即为瓣膜内皮细胞，分选阴性细胞即为瓣膜间质细胞。3、对iPSC分化所得瓣膜内皮细胞及瓣膜间质细胞进行鉴定及功能检测。

(1)如图6，iPSC分化所得瓣膜内皮细胞及瓣膜间质细胞与分离培养的人天然瓣膜内皮细胞与瓣膜间质细胞形态相似。

(2)如图7，流式细胞术证明iPSC经过6天的分化可获得68％CD31CD144双阳性瓣膜内皮细胞，经过磁珠分选后可获得99.4％CD31CD144双阳性瓣膜内皮细胞。

(3)如图8，流式细胞术证明iPSC经过6天的分化及CD144磁珠分选后可获得83.3％Vimentin阳性瓣膜间质细胞。

(4)如图9，使用单细胞测序技术(scRNA-seq)对iPSC分化的瓣膜内皮细胞与人循环系统的所有内皮细胞(包括人淋巴管内皮细胞、人脐静脉内皮细胞、人肺动脉内皮细胞、人主动脉瓣内皮细胞、人肺动脉瓣内皮细胞、人心内膜内皮细胞、胎儿心内膜内皮细胞)进行相似性比较，发现其与瓣膜内皮细胞的相似性最高达0.873，而更不像血管内皮细胞或者淋巴管内皮细胞，这支持分化所得的内皮细胞为瓣膜内皮细胞而不是血管内皮细胞或者淋巴管内皮细胞。在图9中，HDLEC为人淋巴管内皮细胞，HUVEC为人脐静脉内皮细胞，HPAEC为人肺动脉内皮细胞，A-VEC为人主动脉瓣内皮细胞，P-VEC为人肺动脉瓣内皮细胞、Edo-EC为人心内膜内皮细胞、Fetal Edo-EC为胎儿心内膜内皮细胞。

(5)如图10，使用单细胞测序技术(scRNA-seq)对iPSC分化的瓣膜间质细胞与人体分离的天然瓣膜间质细胞进行相似性比较，发现其与分离培养的人天然瓣膜瓣膜间质细胞的相似性高达0.896，这结果支持iPSCs分化的间质细胞为瓣膜间质细胞；在图10中：A-VEC-sub-VIC为人主动脉瓣间质细胞，P-VEC-sub-VIC为人肺动脉瓣间质细胞，iPSC-EC-subVIC为iPSC分化获得的瓣膜间质细胞。

(6)如图11，使用免疫荧光法在蛋白层面证明iPSC分化的瓣膜内皮细胞与人体分离培养的瓣膜内皮细胞表达相同的瓣膜内皮细胞特异性标志物CD31、CD144和NFATC1，这支持本方案分化所得内皮细胞为瓣膜内皮细胞；在图11中：iPSC-VEC为iPSC分化所得瓣膜内皮细胞，hVEC为人体分离培养的瓣膜内皮细胞。

(7)如图12，使用免疫荧光法在蛋白层面证明iPSC分化的瓣膜间质细胞与人体分离培养的瓣膜间质细胞表达相同的瓣膜间质细胞特异性标志物Vimentin和a-SMA，这支持本方案分化所得间质细胞为瓣膜间质细胞。

(8)如图13，成管实验和摄取LDL实验表明iPSC分化的瓣膜内皮细胞与人体分离培养的瓣膜内皮细胞具有一样的成管能力和摄取LDL能力，这支持本方案分化所得内皮细胞为瓣膜内皮细胞。

(9)如图14，免疫荧光法证明了iPSC分化所得瓣膜间质细胞与人体分离培养的瓣膜间质细胞具有一样的生成Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的能力，这支持本方案分化所得间质细胞为瓣膜间质细胞。

(10)如图15，iPSC分化所得瓣膜间质细胞与人体分离培养的瓣膜间质细胞在钙化培育基诱导4周后均发生钙化，茜素红染色红色为钙化灶。这支持本方案分化所得间质细胞为瓣膜间质细胞，并表明iPSC分化的瓣膜间质细胞具有用于心脏瓣膜钙化研究的前景。

(11)如图16，iPSC分化所得瓣膜内皮细胞接种与在去细胞瓣膜支架上3周后形成完整的内皮细胞层，这支持iPSC分化所得瓣膜内皮细胞可用于构建组织工程瓣膜，具有临床应用前景。

本发明方案同样可用于胚胎干细胞的分化，分化细胞可用于心脏瓣膜疾病发病机制的研究。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (6)

1.一种将多能干细胞分化为瓣膜内皮细胞与瓣膜间质细胞的分化方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1:准备用于分化的培养瓶或培养皿；

S2:准备iPSCs：iPSCs用mTeSR1培养基培养，培养皿底部铺matrigel，在细胞生长至80％-85％满时用Versene消化，消化完全后用mTeSR1中和消化液，离心，弃上清，用含10μMY27632的mTeSR1重悬细胞并计数；

S3:D0接种细胞：将iPSCs接种在S1中准备好的培养瓶或培养皿内，用含10μMY27632的mTeSR1培养，水平十字摇匀，放于培养箱中培养；

S4:D1-D4分化：将培养基更换成含有6-8μM CHIR99021和25ng/mL BMP4的N2B27培养基，3天不换液；

S5:D5-D6分化：将培养基更换成含有200ng/ml VEGF-165与1-3μMForskolin的Stempro-34培养基，每天换液；

S6:CD144阳性细胞磁珠分选：在分化满6天后用CD144阳性的磁珠进行分选，分选阳性细胞即为瓣膜内皮细胞分选阴性细胞即为瓣膜间质细胞；

S7:瓣膜内皮细胞及瓣膜间质细胞的培养与传代：磁珠分选后的瓣膜内皮细胞与瓣膜间质细胞分别接种在铺了纤连蛋白的培养瓶里，用EGM-2培养基进行培养，隔天换液。

2.根据权利要求1所述的一种将多能干细胞分化为瓣膜内皮细胞与瓣膜间质细胞的分化方法，其特征在于：所述S2具体为：将iPSCs用mTeSR1培养基培养，培养皿底部按照1:100的比例铺matrigel，在细胞生长至80％-85％满时用Versene消化，消化完全后用mTeSR1中和消化液并轻柔吹打下细胞，1000rpm离心，弃上清，用含10μMY27632的mTeSR1重悬细胞并计数。

3.根据权利要求1所述的一种将多能干细胞分化为瓣膜内皮细胞与瓣膜间质细胞的分化方法，其特征在于：所述S3具体为：将iPSCs以4w-6w/cm2的密度接种在S1中准备好的培养瓶或培养皿，用含10μMY27632的mTeSR1培养，每T25培养瓶4mL培养基，水平十字摇匀，放于培养箱中培养1天。

4.根据权利要求1所述的一种将多能干细胞分化为瓣膜内皮细胞与瓣膜间质细胞的分化方法，其特征在于：所述S4具体为：将培养基更换成含有6-8μM CHIR99021和25ng/mLBMP4的N2B27培养基，每T25培养瓶15-17mL培养基，3天不换液。

5.根据权利要求1所述的一种将多能干细胞分化为瓣膜内皮细胞与瓣膜间质细胞的分化方法，其特征在于：所述S5具体为：将培养基更换成含有200ng/ml VEGF-165与1-3μMForskolin的Stempro-34培养基，每T25培养瓶10-12mL培养基，每天换液。

6.根据权利要求1所述的一种将多能干细胞分化为瓣膜内皮细胞与瓣膜间质细胞的分化方法，其特征在于：所述S7具体为：磁珠分选后的瓣膜内皮细胞与瓣膜间质细胞分别以100w/cm2和75w/cm2的密度接种在铺了纤连蛋白的培养瓶里，用EGM-2培养基进行培养，隔天换液。

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