CN111417716A - 由多潜能干细胞进行的立体器官的构建 - Google Patents

由多潜能干细胞进行的立体器官的构建 Download PDF

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Abstract

本发明解决在将功能细胞与源自脐带的血管内皮细胞及源白骨髓的间充质细胞共培养而由此构建立体结构(器官原基)的以往方法中，存在的[1]依赖于供体而质量存在较大的偏差，[2]细胞来源的增殖潜能有限，[3]由于来源不同而难以保证免疫相容性等问题。由血管细胞、间充质细胞、及组织或器官细胞制作的器官芽，其中所述血管细胞、间充质细胞、及组织或器官细胞分别为由多潜能干细胞诱导的细胞。器官芽的制作方法，包括将血管细胞、间充质细胞、及组织或器官细胞在体外培养，其中所述血管细胞、间充质细胞、及组织或器官细胞分别为由多潜能干细胞诱导的细胞。

Description

由多潜能干细胞进行的立体器官的构建
技术领域
本发明涉及由多潜能干细胞进行的立体器官的构建。
背景技术
已有报告本发明人至今开发了通过将在再生医疗等中使用的功能细胞(源自多潜能干细胞的器官细胞等)与源自脐带的血管内皮细胞，源自骨髓的间充质细胞混合，由此构建立体组织(器官原基)的方法，该器官原基在体外下的功能及对于疾病模型动物的治疗效果等方面优于利用平面培养诱导分化成的细胞(非专利文献1：Nature 2013，非专利文献2：Cell Stem Cell 2015，专利文献1、2)。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Takebe T等.，Nature 499，pp481-484，2013
非专利文献2：Takebe T等.，Cell Stem Cell 16，pp556-565，2015专利文献
专利文献1：WO2013/047639
专利文献2：WO2015/012158
发明概述
发明要解决的问题
在使用2种源自脐带、骨髓细胞的以往方法中，[1]依赖于供体而质量会存在较大的偏差，[2]细胞来源的增殖潜能有限，[3]由于来源不同而难以保证免疫相容性等问题在实用上是绝对性的课题。另外，由于源自脐带、骨髓的细胞是成熟度高的细胞，因此对在器官原基的制作时所需要的未成熟细胞而言分化阶段大不相同，与生物体内的产生有较大距离。
用于解决问题的方法
本发明人通过将用于制作立体的器官原基而使用的3种细胞种类全部由人工多潜能干细胞(iPS细胞)制作，由此成功实现由分化阶段的同步的未成熟细胞制作器官原基。具体而言，对于根据源自iPS细胞的肝内胚层细胞和源自iPS细胞的血管内皮细胞和源自iPS细胞的间充质细胞的组合制作人肝芽，将作为以往方法的利用源自iPS细胞的肝内胚层细胞和源自脐带的血管内皮细胞，源自骨髓的间充质细胞的组合制作的人肝芽，进行了体外的白蛋白分泌能、分化标记的基因表达等的比较。其结果与以往方法相比，确认了大幅的功能改善。另外，将相当于6x106个的源自iPS细胞的肝内胚层细胞的肝芽移植到免疫缺陷动物(NOD/scid小鼠)中，结果发现，分泌到血清中的人白蛋白分泌量也得到了同样的结果。根据本发明，在追求大幅功能改善的同时，能够实现削减在品质评价及制造中涉及的成本及劳力。当取代iPS细胞而使用其它多潜能干细胞(例如：胚胎干细胞(ES细胞))的情况下，也可得到同样的效果的机率较高。
本发明的要旨如下。
(1)器官芽，其由血管细胞、间充质细胞、及组织或器官细胞制作，上述血管细胞、间充质细胞、及组织或器官细胞分别为由多潜能干细胞诱导的细胞。
(2)根据(1)所述的器官芽，其中，器官芽为能够通过成熟而分化为器官的结构体。
(3)根据(1)或(2)所述的器官芽，其中，多潜能干细胞源自人。
(4)根据(1)～(3)中任一项所述的器官芽，其中，多潜能干细胞为选自由人工多潜能干细胞及胚胎干细胞组成的组中的至少1种的细胞。
(5)根据(1)～(4)中任一项所述的器官芽，其中，器官细胞为肝细胞，器官芽为肝芽。
(6)根据(5)所述的器官芽，其中，肝细胞为TBX3阳性及ADRA1B阳性。
(7)根据(1)～(6)中任一项所述的器官芽，其中，间充质细胞为CD166阳性及CD31阴性。
(8)根据(1)～(7)中任一项所述的器官芽，其中，间充质细胞为LHX2阳性及WT1阳性。
(9)根据(8)所述的器官芽，其中，间充质细胞的FOXF1，HLX1、COL4A及ALCAM的转录处于活化，间充质细胞为LHX2阳性、WT1阳性及MIIA阳性。
(10)根据(1)～(9)中任一项所述的器官芽，其中，血管细胞为CD31阳性及CD144阳性。
(11)根据(10)所述的器官芽，其中，血管细胞的选自由PECAM1、CDH5、KDR及CD34组成的组中的至少1个基因的表达高于诱导分化前的多潜能干细胞。
(12)根据(1)～(11)中任一项所述的器官芽，其中，将经过下述步骤得到的细胞在FGF及属于TGFβ超家族因子的存在下培养、诱导分化的TBX3阳性及ADRA1B阳性的细胞用作组织或器官细胞，所述步骤为将多潜能干细胞在ROCK抑制剂的存在下培养之后，在属于转化生长因子β家族的因子，属于Wnt家族的因子及I类组蛋白脱乙酰化酶(HDAC)抑制剂的存在下培养，并进一步在属于转化生长因子β家族的因子及属于Wnt家族的因子的存在下培养。
(13)根据(1)～(11)中任一项所述的器官芽，其中，将经过下述步骤得到的细胞在FGF及属于TGFβ超家族因子的存在下培养、诱导分化的TBX3阳性及ADRA1B阳性的细胞用作组织或器官细胞，所述步骤为将多潜能干细胞在ROCK抑制剂的存在下培养之后，在β连环蛋白活化剂，PI3K抑制剂及属于转化生长因子β家族的因子的存在下培养，并进一步在属于转化生长因子β家族的因子及BMP抑制剂的存在下培养。
(14)根据(1)～(11)中任一项所述的器官芽，其中，将经过下述步骤得到的细胞在FGF及属于TGFβ超家族因子的存在下培养、诱导分化的TBX3阳性及ADRA1B阳性的细胞用作组织或器官细胞，所述步骤为将多潜能干细胞在ROCK抑制剂的存在下培养之后，在属于转化生长因子β家族的因子的存在下培养。
(15)根据(1)～(12)中任一项所述的器官芽，其中，将经过下述步骤得到的细胞在FGF及属于TGFβ超家族因子的存在下培养、诱导分化的TBX3阳性及ADRA1B阳性的细胞用作组织或器官细胞，所述步骤为将多潜能干细胞在ROCK抑制剂的存在下培养之后，在属于转化生长因子β家族的因子及β连环蛋白活化剂的存在下培养，并进一步在属于转化生长因子β家族的因子的存在下培养。
(16)根据(1)～(15)中任一项所述的器官芽，其中，将经过下述步骤得到的LHX2阳性及WT1阳性的细胞用作间充质细胞，所述步骤为将多潜能干细胞在β连环蛋白活化剂及属于TGFβ超家族的因子的存在下培养之后，在PDGF受体活化剂及属于转化生长因子β家族的因子的存在下培养，并进一步在FGF的存在下培养。
(17)根据(1)～(15)中任一项所述的器官芽，其中，将经过下述步骤得到的CD166阳性及CD31阴性的细胞用作间充质细胞，所述步骤为将多潜能干细胞在β连环蛋白活化剂及属于TGFβ超家族的因子的存在下培养之后，在PDGF受体活化剂及属于转化生长因子β家族的因子的存在下培养，并进一步在FGF的存在下培养，之后，利用间充质细胞培养基进行维持培养。
(18)根据(1)～(17)中任一项所述的器官芽，其中，将经过下述步骤得到的CD31阳性及CD144阳性的细胞用作血管细胞，所述步骤为将多潜能干细胞在ROCK抑制剂的存在下培养之后，在β连环蛋白活化剂及属于TGFβ超家族的因子的存在下培养，并进一步在血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)活化剂及腺苷酸环化酶活化剂的存在下培养。
(19)根据(1)～(17)中任一项所述的器官芽，其中，将经过下述步骤得到的CD31阳性及CD144阳性的细胞用作血管细胞，所述步骤为将多潜能干细胞在ROCK抑制剂的存在下培养之后，在血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)活化剂，属于转化生长因子β家族的因子，β连环蛋白活化剂及属于TGFβ超家族的因子的存在下培养，并进一步在血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)活化剂及TGF-β的I型受体的抑制剂的存在下培养。
(20)根据(1)～(17)中任一项所述的器官芽，其中，将经过下述步骤得到的CD31阳性及CD144阳性的细胞用作血管细胞，所述步骤为将多潜能干细胞在ROCK抑制剂的存在下培养之后，在属于转化生长因子β家族的因子的存在下培养，并进一步在FGF及属于TGFβ超家族因子的存在下培养，之后，在血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)活化剂的存在下培养。
(21)根据(1)～(17)中任一项所述的器官芽，其中，将经过下述步骤得到的CD31阳性及CD144阳性的细胞用作血管细胞，所述步骤为将多潜能干细胞在ROCK抑制剂的存在下培养之后，在属于TGFβ超家族的因子的存在下培养，并进一步在属于TGFβ超家族的因子，血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)活化剂及FGF的存在下培养。
(22)器官芽的制作方法，包括将血管细胞、间充质细胞、及组织或器官细胞在体外培养，所述方法中，上述血管细胞、间充质细胞、及组织或器官细胞分别为由多潜能干细胞诱导的细胞。
(23)根据(22)所述的方法，其中不使用构架材料而培养细胞。
(24)组织或器官的制作方法，包括将(1)～(21)中任一项所述的器官芽移植至非人动物中，使其分化为组织或器官。
(25)器官芽的移植方法，包括将(1)～(21)中任一项所述的器官芽移植至人或非人动物中。
(26)组织或器官的再生或功能恢复方法，包括将(1)～(21)中任一项所述的器官芽移植至人或非人动物中，使其分化为组织或器官。
(27)非人嵌合动物的制作方法，包括将(1)～(21)中任一项所述的器官芽移植至非人动物中，使其分化为组织或器官。
(28)评价药品的方法，包括使用选自由根据(1)～(21)中任一项所述的器官芽，通过(24)所述的方法制作的组织及器官，以及(27)所述的通过方法制作的非人嵌合动物组成的组中的至少一个。
(29)制作TBX3阳性及ADRA1B阳性的细胞的方法，包括将经过下述步骤得到的细胞在FGF及属于TGFβ超家族因子的存在下培养，诱导分化为TBX3阳性及ADRA1B阳性的细胞，所述步骤为将多潜能干细胞在ROCK抑制剂的存在下培养之后，在属于转化生长因子β家族的因子，属于Wnt家族的因子及I类组蛋白脱乙酰化酶(HDAC)抑制剂的存在下培养，并进一步在属于转化生长因子β家族的因子及属于Wnt家族的因子的存在下培养。
(30)制作TBX3阳性及ADRA1B阳性的细胞的方法，包括将经过下述步骤得到的细胞在FGF及属于TGFβ超家族因子的存在下培养，诱导分化为TBX3阳性及ADRA1B阳性的细胞，所述步骤为将多潜能干细胞在ROCK抑制剂的存在下培养之后，在β连环蛋白活化剂，PI3K抑制剂及属于转化生长因子β家族的因子的存在下培养，并进一步在属于转化生长因子β家族的因子及BMP抑制剂的存在下培养。
(31)制作TBX3阳性及ADRA1B阳性的细胞的方法，包括将经过下述步骤得到的细胞在FGF及属于TGFβ超家族因子的存在下培养，诱导分化为TBX3阳性及ADRA1B阳性的细胞，所述步骤为将多潜能干细胞在ROCK抑制剂的存在下培养之后，在属于转化生长因子β家族的因子的存在下培养。
(32)制作TBX3阳性及ADRA1B阳性的细胞的方法，包括将经过下述步骤得到的细胞在FGF及属于TGFβ超家族因子的存在下培养，诱导分化为TBX3阳性及ADRA1B阳性的细胞，所述步骤为将多潜能干细胞在ROCK抑制剂的存在下培养之后，在属于转化生长因子β家族的因子及β连环蛋白活化剂的存在下培养，并进一步在属于转化生长因子β家族的因子的存在下培养。
(33)制作LHX2阳性及WT1阳性的细胞的方法，包括将多潜能干细胞在β连环蛋白活化剂及属于TGFβ超家族的因子的存在下培养之后，在PDGF受体活化剂及属于转化生长因子β家族的因子的存在下培养，并进一步在FGF的存在下培养。
(34)制作CD166阳性及CD31阴性的细胞的方法，包括将多潜能干细胞在β连环蛋白活化剂及属于TGFβ超家族的因子的存在下培养之后，在PDGF受体活化剂及属于转化生长因子β家族的因子的存在下培养，并进一步在FGF的存在下培养，之后，利用间充质细胞培养基进行维持培养。
(35)制作CD31阳性及CD144阳性的细胞的方法，包括将多潜能干细胞在ROCK抑制剂的存在下培养之后，在β连环蛋白活化剂及属于TGFβ超家族的因子的存在下培养，并进一步在血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)活化剂及腺苷酸环化酶活化剂的存在下培养。
(36)制作CD31阳性及CD144阳性的细胞的方法，包括将多潜能干细胞在ROCK抑制剂的存在下培养之后，在血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)活化剂，属于转化生长因子β家族的因子，β连环蛋白活化剂及属于TGFβ超家族的因子的存在下培养，并进一步在血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)活化剂及TGF-β的I型受体的抑制剂的存在下培养。
(37)制作CD31阳性及CD144阳性的细胞的方法，包括将多潜能干细胞在ROCK抑制剂的存在下培养之后，在属于转化生长因子β家族的因子的存在下培养，并进一步在FGF及属于TGFβ超家族因子的存在下培养，之后，在血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)活化剂的存在下培养。
(38)制作CD31阳性及CD144阳性的细胞的方法，包括将多潜能干细胞在ROCK抑制剂的存在下培养之后，在属于TGFβ超家族的因子的存在下培养，并进一步在属于TGFβ超家族的因子，血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)活化剂及FGF的存在下培养。
发明效果
本发明与使用2种源自脐带、骨髓细胞的以往方法相比，存在[1]由于不依赖于供体而因此使得质量变得稳定，[2]使用了3种全部为源自iPS细胞细胞的器官原基在功能性上飞跃性地优异，[3]容易保证免疫相容等优越性。
本说明书中包含在作为本申请的优先权的基础的日本专利申请，日本特愿2017-230647的说明书和/或附图中记载的内容。
附图简述
[图1](图1)基于omni孔阵列板的开发的可扩展的(scalable)肝芽的生产及分化。(A)大量生产用的omni孔阵列板的示意性设计(中)。右侧的荧光图像分析确认完全来源于人iPSC的微小肝芽(LB)的大规模(＞20,000)生产。(B)1(omni)孔阵列板的外观(左)，及基于3D表面轮廓测定仪的板的平坦度(右)。(C)由3种祖细胞的共培养生成的iPSC-LB的SEM图像。(D)生成的iPSC-LB的共聚焦图像在内部示出了内皮发芽(白色箭头)。绿色示出iPSC-HE，红色示出HUVEC。(E)由不同的内胚层阶段(0天～20天的范围)生成的肝芽在肉眼下的形态。X轴是指3D培养时间(累积)，Y轴示出来自2D培养的来源细胞的阶段。右侧的2列示出了第22天的收集后的低倍率及高倍率的图像。(F)在各种源自内胚层的肝芽中的大小均一性的小提琴图分析。数据是通过将针对3D培养的第一天起的累积第22天的超过600份肝芽的形态定量化而收集的。
[图2](图2)形成多个祖细胞的源自人iPSC的肝芽的反向最优化。(A)依赖于经历时间的AFP生产及第20天的2小时/每2×105细胞的ALB生产的采用ELISA的定量。数据表示为平均±s.d.。n＝4，*：P＜0.05(B)在从多个阶段的内胚层细胞生成的肝芽的PCA分析中，明确了肝命运的重要参与。X轴根据利用体外实验的成熟顺序而示出。(C)多潜能性、定型内胚层及肝内胚层细胞标记的采用qRT-PCR分析而发生各分化阶段特异性地报告的标记的表征。各种阶段的细胞的显微镜形态在右侧的图板中示出。下侧的图板示出第8天及第10天的阶段中的HNF4A的免疫染色。(D)火山图基因表达数据。以红色的圆示出p值＜0.05，且在第6天和第8天的阶段之间以log2倍的变化水平计存在不同表达的基因。对于细胞表面蛋白质或核蛋白质，在红色圆中与各基因名一起以粗体示出。(E)第8天的移行性内胚层细胞利用qRT-PCR利用TBX3及ADRA1B基因这两者被标记，蛋白质利用免疫染色而被标记(图3A(参考图3A))。数据表示为平均±s.d.。n＝3，*：P＜0.05(F)为早期中胚层基因的T(BRACHURY)，为STM基因的HLX1，GATA4，FOXF1，COL4A1，及ALCAM的采用qRT-PCR的筛选。Meso：第3天的源自iPSC的侧板中胚层，STM：同时暴露于FGF2及PDGFB之后的第10天的细胞，MSC：STM传代后用MSC培养基维持的第20天的细胞。误差棒表示来自3次独立实验(n＝4)的值的s.d.。(G)根据iPSC-STM中的成人人肝间充质细胞特性的层次聚类分析(Asahina等.，2009，Asahina等.，2011，El Taghdouini等.，2015)。(H)采用相位差显微镜的来自iPSC-STM的自我凝集的延时图像分析。集合细胞运动的速度以3次独立实验的平均进行示出。将使用了BMSC及iPSC-MSC的2天的培养组织作为对照示出。(I，J)iPSC-EC的显微镜的表征，及利用CD31及CD144的FACS的经时定量(I)，之后的基质胶的内皮发芽测定(J)。(K)由iPSC-STM及AAVS1：：mCherryiPSC-EC的同时移植带来的在体内的人血管网络的生成。葡聚糖以绿色表示，小鼠特异性的CD31以蓝色表示。比例尺为500μm。
[图3](图3)来自源自iPSC的多个祖细胞的完全的肝芽的自组装。(A)关于不包含饲养细胞的来自人iPSC的全部的iPSC-肝芽的生成的方案的概略。采用免疫染色而常规地进行了工艺验证。免疫染色在tHE上针对TBX3(红色)及ADRA1B(红色)，在STM中为WT1(红色)，LHX2(红色)及肌球蛋白IIA(绿色)，EC上为CD144(红色)及CD31(绿色)进行。(B)对于培养72小时之后的伴随内皮发芽的向肝芽的自组装，利用在明场(上)及光片(lighsheet)(下)的4D延时成像分别得到了确认。绿色表示iPSC-tHE，红色表示iPSC-EC。iPSC-STM未被标记。比例尺为500μm。(C)通过对全部的iPSC芽的共聚焦摄像而确认了内皮网络的存在。(D)产生的全部的iPSC芽的肉眼下的侧面图。在图板中显示为上面图。比例尺为1,000μm。(E)显示了在第2天的人血管的灌注的移植的全部iPSC-LB的肉眼观察。以虚线围住的区域显示移植的全部iPSC-LB。(F)移植的全部iPSC-LB的生物体内成像，证实了来自iPSC-EC的人血管的形成。红色表示AAVS1：：mCherry iPSC-ECs。比例尺为500μm。(G)第28天的全部的iPSC-LB移植内的源自人iPSC的血管和发生排列的iPSC-肝细胞的存在。绿色表示iPSC-tHE，红色表示iPSC-EC。(H)在共注入葡聚糖及荧光小鼠CD31抗体的研究中，明确了iPSC-EC及宿主小鼠血管之间的连接(白色虚线或箭头)。绿色表示葡聚糖，红色表示iPSC-EC，蓝色表示小鼠CD31。(I)iPSC-STM与iPSC-EC的密切关联。绿色表示iPSC-STM，红色表示iPSC-EC。
[图4](图4)大量生产的小型化人肝芽的功能验证。(A)通过评估体外及体内功能，对各108细胞规模的生产周期中的策略性批量验证方案。中央图板示出收集的LB形态的均一性。绿色表示iPSC-tHE。(B)分化的全部的iPSC-LB中的白蛋白产生。作为对照示出了在2D中的人成人肝细胞(AdHep 2D)，AdHep共培养(AdHep LB)及对照LB(由iPSC-tHE，HUVEC及BMSC制作)。数据表示为平均±s.d.。n＝6。(C)多个源自肝细胞的蛋白质的产生，及(D)培养第21天的在体外进行培养的iPSC-LB的氨代谢。数据表示为平均±s.d.。在(C)中，n＝6，在(D)中，n＝3。(E)将来自iPSC(全iPSC-LB)的肝芽的肝成熟状态采用tSNE进行视觉表述。与以往的途径及人初代样品进行了比较。(F)人成人肝细胞(F)与利用Aster Plot所示的分化的全部的iPSC-LB(G)之间的APRES分布。(G)使用了alb-Tk-NOG小鼠的亚急性肝功能衰竭模型之后的移植组及假组的Kaplan-Meier生存曲线。关于LB，为n＝114，关于假移植组，为n＝39。**：P＝0.0013。X轴示出移植后的天数。(H)全iPSC-LB移植(n＝48)或人成人肝细胞移植(n＝12)中时间依赖性的人血清白蛋白产生。数据表示为平均±s.e.m.。(I)iPSC LB移植小鼠中的人特异性的双氯芬酸代谢产物的检测。通过液相层析法-串联质谱(LC-MS/MS)定量3′-羟基-4′-甲氧基双氯芬酸(VI)。3′-羟基-4′-甲氧基双氯芬酸(VI)为已知在血浆中累积的人特异性的代谢物。
[图5](图S1)大量生产的LB的包被的最优化和回收。(A)在细胞接种前利用pHEMA及MPC聚合物进行包覆。绿色表示HUVEC，红色表示MSC。(B)采用移液器操作的LB的回收。示出了在LB回收前(左)及后(右)得到的显微镜图像。回收之后检测不到残留的LB，启示了从板进行的LB的回收是成功的。
[图6](图S2)用于生成LB的细胞用量及混合比依赖性测试。(A)在Elplasia平台上对各种比例的间充质细胞(MC)在LB生成方面进行了测试。示出了显微镜及电子显微镜照片。在示出的MC比率下，显示出了许多的生成的LB。(B)在HNF4A及ALB的qRT-PCR分析中明确了在为全部细胞的1/20时对肝芽的生成而言最有效率。数据表示为平均±s.d.。n＝3(C，D)在到每1斑点中4000个细胞以前的LB的直径中，依赖于总细胞的增加。6000个细胞未形成组织。绿色表示HUVEC，红色表示MSC。将LB大小的定量化示于D。在各自的指示的细胞用量下的LB的基因表达(E)及蛋白质产生能力(F)。数据表示为平均±s.d.。n＝3。
[图7](图S3)大规模生产用omni孔板的建立。(A)Elplasia 24孔，6孔，1(omni)孔板。全部的板满足SBS封装(footprint)尺寸大小。通过将死空间最小化，将每块板的微孔的数量增加到14,400(600×24孔)，18,000(3,000×6孔)，20,000(1孔)。(B)来自24孔，6孔及omni(1)孔板的LB中的肝标记基因HNF4A、RBP4、AFP、ALB、TTR、TAT、TDO2及GLUT2的qRT-PCR分析。数据表示为平均±s.d.。n＝3。
[图8](图S4)源自iPSC的内胚层细胞诱导方案的最优化。(A)用于生成定型内胚层细胞的3个代表性方案。(B，C)在DE阶段下的多潜能性标记及在HE阶段下的肝内胚层标记在按各自被指明的方案后接着进行qRT-PCR分析。数据表示为平均±s.d.。n＝12(D)来自不同方案的成熟肝细胞样细胞的显微镜形态。(E)iPSC-MH阶段中的肝细胞标记的qRT-PCR分析。数据表示为平均±s.d.。n＝6(F)来自源自多个供体的iPSC克隆的iPSC-MH的具有再现性的生成。数据以ng/ml/24小时/2×105细胞进行示出。n＝10。(G)在第4天～第10天的移行中的DE分泌标记cerberus1的ELISA定量。
[图9](图S5)源自iPSC的肝芽形成方案的最优化。(A)来自iPSCs(第0天)，DE(第6天或第7天)，HE(第10天)及MH(第14天)细胞的肝芽。基因表达分析虽然仅为第6天及第10天的内胚层细胞，但明确了在扩大培养后显示最高的肝功能。(B)2-D细胞及3-D组织的层次聚类分析。2-D细胞为iPSC、DE、HE、IH及MH。3-D组织为人iPSC-肝芽，使用了由Si-Tayeb等(Si-Tayeb等.，2010)开发的签名的人胎儿及成人的肝组织。FLT为10gwk或22-40gwk池的胎儿肝组织，ILT为0yr婴儿肝组织，ALT为5yrs，30yrs，44yrs或55yrs年龄的肝组织，AHEP为人初代肝细胞，AHEP-3D为3D培养的人初代肝细胞。(C)对于第6天和第8天的芽之间的血管生成的特征基因，采用GSEA分析及热图的视觉化。
[图10](图S6)作为iPSC-tHE的标记的TBX3及ADRA1B的鉴定。(A，B)TBX3(a)及ADRA1B(b)的时间依赖性表达。数据表示为平均±s.d.。n＝3
[图11](图S7)由无饲养细胞的人iPSC向原始的内皮祖细胞的高效率分化。(A)用于EC分化的4个独立的阶段特异性的方案。(B)经受了各自的分化的iPSC-EC的采用显微镜的表征，及其后接下来的利用CD31及CD144的基于FACS的初期筛选。(C)基于EC标记的qRT-PCR的分析。(D)传代4次后的iPSC-EC的增殖曲线。
[图12](图S8)人iPSC肝芽的体内功能化。(A)第40天的全部的iPSC-LB移植组中的ALB量的箱形图比较(5～95百分比)。各图表示从10只不同小鼠的全部中采集的活值。(B)在iPSC-EC及STM的存在下或非存在下的时间依赖性人血清白蛋白的产生。数据表示为平均±s.e.m.。n＝6。*：P＝0.0356。关于移植的细胞数，在图板A及B中为相当于3×106细胞的LB。
[图13]在从iPSC诱导分化为DE中，Wnt3a能够以CHIR99021代替。图13A：作为Wnt3a的代替而使用CHIR99021的方案的模式图。进行了条件研究的结果，选择在DE诱导分化6天内将CHIR99021以2μM添加3天的条件。图13B：使用Wnt3a的以往方法和将CHIR99021以2μM添加3天的条件下的各分化阶段的细胞形态。与使用了Wnt3a的情况相比，没有观察到形态上的不同。图13C：在使用Wnt3a的以往方法和将CHIR99021以2μM添加3天的条件下的DE阶段中，采用流式细胞术的作为DE标记的CXCR4阳性率分析。与使用了Wnt3a的情况相比，CXCR4阳性率相同。图13D：采用定量PCR(qPCR)的各分化标记的表达分析与使用Wnt3a的情况相同。图13E：MH阶段的分泌白蛋白量的ELISA分析。在多个iPSC克隆中发现了比使用了Wnt3a的情况相同或更高的倾向。
[图14]Wnt3a和CHIR99021的比较(体外MH、LB)。图14A及B：MH(图14A)及LB(图14B)中的细胞形态。与使用了Wnt3a的情况相比，没有观察到形态上的不同。图14C：采用定量PCR(qPCR)的MH及LB中的标记表达分析。与使用了Wnt3a的情况相同，也没有观察到肠道标记等其它细胞谱系的标记基因的表达增加。
[图15]EC诱导。源自iPSC的血管内皮细胞(iPSC-EC)的诱导分化方案修改版。
[图16]面向临床应用的诱导分化培养基研究。图16A：诱导分化方案的模式图。图16B：以往方法及修改方法的细胞形态。没有观察到形态上的不同。图16C：以往方法及修改方法的采用流式细胞术的EC标记阳性率的分析。图16D：图16C的流式细胞术分析的汇总。与以往方法相比，在修改方法中可稳定地实现更高的CD31/CD144阳性率。图16E：采用定量PCR(qPCR)的各分化标记的表达分析。即使经过传代，EC标记表达量也稳定。图16F：每次传代的细胞增殖。与以往方法相比，修改方法在传代之后的增殖潜能更高。
具体实施方式
以下详细说明本发明。
本发明提供器官芽，其由血管细胞、间充质细胞、及组织或器官细胞制作，其中，上述血管细胞、间充质细胞、及组织或器官细胞分别由多潜能干细胞诱导。
在本发明中“器官芽”是指通过成熟能够分化为器官的结构体，是指包含血管细胞、间充质细胞、及组织或器官细胞这三种细胞的结构体。对于某个结构体是否为器官芽，例如可以通过如下操作来确认：将该结构体移植到生物体中，调查是否可以分化为目的器官(如果分化为目的器官则可以判断为器官芽)，以及/或调查该结构体是否包含全部的上述三种细胞(如果包含全部三种细胞则可以判断为器官芽)。器官芽例如可以是分化为：脑，脊髓，肾上腺髓质，表皮，毛发/指甲/皮肤腺，感觉器官，外周神经，晶状体等外胚层性器官，脾脏，肾脏，输尿管，心脏，血液，生殖腺，肾上腺皮质，肌肉，骨架，真皮，结缔组织，中皮等中胚层性器官，肝脏，胰腺，消化道(咽，食道，胃，肠道)，肺，甲状腺，甲状旁腺，尿道，胸腺等内胚层性器官等器官的器官芽等，优选分化为肝脏的器官芽(肝芽)，分化为胰腺的器官芽(胰芽)，分化为肠道的器官芽等分化为内胚层性器官的器官芽。对于某个结构体是否为分化为内胚层性器官的器官芽，可以通过调查作为标记的蛋白质的表达来确认(如果表达出后述的标记蛋白质中的任一个或多个，则可以判断为器官芽)。例如，就肝芽而言，HHEX、SOX2、HNF4A、AFP、ALB等成为标记，就胰芽而言，PDX1、SOX17、SOX9等成为标记，就分化为肠道的器官芽而言，CDX2、SOX9等成为标记。在本领域技术人员间使用的术语中，肝芽(liver bud)、肝憩室(liver diverticula)、肝类器官(liver organoid)、胰(背侧或腹侧)芽(pancreatic(dorsal or ventral)buds)、胰憩室(pancreatic diverticula)、胰类器官(pancreatic organoid)、肠芽(intestinal bud)、肠憩室(intestinal diverticula)、肠类器官(intestinal organoid)(K.Matsumoto，等.Science.19；294(5542)：559-63.(2001))等包含于本发明的器官芽中。
本发明的器官芽是由血管细胞、间充质细胞、及组织或器官细胞这3种细胞全部是由多潜能干细胞诱导的情况制作的。
作为多潜能细胞，可例示从生物体得到的多潜能细胞(例如：ES细胞，从重编程进行诱导而得到的多潜能细胞(例如：iPS细胞，MUSE细胞(Multilineage-differentiatingstress-enduring(Muse)cells are a primary source of induced pluripotent stemcells in human fibroblasts(多系分化应激持久(Muse)细胞是人成纤维细胞中诱导性多潜能干细胞的主要来源).PNAS，2011)，iMPC细胞(induced multipotent progenitor cell(诱导的多源性祖细胞)；Mouse liver repopulation with hepatocytes generated fromhuman fibroblasts(由人成纤维细胞产生的肝细胞再增殖小鼠肝脏).Nature，2014))，它们的组合等。
关于多潜能干细胞，可以为源自人的，也可以源自除了人以外的动物(例如：实验动物，宠物动物，役用动物、赛马、斗犬中等所利用的动物，具体而言，为小鼠、大鼠、兔、猪、犬、猴、牛、马、羊、鸡、鲨鱼、鳐、银鲛、鲑鱼、虾、蟹等)。
本发明的器官芽可以通过由多潜能干细胞诱导的3种细胞(血管细胞、间充质细胞、及组织或器官细胞)在体外共培养而制作。本发明提供器官芽的制作方法，包括将血管细胞、间充质细胞、及组织或器官细胞在体外培养，所述方法中，上述血管细胞、间充质细胞、及组织或器官细胞分别为由多潜能干细胞诱导的细胞。
在本发明中“组织或器官细胞”是包含分化为构成组织或器官的功能细胞的细胞，或能够向功能细胞分化的未分化细胞的概念，在未分化细胞中，包括干细胞、祖细胞、内胚层细胞、器官芽细胞等。未分化细胞优选为虽然确定了向功能细胞的分化命运，但尚未分化为功能细胞的细胞。作为“未分化的组织或器官细胞”，可以为例如能够分化为肾脏、心脏、肺脏、脾脏、食道、胃、甲状腺、甲状旁腺、胸腺、生殖腺、脑、脊髓等器官的细胞等，可列举能够分化为脑、脊髓、肾上腺髓质、表皮、毛发/指甲/皮肤腺、感觉器官、末梢神经、晶状体等外胚层性器官的细胞、能够分化为脾脏、肾脏、输尿管、心脏、血液、生殖腺、肾上腺皮质、肌肉、骨架、真皮、结缔组织、中皮等中胚层性器官的细胞、能够分化为肝脏、胰腺、消化管(咽、食道、胃、肠道)、肺、甲状腺、甲状旁腺、尿道、胸腺等内胚层性器官的细胞等。对于某个细胞是否为能够分化为外胚层性器官、中胚层性器官或内胚层性器官的细胞，可以通过调查成为标记的蛋白质的表达来确认(如果表达出标记蛋白质的任一种或多种，则可以判断为能够分化为外胚层性器官、中胚层性器官或内胚层性器官的细胞)。例如：能够分化为肝脏的细胞中，HHEX、SOX2、HNF4A、AFP、ALB等成为标记，在能够分化为胰腺的细胞中，PDX1、SOX17、SOX9等成为标记，在能够分化为肠道的细胞中，CDX2、SOX9等成为标记，在能够分化为肾脏的细胞中，SIX2、SALL1，在能够分化为心脏的细胞中，NKX2-5MYH6、ACTN2、MYL7、HPPA，在能够分化为血液的细胞中，C-KIT、SCA1、TER119、HOXB4，在能够分化为脑、脊髓的细胞中，HNK1、AP2、巢蛋白(NESTIN)等成为标记。在本领域技术人员间使用的术语中，成肝细胞(hepatoblast)、肝祖细胞(hepatic progenitor cells)、成胰腺细胞(pancreatoblast)、肝前体细胞(hepatic precursor cells)、成胰腺细胞(pancreatoblast)、胰腺祖细胞(pancreatic progenitors)、胰腺祖细胞(pancreatic progenitor cells)、胰腺前体细胞(pancreatic precursor cells)、内分泌前体细胞(endocrine precursors)、肠祖细胞(intestinal progenitor cells)、肠前体细胞(intestinal precursor cells)、间介中胚层(intermediate mesoderm)、后肾间充质前体细胞(metanephric mesenchymalprecursor cells)、多潜能肾单位祖细胞(multipotent nephron progenitor)、肾祖细胞(renal progenitor cell)、心脏中胚层(cardiac mesoderm)、心血管祖细胞(cardiovascular progenitor cells)、心脏祖细胞(cardiac progenitor cells)(JR.Spence，等.Nature.；470(7332)：105-9.(2011)，Self，等.EMBO J.；25(21)：5214-5228.(2006)，J.Zhang，等.Circulation Research.；104：e30-e41(2009)，G.Lee，等.Nature Biotechnology 25，1468-1475(2007))等包括在本发明中未分化的组织或器官细胞中。未分化细胞可以由人工；多潜能干细胞(iPS细胞)，胚胎干细胞(ES细胞)等多潜能干细胞依照公知的方法制作。例如，能够分化为肝脏的细胞可以依照K.Si-Taiyeb，等.Hepatology，51(1)：297-305(2010)，T.Touboul，等.Hepatology.51(5)：1754-65.(2010)制作，能够分化为胰腺的细胞可以依照D.Zhang，等.Cell Res.；19(4)：429-38.(2009)制作，能够分化为肠道的细胞可以依照J.Cai，等.J Mol Cell Biol.；2(1)：50-60(2010)，R.Spence，等.Nature.；470(7332)：105-9.(2011)制作，能够分化为心脏的细胞可以依照J.Zhang，等.Circulation Research.；104：e30-e41(2009)制作，能够分化为脑、脊髓的细胞可以依照G.Lee，等.Nature Biotechnology 25，1468-1475(2007)制作。作为构成器官、组织的功能细胞，可例示：胰腺的内分泌细胞，胰腺的胰管上皮细胞，肝的肝细胞，肠道的上皮细胞，肾脏的肾小管上皮细胞，肾脏的肾小球上皮细胞，心脏的心肌细胞，血液的淋巴细胞、粒细胞，红细胞，脑的神经细胞、胶质细胞，脊髓的神经细胞、施万细胞等。
在本发明的器官芽的制作中，关于组织或器官细胞使用由多潜能干细胞制作(诱导分化)的那些。
多潜能干细胞，例如：对于利用iPS细胞诱导分化为肝内胚层细胞(iPSC-HE)，通过进行分化阶段的比较，通过使用第7天的TBX3 ADR1AB共阳性的细胞，肝功能有大幅的改善(后述的实施例)。
在本说明书中，对于细胞表面标记而言，“阳性”，“+”等表述指通过免疫染色等方法可确认细胞表面标记在该细胞进行表达的状态，另外，“阴性”，“-”等表述指通过免疫染色等方法不能确认表达的状态。
TBX3 ADR1AB共阳性的肝内胚层细胞(iPSC-HE)可以通过后述的实施例中记载的方法制作(图8A的方案1-3及图13A)。
根据图8A的方案1，将多潜能干细胞在ROCK抑制剂，属于转化生长因子β家族的因子，属于Wnt家族的因子及I类组蛋白脱乙酰化酶(HDAC)抑制剂(不加入也可)的存在下培养(例如1～2天)之后，在属于转化生长因子β家族的因子，属于Wnt家族的因子及I类组蛋白脱乙酰化酶(HDAC)抑制剂(不加入也可)的存在下培养(例如：1～2天)。将经过进一步在属于转化生长因子β家族的因子及属于Wnt家族的因子的存在下培养(例如：0～3天)的步骤得到的细胞(定型内胚层，Definitive Endoderm)在FGF及属于TGFβ超家族因子的存在下培养(例如：1～4天)，可以诱导分化为TBX3阳性及ADRA1B阳性的细胞。
根据图8A的方案2，将多潜能干细胞在ROCK抑制剂的存在下培养(例如1～2天)之后，在β连环蛋白活化剂，PI3K抑制剂及属于转化生长因子β家族的因子的存在下培养(例如1～2天)。将经过进一步在属于转化生长因子β家族的因子及BMP抑制剂的存在下培养(例如2～4天)的步骤得到的细胞(定型内胚层)在FGF及属于TGFβ超家族因子的存在下培养(例如1～4天)，可以诱导分化为TBX3阳性及ADRA1B阳性的细胞。
根据图8A的方案3，将经过将多潜能干细胞在ROCK抑制剂的存在下培养(例如1～2天)之后，在属于转化生长因子β家族的因子的存在下培养(例如2～5天)的步骤得到的细胞(定型内胚层)在FGF及属于TGFβ超家族因子的存在下培养(例如1～4天)，可以诱导分化为TBX3阳性及ADRA1B阳性的细胞。
根据图13A的方案，将多潜能干细胞在ROCK抑制剂的存在下，在属于转化生长因子β家族的因子及β连环蛋白活化剂及I类组蛋白脱乙酰化酶(HDAC)抑制剂(不加入也可)的存在下培养(例如1～2天)之后，在属于转化生长因子β家族的因子及β连环蛋白活化剂及I类组蛋白脱乙酰化酶(HDAC)抑制剂(不加入也可)的存在下培养(例如1～2天)。将经过进一步在属于转化生长因子β家族的因子的存在下培养(例如0～4天)的步骤得到的细胞(定型内胚层)在FGF及属于TGFβ超家族因子的存在下培养(例如1～4天)，可以诱导分化为TBX3阳性及ADRA1B阳性的细胞。
在以上所述的由多潜能干细胞到诱导分化为TBX3阳性及ADRA1B阳性的细胞的各培养步骤的前后，也可以加入追加的培养步骤。
在本发明中“血管细胞”为包括分化为构成血管的细胞的细胞，或能够分化为这样的细胞的未分化细胞的概念，在未分化细胞中，包括干细胞，祖细胞，中胚层细胞等。未分化细胞优选为虽然确定了向血管细胞的分化命运，但尚未分化为血管细胞的细胞。作为血管细胞，可例示：血管内皮细胞，血管内皮祖细胞，心脏内膜祖细胞，血管芽细胞等，优选为血管内皮细胞。对于某个细胞是否为血管内皮细胞，可以通过调查是否表达出标记蛋白质、例如：TIE2，VEGFR-1，VEGFR-2，VEGFR-3，CD41来确认(如果表达出所述标记蛋白质的任一种或多种，则可以判断为血管内皮细胞)。在本发明中所用的血管内皮细胞可以是分化了的细胞，也可以是未分化的细胞。对于血管内皮细胞是否为分化了的细胞，可以利用CD31，CD144确认。在本领域技术人员间所使用的术语当中，内皮细胞(endothelial cells)、脐静脉内皮细胞(umbilical vein endothelial cells)、内皮祖细胞(endothelial progenitorcells)、内皮前体细胞(endothelial precursor cells)、血管性祖细胞(vasculogenicprogenitors)、成血管细胞(hemangioblast)(HJ.joo，等.Blood.25；118(8)：2094-104.(2011))等包含于本发明中的血管内皮细胞中。
在本发明的器官芽的制作中，关于血管细胞使用由多潜能干细胞制作(诱导分化)的那些。
在利用多潜能干细胞，例如：iPS细胞诱导分化为血管内皮细胞(iPSC-EC)中，可以使用在Rho激酶存在下分散接种之后，通过培养基1(DMEM/F 12培养基+1-2％B27+1％Glutamax，25ng/mL BMP4，8uM CHIR99021)培养3天，培养基2(StemPro34-SFM+200ng/mLVEGF+2uM毛喉素)培养3-4天的那些。另外，也可以用培养基3(StemPro34-SFM+)50ng/mLVEGF)培养到7天。关于制作的血管内皮细胞(iPSC-EC)，可以使用通过免疫染色法，FACS在90％以上的细胞中发现作为血管内皮的标记的CD31(PECAM1)的表达的那些。在基因表达分析中，可见PECAM1，CDH5，KDR，CD34等血管内皮标记的表达较高，可见与诱导分化前的iPS细胞相比，10倍～100倍以上的表达(后述的实施例)。除了作为血管内皮细胞的标记的CD31以外，通过免疫染色法能够确认CD144，CD309的蛋白的表达(后述的实施例)。
本发明提供制作CD31阳性及CD144阳性的细胞的方法，包括将多潜能干细胞在ROCK抑制剂、β连环蛋白活化剂及属于TGFβ超家族的因子的存在下培养(例如1～2天)之后，在β连环蛋白活化剂及属于TGFβ超家族的因子的存在下培养(例如2～3天)，进一步在血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)活化剂及腺苷酸环化酶活化剂的存在下培养(例如4～8天)(图11A的Pr1)。CD31阳性及CD144阳性的细胞可以为iPSC-EC。CD31阳性及CD144阳性的细胞可以用于器官芽的制作。
本发明也提供制作CD31阳性及CD144阳性的细胞的方法，包括将多潜能干细胞在ROCK抑制剂、血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)活化剂、属于转化生长因子β家族的因子、β连环蛋白活化剂及属于TGFβ超家族的因子的存在下培养(例如1～2天)之后，在血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)活化剂，属于转化生长因子β家族的因子，β连环蛋白活化剂及属于TGFβ超家族的因子的存在下培养(例如2～4天)，进一步在血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)活化剂及TGF-β的I型受体的抑制剂的存在下培养(例如4～7天)(图11A的Pr2)。CD31阳性及CD144阳性的细胞可以为iPSC-EC。CD31阳性及CD144阳性的细胞可以用于器官芽的制作。
本发明也提供制作CD31阳性及CD144阳性的细胞的方法，包括将多潜能干细胞在ROCK抑制剂，属于转化生长因子β家族的因子的存在下培养(例如1～2天)之后，在属于转化生长因子β家族的因子的存在下培养(例如1～3天)，并进一步在FGF及属于TGFβ超家族因子的存在下培养(例如1～3天)，之后，在血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)活化剂的存在下培养(例如2～7天)(图11A的Pr3)。CD31阳性及CD144阳性的细胞可以为iPSC-EC。CD31阳性及CD144阳性的细胞可以用于器官芽的制作。
本发明也提供制作CD31阳性及CD144阳性的细胞的方法，包括将多潜能干细胞在ROCK抑制剂，属于TGFβ超家族的因子的存在下培养(例如1～2天)之后，在属于TGFβ超家族的因子的存在下培养(例如2～4天)，并进一步在属于TGFβ超家族的因子，血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)活化剂及FGF的存在下培养(例如2～7天)(图11A的Pr4)。CD31阳性及CD144阳性的细胞可以为iPSC-EC。CD31阳性及CD144阳性的细胞可以用于器官芽的制作。
在以上所述的由多潜能干细胞到诱导分化为CD31阳性及CD144阳性的细胞的各培养步骤的前后，也可以加入追加的培养步骤。
进一步，也能够通过将为CD31阳性及CD144阳性的细胞进行再接种，在扩大培养基中培养，由此提高CD31和/或CD144的阳性率(后述的实施例3)。对扩大培养基而言，可以在经过一定的时期后交换时改变种类。作为再接种时的扩大培养基优选为补充了VEGF-A的StemPro-34SFM，作为与其交换的培养基优选为Miracell(注册商标)EC(TAKARABio)，但不限于这些培养基。再接种时可以添加1天ROCK抑制剂。
在本发明的器官芽的制作中，血管细胞可以为CD31阳性，为CD144阳性。另外，血管细胞可以为选自由PECAM1、CDH5、KDR及CD34组成的组中的至少1个基因的表达高于诱导分化前的多潜能干细胞。
在本发明中“间充质细胞”是指包括分化为主要存在于中胚层来源的结缔组织中，并形成在组织中发挥功能的细胞的支持结构的结缔组织细胞的细胞，或能够分化为这样的细胞的未分化细胞的概念，在未分化细胞中包括干细胞，祖细胞，中胚层细胞等。未分化细胞优选为虽然确定了向间充质细胞的分化命运，但尚未分化为间充质细胞的细胞。对于某个细胞是否为未分化间充质细胞，可以通过调查是否表达出标记蛋白质、例如：Stro-1，CD29，CD44，CD73，CD90，CD105，CD133，CD271，巢蛋白来确认(如果表达出所述标记蛋白质的任意一种或多种，则可以判断为未分化间充质细胞)。另外，对于没有表达出前项的标记的任意一种的间充质系细胞可以判断为分化间充质系细胞。在本领域技术人员间使用的术语中，隔间充质(Septum Mesenchyme)，横隔间充质(Septum Transversum Mesenchyme)，间充质干细胞(mesenchymal stem cells)、间充质祖细胞(mesenchymal progenitor cells)、间充质细胞(mesenchymal cells)(R.Peters，等.PLoS One.30；5(12)：e15689.(2010))等包含于本发明中的间充质细胞中。
在本发明的器官芽的制作中，关于间充质细胞使用由多潜能干细胞制作(诱导分化)的那些。
在利用多潜能干细胞，例如：iPS细胞诱导分化为间充质细胞(iPSC-MC)中，可以在Rho激酶存在下分散接种之后，通过培养基1(DMEM/F12培养基+1-2％B27+1％Glutamax+8uMCHIR 99021+BMP4 25ng/m1)培养3天，通过培养基2(DMEM/F12培养基+1-2％B27+1％Glutamax+10ng/ml PDGFBB+2ng/ml激活蛋白A)培养2天。可以使用进一步通过培养基3(DMEM/F12培养基+1-2％B27+1％Glutamax+10ng/ml bFGF+12ng/ml BMP4)培养2天的那些。或者也可以使用进一步在MSCGM等间充质细胞用的培养基中维持培养的那些。制作的间充质细胞(iPSC-MC)可以为CD166阳性，不表达作为血管内皮的标记的CD31(PECAM1)的细胞。
本发明也提供制作CD166阳性及CD31阴性的细胞的方法，包括将多潜能干细胞在ROCK抑制剂、β连环蛋白活化剂及属于TGFβ超家族的因子的存在下培养(例如1～2天)之后，在β连环蛋白活化剂及属于TGFβ超家族的因子的存在下培养(例如3～5天)，在PDGF受体活化剂及属于转化生长因子β家族的因子的存在下培养(例如1～4天)，并进一步在FGF及属于转化生长因子β家族的因子的存在下培养(例如2～6天)，之后，利用间充质细胞培养基进行维持培养(例如3～20天)。在由多潜能干细胞到诱导分化为CD166阳性及CD31阴性的细胞的各培养步骤的前后，也可以加入追加的培养步骤。CD166阳性及CD31阴性的细胞可以为间充质细胞(iPSC-MC)。CD166阳性及CD31阴性的细胞可以用于器官芽的制作。
作为间充质细胞培养基，可例示MSCGM等，但不限于这些。
在本发明的器官芽的制作中，间充质细胞可以为横隔间充质(septumtransversum mesenchyme，STM)细胞。STM细胞可以为LHX2阳性，WT1阳性。STM细胞中，FOXF1，HLX1、COL4A及ALCAM的转录处于活化，可以为LHX2阳性、WT1阳性及MIIA阳性。
本发明也提供制作LHX2阳性及WT1阳性的细胞的方法，包括将多潜能干细胞在ROCK抑制剂、β连环蛋白活化剂及属于TGFβ超家族的因子的存在下培养(例如1～2天)之后，在β连环蛋白活化剂及属于TGFβ超家族的因子的存在下培养(例如3～5天)，在PDGF受体活化剂及属于转化生长因子β家族的因子的存在下培养(例如1～4天)，并进一步在FGF及属于转化生长因子β家族的因子的存在下培养(例如2～6天)。在由多潜能干细胞到诱导分化为LHX2阳性及WT1阳性的细胞的各培养步骤的前后，也可以加入追加的培养步骤。为LHX2阳性及WT1阳性的细胞可以为横隔间充质(STM)细胞。为LHX2阳性及WT1阳性的细胞可以用于器官芽的制作。
针对在上述的由多潜能干细胞诱导分化为各种细胞(器官细胞，血管细胞，间充质细胞)的方法中可使用的因素进行说明。
作为ROCK抑制剂，可例示：Y-27632，GSK429286A，SR3677，Ripasudil(K-115)，法舒地尔(Fasudil)，Thiazovivin等，其中，优选Y-27632。
作为属于转化生长因子β家族的因子，激活蛋白A，Nodal等可例示，其中，优选激活蛋白A。
作为属于Wnt家族的因子，可例示：Wnt3a，Wnt3a-AFM，CHIR99021，R-Spondin-1，BIO(6-溴靛红素-3′-肟)等，其中，优选Wnt3a。属于Wnt家族的因子可以为能够将β连环蛋白(βcatenin)活化的那些。
作为I类组蛋白脱乙酰化酶(HDAC)抑制剂，可例示：丁酸盐(例如：丁酸钠)，丙戊酸，帕比司他(Panobinosta)(LBH589)，阿皮西定(Apicidin)，BML-210，狄普德星(Depudecin)，HC毒素，M344，奥克氟汀(Oxamflatin)，Scriptaid，Splitomicin，辛二酰双羟肟酸(Suberoyl bis-hydroxamic acid)，曲古抑菌素(Trichostatin)A，伏立诺他(Vorinostat)(SAHA，MK0683)，恩替诺特(Entinostat)(MS-275)，帕比司他(Panobinostat)(LBH589)，莫替司他(Mocetinostat)(MGCD0103)，联苯-4-磺酰氯，ACY-738，贝利司他(Belinostat)(PXD101)，罗米地辛(Romidepsin)(FK228，缩酚酸肽(Depsipeptide))，MC1568，Tubastatin A，吉维诺司他(Givinostat)(ITF2357)，达西司他(Dacinostat)(LAQ824)，CUDC-101，奎司司他(Quisinostat)(JNJ-26481585)，普西司他(Pracinostat)(SB939)，PCI-34051，佐西司他(Droxinostat)，Abexinostat(PCI-24781)，RGFP966，AR-42，Rocilinostat(ACY-1215)，泰克地那林(Tacedinaline)(CI994)，CUDC-907，姜黄素(Curcumin)，Tubacin，RG2833(RGFP109)，瑞米司他(Resminostat)，双丙戊酸钠(Divalproex Sodium)，苯基丁酸钠(Sodium Phenylbutyrate)，Tubastatin A，TMP269，Santacruzamate A(CAY1 0683)，TMP195，Tasquinimod，BRD73954，Citarinostat(ACY-241)，HPOB，LMK-235，Nexturastat A，Tucidinostat(西达本胺，Chidamide)，(-)-银胶菊内酯((-)-Parthenolide)，CAY10603，4SC-202，BG45，ITSA-1(ITSA1)等，其中，优选丁酸钠。
作为FGF(成纤维细胞生长因子)，可例示：碱性FGF(有时也记作bFGF，FGF2)，FGF4，FGFC(嵌合成纤维细胞生长因子，Chimeric Fibroblast Growth Factor)等，其中，优选碱性FGF。
作为属于TGFβ超家族的因子，可例示：BMP4，BMP2，BMP等，其中，优选BMP4。
作为β连环蛋白活化剂，可例示：CHIR99021，Wnt3a，Wnt3a-AFM，R-Spondin-1，BIO(6-溴靛红素-3′-肟)等，其中，优选CHIR99021。CHIR99021可作为由iPSC诱导分化为DE中的Wnt3a的代替品(后述的实施例2，图13A的CHIR d3)。
作为PI3K抑制剂，可例示：PI-103，ZSTK474，NVP-BEZ235，LY294002，渥曼青霉素(Wortmannin)等，其中，优选PI-103。P13K抑制剂可以为PI3K，Akt，mTOR抑制剂。
作为BMP抑制剂，可例示：LDN-193189，Galunisertib(LY2157299)，LY2109761，SB525334，SB505124，吡非尼酮(Pirfenidone)，GW788388，LY364947，RepSox，K02288，SD-208，LDN-214117，SIS3 HCl，Vactosertib(TEW-7197)，DMH1，LDN-212854，ML347，Kartogenin，橙皮素(Hesperetin)、土木香内酯(Alantolactone)等，其中，优选LDN-193189。BMP抑制剂可以为ALK2及ALK3抑制剂。
作为血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)活化剂，可例示：VEGF、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、PlGF等，其中，优选VEGF。
作为腺苷酸环化酶活化剂，可例示：毛喉素(Forskolin)，HJC0350，8-Br-cAMP，3′，5′-环腺苷单磷酸酯(cAMP)，二丁酰-cAMP(布拉地新)等，其中，优选毛喉素。腺苷酸环化酶活化剂可以为使细胞内cAMP浓度升高的那些。
作为TGF-β的I型受体的抑制剂，可例示：SB431542、LDN-193189、Galunisertib(LY2157299)、LY2109761、SB525334、SB505124、GW788388、LY364947、RepSox、LDN-193189、K02288、LDN-214117、SD-208、Vactosertib(TEW-7197)、ML347、LDN-212854、DMH1、Pirfenidone、土木香内酯(Alantolactone)、SIS3、橙皮素(Hesperetin)等，其中，优选SB431542。TGF-β的I型受体的抑制剂为ALK4，ALK5，ALK7抑制剂，可以为激活蛋白抑制剂。
作为PDGF受体活化剂，可例示PDGFBB，PDGF-AA，PDGF-AB，PDGF-CC，PDGF-DD等，其中，优选PDGFBB。
对于共培养中3种细胞的培养比，只要是可以形成器官芽的范围内就没有特别限定，合适的细胞的个数比为组织或器官细胞∶血管内皮细胞∶间充质细胞＝10∶10～5∶2～1。
关于培养时使用的培养基，只要是可以形成器官芽的培养基，则无论是何种都可以，优选使用血管细胞(例如：血管内皮细胞)培养用的培养基，组织或器官细胞培养用的培养基，混合了上述2个培养基的那些等。血管内皮细胞培养用的培养基无论使用何种都可以，优选使用包含hEGF(重组人上皮细胞生长因子)，VEGF(血管内皮细胞生长因子)，氢化可的松，bFGF，抗坏血酸，IGF1，FBS，抗生素(例如：庆大霉素，两性霉素B等)，肝素，L-谷氨酰胺，酚红，BBE中的至少一种。作为血管内皮细胞培养用的培养基，可以使用EGM-2BulletKit(Lonza公司制)，EGM BulletKit(Lonza公司制)，VascuLife EnGS Comp试剂盒(LCT公司制)，人内皮-SFM基础生长培养基(Invitrogen公司制)，人微小血管内皮细胞增殖培养基(TOYOBO公司制)等。组织或器官细胞培养用的培养基无论使用何种都可以，在器官细胞为肝细胞的情况下，优选使用包含抗坏血酸，BSA-FAF，胰岛素，氢化可的松，GA-1000中的至少一种的那些。作为肝细胞培养用的培养基，可以使用从HCM BulletKit(Lonza公司制)中除去了hEGF(重组人上皮细胞生长因子)培养基、向RPMI1640(Sigma-Aldrich公司制)中加入了1％B27补充剂(GIBCO公司制)和10ng/mL hHGF(Sigma-Aldrich公司制)等。关于人肝芽的形成，当将GM BulletKit(Lonza公司制)与从HCM BulletKit(Lonza公司制)中除去了hEGF(重组人上皮细胞生长因子)的培养基以1∶1混合，向所得的培养基中添加地塞米松、抑癌蛋白M、HGF时，判明了对于肝芽的成熟有效果。
在细胞培养时虽然不是必须使用构架材料，但可以将3种细胞的混合物在间充质细胞能收缩的凝胶态支撑体上培养。
关于间充质细胞的收缩，可以通过进行(显微镜或肉眼下)形态学上的形成立体组织的确定、伴随利用药匙等的回收而显示的具有维持组织的形状的强度等(Takebe等.Nature 499(7459)，481-484，2013))进行确认。
支撑体为具有适当的硬度例如：杨氏弹性模量200kPa以下(包被基质胶后的形状为平坦的凝胶的情况等)，支撑体的适当的硬度可能根据包被和形状而变化)的凝胶态基材即可，作为这样的基材，可例示水凝胶例如：丙烯酰胺凝胶，明胶，基质胶等)等，但不限于这些。需要说明的是，相应于目标聚集体的形状、大小、量，支撑体的硬度不必然是均一的，可以对硬度设定空间、时间上的梯度、或图案化。在支撑体的硬度均一的情况下，支撑体的硬度优选为100kPa以下，更优选为1～50kPa。凝胶态支撑体可以为平面，或者，凝胶态支撑体的进行培养侧的剖面可以为U或V字的形状。由于通过使凝胶态支撑体的进行培养侧的剖面为U或V字的形状，使得细胞在支撑体的培养面聚集，以更少数量的细胞和/或组织形成细胞聚集体，因而有利。另外，也可以对支撑体实施化学、物理的修饰。作为修饰物质，可例示：基质胶、层粘连蛋白、entactin、胶原蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白等。
对于凝胶态培养支撑体的硬度进行空间的梯度设定的一个实例而言，为中央部的硬度比周边部的硬度更硬的凝胶态培养支撑体。中央部的硬度为200kPa以下为适合，周边部的硬度比中央部更柔软即可，支撑体的中央部和周边部的适当的硬度可根据包被和形状而变化。对于凝胶态培养支撑体的硬度进行空间的梯度设定的另外的一个实例而言，为周边部的硬度比中央部的硬度更硬的凝胶态培养支撑体。
对于图案化的凝胶态培养支撑体的一个实例而言，为具有1个以上的中央部的硬度比周边部的硬度更硬的图案的凝胶态培养支撑体。中央部的硬度为200kPa以下为适合，周边部的硬度比中央部更柔软即可，支撑体的中央部和周边部的适当的硬度可根据包被和形状而变化。对于图案化的凝胶态培养支撑体的另外一个实例而言，为具有1个以上的周边部的硬度比中央部的硬度更硬的图案的凝胶态培养支撑体。周边部的硬度为200kPa以下为适合，中央部的硬度比中央部更柔软即可，支撑体的中央部和周边部的适当的硬度可根据包被和形状而变化。
对培养时的温度没有特别限定，优选为30～40℃，进一步优选为37℃。
对培养时期没有特别限定，优选为3～10天，进一步优选为6天。
在本发明中，通过将器官芽的制作中使用的3种细胞种类全部由多潜能干细胞制作，由此可以使3种细胞种类的分化阶段同步，通过由这些细胞制作器官芽，可以谋求器官芽的功能的改善。另外，能够实现削减在3种细胞种类的品质评价或者制造中涉及的成本及劳力。
通过将本发明的器官芽移植至非人动物中，并使在该非人动物内中成熟，可以制作组织或器官。即，本发明也提供组织或器官的制作方法，包括将上述器官芽移植至非人动物中，使其分化为组织或器官。作为使用的非人动物，可列举利用作：实验动物、宠物动物、役用动物、赛马、斗狗等的动物，具体地，可以例举：小鼠、大鼠、兔子、猪、狗、猴、牛、马、羊、鸡、鲨鱼、鳐、银鲛、鲑鱼、虾、蟹等。另外，为了避免免疫排斥反应，使用的非人动物优选是免疫缺陷动物。
因此，本发明也提供器官芽的移植方法，包括将上述器官芽移植至人或非人动物中。器官芽的移植部位只要是能够移植的部位即可，可以是任何部位，可以例示：颅内，肠系膜，肝脏，脾脏，肾脏，肾被膜下，门静脉上等。在移植至颅内的情况下，可以移植在体外制作的1～3个左右的5mm大的器官芽，在移植至肠系膜的情况下，可以移植在体外制作的1～6个左右的5mm大的器官芽，在移植至门静脉上的情况下，可以移植在体外制作的1～20个左右的5mm大的器官芽。在移植至肾被膜的情况下，可以移植在体外制作的1～5个左右的5mm大的器官芽，在移植至肝脏、脾脏、肾脏-的情况下，可以移植体外制作的100～200个左右的100μm大的器官芽。
如上所述制作的组织及器官可以用于新药筛选、再生医疗等。
因此，本发明提供组织或器官的再生或功能恢复方法，包括将上述器官芽移植至人或非人动物中，使其分化为组织或器官。作为非人动物，可列举利用作：实验动物、宠物动物、役用动物、赛马、斗狗等的动物，具体地，可以例举：小鼠、大鼠、兔子、猪、狗、猴、牛、马、羊、鸡、鲨鱼、鳐、银鲛、鲑鱼、虾、蟹等。
本发明的器官芽可制为制剂，以再生医疗用组合物的形态使用。将本发明的组合物移植至生物体内可以制造组织或器官。另外，将本发明的组合物移植至生物体内可以进行组织或器官的再生或功能恢复。
将本发明的组合物移植至生物体之后，器官芽能够分化为具有血管网的组织或器官。在该血管网中可产生血管灌注。认为通过在血管网中产生血管灌流，能够实现创出具有与成体组织同等或与其接近的高度有序的组织结构的组织和器官。
本发明的组合物中也可以添加FGF2、HGF、VEGF等组织血管化促进剂、伴随移植的止血用明胶海绵(商品名：Spongel，Astellas株式会社)、和用于固定移植组织的Bolheal(帝人制药株式会社)，Beriplast(CSL Behring株式会社)，Tachocomb(CSL Behring株式会社)等组织粘附剂等。
另外，本发明也提供非人嵌合动物的制作方法，包括将上述器官芽移植至非人动物中，使其分化为组织或器官。移植了器官芽的非人动物(例如：小鼠)能模仿在器官芽的制作中使用的组织或器官细胞的来源生物种类(例如：人)的生理功能。
进一步，本发明也提供评价药品的方法，包括使用选自由上述器官芽，组织及器官，及非人嵌合动物组成的组中的至少一个。作为药品的评价，可以例举例如，药物代谢的评价(例如，药物代谢概况的预测)、药效评价(例如，筛选作为医药品的有效药品等)、毒性评价、药物相互作用评价等。
药物代谢的评价可以通过在选自由通过上述方法制作的器官芽，组织及器官，及非人嵌合动物组成的组中的至少一个中，提取、分析施用医药品的候选化合物后的生物试样，获得人型的药物代谢分布。由此，使得通过现有技术极难以实现的在人中预测医药品的分布、代谢和排泄过程成为可能，并且有望飞跃性地加快安全且有效的医药品的开发。
对于作为医药品而言有效的药品的筛选，能够实现通过对选自由从疾病患者建立的细胞通过上述的方法制作的器官芽，组织及器官，及非人嵌合动物组成的组中的至少一个施用新型的医药品候选化合物而进行分析。由此，就可以期待有可能能够大幅度改善以往的体外试验中不够充分的、实际中向人施用时的药效的预测精度。
对毒性评价而言，可以通过在选自由通过上述的方法制作的器官芽，组织及器官，及非人嵌合动物组成的组中的至少一个中施用被测物质后，测定组织障损伤标记等，由此能够提高损伤预测的精度。
药物相互作用评价可以通过在选自由通过上述的方法制作的器官芽，组织及器官，及非人嵌合动物组成的组中的至少一个中施用多个药品后，进行之后的各药品的分布、代谢、排泄过程等药物动力学、毒性评价，药效评价从而进行。
另外，能够由通过本发明的方法制作的组织及器官创造出组织干细胞，本发明能够应用在人组织细胞、器官细胞的大量创造的细胞操作技术中。
实施例
以下通过实施例更详细地描述本发明。
[实施例1]
由人多潜能干细胞进行的肝芽的大量制造手段的建立
摘要
类器官移植疗法可能成为革新性的疾病治疗范例，但最重要的问题主要是确保再现性及可扩展性(scalability)。在本研究中，通过构建由人人工多潜能干细胞(iPSC)进行器官芽的大量生产的平台而尝试了解决这些为题。首先，通过进行大规模的“反向”筛选实验，鉴定了用于再现性高地生成肝芽的有效的祖细胞群体(肝内胚层，内皮，及横隔间充质)。进一步，发明人通过开发用于以＞108规模均质地批量生产小型化的肝芽的omni孔阵列培养平台，实现了移植治疗所要求的水平的容量。在全部由iPSC生成的、形成血管的且有功能的肝组织中，被阶段性的产生基础上的祖细胞的相互作用所增强，而显著改善之后的肝的功能化。另外，该肝组织通过移植实现了对急性肝功能衰竭的有功能的救济。本研究为实现用于包括多细胞的肝芽类器官的供给的制造平台，期待使将来用于肝病的治疗的临床及新药应用大幅加速。
介绍
“类器官技术”为对难治性疾病的治疗，以及人的发育及疾病模型的最近进化出的方法(Huch and Koo，2015，Lancaster and Knoblich，2014，Sasai，2013)。基于自我凝缩原理，发明人最近通过发展具有对于各种小鼠疾病模型的治疗可能性的肝芽，胰芽，及肾芽等多细胞器官芽，成功对类器官构建了进一步的复杂化(Takebe等.，2015，Takebe等.，2013，Takebe等.，2014)。然而，为了使得能够生成用于在人中移植及药物测试的充分大而稳定的类器官，对于基于类器官的方法的更广泛的应用而言，在可扩展性及再现性的课题上存在挑战(Ding and Cowan，2013)。为了促进将来以器官芽为基础的方法的治疗应用，发明人的目的在于建立一种全面的、可扩展、具有再现性的方法，所述方法用于由无饲养细胞的人iPSC完全生成形成有血管的人肝芽(LB)，并证实其用于适用移植的功能性能力。
结果
首先，目的在于使用肝芽(LB)的例子建立可扩展的三维类器官培养平台。将整体策略概述于图1A，B(图1A，B)中。简要的说，发明人通过将准确的模板结构转印在树脂膜上，而利用开发微小结构的膜的组合化学技术开发了U字底型微孔板。如(图1C(图1C)所示，发明人的微孔阵列具有非常高的高宽比，各凹陷的开口直径为约500μm，深度为400μm，凹陷以30μm的间隔紧密接触且配置为三角形状)。这样的高宽比利用以往的成型机是难以广泛转印的。因此，发明人通过使用在内部进行了最优化的成型机而改善了转印精度(参考方法)。其结果显示，在原型设计(Prototyping)中，24孔及6孔形式，即ElplasiaTMRB(圆底)(24孔中600斑点/孔；6孔中3,000斑点/孔)获得成功。之后，发明人将源自人的iPSC的肝内胚层(iPSCHE)，人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)，及骨髓间充质干细胞(BMSC)如以前记载的方式(Takebe等.，2013)混合，由此使该板适应于肝芽培养。通过对包被材料(图5(图S1))、凹陷的形状(数据未示出)、混合比(图6A-C(图S2 A-C))及细胞数(图6D-F(图S2 D-F))的最优化，使用基于该微孔阵列的方法能够有效地形成小型肝芽(补充文本)。
为了将该策略集中地扩大规模，发明人考虑了在每1孔中含有20,000个以上的微斑点的omni(1)孔阵列板(图7A(图S3A))。omni孔阵列板的框架(长度，宽度，高度)的外尺寸与一般微量滴定板同样满足SBS标准。平板由2个模块构成。即，无底板的框架和微孔转印膜。它们利用激光焊接组装得到(图1A(图1A)，左)。由于中央部分的显著的凹陷引起了异常的类器官取代和之后的融合，因此，在以24/6孔形式使用的微孔转印膜的适用中，omni孔形式无效(图1B(图1B)，中央)。因此，发明人依照以下2个策略进行了意在平坦性的改善：1.降低膜的残留应力，2.提高膜的刚性。首先，发明人通过成型温度、冲压时间等成型条件的最优化和激光熔接时的膜的弯曲的改善，将转印图案的成型压力抑制到最小限度，抑制了模板转印的极限。接着，通过将膜变厚而提高了刚性(图1B(图1B)，插图说明)。可知在0.8mm～1.4mm的范围内的各种厚度的条件中，1.1mm的膜厚不妨碍显微镜观察并满足可允许的刚性。3D表面形状测定装置显示了经改善的条件下最小的高度变动，使能够进行之后的更大规模下的LB培养(图1B(图1B)，右)。重要的是，生成的LB的99％以上利用简单的手动吹打而被顺利收集(图5B(图S1B))。一次将三种祖细胞接种于omni孔板中时，超过20,000个的内皮化LB发生了自组装，与此相对，单一的iPSC-HE培养没有发生自组装(图1C，D(图1C，D))。采用qRT-PCR的品质确认分析显示，omni孔中的LB与24孔/6孔形式的LB具有同等的特性(图7B(图S3B))。综上所述，发明人开发了用于大规模的类器官生产的omni孔阵列板的原型设计。
接着，尝试了对于人中肝芽形成的最适内胚层细胞群体的表现型的定义。为此，通过基于得到的类器官的质量而比较了多个内胚层阶段，进行了大规模的“反向”筛选实验。在选择最具有再现性的发表的成熟肝细胞分化方案(图8A-F(图S4A-F)及补充文本)(Kajiwara等.，2012，Loh等.，2014，Si-Tayeb等.，2010)之后，发明人进一步通过由第0天～第20天的细胞开始肝芽培养，试图准确确定iPSC-LB功能最良好的内胚层阶段(图9(图S5))及图2A，B(图2A，B))。首先，通过由多个阶段(0～20天)生成的回收LB的形态学变化的基于荧光的定量评价，明确了第8天的细胞为能够以100～200μm的大小维持高度均匀的LB的唯一的群体(图1E，F(图1E、F))。之后的肝标记基因的qRT-PCR(图9A(图S5A))及蛋白质产生的ELISA(图2A(图2A))显示，源自第8天的细胞的iPSC-LB品质高于源自第0天(iPSC)，第5天，第6天，第7天，第10天及第20天的肝芽培养。转录分析显示，LB的表达特性比2-D分化细胞更类似于人成人肝组织(图9B(图S5B))。从头到尾一致地，在全部的基因表达的主要成分分析中显示：与其它阶段相比，PC1轴在第8天的肝芽的分布最接近人成人的肝组织样品的分布(图2B(图2B))。有趣的是，虽然在第8天的肝芽中观察到作为血管生成的特征的基因集合的明显强化，但在第7天的芽中没有观察到(图9C(图S5C))。这可能对在体内有利的血管生成的结果有用。
为了将这些经“反向”鉴定的第8天的群体进一步表征，发明人进行了采用SOX17/HNF4A共免疫染色，qRT-PCR，FACS，及Cerberus1 ELISA的特征鉴定，鉴定了第8天的细胞表示出从定型内胚层向肝内胚层细胞的移行期的群体(图8G(图S4G)及图2C(图2C))。在此，将该细胞定义为移行性肝内胚层细胞(transitional hepatic endoderm，tHE)。虽然第8天的细胞对于DE标记是阴性的，但没有表达HNF4A这样的HE标记(图2C(图2C))，因此发明人尝试了通过鉴定在第6天和第8天的群体间的比较转录组分析中能够定义的标记而来定义细胞。从火山图分析(iPSC-DE和iPSC-tHE与的比较)，基于转录组动力学鉴定了Tbox转录因子3(TBX3)及肾上腺素能受体α 1B(ADRA1B)(图2D(图2D)及图10(图S6))。以上通过免疫染色及qRT-PCR得到确认(图2E(图2E)，及图3A(图3A))。综上所述，虽然该经反向鉴定的群体在产生上的相关性仍不明确，发明人的结论为TBX3及ADRA1B共阳性tHE为用于肝芽生成的最有效的阶段。
对于这样的LB基础的途径的将来的应用而言，一个较大的障碍为相关于源自出生之后组织的间质祖细胞(即HUVEC及BMSC)的使用。为此，发明人的目的在于从人iPSC诱导2种肝芽基质祖细胞。在肝脏的器官形成初期，肝内胚层细胞转移到LIM Homeobox 2(LHX2)及Wilms tumor1(WT1)阳性横隔间充质(STM)，形成肝芽(Delgado等.，2014，Kolterud等.，2004)。STM不仅参与肝芽形成，也参与至少由源自STM的旁分泌因子介导的肝母细胞的增殖及生存(Zaret，2002)。但是，尚未开发STM细胞的分化方案(Iyer等.，2015，Witty等.，2014)。为了指示STM的命运，发明人在第4天暴露了在源自iPSC的侧板中胚层(iPSC-Meso)中潜在的衍生物质及它们的组合。几乎未检测到为PSC标记的NANOG，早期中胚层标记T，而为STM标记的FOXF1、HLX1、COL4A及ALCAM的转录活化在第10天通过FGF2及PDGFB同时暴露而被顺利诱导(图2F(图2F))。WT1，MIIA及LHX2的免疫染色也确认了推定在STM细胞中的正确细胞命运的诱导(图3A(图3A))。根据全局基因阵列分析启示，iPSC-STM的特性显示出向报告的人成人肝间充质细胞的特性的明显变化(Asahina等.，2009，Asahina等.，2011，ElTaghdouini等.，2015)(图2G(图2G))。发明人以前示出了在LB代中，间充质细胞的一个功能为肌球蛋白IIA依赖性的自我凝聚。从头到尾一致地，发明人根据延时摄影图像证实iPSC-STM的自己凝缩能力与以往的BMSC是同样的(图2H(图2H))。
为了能够再现地生成内皮祖细胞(iPSC-EC)，发明人开发了在适应无饲养细胞的iPSC的培养后，根据以前的文献修改的4个独立方案(Narazaki等.，2008，Orlova等.，2014，Patsch等.，2015，Samuel等.，2013)(图11A(图S7A))。对各方案下进行了完全分化程序的iPSC-EC采用流式细胞分析(FACS)及qRT-PCR进行了评价(图11B，C(图S7B，C))。根据该结果可知，遵照方案1的细胞示出了EC标记的最高表达，将多潜能性标记最小化。对VEGF和毛喉素的组合而言，即使不进行基于磁性珠的筛选，根据定期的FACS分析(＞92.8％，n＝12)，也可以诱导最高水平的CD144(VE-钙黏着蛋白)和CD31的同时表达(图2I(图2I))。连续传代之后，EC严密地增殖(～200倍的增加)(图11D(图S7D))，并且该表达维持到4次传代。根据内皮标记的免疫染色确认；在基质胶栓(Matrigel plug)上铺板之后，细胞显示出严密的转移和之后的内皮发芽潜能(图2J(图2J))。进一步重要的是，在柔软基质上的iPSC-EC与iPSC-STM的共培养中，也得到了凝缩的组织的形成(Takebe等.，2015)，移植48小时后可以生成开放性的血管。这一点，通过使用注入荧光葡聚糖之后的AAVS1：：mCherry iPSC-EC的细胞的共聚焦成像而确认(图2K(图2K))。这些结果启示，由具有用于自己凝聚及血管生成的功能性的能力的无饲养细胞iPSC顺利分化为人iPSC-STM及-EC群体。
三种祖细胞的强力的诱导，实现了由iPSC(全部iPSC-LB)到肝芽的生成的可能性的检查(图3A(图3A))。由Ff-l01及Ff-l14等包含HLA均接合体的克隆的多个人无饲养细胞iPSC供给源(测试后5个独立的供体源自克隆)良好地诱导为这3种不同的祖细胞。4D明场和光片图像分析分别示出在STM的存在下成功的自己凝聚(图3B(图3B)，上部)和自组装iPSC-EC网络(图3B(图3B)，下部)。根据3天的培养组织的共聚焦广视野摄像，确认到iPSC-tHE和排列好的发芽的iPSC-EC(图3C，D(图3C、D))。通过移植到免疫缺陷小鼠的颅窗，进一步对血管生成的可能性进行了评价。生物体内成像显示，48小时的功能性血管的形成及最终的iPSC-tHE的植活(图3E～G(图3E-G))。iPSC-EC与小鼠CD31内皮细胞直接吻合(图3H(图3H))，在血管周围的位置被iPSC-STM包围(图3I(图3I))。因此，发明人由人iPSC完全顺利生成了血管生成及功能性肝组织。
由于为了纠正特定的代谢肝功能至少需要108个肝细胞进行移植(Martin等.，2014)，因此最大课题是使全部的iPSC-LB策略去适应能以omni孔阵列规模实施的培养平台。为了该目标，将发明人的大量生产及全部的iPSC-LB的批量验证的策略概述于图4A(图4A)。简单地说明而言，发明人制备了用于制造每次培养108细胞规模的肝芽的5-10个omni孔阵列板，明确了体外的功能及体内的治疗可能性。其结果，在10天培养之后，大量生产的全部的iPSC-LB显示出比以往的LB(HUVEC/BMSC)、成人人肝细胞(AdHep)更高的白蛋白产生(10μg/ml/24hr/106细胞以上)(图4B(图4B)及图9B(图S5B))。不仅如此，该iPSC-LB也生产了包括补体因子H、凝固因子VIII、转铁蛋白及AAT在内的若干重要的肝血清蛋白质(图4C(图4C))。应该注意到，长期培养的全部的iPSC-LB的铵清除能力与培养中的初代成人人肝细胞的情况是同样的(图4D(图4D))。进一步，全局转录分析中显示，分化的全部的iPSC-LB相比于以往的LB更成熟，而AdHep是同样的(但没有成熟到30岁的成人肝组织程度。)(图4E(图4E)及图9B(图S5B))。为了进行与人AdHep的公平比较，发明人开发了基于肝功能基因特性数据的评分方法。该评分方法命名为APRES(相对富集分数的Aster Plot，Aster Plot ofRelative Enrichment Score)。使用MSigDB5.0版(Subramanian等.，2005)中特征的基因集合，发明人使用根据涉及胎儿肝的人成人肝细胞(AdHep 2D)中的发展性特性的表达水平计算出的mNES得分的相对大小，确定了Aster Plot的各分量的幅度(参考方法)。对各组织或细胞类型，相对mNES得分为将分量的宽度及高度相乘以后作为Aster Plot的各分量的高度示出，然后将合计定义为总相对得分。无偏倚的APRES基础评分明确显示出：分化的全部iPSC-LB的特征与包括补体，血管生成及胆固醇稳态级联的AdHep及以往的iPSC-MH的特征类似(图4F(图4F))。
最后，在肝功能衰竭的免疫缺陷小鼠模型中进行了大量生产的人LB的功能性批量验证。制备相当于108个的肝细胞的肝芽，将每个大量生产相当于107个的细胞的LB分至约10只小鼠，通过判定全肝芽的治疗可能性对它们进行了评价。进行移植至Alb-Tk-NOG小鼠的肾包膜下。整体来看，从114只移植小鼠得到的结果提供了通过纠正总肝功能损伤而改善生存性的具有统计学差异性的强证据(图4G(图4G))。重要的是，后续血清分析也支撑了如下事实：通过与生产循环无关系地在体内生产ALB，使AFP减少(未检出)，大量生产的肝芽在功能性上是稳定的(图12A(图S8A))。应该注意到，相比于从人初代肝细胞(N＝12，4供体)移植得到的情况，人白蛋白的大小及持续性显著更高(图4H(图4H))。LB的药物代谢能力也通过人特异性的双氯芬酸代谢产物检测而得到确认(图4I(图4I))。对于基质细胞不存在的iPSC-tHE细胞的移植而言，在通过移植的小鼠中利用人ALB进行的评价中几乎没有发挥功能(图12B(图S8B))。这一点如单细胞RNA测序的最近的研究(Camp等.，2017)中示出的那样，启示了对iPSC-STM及-EC的肝功能化的潜在的功能。综上所述，发明人的类器官大量生产培养平台不仅解决了规模化的问题，还提供了对于108个以上的与成人肝细胞为同等功能的源自人的iPSC的人肝组织的具有严密再现性的分化平台。
讨论
作为结论，在本研究中概述的技术明确了供给iPSC基础的多细胞性类器官在药品测试及再生应用中的令人兴奋的策略。特别是，认为本实施例中得到的108细胞规模以上的肝芽的生产为适合对人移植应用的规模。这是由于证实了细胞移植测试的数量，特别是用于儿童患者的最低用量的108细胞在临床中的有效性(Enosawa等.，2014，Jorns等.，2012)。如果标准的治疗规模为患者每1人109个的肝细胞或者其以上(Horslen and Fox，2004)，则有望在代谢障碍的动物模型中相应的有效性的研究中继续致力于规模化。尽管如此，该方案是利用基于临床级成分的多个学术性及产业的联合操作努力而开发的。在临床级成分中，包括遗传地表征了的iPSC，规定的培养基及底物，微孔阵列板，以及用于将来的临床测试的准备的显微镜检验。为了使其加速，全部的iPSC-LB策略完全适合cGMP级系统对将来的临床应用以及通过了临床上适当的移植途径的安全性评价至关重要。发明人认为最终通过一系列的制造技术的综合，能够实现开发出用于治疗目前困难的肝病的临床上有效的肝芽移植疗法。
实验顺序
微孔中的人肝芽的培养
全部iPSC系统在层粘连蛋白511E8片段(iMatrix-511(商标)，由Nippi，Inc.友好提供)包被的平皿基础上，在StemFit(注册商标)(Ajinomoto Co.，Inc.)中维持。用于特异性的分化为各系统的方法记载在补充方法中。为了在体外生成人LB，将每微孔合计1140～10，140细胞以10∶7∶2(＝人iPSC-tHE∶iPSC-EC∶iPSC-STM)的比，再悬浮在EGM和肝细胞培养培养基(HCM)(Cambrex，Baltimore，MD)的混合培养基中。该混合培养基中包含地塞米松(0.1μM，Sigma-Aldrich，St Louis，MO)，抑癌蛋白M(10ng/ml，R&D System，Minneapolis，MN)，HGF(20ng/ml，PromoKine)，及SingleQuots(Lonza)。将再悬浮的细胞接种在24孔板，或24孔，6孔或1孔板中的Elplasia(商标)平台(由Kuraray，Inc.协作开发的)中任一个上。图3B(图3B)上所示的相位差克隆图像的获得使用BioStation CT培养培养箱，显微镜，及数码成像系统(Nikon，Tokyo，Japan)实现。图3B(图3B)的下所示的荧光延时成像利用Lightsheet Z.1显微镜(Zeiss，Germany)图像化。通过缓慢的吹打收集生成的人iPSC-LB，使用于体外成熟评价及体内移植实验中。作为对照，发明人使用了5个不同的人初代成人肝细胞(批次编号：H768，H737，HC2-8，H4.1及批次编号：M00995，从XenoTech，KS，USA及Veritas，Tokyo，Japan购买)。
数量化和统计分析
数据在说明中以特定的独立的实验的平均±s.e.m或平均±s.d.方式表示。该研究中未使用随机化或盲法。生产的白蛋白量的统计学差异性根据非参数Mann-Whitney U检验进行了评价。认为两侧p值小于0.05为显著。对于生存分析，使用了GraphPad Prism软件6.0版用于统计分析。
补充资料
在补充资料中包括补充的实验顺序，8幅图(图5～12(图S1-S8))。
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实验模型及事项细节
小鼠
提取在体外生成的LB，移植至非肥胖糖尿病/重症复合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠(Sankyo Lab.Co.，Tsukuba，Japan)的预先形成的颅窗或其它示出的部位。移植的细胞的体内命运使用Leica TCS SP8共聚焦显微镜(Leica Microsystems，Germany)通过生物体内成像而监控。为了体内的功能化研究，使用了8周龄的雄性NOG小鼠(体重约20-30g)(由Central Institute for Experimental Animals(CIEA)，Kanagawa，Japan供给)(Hasegawa等.，2011)。对生存曲线，在该研究中使用了白蛋白-TK-NOG小鼠(体重约20-30g)(由CIEA，Kanagawa，Japan供给)。为了在移植前诱导转基因肝实质细胞的组织特异性的消融，施用对人或小鼠组织没有毒性的药物甘西洛韦(GCV，50mg/kg，i.p.)，以相当于每小鼠1×107细胞的iPSC-LB移植至肾脏的肩胛下部位。对试样的大小而言，根据分泌的白蛋白蛋白质存在30％的变化的情况下，为了以80％的输出得到显著的差异(P＜0.05)的必要的最小大小而确定。安乐死的时刻是随机分配的。关于移植实验的排除标准，事前确定将由于疾病而进行安乐死的小鼠从数据中排除。这样的数据与移植不相关。小鼠依照涉及实验动物的使用的横滨市立大学的设施指导方针饲养，维持。
方法的细节
人iPSC培养及tHE分化
人iPSC系统(TkDA3-4、1231A3、1383D2、1383D6及Ff01)由京都大学及东京大学提供。1231A3、1383D2及1383D6由京都大学CiRA的ePBMC(注册商标)(Cellular TechnologyLimited，OH)建立的系统。全部iPSC系统在层粘连蛋白511E8片段(iMatrix-511(商标)，由Nippi，Inc.友好提供)包被的平皿基础上，在StemFit(注册商标)(Ajinomoto Co.，Inc.)中维持。为了体外及体内的实时成像分析，使用了腺相关病毒组装部位1(AAVS1：：EGFP或mCherry)的表达下的荧光蛋白质敲入报告物。为了导出iPSC-tHE，发明人开发了2阶段分化法(参考补充文本)。第1阶段中，将人iPSC与10μM ROCK抑制剂Y-27632(Wako，产品目录编号253-00513)共同接种在iMatrix-511包覆平皿上，加入1％B27，将含有人100ng/ml激活蛋白A(由Ajinomoto Co.，Inc.提供)及50ng/ml Wnt3a(R&D Systems)的RPMI-1640作为培养基使用6天。iPSC铺板的第一天，添加了1mM酪酸钠(Sigma)。成功的内胚层的特化使用Cerberus 1ELISA试剂盒(Dojin Kagaku，Kumamoto，Japan)进行了定量评价。接下来，将源自人的iPSC内胚层细胞在包含1％B27，10ng/ml人碱性FGF及20ng/ml人BMP4的RPMI-1640中进一步处理2天，诱导为TBX3及ADRA1B阳性移行性肝内胚层群体。在使每个iPSC克隆适应记载的方案前，发明人强力推荐除了仔细的显微镜观察以外，采用免疫染色及基因表达研究在分化的各时刻检查人iPSC的各自的特异化标记。这是由于成功的肝芽的生成对于体内的有功能成熟是重要的。该实施例中的人iPSC的使用得到横滨市立大学的伦理委员会的认可。
人iPSC-EC及STM分化
为了EC分化，将人iPSC使用Accutase解离，铺板至层粘连蛋白511E8片段(iMatrix-511(商标)，由Nippi，Inc.提供)上。使人iPSC在包含10μM的ROCK抑制剂Y-27632的StemFit(注册商标)(Ajinomoto Co.，Inc.)中成为各种最合适密度(依赖于细胞株)。次日，将培养基置换为启动培养基(Priming Medium)。启动培养基由包含8μM的CHIR99021(Tocris Bioscience)和25ng/ml BMP4(R&D Systems)的B27培养基(包含1％Glutamax及1％B27(均为Life Technologies)的DMEM和F12的1∶1的混合培养基)组成。再过3天之后，将启动培养基置换为EC诱导培养基。EC诱导培养基由补充了200ng/ml VEGF(LifeTechnologies)及2μM毛喉素(Sigma-Aldrich)的StemPro-34 SFM培养基(LifeTechnologies)组成。诱导培养基每日更换为新的。在分化的第7天将EC用0.05％胰蛋白酶解离，进行了FACS分析。源自iPSC的EC应显示伴有局部化CD144及CD31的接合部的典型的内皮形态。将EC在由1μg/cm2的纤连蛋白(Sigma-Aldrich)包被的平皿上，在EC扩大培养基中，以50,000细胞cm-2的密度进行再铺板。EC扩大培养基由补充了50ng/ml的VEGF-A的StemPro-34SFM组成。EC扩大培养基每隔1天进行交换。为了STM分化，将人iPSC使用Accutase解离，以2000～8000细胞/cm2铺板到层粘连蛋白511E8片段上，在包含10μM的ROCK抑制剂Y-27632的StemFit(注册商标)中，在诱导前的4～6天进行培养。在中胚层诱导阶段中，将维持培养基置换为中胚层诱导培养基，接着暴露于2ng/ml激活蛋白A及10ng/ml PDGFBB(R&D Systems)中3天。中胚层诱导培养基为包含1％Glutamax及1％B27的DMEM和F12的1∶1的混合培养基，B27包含8μM CHIR99021及25ng/ml BMP4。3天后，将中胚层诱导培养基置换为STM诱导培养基，培养3天。STM诱导培养基由补充了10ng/ml的FGF2及10ng/ml的PDGFBB的StmePro-34SFM培养基组成。
Elplasia(商标)微孔板的制造步骤
Elplasia(商标)微孔板利用2个技术的组合而工业制造。一个为制作精细结构化的模具，另一个是将结构准确地从模具转印到树脂膜中。精细结构化的模具的制作从主块的准备步骤开始。发明人利用精密的金属切削加工以等间隔在金属板上雕刻了微孔。各微孔为U字底型，开口直径为约500μm，深度为400μm。为了使得接种的细胞的全部被分入各微孔，将它们以30μm间隔紧密地且配置为三角形状。在金属切削加工后，切取正方形，研磨其背面，进行改善树脂从模具的剥离的脱模处理。通过以上的步骤，制作成作为在其表面具有为微孔的反转的形状的微小的柱状体的模具的镍板。从模具到树脂膜的微孔形状的转印使用内部开发的转印成型机进行。与一般注塑成型机相比，发明人的成型机显著改善了特别是在如板的形状的高宽比的高的区域的部分中的转印精度(“高宽比”为微观结构的高度与宽度之比)。实际上，发明人的微孔(深度：400μm，间隔：30μm)具有用以往的成型机难以转印的非常高的高宽比。发明人将模具安装在成型机，将熔融的聚苯乙烯树脂涂布在模具上。通过将包括温度，冲压重量及保留时间的若干的条件进行最优化，发明人最终得到了完全转印了微孔的树脂膜。修剪后的膜被结合到没有底部的预先制作的孔板框架上，由此完成了在板的底部具有微孔阵列的Elplasia(商标)微孔板。每1em2存在约320个微孔，因此24孔形式中为每孔存在约600个微孔，6孔形式中为每孔存在约3,000个微孔，omni孔形式中每板存在约20,000个微孔。
体外成像
图3B(图3B)上所示的相位差克隆图像的获得是使用BioStation CT培养箱，显微镜，以及依照提供的指示调整使得自动对焦及细胞图像分层获得功能最优化的数码成像系统(Nikon，Tokyo，Japan)实现的。在图3B(图3B)的下方所示的荧光延时成像利用Lightsheet Z.1显微镜(Zeiss，Germany)图像化。
生物体内成像
使用1％四甲基罗丹明结合葡聚糖(MW 2,000,000)，荧光素异硫氰酸酯结合葡聚糖(MW 2,000,000)及Texas Red结合葡聚糖(70,000MW，Neutral)的尾静脉注射，鉴定了血管内腔(均来自Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)。使用静脉内注射的Alexa647结合小鼠特异性的CD31(BD)，将宿主内皮细胞进行视觉表述。对移植的血管及葡聚糖获得共聚焦图像堆栈。
基因表达分析
qRT-PCR分析如以前记载的方式进行(Takebe等.，2013)。对于微阵列，使用RNeasyMini试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)制备了总RNA。用于基因表达特征鉴定的RNA在人类全基因组Agilent 4x44K v2寡核苷酸微阵列或人类全基因组Agilent 8x60K v2寡核苷酸(Agilent Technologies，Palo Alto，CA)上依照制造商的指示进行了杂交。作为对照样品，除了上述人初代肝细胞样品以外，从Biochain Institute(Hayward，CA，USA)获取了人的FLT(10gwk或22-40gwk池胎肝组织)，ILT(0yr婴儿肝组织)及ALT(5yrs，30yrs，44yrs或55yrs年龄的成人肝组织)RNA样品。
层次聚类分析
微阵列数据使用GeneSpring标准方案处理。简而言之，低于1的信号强度被修改为1(未检测到)，然后进行75百分比移位归一化。将对复制点内的信号强度进行平均之后，将在不同的8x60k v2阵列芯片内观察到(数据未示出)的批效果以相同分化阶段的协变量利用Combat(Leek等.，2012)除去。与4x44k v2阵列的数据进行比较时，发明人为了确保除去芯片间的差异和批效果而进行了分位数标准化。为了分析全基因组的分化状态，发明人使用编码蛋白质基因的定量的表达水平进行了主要成分分析(PCA)(Le等.，2008)。对上层主要成分(PC)而言，说明了从经2-D培养的iPSC到临床被检物为止的全部的样品的分散约40％，因此发明人主要使用了PCI(图2D(图2D))。无监督的层次聚类分析使用基于Pearson的相关的距离及均值耦合方法实施。为了明确开发的特征，发明人将从http：//discovery.1ifemapsc.com/in-vivo-development/，2015/4/8使用Discovery Life MapSignature，以及来自Gene Set Enrichment Analysis(GSEA)(Subramanian等.，2005)的p值利用热图(图2H(图2H)，其比较记载在该图中)示出。除非另有说明，否则数据处理及分析使用统计软件R 3.0.1版实施。
APRES(相对富集得分的Aster plot)算法
首先，使用MSigDB 5.0版(Subramanian等.，2005)中特征的基因集合，发明人进行了人胎儿肝组织(FLT，10w)和若干的不同分化阶段的组织/细胞的比较的富集分析。基于GSEA软件计算的规范化富集得分(NES)如下转换为修饰NES(mNES)：在NES＞1的情况下，mNES为NES；如果-1＜NES＜1，则mNES为1；除此以外，mNES为1/|NES|。通过该转换，无论样品或FLT的比较中靶基因集合是否富集，都能实现NES的比较。接着，发明人使用从人成人肝细胞(AHEP 2D)与FLT的比较计算的mNES的相对大小，确定Aster Plot的各成分的宽度。对于各组织或细胞类型，将相对mNES得分除以AHEP 2D对FLT的mNES进行计算，将该得分作为Aster Plot的各分量的高度示出。最后，发明人将分量的宽度和高度相乘，加上这些并定义为总相对得分。总相对得分示于Aster Plot的中心(图4F(图4F))。
ELISA
使血液样品于室温在离心管(约5分)中凝固，从管的侧面松开，用4℃(溶解的冰)孵育20分钟。将已凝固的血液于10～15分钟，400g，4℃离心，以小心地排除红细胞或凝固的物质的方式除去血清级分。人CER1，ALB及AAT在小鼠血清样品中使用人Cerberus 1定量试剂盒(Dojin Kagaku，Kumamoto，Japan)，人白蛋白ELISA定量试剂盒(Bethyl LaboratoriesInc.，Montgomery，TX，USA)，及人alpha 1-抗胰蛋白酶ELISA定量试剂盒(GenWay Biotech，Inc.，San Diego，CA，USA)，依照制造商的指示测定。盲评研究者使用体外培养上清液或体内血清进行全部的ELISA实验。
数据和软件的有效性
关于该实施例中报告的微阵列数据的保藏号，通过NCBI GEO进行上传数据而更新。
补充文本
小型肝芽培养
选择包被材料(图5(图S1))之后，发明人首先通过实施混合比及用量依赖性测试最优化细胞培养条件。对于内皮细胞相对于全部细胞的混合方案，已经基于有效地移植后血管生成而在以前最优化了(Takebe等.，2014)。但是，间充质细胞的方案还没有确定。根据SEM分析，确认间充质细胞混合物的10％～1.4％(内胚层细胞的1/5～1/40)能够为具有再现性的LB生成(图6A(图S2A))，通过之后的基因表达分析，启示2.8％(内胚层细胞的1/20)为对于稳定的肝分化及组织形成的最有效的比例(图6B，C(图S2B，C))。接着，发明人进行了用于确定用于功能性LB生产的最小细胞数的用量减少研究(图6D-F(图S2D-F))。将依赖于细胞数的LB大小示于图6D(图S2D)。对LB大小而言，到4000个细胞(每微孔超过6000个细胞不能形成LB)之前显示了用量依赖性的增加。关于使其长期分化的LB的采用ELISA的功能筛选显示，每LB包含600个iPSC-tHE细胞(合计1130细胞)，相比于比其多的量或少的量(在每LB150-1200个的iPSC-tHE细胞的范围中)生产的人白蛋白最多(图6F(图S2F))。这一点也通过追加的肝分化标记的基因表达分析确认了(图6D，E(图S2 D、E))。
用于生成肝细胞样细胞的高效率分化方案的选择
发明人使用多个分化阶段的内胚层细胞，通过对分化的肝芽的形态及功能性的比较进行了多个“反向”筛选实验。有许多出版物报告了通过基因及蛋白质的循序添加的各自的特异性的方法来生产肝细胞样细胞。但是，几乎没有进行比较分析。首先，为了选择3个有希望的阶段性分化方案(Kajiwara等.，2012，Loh等.，2014，Si-Tayeb等.，2010)而进行了2D基础上的筛选(图8A(图S4A))。为此，通过将细胞密度、细胞因子暴露时期及基础培养基最优化而将3个主要方案修改为发明人的无饲养细胞iPSC培养之后，方案(Pr)1中的分化细胞与Pr 2及Pr 3相比，可知多潜能性标记(OCT4及NANOG)的最小限的表达，及定型内胚层(DE)及成熟肝细胞样(MH)细胞中的肝标记(FOXA2，HNF4A，ALB及AFP)的更高表达(图8B-E(图S4B-E))。利用采用ELISA的人白蛋白分泌分析确认了这些结果，可知来自Pr 1的MH的分泌为Pr 2及3的分泌的约2.5倍(数据未示出)。在扩增Wnt信号转导途径的Pr1下，在源自4个不同患者的iPSC克隆中以非常具有再现性的方式分化了有功能的肝细胞样细胞(图4F(图4F))。综上所述，早期内胚层特化中的Wnt3A暴露对在2D培养中生成功能性肝细胞样细胞有效。
采用检测CER1分泌的将来的验证
白蛋白高(良好)/低(不良)MH与原始的DE细胞的基于转录的比较启示：为了鉴定将来的验证标记，2D MH功能的更良好结果与DE特化的效率相关(数据未示出)。因此，发明人假设：成功的肝成熟，特别是在DE阶段中较大依赖于初期内胚层特化的质量。为了鉴定良好的DE标记，通过比较良好DE和不良DE(最终利用iPSC-MH功能进行区别)的全部的基因表达分布，可知良好DE具有明显高水平地表达Cerberus 1(CER1)的倾向(Iwashita等.，2013)。Cerberus 1为分泌蛋白质，是已知的定型内胚层标记，其量可以在培养上清液中通过ELISA测定。因此，发明人发现，至少在第6天的培养基中检出CER1蛋白质对第20天的最终检出ALB是必需的(图4G(图4G))。这一点启示了第6天的分泌蛋白质的量对最终分化完毕之后的肝功能的潜在必要性。
补充文献
Iwashita，H.，Shiraki，N.，Sakano，D.，Ikegami，T.，Shiga，M.，Kume，K.，andKume，S.(2013).Secreted cerberus1 as a markerfor quantification of definitiveendoderm differentiation of the pluripotent stem cells.PLoS One 8，e64291.
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[实施例2]
对于由人iPSC进行的tHE诱导分化，实施了与实施例1的人iPSC培养及tHE分化部分为相同的分化方法，但在下述方面进行了变更。
在第1阶段中，将人iPSC与10μM ROCK抑制剂Y-27632(Wako，产品目录编号253-00513)共同接种在iMatrix-511包覆平皿上，加入1％B27，将含有100ng/m1人激活蛋白A(由Ajinomoto Co.，Inc.提供)及50ng/ml Wnt3a(R&D Svstems)的RPMI-1640培养基使用6天。通过2uM CHIR99021添加3天，代替上述的50ng/ml Wnt3a(R&D Systems)，由此实现成本降低及适合无外源化及源自生物的原料标准(图13，14)。
将作为Wnt3a的代替使用CHIR99021的方案的模式图示于图13A。条件研究的结果为选择了在DE诱导分化6天内，将CHIR99021以2μM添加3天的条件。
将使用Wnt3a的以往方法和将CHIR99021以2μM添加3天的条件下的各分化阶段的细胞形态示于图13B。与使用了Wnt3a的情况相比，没有观察到形态上的不同。
将在使用Wnt3a的以往方法和将CHIR99021以2μM添加3天的条件下的DE阶段中，采用流式细胞术的作为DE标记的CXCR4阳性率分析示于图13C。与使用了Wnt3a的情况相比，CXCR4阳性率相同。
将采用定量PCR(qPCR)各分化标记的表达分析示于图13D。CHIR d3中各阶段的标记表达量与使用了Wnt3a的情况相同。
将MH阶段下的分泌白蛋白量的ELISA分析示于图13E。在多个iPSC克隆中观察到CHIR d3中的ALB分泌量与使用了Wnt3a的情况相同或更高的倾向。
在MH(图14A)及LB(图14B)中的细胞形态中，与使用Wnt3a的情况比，没有观察到形态上的差异。
将采用定量PCR(qPCR)MH及LB中的标记表达分析示于图14C。对于标记表达量和ALB分泌量，在Wnt3a和CHIR之间没有确认到显著的差异。也没有观察到肠道标记等其它细胞谱系的标记基因的表达增加。
[实施例3]
对于EC扩大培养，实施了与实施例1的人iPSC-EC及STM分化部分为相同的分化方法，但在下述方面进行了变更。
为了EC分化，将人iPSC使用Accutase解离，铺板至层粘连蛋白511E8片段(iMatrix-511(商标)，由Nippi，Inc.提供)上。培养基置换为包含Rock抑制剂的启动培养基。启动培养基由包含8μM的CHIR99021(Tocris Bioscience)和25ng/ml BMP4(R&DSystems)的B27培养基(包含1％Glutamax及1％B27(均为Life Technologies)的DMEM和F12的1∶1的混合培养基)组成。在次日置换为不包含Rock抑制剂的启动培养基。
再过3天之后，将启动培养基置换为EC诱导培养基。EC诱导培养基由补充了200ng/ml VEGF(Life Technologies)及2μM毛喉素(Sigma-Aldrich)的StemPro-34 SFM培养基(Life Technologies)组成。诱导培养基每日更换为新的。在分化的第7天将EC用0.05％胰蛋白酶解离，进行了FACS分析。源自iPSC的EC应显示伴有局部CD144及CD31接合部的典型的内皮形态。将EC在层粘连蛋白511E8片段(iMatrix-511(商标)，由Nippi，Inc.提供)上，在包含Rock抑制剂的EC扩大培养基中，以50,000细胞cm-2的密度进行再铺板。EC扩大培养基由补充了50ng/ml的VEGF-A的StemPro-34SFM组成。
次日培养基交换为Miracell(注册商标)EC(TAKARABio)，每隔1天进行交换。
由此，可以更稳定地得到高CD31/CD144共阳性细胞(图15、16)。
将源自iPSC的血管内皮细胞(iPSC-EC)的诱导分化方案修改版示于图15。
将诱导分化方案的模式图示于图16A中。
将以往方法及修改方法的细胞形态示于图16B。没有观察到形态上的不同。
将以往方法及修改方法的采用流式细胞术的EC标记阳性率的分析示于图16C。
将图16C的流式细胞术分析的汇总示于图16D。与以往方法相比，在修改方法中可稳定地实现更高的CD31/CD144阳性率。
将采用定量PCR(qPCR)各分化标记的表达分析示于图16E。即使经过传代，EC标记表达量也稳定。
将每次传代的细胞增殖示于图16F。修改方法与以往方法相比，在传代之后的增殖潜能更高。
根据以上内容可见，即使EC在P0时的阳性率不稳定，也能够通过再接种而制备稳定的EC。EC完成之后的增殖获得成功。
将本说明书中引用的全部出版物、专利和专利申请全文作为参考并入本说明书中。
工业实用性
本发明可以用于再生医疗、新药筛选中。

Claims (38)

1.器官芽，其由血管细胞、间充质细胞、及组织或器官细胞制作，其中所述血管细胞、间充质细胞、及组织或器官细胞分别为由多潜能干细胞诱导的细胞。
2.根据权利要求1所述的器官芽，其中，器官芽为能够通过成熟而分化为器官的结构体。
3.根据权利要求1或2所述的器官芽，其中，多潜能干细胞源自人。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的器官芽，其中，多潜能干细胞为选自人工多潜能干细胞及胚胎干细胞中的至少1种的细胞。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的器官芽，其中，器官细胞为肝细胞，器官芽为肝芽。
6.根据权利要求5所述的器官芽，其中，肝细胞为TBX3阳性及ADRA1B阳性。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的器官芽，其中，间充质细胞为CD166阳性及CD31阴性。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的器官芽，其中，间充质细胞为LHX2阳性及WT1阳性。
9.根据权利要求8所述的器官芽，其中，间充质细胞的FOXF1，HLX1、COL4A及ALCAM的转录活化，间充质细胞为LHX2阳性、WT1阳性及MIIA阳性。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的器官芽，其中，血管细胞为CD31阳性及CD144阳性。
11.根据权利要求10所述的器官芽，其中，血管细胞的选自PECAM1、CDH5、KDR及CD34中的至少1个基因的表达高于诱导分化前的多潜能干细胞。
12.根据权利要求1～11中任一项所述的器官芽，其中，将经过下述步骤得到的细胞在FGF及属于TGFβ超家族因子的存在下培养、诱导分化的TBX3阳性及ADRA1B阳性的细胞用作组织或器官细胞，所述步骤为将多潜能干细胞在ROCK抑制剂的存在下培养之后，在属于转化生长因子β家族的因子，属于Wnt家族的因子及I类组蛋白脱乙酰化酶(HDAC)抑制剂的存在下培养，并进一步在属于转化生长因子β家族的因子及属于Wnt家族的因子的存在下培养。
13.根据权利要求1～11中任一项所述的器官芽，其中，将经过下述步骤得到的细胞在FGF及属于TGFβ超家族因子的存在下培养、诱导分化的TBX3阳性及ADRA1B阳性的细胞用作组织或器官细胞，所述步骤为将多潜能干细胞在ROCK抑制剂的存在下培养之后，在β连环蛋白活化剂，PI3K抑制剂及属于转化生长因子β家族的因子的存在下培养，并进一步在属于转化生长因子β家族的因子及BMP抑制剂的存在下培养。
14.根据权利要求1～11中任一项所述的器官芽，其中，将经过下述步骤得到的细胞在FGF及属于TGFβ超家族因子的存在下培养、诱导分化的TBX3阳性及ADRA1B阳性的细胞用作组织或器官细胞，所述步骤为将多潜能干细胞在ROCK抑制剂的存在下培养之后，在属于转化生长因子β家族的因子的存在下培养。
15.根据权利要求1～12中任一项所述的器官芽，其中，将经过下述步骤得到的细胞在FGF及属于TGFβ超家族因子的存在下培养、诱导分化的TBX3阳性及ADRA1B阳性的细胞用作组织或器官细胞，所述步骤为将多潜能干细胞在ROCK抑制剂的存在下培养之后，在属于转化生长因子β家族的因子及β连环蛋白活化剂的存在下培养，并进一步在属于转化生长因子β家族的因子的存在下培养。
16.根据权利要求1～15中任一项所述的器官芽，其中，将经过下述步骤得到的LHX2阳性及WT1阳性的细胞用作间充质细胞，所述步骤为将多潜能干细胞在β连环蛋白活化剂及属于TGFβ超家族的因子的存在下培养之后，在PDGF受体活化剂及属于转化生长因子β家族的因子的存在下培养，并进一步在FGF的存在下培养。
17.根据权利要求1～15中任一项所述的器官芽，其中，将经过下述步骤得到的CD166阳性及CD31阴性的细胞用作间充质细胞，所述步骤为将多潜能干细胞在β连环蛋白活化剂及属于TGFβ超家族的因子的存在下培养之后，在PDGF受体活化剂及属于转化生长因子β家族的因子的存在下培养，并进一步在FGF的存在下培养，之后，利用间充质细胞培养基进行维持培养。
18.根据权利要求1～17中任一项所述的器官芽，其中，将经过下述步骤得到的CD31阳性及CD144阳性的细胞用作血管细胞，所述步骤为将多潜能干细胞在ROCK抑制剂的存在下培养之后，在β连环蛋白活化剂及属于TGFβ超家族的因子的存在下培养，并进一步在血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)活化剂及腺苷酸环化酶活化剂的存在下培养。
19.根据权利要求1～17中任一项所述的器官芽，其中，将经过下述步骤得到的CD31阳性及CD144阳性的细胞用作血管细胞，所述步骤为将多潜能干细胞在ROCK抑制剂的存在下培养之后，在血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)活化剂，属于转化生长因子β家族的因子，β连环蛋白活化剂及属于TGFβ超家族的因子的存在下培养，并进一步在血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)活化剂及TGF-β的I型受体的抑制剂的存在下培养。
20.根据权利要求1～17中任一项所述的器官芽，其中，将经过下述步骤得到的CD31阳性及CD144阳性的细胞用作血管细胞，所述步骤为将多潜能干细胞在ROCK抑制剂的存在下培养之后，在属于转化生长因子β家族的因子的存在下培养，并进一步在FGF及属于TGFβ超家族因子的存在下培养，之后，在血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)活化剂的存在下培养。
21.根据权利要求1～17中任一项所述的器官芽，其中，将经过下述步骤得到的CD31阳性及CD144阳性的细胞用作血管细胞，所述步骤为将多潜能干细胞在ROCK抑制剂的存在下培养之后，在属于TGFβ超家族的因子的存在下培养，并进一步在属于TGFβ超家族的因子，血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)活化剂及FGF的存在下培养。
22.器官芽的制作方法，包括将血管细胞、间充质细胞、及组织或器官细胞在体外培养，其中所述血管细胞、间充质细胞、及组织或器官细胞分别为由多潜能干细胞诱导的细胞。
23.根据权利要求22所述的方法，其中不使用构架材料而对细胞进行培养。
24.组织或器官的制作方法，包括将权利要求1～21中任一项所述的器官芽移植至非人动物中，使其分化为组织或器官。
25.器官芽的移植方法，包括将权利要求1～21中任一项所述的器官芽移植至人或非人动物中。
26.组织或器官的再生或功能恢复方法，包括权利要求1～21中任一项所述的器官芽移植至人或非人动物中，使其分化为组织或器官。
27.非人嵌合动物的制作方法，包括将权利要求1～21中任一项所述的器官芽移植至非人动物中，使其分化为组织或器官。
28.评价药品的方法，包括使用选自权利要求1～21中任一项所述的器官芽，权利要求24所述的方法制作的组织及器官，以及权利要求27所述的方法制作的非人嵌合动物中的至少一个。
29.制作TBX3阳性及ADRA1B阳性的细胞的方法，包括将经过下述步骤得到的细胞在FGF及属于TGFβ超家族因子的存在下培养，诱导分化为TBX3阳性及ADRA1B阳性的细胞，所述步骤为将多潜能干细胞在ROCK抑制剂的存在下培养之后，在属于转化生长因子β家族的因子，属于Wnt家族的因子及I类组蛋白脱乙酰化酶(HDAC)抑制剂的存在下培养，并进一步在属于转化生长因子β家族的因子及属于Wnt家族的因子的存在下培养。
30.制作TBX3阳性及ADRA1B阳性的细胞的方法，包括将经过下述步骤得到的细胞在FGF及属于TGFβ超家族因子的存在下培养，诱导分化为TBX3阳性及ADRA1B阳性的细胞，所述步骤为将多潜能干细胞在ROCK抑制剂的存在下培养之后，在β连环蛋白活化剂，PI3K抑制剂及属于转化生长因子β家族的因子的存在下培养，并进一步在属于转化生长因子β家族的因子及BMP抑制剂的存在下培养。
31.制作TBX3阳性及ADRA1B阳性的细胞的方法，包括将经过下述步骤得到的细胞在FGF及属于TGFβ超家族因子的存在下培养，诱导分化为TBX3阳性及ADRA1B阳性的细胞，所述步骤为将多潜能干细胞在ROCK抑制剂的存在下培养之后，在属于转化生长因子β家族的因子的存在下培养。
32.制作TBX3阳性及ADRA1B阳性的细胞的方法，包括将经过下述步骤得到的细胞在FGF及属于TGFβ超家族因子的存在下培养，诱导分化为TBX3阳性及ADRA1B阳性的细胞，所述步骤为将多潜能干细胞在ROCK抑制剂的存在下培养之后，在属于转化生长因子β家族的因子及β连环蛋白活化剂的存在下培养，并进一步在属于转化生长因子β家族的因子的存在下培养。
33.制作LHX2阳性及WT1阳性的细胞的方法，包括将多潜能干细胞在β连环蛋白活化剂及属于TGFβ超家族的因子的存在下培养之后，在PDGF受体活化剂及属于转化生长因子β家族的因子的存在下培养，并进一步在FGF的存在下培养。
34.制作CD166阳性及CD31阴性的细胞的方法，包括将多潜能干细胞在β连环蛋白活化剂及属于TGFβ超家族的因子的存在下培养之后，在PDGF受体活化剂及属于转化生长因子β家族的因子的存在下培养，并进一步在FGF的存在下培养，之后，利用间充质细胞培养基进行维持培养。
35.制作CD31阳性及CD144阳性的细胞的方法，包括将多潜能干细胞在ROCK抑制剂的存在下培养之后，在β连环蛋白活化剂及属于TGFβ超家族的因子的存在下培养，并进一步在血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)活化剂及腺苷酸环化酶活化剂的存在下培养。
36.制作CD31阳性及CD144阳性的细胞的方法，包括将多潜能干细胞在ROCK抑制剂的存在下培养之后，在血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)活化剂，属于转化生长因子β家族的因子，β连环蛋白活化剂及属于TGFβ超家族的因子的存在下培养，并进一步在血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)活化剂及TGF-β的I型受体的抑制剂的存在下培养。
37.制作CD31阳性及CD144阳性的细胞的方法，包括将多潜能干细胞在ROCK抑制剂的存在下培养之后，在属于转化生长因子β家族的因子的存在下培养，并进一步在FGF及属于TGFβ超家族因子的存在下培养，之后，在血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)活化剂的存在下培养。
38.制作CD31阳性及CD144阳性的细胞的方法，包括将多潜能干细胞在ROCK抑制剂的存在下培养之后，在属于TGFβ超家族的因子的存在下培养，并进一步在属于TGFβ超家族的因子，血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)活化剂及FGF的存在下培养。
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