CN106029872A - 使诱导性多能干细胞分化成肾近端小管细胞样细胞的方法 - Google Patents

Abstract

提供了一种使诱导性多能干细胞(iPSC)分化成肾近端小管细胞(PTC)样细胞的方法。所述方法包括在足以诱导iPSC分化成PTC样细胞的条件下，在存在一种或更多种细胞外基质(ECM)分子、骨形态形成性蛋白2(BMP2)和骨形态形成性蛋白7(BMP7)的肾上皮细胞培养介质中，培养未分化的iPSC，持续约8天至约10天的时间。还提供了一种分化的PTC样细胞的细胞群，以及使用所述细胞群的用途和方法。

Description

使诱导性多能干细胞分化成肾近端小管细胞样细胞的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2013年11月11日提交的新加坡临时申请第201308341-5号的权益和优先权，其内容据此通过引用并入本文。

技术领域

本发明涉及一种通过诱导性多能干细胞的分化产生肾近端小管细胞样细胞的方法。

背景技术

肾上皮细胞在治疗肾病中是有用的。这包括在人工生物肾脏装置更换或补偿失去的器官功能中的应用。因此，需要肾上皮细胞的充足供应。特别感兴趣的是肾近端小管细胞(PTC)，其执行多种肾功能。

肾近端小管细胞在药物转运和代谢中起作用，且因此在体外肾脏毒理学中也是特别感兴趣的。这种细胞类型是在肾脏中药物诱导的毒性的主要的靶标。许多广泛使用的市售药物，包括抗癌药物、抗生素、免疫抑制剂和造影剂往往是肾毒性的，且因此可能损伤肾脏中近端小管细胞。药物诱导的肾毒性是急性肾损伤(AKI)的主要原因。

尽管如此，在药物开发期间预测肾毒性仍然是困难的。典型地，化合物肾毒性仅在药物开发的后期检测。临床前的动物模型的预测成功有限；开发证实具有强预测性的用于测定肾毒性的体外模型是具有挑战性的。大多数现有的体外测定系统基于已建立的细胞系。仅可获得有限量的原代肾近端小管细胞，并且受供体间变化性和体外培养以及传代期间的功能变化影响。

以前的技术描述了一种用于使人胚胎干细胞(hESC)分化成表达水通道蛋白(AQP)-1的细胞的方法。在肾脏中，AQP-1在近端小管细胞中特异地表达。约30％的hESC衍生细胞表达AQP-1，并且近一步分析显示，关于基因和蛋白表达模式以及形态和功能特征，hESC衍生细胞与在体外培养的人原代肾近端小管细胞(HPTC)相似。基于hESC的技术受伦理及相关法律问题的影响，这可能限制(compromise)商业化。hESC衍生的HPTC样细胞的相对低的比率(30％)也是一个问题，并且为了使这种HPTC样细胞在任何实际应用中是有用的，需要纯化步骤。进一步的，hESC衍生的细胞以很低的水平表达一些主要的药物转运蛋白，如有机阴离子转运蛋白(OAT)3，其可能限制这种细胞在体外肾脏毒理学中的应用。

发明内容

本发明涉及使用诱导性多能干细胞(iPSC)(包括人iPSC(hiPSC))产生肾近端小管细胞(PTC)样细胞(包括人原代肾近端小管细胞(HPTC)样细胞)。

在一些实施方案中，通过该方法产生的分化的细胞群中，约90％或更高的细胞被分化成PTC样细胞。

如此高纯度的分化细胞类型意味着在一些应用中细胞群可被直接使用，无需进一步的加工、收集、纯化或分选。

因此，该方法提供了一种用于产生PTC样细胞(包括HPTC样细胞)群的快速的、一步的方法，这种方法可在多种应用中使用，例如体外毒理学测定以预测PTC毒性，包括在药物开发研究期间。这种体外研究可使用机器学习算法，并且因此可获得关于PTC毒性预测的高度准确的结果。

在一个方面，本发明提供了一种使诱导性多能干细胞(iPSC)分化成肾近端小管细胞(PTC)样细胞的方法，该方法包括：在足以诱导iPSC分化成PTC样细胞的条件下，在存在一种或更多种细胞外基质(ECM)分子、骨形态形成性蛋白2(BMP2)和骨形态形成性蛋白7(BMP7)的肾上皮细胞培养介质中，培养未分化的iPSC持续约8天至约10天的时间。

所述iPSC可以是任何类型的iPSC，包括哺乳动物iPSC或人iPSC。

在培养前，所述iPSC初始被接种在存在ROCK抑制剂且不存在BMP2和BMP7中。所述iPSC可以以约5000至约10000活细胞/cm²、或者约8000活细胞/cm²的初始密度接种。

在一些实施方案中，所述一种或更多种ECM分子包括基质胶基质(Matrigelmatrix)，包括低生长因子(growth factor reduced)的基质胶基质。

肾上皮细胞培养介质包括肾上皮细胞生长介质。

在iPSC的初始接种后约12至约24小时，添加BMP2和BMP7至肾上皮细胞培养介质。在培养期间，BMP2以约1ng/ml至约25ng/ml、或者约2.5ng/ml至约15ng/ml的浓度存在。在培养期间，BMP7以约0.25ng/ml至约10ng/ml、或者约1ng/ml至约5ng/ml的浓度存在。

在一些实施方案中，所述iPSC是人iPSC，并且所述方法包括以约8000活细胞/cm²的密度接种未分化的iPSC至肾上皮细胞生长介质(无BMP2和BMP7，且包含约5μM至约15μMROCK抑制剂)中，持续约12小时至约24小时，以允许未分化的iPSC附着至包被有低生长因子的基质胶基质的培养支持物上；更换肾上皮细胞生长介质为无ROCK抑制剂、且包含约2.5ng/ml至约15ng/ml的BMP2和约1ng/ml至约5ng/ml的BMP7的新鲜的肾上皮细胞生长介质；在足以诱导iPSC分化成PTC样细胞的条件下，在约37℃的温度和在约5％的CO₂中，在包含BMP2和BMP7的肾上皮细胞生长介质中培养iPSC持续约8至约10天的时间。

在另一方面，本发明提供了一种PTC样细胞群，其分化自诱导性多能干细胞(iPSC)群，所述诱导性多能干细胞(iPSC)以约5000至约10000活细胞/cm²的密度接种在肾上皮细胞培养介质中持续约7天至约10天的时间，其中所述的肾上皮细胞培养介质存在一种或更多种细胞外基质分子、骨形态形成性蛋白2和骨形态形成性蛋白7。

所述细胞群以与本发明的方法一致的方法制备。

在一些实施方案中，在细胞群中，约90％或以上的细胞表达AQP1、PEPT1、OAT3和GLUT1。

在一些实施方案中，细胞群被包含在人工生物肾脏装置的中空纤维生物反应器中、水凝胶中、或生物工程化的接枝物中。

因此，在另一方面，本发明提供了一种生物工程化的组织接枝物，其包含接种有本发明的细胞群的基质。所述基质可以是脱细胞化的(decellularized)基质或者可以是3D肾基质。

在另一方面，本发明提供了一种用于筛选化合物的肾毒性的体外方法，该方法包括：使测试化合物与本发明的测试细胞群接触；以及与没有与测试化合物接触的对照细胞群比较，确定测试化合物的作用。

可以评估测试群关于测试化合物对细胞活力(viability)、细胞数量、标记物基因的表达、细胞形态学、细胞骨架成分的排列、细胞因子的易位、ATP耗竭、线粒体损伤、谷胱甘肽(GSH)耗竭、膜损伤、活性氧的产生或DNA损伤的作用。

在本方法的一些实施方案中，测试细胞群可以根据本发明的方法被制备，并且在约8天至约10天的分化后对测试群进行接触，在接触前不经收集。

在另一方面，本发明提供了一种制备人工生物肾脏装置的方法，所述方法包括以本发明的细胞群接种装置。

在另一方面，本发明提供了一种在受试者中治疗肾相关疾病的方法，所述方法包括外部连接含有本发明的细胞群的人工生物肾脏装置。

在另一方面，本发明提供了使用含有本发明的细胞群的人工生物肾脏装置用于治疗有需要的受试者中的肾相关疾病。

在另一方面，本发明提供了本发明的细胞群在制造用于治疗有需要的受试者中肾相关疾病的人工生物肾脏装置中的用途。

在另一方面，本发明提供了一种含有本发明的细胞群的人工生物肾脏装置，其用于治疗有需要的受试者中的肾相关疾病。

在另一方面，本发明提供了一种治疗有需要的受试者中的肾相关疾病的方法，所述方法包含移植有效量的本发明的细胞群、或者本发明的生物工程化的组织接枝物至受试者需要PTC样细胞的部位。

在另一方面，本发明提供了本发明的有效量的细胞群、或者本发明的生物工程化的组织接枝物用于治疗有需要的受试者中的肾相关疾病的用途。

在另一方面，本发明提供了有效量的细胞群在制造用于治疗有需要的受试者中的肾相关疾病的本发明的生物工程化的组织接枝物中的用途。

在另一方面，本发明提供了有效量的本发明的细胞群、或本发明的生物工程化的组织接枝物，用于治疗有需要的受试者中的肾相关疾病。

在所述方法和所述用途的一些实施方案中，肾相关疾病包含急性肾损伤、慢性肾脏疾病、终末期肾疾病、肾病(nephropathy)、糖尿病肾病、肾病变(nephrosis)、布赖特氏病(Bright’s disease)、肾功能不全、肾小球炎、肾小球硬化、或肾炎。

结合附图，在回顾本发明的具体实施方案的下列描述后，对于本领域普通技术人员来说，本发明的其它方面和特征将变得明显。

在附图中只通过示例说明本发明的实施方案，附图如下：

附图说明

图1：描述分化方法的步骤与之后药物测试的一种实施方案的流程图。

图2：药物处理对hiPSC衍生HPTC样细胞的数量的影响。

图3：在分化期间iPS(包皮)-4衍生细胞的标记物表达模式的变化。

图4：iPS IMR90-4衍生细胞和iPS DF19-9-11T.H衍生细胞的标记物蛋白表达。

图5：通过免疫染色和FACS表征hiPSC衍生第8天的细胞。

图6：表征iPS(包皮)-4衍生第8天的细胞。

图7：hiPSC衍生细胞的GGT活性和OCT2活性。

图8：转运蛋白介导的药物摄取和药物诱导的IL6和IL8的表达。

图9：hiPSC衍生细胞中标记物表达。

图10：预测HPTC和iPSC衍生HPTC样细胞的性能。

具体实施方式

本发明涉及使iPSC分化成肾近端小管细胞(PTC)样细胞(包括使hiPSC分化成HPTC样细胞)的分化方法、通过该分化方法制备的细胞群、以及使用该细胞群的方法和该细胞群的用途。

以前，已经开发了使人或鼠胚胎干细胞(ESC)或诱导性多能干细胞(iPSC)分化成肾系(renal lineage)的多种方法。这些以前的方法中的一些旨在重现(recapitulate)胚胎肾发育并涉及具有多步骤的间接分化，以模拟不同的阶段。这种方法产生胚胎肾前体，并且典型地得到不同肾细胞类型的混合物。尽管该结果对再生医学中的应用中是令人关注的，但是药物筛选的适用性是有限的。还没有建立基于这些方法的药物毒性应用。

此外，以前已经描述了非多步骤的基于hESC的方法(Narayanan等人,KidneyInt.,2013)。通过Narayanan等人的方法获得的HPTC样细胞已经被用于体外毒理学测定(Li等人,Mol.Pharm.,2014)。

尽管以前人胚胎干细胞(hESC)已被分化成表达AQP-1的细胞，但是胚胎干细胞的使用是有争议的。然而，人iPSC不受如hESC面对的同样的伦理和法律问题的影响。因此，衍生自hiPSC的肾上皮细胞的潜在应用包括药物筛选和体外毒理学。

在本发明之前，没有可靠的、具有良好特性的用于从iPSC获得PTC样细胞的方法。如本文所述，现在获得了这些方法和细胞。已发现本发明的PTC样细胞具有很多PTC的特征，并且在可以使用PTC的应用中是有用的，包括肾毒性测定和在用于肾缺陷和疾病的治疗应用，包括人工生物肾脏装置。

本方法涉及使iPSC直接分化成PTC样细胞，意味着分化发生在PTC样细胞中，不存在胚状体(EB)的形成。EB是细胞的集合，其能促进比得上胚胎的分化，且因此可含有来自所有三个胚层(外胚层、中胚层和内胚层)的细胞。在间接分化中，ES细胞首先聚集形成EB而后使EB暴露在促进分化成肾祖细胞的条件中。因为EB的形成导致多种细胞类型的形成，所以使用EB的间接分化导致分化的细胞的异质群和肾祖细胞的产量低。因此，本方法允许相对一致的细胞环境和更多的分化的细胞的同质群，且因此可能提供比涉及EB形成的方法更高的PTC样细胞的产量。

简略地，根据本分化方法获得的PTC样细胞是这样一种细胞，即从iPSC直接分化而来，并且表达一种或更多种肾特异性的或PTC特异性的细胞标记物。因此，在该方法中获得的PTC样细胞是“衍生自”或“分化自”iPSC。肾特异性的或PTC特异性的细胞标记物包括在PTC(包括HPTC)中表达、并且在iPSC(包括人iPSC)中不表达或较少程度表达的细胞基因或蛋白。可以使用这种标记物作为特定的细胞已从iPSC细胞分化成PTC样细胞的指示。这种标记物包括：例如VIT D3、SLC34A1、NBC1、Na⁺/K⁺ATP酶、KSP-CAD、AQP1、GGT、CD13、OAT1、MEG、OAT3、OCT2、OCTN2、PEPT1、GLUT1、GLUT5、SGLT1、SGLT2、URO-10或ZO-1(基因和蛋白全称参见表1)。在一些实施方案中，在所述方法中衍生自iPSC的PTC样细胞表达OAT3。在一些实施方案中，在所述方法中衍生自iPSC的PTC样细胞可表达AQP1、PEPT1、OAT3和GLUT1。在一些实施方案中，在所述方法中衍生自iPSC的PTC样细胞可表达Na⁺/K⁺ATP酶、AQP1、PEPT1、OAT3、SGLT2、URO10、ZO-1和GLUT1。基底外侧(Baso-lateral)药物摄取转运蛋白OAT1、OAT3和OCT2可以在iPSC衍生的PTC样细胞中表达。主要的磷酸盐摄取转运蛋白SLC34A1可以在iPSC衍生的PTC样细胞中表达。

因此，提供了使iPSC分化成PTC样细胞的方法。本文中描述的方法是一种直接分化的方法，并且在一些实施方案中，其可以被用作一种快速、一步的方法。换言之，在一些应用例如体外毒性测定中，在分化期的完成后可以立即使用分化的细胞群，不需要进一步的细胞收集或细胞分选。

因此，所述方法涉及使诱导性多能干细胞(iPSC)分化成肾近端小管细胞(PTC)样细胞。简略地，所述方法包含在足以诱导iPSC分化成PTC样细胞的条件下，在存在骨形态形成性蛋白2和骨形态形成性蛋白7的肾上皮细胞培养介质中培养未分化的iPSC，持续约8至约10天的时间。

在上下文允许时，如本文所使用的术语“细胞”(包括当iPSC或PTC样细胞的情况中所使用的)旨在指单细胞以及多细胞或细胞群。相似地，在上下文允许时，术语“细胞”还旨在指单细胞。所述细胞可以是分批培养或在组织培养板中生长的细胞，并且可以是在悬浮液中或可以附着在培养支持物表面。

如本文所使用的iPSC是从非多能起源细胞经诱导为多能状态的多能干细胞，例如部分或者完全分化的细胞，通过暴露于合适的条件和转录因子或者其它在多能细胞中调节基因的表达谱的蛋白因子(例如Sox2、Oct4、c-Myc和Klf4)，从而能够被诱导成为多能。已知诱导多能性的方法，例如在Takahashi和Yamanaka,Cell 126(2006),663-676中描述的。因此，iPSC是一种多能细胞，其衍生自非多能起源细胞，并且不是一种胚胎干细胞。

诱导性多能干细胞、或iPSC可以是任何类型的iPSC，包括动物iPSC，包括哺乳动物iPSC，包括人iPSC。iPSC可以来自已建立的iPSC培养或来源，例如市售的iPSC来源。人iPSC可以衍生自正常受试者或患者。患者患有肾疾病或者对药物作用敏感，包括药物不良反应。人iPSC还可以衍生自这种患者的亲属。特别是用于在本文描述的方法中使用，包括使用前不久或使用前立即将iPSC从非多能细胞诱导成多能，或者在本文描述的分化方法中使用之前，在培养中存储或维持一段时间。

在接种用于分化之前，iPSC可在未分化状态中维持或增殖。一般地，培养iPSC以维持细胞在未分化状态的方法是已知的，并且因此使用已知的用于iPSC的方法，可以将iPSC维持在未分化的状态。iPSC可以在不诱导分化的合适的介质中维持，例如在mTesR1介质中。一般地，mTeSR1是一种确定成分的(defined)介质，其能够用于hESC和iPSC的无饲养培养。在一些实施方案中，mTeSR1含有牛血清白蛋白、rh bFGF、rh TGFβ、氯化锂、哌啶酸和GABA。尽管mTeSR1确定成分的介质可以是市售的，该介质是已知的并且方法是可获得的，允许技术人员使用常规的实验室方法很容易制备mTeSR1。(Ludwig等人,Nature Methods,2006a,3:637-646；Ludwig等人,Nature Biotechnology,2006b,24:185-187.)在分化方法中使用之前，其它不诱导干细胞分化的介质也可以被用于维持或增殖iPSC。

为了分化iPSC，未分化的iPSC被接种到合适的器皿的培养表面上，例如组织培养板。细胞可以以合适的密度接种，例如，以足以分裂并形成汇合的单层，或几乎汇合的单层的密度，例如通过约6天至约10天的分化，或者通过约6天或约7天的分化，约80％至约90％的汇合度。例如，iPSC可以以约5000活细胞/cm²至约10000活细胞/cm²、或者以约7000活细胞/cm²至约9000活细胞/cm²、或约8000活细胞/cm²的密度接种。

当悬浮接种时，iPSC可以包括Rho激酶(ROCK)抑制剂(Y-27632,Calbiochem,Merck,达姆施塔特,德国)。例如，在分化前接种iPSC时，iPSC的悬浮液中可以包括约1μM至约25μM、约5μM至约15μM、或约10μM ROCK抑制剂。当接种多能干细胞的单细胞悬浮液时，ROCK抑制剂可以改善iPSC的存活。

为了诱导分化，使用肾上皮细胞培养介质培养未分化的iPSC用于分化。肾上皮细胞培养介质可以是旨在支持肾上皮细胞的生长的任何生长介质，并且其含有维持肾上皮细胞的附着、生长和增殖所需的营养和因子。肾上皮细胞培养介质可含有选择的基本因子以允许肾细胞(例如PTC)培养的扩增和存活，例如胎牛血清(FCS)、生长因子例如表皮生长因子(EGF)、胰岛素、氢化可的松、肾上腺素、以及三碘甲状腺原氨酸(T3)和转铁蛋白。

肾上皮细胞培养介质是已知的，并且是市售的，包括肾上皮细胞基础介质(REBM)和肾上皮细胞生长介质(REGM BulletKit,购自Lonza Bioscience,新加坡)。

例如，可以使用Lonza Bioscience REGM^TM BulletKit^TM(CC-3190)，其包括添加有0.5ml hEGF；0.5ml氢化可的松；0.5ml肾上腺素；0.5ml胰岛素；0.5ml三碘甲状腺原氨酸；0.5ml转铁蛋白；0.5ml GA-1000；和2.5ml FBS的500ml肾上皮细胞基础介质。

例如，可以使用ATCC肾上皮细胞生长试剂盒(ATCC PCS-400-040)，其包括肾上皮细胞基础介质，所述肾上皮细胞基础介质中添加有：1.00μM肾上腺素、10ng/ml重组hEGF、5μg/ml重组人胰岛素、10nM三碘甲状腺原氨酸、100ng/ml氢化可的松琥珀酸酯(hydrocortisone hemosuccinate)、2.4mM L-Ala-L-Gln、和5μg/ml转铁蛋白。

除肾上皮细胞培养介质之外，为了诱导未分化的iPSC分化成PTC样细胞，在生长条件中包括细胞外基质(ECM)分子。

因此，将iPSC接种于包被有一种或更多种ECM分子的培养表面上，用以模拟上皮基底膜。一种或更多种ECM分子的每一种可以是在肾上皮细胞培养介质中支持iPSC生长和分化的任何ECM分子。例如，ECM分子可为纤连蛋白、层粘连蛋白、IV型胶原或MATRIGEL^TM(BDBiosciences)。MATRIGEL^TM基质是从EHS小鼠肉瘤中提取的溶解的基底膜制品，并且包含多种基底膜成分和已知促进上皮组织建立的结合型生长因子，包括层粘连蛋白、IV型胶原、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和巢蛋白。在一些实施方案中，ECM分子是MATRIGEL^TM基质，包括低生长因子的MATRIGEL^TM基质。

在添加一种或更多种ECM分子至培养表面之前，可以使用肾上皮细胞培养介质(例如REBM)稀释ECM分子。例如，在包被在培养表面上之前，稀释ECM分子约10倍至约50倍。ECM分子可以使用冷的(例如冰冷的)肾上皮细胞培养介质稀释。

使接种的iPSC附着在包被的培养表面。附着之后，更换肾上皮细胞培养介质为新鲜的介质，例如在接种后约12至约24小时，或者在接种后约12至约16小时，或者在接种后约16小时。一旦细胞附着，新鲜的介质则不含ROCK抑制剂。

此外，在iPSC附着至包被ECM分子的培养表面之后，添加新鲜的肾上皮细胞培养介质，其添加有：骨形态形成性蛋白BMP2和BMP7。BMP2和BMP7在引导iPSC分化成PTC样细胞类型中起作用，且因此在分化方法中，可提高获得的PTC样细胞的数量。

例如，培养介质中可以包括约1ng/ml至约25ng/ml、或约2.5ng/ml至约15ng/ml、或约10ng/ml的BMP2。

例如，培养介质中可以包括约0.25ng/ml至约10ng/ml、或约1ng/ml至约5ng/ml、或约2.5ng/ml的BMP7。

在存在ECM分子的肾上皮细胞培养介质中、并且在足以诱导培养中存在的至少一些iPSC分化成PTC样细胞的温度和生长条件下，iPSC生长约8至约10天的时间。例如，对于人iPSC，细胞可以在37℃，在5％CO₂中分化。在分化期期间，细胞应附着在已包被有一种或更多种ECM分子的培养表面，并且应最终扩增和增殖形成约80％至约100％汇合的单层。

一经接种用于分化，为了获得分化的PTC样细胞而培养iPSC，没有进一步传代。换言之，理想地，分化期结束之前或结束时，培养应是约80％至约100％汇合，或约90％至约100％汇合。例如，通过6天或7天的分化，培养可以是约80％至约100％汇合。在没有限定到任何理论的情况下，汇合或接近汇合涉及促进分化。

尽管在分化期，培养没有进一步传代，在整个分化期中，肾上皮细胞培养介质可以被更换为新鲜的介质。例如每天或每隔一天更换介质。如上所述，新鲜的介质包括BMP2和BMP7。

应当理解用于分化期所使用的精确条件取决于获得iPSC的生物体。例如，对于人iPSC，在分化期期间，细胞可以被培养长达10天，例如在37℃、含有2-10％CO₂、或5％CO₂中8-10天。

第0天计数接种的初始iPSC。添加有BMP2和BMP7的介质的添加为分化的第1天。分化期的结束是约第8天至约第10天。汇合或接近汇合应在分化期的结束之前获得，例如约第6天至约第8天，或约第6天至约第7天。

如以上所述，随着iPSC群经历分化，在培养中细胞将表达PTC特异性标记物。

当使用hiPSC时，特别注意的是，根据本描述的方法从hiPSC获得的HPTC样细胞中观察到OAT3相对高的表达水平。该蛋白是肾近端小管细胞中主要的药物转运蛋白之一，并且该蛋白对体外肾毒性研究是重要的。

在人PTC中OAT3在体内表达，但是在体外HPTC中其通常以明显较低的水平表达，并且目前没有任何已知的方法用以在体外培养的这种原代细胞中增强OAT3表达，达到与在体内表达水平相似的水平。OAT3在第20天的hESC衍生的HPTC样细胞中同样仅以十分低的水平表达。

在所述方法中，分化期的持续时间显得重要，并且影响最终获得的分化细胞的特性。换言之，鉴于使用以前描述的方法从hESC衍生的HPTC样细胞在分化直至第20天被收集，对于通过本发明描述的方法获得的人iPSC衍生的HPTC样细胞在分化约第8-10天显示HPTC样表型。

如果分化期太短，细胞仍没有分化，并且将不是PTC样。另一方面，如果细胞的分化期进行太长，细胞可能开始经历转分化，显示PTC标记物的表达降低，例如包括OAT3，并且其它的非PTC标记物的表达增加，例如成肌纤维细胞标记物(例如α-平滑肌肌动蛋白(alphaSMA)。典型地，单层被破坏，伴随一些细胞形成集合，并且甚至形成小管样结构。

使用人iPSC时，已经观察到在超过分化的约第8-10天之后，iPSC衍生的培养趋向于显示PTC特异性标记物的表达降低，显示间充质标记物的表达增加，并且细胞开始以递增的水平表达成肌纤维细胞标记物αSMA。应注意的是，在体外条件下，HPTC样细胞以及HPTC总是一定程度上表达αSMA和间充质标记物。在第10天后，间充质的标记物和αSMA的表达的提高与上皮至间充质的转变和转分化为成肌纤维细胞样细胞相一致。与PTC相比，当转分化为成肌纤维细胞样细胞时，细胞经历若干转变阶段。具有显著的成肌纤维细胞样表型的细胞仅低水平表达PTC特异性标记物，这种细胞对于需要PTC的应用是没有用的。同样地，转分化为成肌纤维细胞样细胞的细胞趋向于形成集合，其随后破坏与小管形成的过程中有关的单层(例如在第14天)。这种结构将不与如例如人工生物肾脏或者药物测试中高内涵筛选的应用相兼容。

换言之，在约第8天之后，群可以显示大比例(例如约90％或更高)的表达典型的PTC细胞标记物的细胞。标记物表达在大约第8-10天最优，并且在该时间点之后迅速的退化。例如，即使在第12-14天，标记物表达谱已经开始明显地退化，在这些之后的时间点，αSMA表达的水平显著地提高。

关于HPTC，以前已经描述了转分化后在基底(substrate)表面上形成小管(Zhang等人,Biomaterials 30(2009)2899；和Zhang等人,J Cell Mol Med 15(2011)1287)。在本方法中，衍生自hiPSC的HPTC样细胞同样经历转分化后在基底表面上形成小管样结构，再次强调了这些细胞和HPTC的相似性。如以上所述，hESC衍生的HPTC样细胞在甚至分化的第20天被收集；相反，第20天时，hiPSC衍生细胞的大部分不再是HPTC样状态。

因此，当使用人iPSC产生HPTC样细胞时，特别是当接种期间使用约8000细胞/cm²的密度接种和ROCK抑制剂时，约8至约10天的分化期是最优的。如以上所述，首次添加BMP2和BMP7至培养中算作是分化的第1天(d1)。应注意的是，分化期的时间可能受初始培养的接种密度的影响。因此，为了在分化的第8天获得HPTC样细胞，hiPSC可以以约8000活细胞/cm²的密度随同ROCK抑制剂接种。

应当理解的是，当对细胞群进行所述方法时，例如细胞培养，不是在群或培养中的每个细胞将必然会分化成PTC样细胞。因此，在群或培养中的一些细胞可能未分化，并且可能保持了其iPSC性质，然而在相同的群或培养中的其它细胞被诱导分化并且成为PTC样。

因此，本方法可以导致iPSC的群分化成PTC样细胞，其PTC样细胞可表达例如KSP-CAD、AQP-1、PEPT1、OAT3和/或GLUT1。

例如，在分化期之后，至少30％的细胞可表达PTC特异性标记物，或者在群中至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％的细胞可表达PTC特异性标记物。例如，约30％至约95％、或者约50％至约90％的PTC样细胞，或者在PTC样细胞的群中约80％或更高、约85％或更高、约90％或更高、或约95％或更高的细胞可表达PTC特异性标记物，包括例如OAT3。在一个实施方案中，约90％或更高的细胞表达PTC特异性标记物，包括例如OAT3。

使用标准的方法，技术人员可以很容易确定分化成PTC样细胞的程度，包括如在以下实施例中所描述的，例如免疫组织化学技术、荧光激活细胞分选术(FACS)、蛋白免疫印迹技术(Western Blot)和qPCR技术用以确认特定的标记物基因和蛋白的表达。此外，通过本发明的方法产生的分化的细胞群和人原代肾近端小管细胞之间的相似性，可以通过测试转运蛋白活性、药物反应、酶活性、对甲状旁腺素的反应性以及通过其它功能性测定而被证实。

图1描述了代表分化方法、之后在体外毒理学方法中的使用分化细胞群的一个实施方案的流程图。在图1中描述的实施方案中，在第0天，接种hiPSC至多孔板；在第1天，添加含有BMP2和BMP7的分化介质；在随后的一周期间，细胞分化成HPTC样细胞，并且在第8天的晚上用于药物测试；在药物暴露过夜后，在第9天早上，收集细胞裂解物，通过qPCR确定IL6和IL8的水平。除了图1中描述的步骤以外，分化方法可以以其它方式与毒性筛选相结合。例如，药物暴露可以在第8天开始，可以进行持续更长的一段时间，和/或之后进行额外的测定。此外，分化细胞可以直接被用于其它测定，而不是毒性筛选，包括例如磷酸盐重吸收和药效。

因此，在一些实施方案中，以下条件和方法的一些或全部可以被用于iPSC的分化，包括人iPSC。

与以前报道的分化方法相比，已经发现当分化方法中包括以下条件时，iPSC(包括hiPSC)可显示最优的分化(如例如通过显示肾和PTC特异性标记物的细胞的百分比以及通过表达的或不表达的标记物的亚群所确定的)。所使用的细胞外基质成分可以是低生长因子的(GFR)基质胶，稀释于冷的(例如冰冷的)肾上皮细胞基础介质(REBM；例如获自LonzaBioscience)。如以上所述，在未分化状态时iPSC的增殖可以在mTeSR1介质中进行。将iPSC转移至分化条件可以通过用含有酶的细胞分离介质(例如Accutase)孵育而进行，例如约4分钟。在细胞的接种期间以及当细胞在悬浮液中时，可以包括ROCK抑制剂。iPSC以大约8000活细胞/cm²的密度接种在分化介质中。大约在接种后12至16小时，在细胞附着至生长表面后，可以添加细胞因子骨形态形成性蛋白BMP2和BMP7至分化的条件中。分化细胞持续约8至约10天的时间。

在本方法的一个实施方案中，在分化方法之前，可使用mTeSR1介质在未分化的状态中增殖iPSC。为了分化成HPTC样细胞，例如使用含有酶的细胞分离介质例如StemPro^TMAccutase(Life Technologies)通过在37℃孵育4分钟制备iPSC的单细胞悬浮液。随后悬浮液可以使用肾上皮细胞生长介质(REGM)洗涤并且重悬。每当细胞在悬浮液中时，添加10μMROCK抑制剂(Y-27632,Calbiochem)。ROCK抑制剂还可以添加至悬浮液中用于细胞接种。细胞可以以大约8000活细胞/cm²的密度接种至6孔板中的低生长因子的基质胶上，所述基质胶在包被前使用冰冷的肾上皮细胞基础介质(REBM；Lonza Bioscience)以1:50稀释。(用于包被：组织培养板的每孔中添加1ml的稀释的GFR基质胶在37℃持续1小时)。在细胞附着过夜后(约12-16小时)，可以更换介质为添加有10ng/ml的BMP2和2.5ng/ml的BMP7的REGM，标记为分化的第1天。每隔一天更换介质为新鲜介质。在约第8天收集细胞。

因此，如前所述，本方法提供了一种细胞群，其含有衍生自iPSC的分化的PTC样细胞。

在群中的PTC样细胞表达一种或更多种在体内PTC表达的标记物，其包括以下的一种或更多种：VIT D3、SLC34A1、NBC1、Na⁺/K⁺ATP酶、KSP-CAD、AQP1、GGT、CD13、OAT1、MEG、OAT3、OCT2、OCTN2、PEPT1、GLUT1、GLUT5、SGLT1、SGLT2、URO-10和ZO-1。在一些实施方案中，在群中的PTC样细胞表达OAT3。在一些实施方案中，在群中的PTC样细胞表达AQP1、PEPT1、OAT3和GLUT1。在一些实施方案中，在群中的PTC样细胞表达KSP-CAD、AQP1、PEPT1、OAT3和GLUT1。在一些实施方案中，在群中的PTC样细胞表达Na⁺/K⁺ATP酶、AQP1、PEPT1、OAT3、SGLT2、URO10、ZO-1和GLUT1。

群可含有大多数已经分化成为PTC样细胞的细胞。例如，群可含有至少30％的PTC样细胞、至少40％的PTC样细胞、至少50％的PTC样细胞、至少60％的PTC样细胞、至少70％的PTC样细胞、至少80％的PTC样细胞、或至少90％的PTC样细胞。群可含有约30％至约95％、或约50％至约90％的PTC样细胞，或约80％或更多、约85％或更多、约90％或更多、或约95％或更多的PTC样细胞。

群含有起源自iPSC的细胞。因此除PTC样细胞外，群可能还含有未分化的iPSC、部分分化的iPSC、以及一些转分化细胞，例如具有增加的成肌纤维细胞标记物(例如αSMA)表达的细胞。优选地，群含有很少或没有转分化细胞。

当与在体外培养的PTC相比时，在相似的体外条件下，iPSC衍生的PTC样细胞可显示相似的特性。

使用人iPSC发现，在分化的群中，很高程度的细胞是hiPSC衍生的HPTC样细胞，在一些情况中，如以下实施例中描述的，在第8天约90％或更多的细胞表达多种肾和HPTC标记物(包括AQP-1)。HPTC的培养通常是更多变的；尤其是在体外HPTC经常以十分低的水平表达一种主要的药物转运蛋白OAT3。OAT3趋于被通过本文公开的方法中hiPSC衍生的HPTC样细胞所表达，例如通过qPCR和免疫染色结果所定量的。应注意的是，表达的多种标记物的水平取决于使用的iPSC系。例如相比在HPTC中的水平，在iPS(包皮)-4衍生细胞(例如那些在以下实施例2中所使用的)中OAT3可以以更高的水平表达。在衍生自不同的iPSC系的其它HPTC样细胞中，OAT3的水平可能更低。使用不同的PTC特异性标记物观察到相似的结果。同样地，与HPTC相比，hiPSC衍生的HPTC样细胞中GGT的表达和活性是低的。

相比之下，衍生自hESC的分化的HPTC样细胞群典型地以约30％的范围表达AQP1(Narayanan等人,2013)。这表明衍生自hESC的HPTC样细胞群含有更多样的不同细胞类型的混合，其需要进一步的纯化。

因此，使用iPSC生产分化的PCT样细胞群提供了用于体内和体外中多种应用的良好的细胞来源。这些细胞对于在体内对PTC直接有毒的肾毒物敏感，并且能够在体外肾脏毒理学模型中应用。

本发明的细胞群可以减少或避免有时与原代细胞培养相关的困难，例如人肾细胞样本的不足、从不同的供体获得的细胞群之间的变化性、以及在传代期间发生在原代细胞中的功能变化。同样地，通过本文描述的方法从iPSC分化的细胞群可以减少或避免与从胚胎干细胞分化的群有关的问题。人胚胎干细胞的使用面对伦理和法律的考量。同样地，涉及胚胎干细胞的方法趋于更费时，且产出更低百分比的分化的细胞。

由于在群中iPSC衍生的PTC样细胞的高纯度，该群可以在体外测定中直接使用。例如，用于使iPSC分化成PTC样细胞的组织培养板，可以用于肾脏毒理学研究，不需要任何收集细胞和再铺板(replating)。

如以上所述，所述细胞无需加工、收集、纯化或分选，可以直接在多种不同的体外测定中使用。例如，在大约第8天至约第10天开始，所述细胞能够在体外测定例如毒性筛选、或者其它测定例如磷酸盐重吸收和药效中使用。所述细胞可以在连续的测定中使用，例如在体外毒性筛选之后进行额外的测定。

因此，考虑设计分化方法与随后的体外测定。如果分化进行了8天，完成细胞分化和之后的过夜药物测试步骤的组合时间可能是至少9天。如图1中描述的，细胞分化成PTC样细胞，并且在第8天的晚上用于药物测定；在药物暴露过夜之后，在第9天的早上收集细胞裂解物用于分析，例如通过qPCR确定IL6和IL8的水平。

如在以下实施例中描述的，使用人iPSC例证所述方法。在分化中，分化的细胞表达典型的人肾细胞和人原代肾近端小管细胞(HPTC)标记物。在体外肾脏毒理学模型中测试hiPSC衍生的HPTC样细胞。数据表明，当在体外肾脏毒理学模型中应用hiPSC衍生的HPTC样细胞时，在这些模型的可预测性是高的。使用hiPSC衍生的细胞获得的结果至少与使用HPTC或hESC衍生的HPTC样细胞获得的结果相当。因此，hiPSC衍生的肾细胞可能是目前在体外肾脏毒理学、肾组织工程和再生医学的应用中最合适的细胞类型。

因此，本发明提供了一种筛选化合物的肾毒性的方法。简略地，所述方法包括使所述的从iPSC分化的PTC样细胞测试群与待评估对近端小管(PT)毒性的测试化合物接触。接触之后，观察和/或测量细胞群的特定的特性或表型，并且与未接触测试化合物的对照细胞群的相同的特性或表型相比较。

例如，细胞暴露于测试化合物持续给定的时间长度，然后处理之后观察细胞活力和细胞数量。可以评估其它特性、表型或终点(endpoints)，例如，特定的基因的表达例如白介素(IL)-6和IL-8、以及细胞形态和细胞骨架成分的变化、和核因子(NF)kappaB的易位、ATP耗竭和线粒体损伤、谷胱甘肽(GSH)耗竭、乳酸脱氢酶(LDH)漏出(膜损伤)、活性氧(ROS)的产生和DNA损伤(基因毒性)。

测试化合物的作用可以与已知毒物的处理相比较，所述毒物在体内对PTC直接有毒的，或者是肾毒性的，但在体内对PTC不是直接有毒的，或者是无肾毒性的。

方便地，测试细胞群可以从分化方法直接地使用，没有进一步的传代或收集。这种方法是方便的，并且还可提供高质量的PTC样细胞，具有高比例还未开始转分化的细胞。应注意的是，收集和再接种可导致PTC特异性标记物表达的下降。

或者，可以收集细胞，分离并且然后以任何形式培养，包括作为汇合的单层、近汇合的单层(subconfluent monolayer)、汇合的上皮细胞、器官样(organoid)培养、汇合2D培养、体外小管、3D器官样培养、或者3D培养，其包括静态3D培养或保持在微流体条件下的3D培养。

在一些实施方案中，细胞在单层中生长，例如汇合或近汇合单层。应注意的是，汇合单层的细胞密度能够实现良好的细胞分化。

例如，分化的细胞可以以高密度(例如50000细胞/cm²)接种在多孔板中，然后在与化合物接触之前培养3天，为了给细胞提供时间以形成分化的上皮(epithelium)，所述上皮是汇合的单层上皮的形式(不同于在其它实施方案中使用的近汇合或多层)。如以上所述，收集和再接种可导致细胞减少PTC特异性标记物的表达。

在一些实施方案中，细胞可以在微流体生物反应器中直接分化或生长，包括以汇合单层或2D汇合上皮的形式。如本文描述的，微流体生物反应器对于长期培养和重复暴露于测试化合物是有用的。这种形式对于在培养中产生化合物浓度梯度是有用的。

在所述测定方法中，使在体外培养的细胞与在体内对PTC具有潜在毒性的待测试化合物接触。

测试化合物可以是待评估PT毒性的任何化合物。测试化合物可以是预期与受试者接触的任何化合物，包括被受试者吸收或摄入。例如，测试化合物可以是药物化合物、有机化合物、杀虫剂、环境毒物、含重金属的化合物、有机溶剂、食品添加剂、化妆品成分或纳米颗粒。

接触可以通过添加化合物到培养细胞的组织培养介质中完成。

接触可以持续一段时间完成，例如通过使待测试的化合物与在培养中的细胞孵育。这种接触可以进行持续约8小时或更长、持续约16小时或更长、持续24小时或更长、持续72小时或更长。与测试化合物的接触可以进行过夜，例如持续约8小时至16小时，或者甚至更长。

使用的测试化合物的浓度可以不同，并且取决于待测试的化合物。典型地，当以约1μg/ml至约1000μg/ml的浓度在体外PTC样细胞中观察毒性时，该毒性趋于以临床相关浓度在体内PTC毒性的预测。

例如，测试化合物可以以约0.001μg/ml或更高、约0.01μg/ml或更高、约0.1μg/ml或更高、约1μg/ml或更高、约10μg/ml或更高、约100μg/ml或更高、或约1000μg/ml或更高的浓度与测试细胞群接触。测试化合物可以以约0.001μg/ml至约1000μg/ml、约0.005μg/ml至约1000μg/ml、或者约0.01μg/ml至约500μg/ml的浓度与细胞群接触。

应理解，分化的PTC样细胞对照群尽管未与测试化合物接触，但与阴性对照溶液接触，例如用于溶解与测试群接触的测试化合物的溶剂或溶液(载体对照)。

接触可以是重复的。例如，在给定的一段时间，接触可以进行两次或更多次、三次或更多次、四次或更多次或者五次或更多次。

例如，在第一段的接触完成后，组织培养介质可以更换为含有化合物的新鲜的介质。可选择地，介质可以更换为不含有测试化合物的新鲜的介质，并且在没有接触的一段时间之后，然后测试化合物可以再与测试细胞群接触。

因此，接触可以是重复一次或者更多额外的次数(超出首次接触的情况)，例如持续约3至约28天的时间。没有任何测试化合物接触的间隔(即细胞暴露于新鲜介质)可以持续，例如在接触阶段之间持续一天至14天。

可以在观察和/或测量的前不久或立即重复接触。

已知多种不同的肾脏毒理学测定，并且在这些测定方法中能够评估来自肾脏毒理学体外测定的任何特性、表型或终点。如以上所述，观察和/或测量的特性或表型可以是，例如：细胞活力、细胞数量、基因表达水平包括IL-6和/或IL-8的表达、细胞形态变化、细胞骨架成分的排列、细胞因子的易位包括NF kappaB的易位、ATP耗竭、线粒体损伤、谷胱甘肽耗竭、膜损伤包括LDH漏出的量、活性氧的产生以及还有DNA损伤。

因此，细胞群可以从iPSC分化，并且然后在尽可能短于9天的时间中迅速用于评估测试化合物的毒性，包括在药物开发期间的潜在的药物候选物。如以下实施例2中证实，使用本文描述的方法的hiPSC衍生的HPTC样细胞进行测定的敏感性、特异性和平衡准确度值分别可以是，例如：约85％、91％和88％(参见表4)。

将以前的方法与本方法相比较，用于产生表达近端小管标记物的干细胞衍生细胞的最快速的替代方法包含在接种后约12天的时间。与本文描述的方法相比较，以前的方法涉及多个步骤，以及高五倍的接种密度。使用替代的方法产生的分化更好的肾系干细胞衍生细胞的纯度或质量的结果没有被描述，并且没有开发基于这种细胞的应用。

iPSC衍生的PTC样细胞相比hESC衍生的细胞具有更高的纯度，这导致使用iPSC衍生的PTC样细胞的整体预测性的改善。例如，使用hESC衍生细胞获得的平衡准确度是0.76，然而如以下实施例2中描述的，在本文中我们获得了0.88的平衡准确度。

在预测性中的这种改善可能不仅是由于细胞的质量，还由于体外模型与机器学习的结合。

换言之，当使用本文描述的PTC样细胞的体外测定方法与机器学习技术结合时，可以实现PTC毒性的预测性的水平的改善。

机器学习在预测药物诱导的毒性中发挥着越来越重要的作用。已知涉及模式识别、分类和回归分析的支持向量机(SVM)分类器方法和学习算法，并且SVM分类器已经被认定为有价值的工具。使用该分类器，大数据集可以在无人工干预下进行有效的分析，并且这种方法相比其它更易出现偏倚的方法是优选的。如在以下实施例2中描述的，与其它发现相一致，当用于本分析方法时基于SVM的分类显示产生高准确度。

除在体外测定方法中描述的之外，PTC样细胞可以在人工生物肾脏中应用以替代PT功能，并且用于肾小管的产生，包括在体外凝胶剂中或在二维(2D)平面上产生人肾小管。

本发明提供了一种含有从iPSC分化的PTC样细胞的人工生物肾脏，该装置可以用于治疗肾功能的丧失。

一般地，人工生物肾脏含有两个中空纤维筒(cartridges)。一个用于血液滤过，然而第二个是含有肾细胞的生物反应器。现有技术已知这种装置，并且可以按照血液透析或血液滤过装置的方式连接到患者。

例如，在这种装置中，具有膜表面的中空纤维血液滤过筒可以被用作为细胞生长的支架。iPSC可以被接种在内部或外部表面，并且如以上所述进行分化。可选择地，可以在表面接种分化的iPSC衍生细胞。

因此，本发明提供了一种制备装置的方法，所述方法包括在中空纤维装置中接种细胞之前或之后，如以上描述的使iPSC分化成PTC样细胞。

通过将本发明描述的细胞置于这种装置内，当通过作为人工免疫屏障的半渗透膜由血液循环分开时，所述细胞可用于临床应用，降低了免疫排斥反应或其它免疫并发症的风险，以及可由未分化的干细胞进入血流中发生的可能的致肿瘤性的风险。

以上所述的人工生物肾脏可用于治疗患有肾相关疾病的受试者。人工生物肾脏内的细胞可发挥PTC的功能，因此替代或补充患病的肾脏中受损或缺失的PTC功能。

因此，本发明还提供了一种在受试者中治疗肾相关疾病的方法。该方法包括将本发明的人工生物肾脏连接到有需要的受试者上。

治疗肾相关疾病指为获得有益的或期望的结果(包括临床结果)的方法。有益的或期望的临床结果可包括，但不限于，减轻或改善一种或多种症状或状态、减小病症或疾病的程度、使疾病的状态稳定、防止病症或疾病的发展、防止病症或疾病的蔓延、延迟或减缓病症或疾病进程、延迟或减缓病症或疾病的发病、改进或延缓病症或疾病状态以及(部分或全部)缓解。“治疗”也意味着延长受试者的生存使其超出在没有治疗的情况下的预期。“治疗”还意味着抑制病症或疾病的进程，暂时减缓病症或疾病的进程，但是更优选地，其涉及永久停止病症或疾病的进程。

受试者可以是任何患有肾相关疾病或需要治疗肾相关疾病的受试者。肾相关疾病指引起、导致肾功能永久性或暂时性下降、肾变性或肾衰竭，或与肾功能永久性或暂时性下降、肾变性或肾衰竭有关的任何疾病、病症或状态，其包括急性肾损伤、慢性肾脏疾病、终末期肾疾病、肾病、糖尿病肾病、肾病变、布赖特氏病、肾功能不全、肾小球炎、肾小球硬化、或者肾炎。

如以上所述，这种装置和这种装置的使用在本领域中是已知的。一般地，以与传统的血液透析装置或血液滤过装置相似的方式使用该装置。该装置被外部连接到受试者，并且受试者的血液或滤过血液(产生于第一中空纤维筒)通过该装置泵入，通过在膜的对侧接种有细胞的膜，然后最终回到受试者中。在来自受试者的血液或滤过血液通过该装置时，该细胞能够进行近端小管功能(参见以上)。

本发明还提供了一种在受试者中治疗肾相关疾病的方法，其包含在有需要的受试者中移植本发明的细胞。

可以使用标准的外科手术或注射的方法移植细胞。细胞可被移植到受试者中的合适部位，以对肾相关疾病提供治疗性治疗，例如需要肾上皮细胞的部位，包括在肾皮质或近端小管中。细胞可以被移植到患病肾脏的皮质中。

在一个实施方案中，细胞可以被移植到递送载体中，例如支持水凝胶。已知用于移植活细胞的递送载体，其包括例如：水凝胶、3D肾基质，或者例如细胞支架，例如聚合物细胞支持物。这种递送载体可以是生物相容性的和生物可降解的、以及可以包含合成材料、生物材料、或者其组合。

细胞还可以适用于通过接种细胞至3D肾基质中产生的生物工程化接枝物。例如，可以设计3D肾基质以模拟人肾脏的基质，其由一种或更多种合成的或天然的化合物组成。可以使用例如3D打印的技术生产反映人肾脏的形状、大小和架构的基质。未分化的iPS可以被接种至基质，并且根据本文中描述的方法在基质中分化。可选择地，分化的iPS衍生的PTC样细胞可以被接种于基质。iPS或PTC样细胞可以被单独的接种，或者与其它细胞类型共同接种，例如其它肾脏特异性的和血管细胞类型。

可以使用脱细胞化的基质，例如脱细胞化的肾脏(Song等人,Nature Medicine,2013,19(5),646-51)。用于移植至人中，衍生自猪肾脏的基质具有合适的大小。例如，未分化的iPSC可以被接种到脱细胞化的基质，并且根据本文中描述的步骤在基质中分化。可选择地，分化的iPS衍生的PTC样细胞可以被接种至脱细胞化的基质。iPS或PTC样细胞可以被单独接种，或者与其它细胞类型共同接种，例如其它肾特异性的和血管的细胞类型。

生物工程化的接枝物可以在用于多种应用的器官培养中使用，包括化合物效力测试和安全性筛选。具有小尺寸的接枝物优选用于这种应用。例如，仅代表了部分肾脏的接枝物(例如皮质或近端小管)可以用作肾疾病模型。

同样地，生物工程化的接枝物可以用于移植至患有晚期肾疾病的人或动物。

向受试者施用有效量的PTC样细胞，包括生物反应器或生物工程化接枝物内的细胞。如本文所用术语“有效量”指实现期望的结果例如治疗肾相关疾病所需的剂量和时间段内有效的量。

要被施用的细胞的总数的数量会变化，取决于几个因素，包括肾相关疾病的严重度和类型、施用方式和受试者的年龄和健康状况。

此外，如本文中描述获得的PTC样细胞可以用于其它体外应用中，包括例如：生产体外小管或小管样结构。例如，在PCT公布的申请WO 2010/064995中以前已经描述的方法。

通过以下非限定性的实施例进一步例示本文中描述的方法、细胞群、装置和用途。

实施例

实施例1

2012年11月5日开始，使用两种测试药物(利福平和百草枯，均是对PTC直接有毒的肾毒物)处理hiPSC衍生的HTPC样细胞。使用基于白介素6/白介素8表达的肾脏毒理学体外模型测试药物反应(Li等人,Toxicol.Res.2(2013),352-362)。数据显示在使用PTC特异性的肾毒物处理后，IL-6(以及在利福平的情况中IL-8)表达提高。这表明使用PTC特异性的肾毒物处理导致阳性的反应。

材料和方法

使用无菌技术实施所有步骤。

试剂：mTeSR1介质试剂盒：STEM CELL Technologies，货号：05850；BD Matrigel^TM基底膜基质，低生长因子(GFR)，BD Biosciences，货号：356230；Rock抑制剂(Y-27632)Calbiochem，货号：688000；肾上皮细胞基础介质(REBM)，Lonza Bioscience，货号：CC-3191；细胞分离试剂，100ml，Lifetech，货号：A11105-01；肾上皮细胞生长介质(REGM)，Bulletkit，Lonza Bioscience，货号：CC-3190；BMP2，R&D systems，货号：355-BM-010；BMP7，R&D systems，货号：354-BP-010；确定成分的胎牛血清(FBS)，ThermoScientific Hyclone，货号：SH30070.03；二甲基亚砜(DMSO)Sigma，货号：D2650。

未分化的iPSC的增殖：人诱导性多能干细胞(hiPSC)的培养在6孔包被有GFR基质胶的板上，在每天更换的mTeSR1介质(根据制造商的说明书)中生长。mTeSR1介质试剂盒：STEM CELL Technologies，货号05850；BD Matrigel^TM基底膜基质、低生长因子(GFR)，BDBiosciences，货号：356230。

iPSC的分化：到第5-6天，当未分化的hiPSC培养为～80％汇合时，应用肾分化条件。

制备包被低生长因子(GFR)基质胶的板。以冰冷的REBM(肾上皮细胞基础基质，Lonza)50x稀释GFR基质胶成为用于包被的工作溶液(6孔板的每孔中1ml的GFR基质胶工作溶液)。当包被板时，稀释的基质胶是冷的(10℃以下)。包被通过在37℃孵育板1小时进行。

在基质胶的包被时间之后，传代hiPSC培养。从hiPSC培养皿中移除旧的mTeSR1基质，使用无菌的1xPBS冲洗两次，并且在37℃使用预热的accutase(6孔板的每孔中1ml)孵育4分钟。通过1ml微量移液器，通过多次上下移液，使集落分离为单细胞，同时在过程中避免引入泡。

细胞悬浮液转移至含有10μM的Rock抑制剂、含有5x体积的REGM(即1ml细胞悬浮液添加有4ml的REGM)的50ml离心管。取一份细胞悬液以确定总细胞数。每当细胞在悬浮液中或者仅在接种细胞用以附着的开始的12-16小时，溶液中存在Rock抑制剂。

以300g离心细胞悬浮液5分钟以使细胞沉淀(使用水平离心机(swing bucketcentrifuge))。在离心期间计算在总重悬体积中的总细胞数。准备重悬细胞为约8000细胞/cm²密度所需的REGM，REGM中含有10μM的Rock抑制剂。

在离心后，从管中移除上清液介质，并且添加准备的用于重悬细胞的REGM。对于6孔板，每孔需要的REGM的体积是2ml。细胞以需要的密度和体积接种至板中，并且之后尽快移至37℃的CO₂培养箱。由于摇动妨碍用于分化所需细胞密度的附着，避免干扰培养箱。严格地保持细胞接种的密度，并且在接种细胞后尽快将板放置在培养箱中，以避免任何细胞活力的损失。

使细胞附着过夜，之后更换介质为添加有10ng/ml的BMP2和2.5ng/ml的BMP7的REGM。

在含有10ng/ml的BMP2和2.5ng/ml的BMP7的REGM中实施分化，每隔一天更换介质。BMP2和BMP7是在添加到细胞之前新鲜添加到介质中的。

首次添加BMP2和BMP7到细胞培养计算为分化的第一天。应用分化条件直到第8-10天。到第3天结束时，细胞密度增加，并且到第6天结束时，细胞已形成单层。如果在这个阶段没有形成单层，则细胞可能分化为成纤维细胞样细胞。到第7至第8天，细胞应形成具有上皮形态的汇合单层。

冷冻保存：根据标准的步骤冷冻保存分化的细胞。如下制备冷冻保存介质：40％高级别确定成分的FBS；50％REGM；10％DMSO。细胞以2x10⁶细胞/ml/冷冻瓶冷冻保存。为了最佳的冷冻条件，使用标准的冷冻保存容器。细胞首先保持在-80℃，并且次日将细胞移至汽相的液氮存储。

药物处理：迅速解冻冷冻瓶，并且添加含有10μM的Rock抑制剂的REGM。使细胞沉淀，并且以含有BMP2和BMP7添加剂和Rock抑制剂的新鲜REGM重悬细胞。以24孔板的每平方厘米1x10⁵个细胞，在添加有10ng/ml的BMP2和2.5ng/ml的BMP7的REGM中接种细胞，并且在药物处理的开始之前，培养3天(根据如用于原代HPTC相似的方法；Li等人,Toxicol.Res.2(2013),352-362)。药物以它们各自的溶剂溶解，并且添加到REGM中，例如以1、10、100和1000μg/ml。

除了使用冷冻保存的细胞，iPSC可以被接种至用于药物处理的多孔板中，并且使用以上概述的方法在该板中分化成HPTC样细胞。细胞在第8-10天备好用于药物处理。

图2.药物处理对hiPSC衍生HPTC样细胞的数量的影响。从iPS(包皮)-4细胞获得HPTC样细胞。接种HPTC样细胞至多孔板中，并且接种后3天使用多种药物浓度(x轴)处理。使用PTC特异性肾毒素(上面)或者非肾毒性药物(下面)处理细胞过夜。在药物暴露之后，通过高内涵筛选(HCS)确定细胞数量。所有数据以载体对照(100％)归一化。当使用非肾毒性药物处理HPTC样细胞时，细胞数量没有下降。相反，当使用PTC特异性肾毒素处理HPTC样细胞时，细胞数量下降。在使用HPTC进行的相似的实验中，使用庆大霉素和百草枯处理之后，没有观察到细胞数量的下降(Li等人,Toxicol.Res.2(2013)352-362)。这表明hiPSC衍生的HPTC样细胞比HPTC更敏感。

结果

当应用以上概述的分化方法时，在约第8天之后，证实群中大比例(例如约90％或更高)的细胞表达PTC典型的细胞标记物。为了确定分化培养期的最佳范围，进行具有免疫染色数据的时间进程。除了α-平滑肌肌动蛋白(SMA)，所有测试的标记物是肾近端小管细胞所特有的。当肾近端小管细胞转分化成成肌纤维细胞样细胞时表达SMA，并且这种成肌纤维细胞样细胞在PTC样细胞培养中是不期望的。结果显示在大约第8-10天，标记物的表达是最佳的，并且之后迅速退化。甚至在第12-14天，标记物表达谱已经显著地退化。在这些之后的时间点观察到SMA表达显著地提高。

然而使用以前描述的方法从hESC衍生的HPTC样细胞在分化直至第20天被收集，通过本发明描述的方法获得的hiPSC衍生的HPTC样细胞在分化的第8-10天显示最佳的特性。

在分化的第8-10天之后，iPSC衍生的培养显示PTC特异性标记物的表达的下降，并且细胞开始转分化为成肌纤维细胞样细胞。

标记物中的一种是肾脏特异性钙粘蛋白(KSP-CAD)，其在肾脏中被专有地转录。此外，测试了以下近端小管(PT)特异性标记物：水通道蛋白1(AQP1)、γ-谷氨酰转移酶(GGT)和有机阴离子转运蛋白3(OAT3)。还包括成肌纤维细胞标记物α-SMA。

KSP-CAD的表达确认hiPSC衍生的细胞的肾分化。对于PTC特异性标记物的表达，qPCR结果与免疫染色数据相一致，并且在功能性测定中观察到相对低的水平GGT活性。衍生自两种hiPSC系的HPTC样细胞显示相似的标记物基因的上调或下调的模式。在两种情况中，这些模式与使用hESC衍生的细胞获得的模式不同。

α-平滑肌肌动蛋白(αSMA)是成肌纤维细胞标记物，其在约第10天之后出现上调。与PTC相比，当转分化为成肌纤维细胞样细胞时，细胞经历若干转变阶段。已进入成肌纤维细胞样阶段的细胞不能用于需要PTC的应用。同样地，转分化为成肌纤维细胞样细胞的细胞趋向于形成集合，其随后破坏与小管形成的过程有关的单层(第14天)。这种结构将不与人工生物肾脏或者药物测试中高内涵筛选的应用相兼容。

特别注意的是，在从iPSC获得的HPTC样细胞中，在第8-10天观察到OAT3的表达。在体内OAT3在人PTC中表达，但是在体外HPTC中其通常以明显较低的水平表达，并且目前没有任何已知的方法用以在体外培养的这种原代细胞中增强OAT3表达，达到与在体内表达水平相似的水平。OAT3在第20天的hESC衍生的HPTC样细胞中同样仅以十分低的水平表达(参见例如Narayanan等人,2013,图3)。

通过描述的方法获得HPTC样细胞群的高比例趋于分化。在一些实施例中，已经通过FACS确认在第8天约93％的iPSC衍生的HPTC表达OAT3(AQP1 98％)，并且其它HPTC特异性标记物也大于90％。相比之下，衍生自hESC的分化的HPTC样细胞群典型地以约30％的范围表达AQP1(Narayanan等人,2013)。这表明衍生自hESC的HPTC样群含有更多样的不同细胞类型的混合，其需要进一步的纯化。

已经通过FACS确认93％的hiPSC衍生的HPTC样细胞在第8天表达OAT3(AQP198％)，并且其它HPTC特异性标记物也大于90％。需注意的是，使用第20天hESC衍生的细胞的最佳结果是以约30％的范围表达AQP1(Narayanan等人，2013；在该出版物中，没有通过FACS检测其它标记物，而且其它标记物的免疫染色数据与使用iPSC衍生的细胞获得的那些数据不一致)。因此，这里的结果显示衍生自hESC的HPTC样群(如Narayanan等人描述的)和本文描述的从hiPSC衍生的那些之间存在主要的定量和定性的差异。

实施例2

使用用于使hiPSC分化成HPTC样细胞的一步方法，之前不进行细胞收集，立即进行药物测试。通过评估对30种化合物的反应确定hiPSC衍生的细胞的预测性能。通过支持向量机算法自动分类结果。用这种方法，在人中PTC毒性可以以高准确度进行预测。因此，一步分化的方法与机器学习的结合可以提供一种用于在人中准确预测PTC毒性的高效方法。

材料和方法

hiPSC的扩增和分化：从WiCell研究机构(麦迪逊,WI,美国)获得iPS(包皮)-4、iPSIMR90-4和iPS DF19-9-11T.H细胞。使用这些hiPSC系工作经新加坡国立大学的机构审查委员会批准(NUS-IRB参考代码：13-437)。使用mTeSR1介质(Stemcell Technologies,新加坡)，在包被有低生长因子基质胶(BD,富兰克林湖,NJ,美国)的多孔板中扩增未分化的细胞。用于分化，以8000细胞/cm²的密度接种hiPSC(第0天)至包被有低生长因子的基质胶的24孔板中。使用StemPro Accutase(Life Technologies,卡尔斯巴德,CA,美国)制备单细胞悬浮液。

使用商业化肾上皮生长介质(REGM BulletKit；Lonza Bioscience,新加坡)重悬细胞并接种，介质中添加有10μm Rho激酶(ROCK)抑制剂(Y-27632,Calbiochem,Merck,达姆施塔特,德国)。在第1天将介质更换为添加有10ng/ml的BMP2和2.5ng/ml的BMP7(R&DSystems,明尼阿波里斯,MN,美国)的REGM。添加BMP的介质不含有ROCK抑制剂。每隔一天更换介质。

在第8天进行化合物处理，并且继续使用细胞已经分化的相同的板进行化合物测试。分化步骤与之后的药物测试的流程图在图1中提供。

荧光激活细胞分选术(FACS)和免疫荧光：如以前所概述的进行FACS和免疫荧光(Li等人,Toxicol.Res.2(2013),352-362；Narayanan等人,Kidney Int.83(2013),593-603)。

扫描电子显微术(SEM)和g-谷氨酰转移酶1(GGT)的确定以及药物转运蛋白活性：这些步骤如以前所概述的进行(Tiong等人.Mol.Pharm.11(2014),1933-1948；Narayanan等人,Kidney Int.83(2013),593-603)。

化合物处理和IL6和IL8表达水平的确定：化合物处理进行16小时。除马兜铃酸以外，所有化合物已经在以前的研究中使用，并且提供了在人中肾毒性的详细信息(Li等人,Toxicol.Res.2(2013),352-362；Li等人.Mol.Pharm.11(2014),1982-1990)。马兜铃酸(马兜铃酸I和II的1:1的混合物)购自EMD Millipore(比勒利卡,MA,美国)。马兜铃酸是一种特性明确的肾毒素，其能够在人中导致与对肾近端小管直接毒性相关的急性肾损伤或者慢性肾脏疾病，以及尿路上皮癌(Yang等人,Nephrol.Dial.Transplant.27(2012),292-298)。

所有化合物以1、10、100和1000μg/ml的浓度(每种三个重复)测试，并且如以前研究，所有结果以载体对照归一化。所有板含有100μg/ml地塞米松(阴性)和100μg/ml嘌呤霉素(阳性)作为对照(每种三个重复)。如描述的(Zhang等人J.Biomol.Screen 4(1999),67-73)计算Z’值，计入Z’值大于0.5的板。如前通过使用相同的引物(表1)通过定量的实时逆转录聚合酶链式反应(qPCR)确定IL6和IL8的mRNA水平。所有数据以两种参考基因(GAPDH和PPIA)归一化。

下表1提供了用于qPCR的标记物的详细说明。该表列出了用于qPCR的所有标记物。使用首字母缩略词以字母顺序列出。HUGO基因命名委员会(HGNC)的命名之后是基因ID和说明。提供了用于qPCR的引物对(F：正向，R：反向)和以碱基对(bp)计的扩增子大小。

表1.qPCR引物

确定标记物表达水平：如描述的(Li等人,Toxicol.Res.2(2013),352-362)通过qPCR确定标记物的表达水平。在上表1中提供了引物和扩增子的详细说明。

计算和统计：本文中描述的非计算分析部分的所有计算和统计使用MicrosoftOffice Excel 2010进行。使用非配对t检验(Microsoft Office Excel 2010)进行统计。使用SigmaStat(3.5)(Systat Software Inc.,芝加哥,IL,美国)确认数据的正态分布。

计算分析：对于每种药物，以所有剂量测量的IL6或IL8的表达值以各自的载体对照归一化。然后将得到的比例进行log2转换，使用下限＝0的三参数对数逻辑模型(log-logistic model)获得sigmoidal剂量反应曲线(Ritz和Streibig,J.Stat.Software 12(2005),1-22)。该模型具有以下形式：

$f(x,(b,d,e\left)\right)=\frac{d}{1+exp\left\{b\left(log\right(x)-log(e\left)\right)\right\}}$

在上式中，x是药物浓度，e是上限d至0之间的一半的反应(response half-way)，以及b是e周围(around)的相对斜率。根据估算的剂量反应曲线，确定在最高测试药物剂量(IL6最高或IL8最高)时的反应值(IL6或IL8水平)。以前已获得在三个批次HPTC中IL6和IL8的表达数据(Li等人,Toxicol.Res.2(2013),352-362)并且在本文中重新分析。

使用具有径向基核函数的支持向量机(SVM)(Cortes,C.和Vapnik,V.,MachineLearning 20(1995),273-297)预测药物诱导的肾毒性。SVM具有两种参数：正则化/成本(regularization/cost)参数(C)和径向基核函数的广度(width)(γ)。这些参数使用详尽的网格搜索对C＝10-5至10 5和γ＝10-5至10 5进行最佳化(C.-W.Hsu,C.-C.Chang和C.-J.Lin,A practical guide to support vector classification.National TaiwanUniversity,2003)。

最后，使用三倍交叉验证步骤估算分类性能(Hastie等人(eds)The Elements ofStatistical Learning:Data Mining,Inference,and Prediction,第二版,(2009),Springer Science+Business Media LLC,费城,PA,美国)。

整个数据集被随机地划分为大致相等且分层的三折(fold)，其中的两个用于训练SVM，并且剩下的折用于测试经训练的SVM。全部步骤重复10次。所有的分类性能测量是这10次试验的平均值。使用以下三种分类性能测量：

敏感性＝TP/TP+FN x 100％

特异性＝TN/TN+FP x 100％

平衡准确度＝敏感性+特异性/2x 100％

TP是真阳性的数量，TN是真阴性的数量，FP是假阳性的数量以及FN是假阴性的数量。在配置有Intel Core i7-3770K处理器和Windows 7操作系统的个人计算机上，使用‘e1071’库(v1.6-1)在R统计环境(v3.0.2)下进行所有的分析。

图3.在分化期间iPS(包皮)-4衍生细胞的标记物表达模式的变化。a)在15天的时间期间，每隔一天通过qPCR确定标记物表达水平(灰色条)。在第1天应用分化方法。条显示平均值+/-标准差(s.d.,n＝3)。标记物的表达水平以在未分化的iPS(包皮)-4细胞(第0天)中各标记物的表达水平归一化。未分化的hiPSC的平均表达水平被设置为1。黑色条表明HPTC中的表达水平(在一些情况中，表达水平是很低并且条不可见)。表明检测的标记物以及其在体内的表达模式(PSC、中胚层、间充质肾前体、肾元祖(nephron progenitors)、PTC)。通过qPCR检测的标记物的所有基因ID、说明和首字母缩略词在表1中总结。b)在第8、10、12和14天，通过免疫染色(绿色；细胞核：蓝色)检测PTC特异性标记物。检测以下标记物：AQP1、溶质运载蛋白家族5(钠/葡萄糖协同转运蛋白)成员2(SGLT2)、溶质运载蛋白家族2(促葡萄糖转运蛋白)成员1(GLUT)1、有机阴离子转运蛋白(OAT)3、丙氨酰(膜)氨基肽酶(CD13)、泌尿道上皮糖蛋白(URO)10、闭锁小带(ZO)-1以及平滑肌肌动蛋白(SMA)。通过箭头标记高水平表达SMA的细胞团块。比例尺：50μm。

图4.iPS IMR90-4衍生细胞和iPS DF19-9-11T.H衍生细胞的标记物蛋白表达。a)分化iPS IMR90-4细胞不同时间。显示在第8、10、12和14天测试细胞获得的结果。左侧显示通过免疫荧光(绿色)检测的标记物。细胞核以蓝色显示。大多数PTC标记物的表达在第10天后下降。在之后的时间点发生细胞团块被αSMA强染色(箭头)。比例尺：50μm。b)使用iPSDF19-9-11T.H衍生第8天的细胞获得的FACS结果。显示所示标记物的阳性细胞百分比。

图5.通过免疫染色和FACS表征hiPSC衍生第8天的细胞。左侧图显示从iPS(包皮)-4和iPS IMR90-4细胞衍生第8天的细胞的上皮。左侧显示通过免疫荧光(绿色；细胞核：蓝色)检测的PTC特异性标记物：比例尺：100μm。右侧图显示iPS(包皮)-4和iPS IMR90-4衍生第8天的细胞获得的FACS结果。显示右侧所示标记物的阳性细胞百分比。FACS结果与免疫染色数据一致，并且显示在大多数情况下大于90％的细胞是阳性的。

图6.表征iPS(包皮)-4衍生第8天的细胞。a-c)在组织培养塑料制品(TCPS)上培养的细胞形成的圆顶(dome)。在a)和b)图中显示不同的焦平面。c)通过免疫荧光检测GLUT1(绿色)。比例尺：100μm。d)具有顶端刷状缘的极化细胞(比例尺：5μm)。通过在基质胶(e)或TCPS(f)的表面上培养细胞生成小管。比例尺：100μm。g)通过qPCR确定的在iPS(包皮)-4衍生的HPTC样第8天的细胞(灰色条)和HPTC(黑色条)中31种标记物的表达水平。条显示平均值+/-s.d.(n＝3)。如在底部显示的，根据标记物的功能或在体内表达模式将其分类。

图7.hiPSC衍生细胞的GGT活性和OCT2活性。a-c)确定BALB/c 3T3纤维母细胞(阴性对照，黑色条)、HPTC(阳性对照，白色条)和hiPSC衍生细胞(灰色条)的相对GGT活性。在如x轴所示的不同时间点测试hiPSC衍生细胞。条显示平均值+/-标准差(s.d.,n＝3)。所有结果以使用BALB/c 3T3细胞获得的结果(设置为1)归一化。显示iPS(包皮)-4衍生细胞(a图)、iPS IMR90-4衍生细胞(b图)和iPS DF19-9-11T.H衍生细胞(c图)获得的结果。d)hiPSC衍生细胞的OCT2活性。iPS(包皮)-4和iPS IMR90-4衍生第8天细胞与含有载体(DMSO)的细胞培养介质孵育，或与含有50μm的OCT2抑制剂四戊铵盐的细胞培养介质孵育。在孵育5分钟之后，添加25μm的OCT2荧光基底ASP⁺(4-(4-(二甲氨基)苯乙烯基)-N-甲基吡啶碘化物)。在30分钟后，添加碘化丙啶用于监测细胞活力，并且通过FACS分析细胞。该图显示经抑制剂处理的样本(灰色)和载体对照(白色)的细胞荧光强度(n＝3)。在iPS IMR90-4衍生的细胞的情况中，两种图很大程度上重叠，这显示OCT2抑制剂处理的样本和载体对照之间无差异。这表明在这些细胞中缺乏OCT2活性。在iPS(包皮)-4衍生细胞的情况中，经抑制剂处理的细胞显示荧光强度的下降，与存在OCT2抑制剂时OCT2荧光基底的摄取下降一致。数据分析产生的MDR活性因子(MAF)值大于25。具有MAF值>25的样本被认为是转运蛋白活性阳性的(星号)。

图8.转运蛋白介导的药物摄取和药物诱导的IL6和IL8的表达。iPS(包皮)-4衍生第8天的HPTC样细胞使用100μg/ml橘霉素(a)或利福平(b)处理。在药物处理的细胞中IL6和IL8表达水平以深灰色条显示。条显示平均值+/-s.d.(n＝3)，并且所有表达水平以载体对照(设置为1)归一化。经OAT1和OAT3以及这些转运蛋白介导的、通过PTC摄取的橘霉素被丙磺舒抑制。暴露于橘霉素和丙磺舒(在a图中浅灰色条)降低了31％的橘霉素诱导的IL6表达水平。PTC摄取利福平由OCT2介导，被西咪替丁抑制。暴露于利福平和西咪替丁分别降低了40％和26％的利福平诱导的IL6和IL8的表达水平(在b图中浅灰色)。相对于载体对照，单独的抑制剂不显著地改变IL6和IL8的表达水平(白色条；两种抑制剂以2mM的浓度使用)。以星号显示药物处理和药物+抑制剂处理样本之间的显著差异。

图9.hiPSC衍生细胞中标记物表达。在iPS(包皮)-4衍生第8天的细胞中，通过免疫荧光检测PAX2、WT1和JAG1(红色；左侧图)。4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色的细胞核以蓝色显示(中间)。右侧图显示合并。比例尺：200μm。b)通过qPCR确定在hiPSC衍生的第8天细胞和HPTC中的在x轴所示的14种标记物的表达水平。通过所示的不同颜色表示细胞类型。所有的表达水平以GAPDH表达的百分比显示。条显示平均值+/-s.d.(n＝3)。

图10.预测HPTC和HPTC样细胞的性能。a)散点图显示由组1(白色；在人中对PTC有毒的)和组2(黑色；在人中对PTC无毒的)化合物诱导的HTPC样细胞的IL6和IL8基因表达水平的变化。每点代表一种化合物。使用这些特征训练支持向量机(SVM)分类器。b)在收集自HPTC样细胞(红色)以及三个批次的HPTC(HPTC1-蓝色、HPTC2-紫色、和HPTC 3-绿色)的所有数据上训练最终SVM的受试者工作特性(ROC)曲线。红色、蓝色和紫色图重叠。插图提供分类器的曲线下面积值(AUC_最终)以及平衡准确度(准确度_最终)。基于HPTC样细胞和HPTC批次1和2的SVM可以完美地分离30种化合物。

结果

分化期间基因和蛋白表达：使用在材料和方法部分中(hiPSC的扩增和分化)描述的方法，分化三种特性明确的hiPSC系iPS(包皮)-4、iPS IMR90-4和iPS DF19-9-11T.H。在iPS(包皮)-4衍生细胞中监测基因表达模式的变化持续15天的时间(图3a)。在第1天(d)后，OCT3/4、NANOG、SOX2和DNMT3B下调。这些“干性(stemness)”标记物的下调之后，在第3天进行T的瞬时脉冲(transient pulse of T)(图3a)。T在脊椎动物胚胎的早期中胚层瞬时表达，肾脏从该胚层衍生。当多能干细胞(PSC)向肾系分化时，典型地观察到“干性(stemness)”标记物的下调和T的早期瞬时脉冲。

在这里，在第5-13天，T又以低水平表达。在第7天至第9天，OSR1强烈上调(图3a)。在胚胎发育期间，在肾前体群15的整个发育中OSR1持续表达。在第7天至第9天，肾元祖和PTC标记物强烈上调(图3a)。这包括肾元祖标记物SIX2、WT1和GDNF、以及HOXD11，其说明后肾肾脏的发育。在第7天至第9天上调的PTC标记物是KSP-CAD、AQP1和GGT。KSP-CAD的表达是肾特异性的，并且限于小管上皮细胞。AQP1和GGT表达是近端小管上皮细胞的特性。

这些结果显示在第7天至第9天强烈的变化，在第9天，细胞表达高水平的测试的所有的肾元祖和PTC标记物。尽管在体内成熟的人PTC中不表达肾元祖标记物，其在体外条件下典型地被重表达。这被本文中获得的结果所确认，所述结果显示在体外培养从成人肾脏分离的HPTC(图3a；黑色条)表达与第9天hiPSC衍生的细胞相似模式的肾元组和PTC标记物。免疫染色显示，在第8天衍生自所有三种hiPSC系的细胞形成紧密连接的汇合上皮以及适当的PTC特异性蛋白表达和定位(图3b、图4a和5)。

本文中观察到的基因表达的变化(包括干性标记物的早期下调，T的瞬时峰值以及随后OSR1和肾元祖标记物的上调)与最近应用多步方法使PSC向肾系分化的先前研究结果一致。在这些研究的大部分中，如本文的情况，观察到在最终分化的肾细胞中标记物表达的上调。

在本文中，在第9天之后观察到PTC特异性标记物基因的表达逐渐下降，并且在第11天之后肾元祖细胞标记物的表达下降(图3a)。这些qPCR结果与免疫染色结果一致，所述结果显示在第10天(iPS DF19-9-11T.H衍生细胞)或在第10天之后(iPS(包皮)-4和iPSIMR90-4衍生细胞)PTC和上皮标记物蛋白的表达下降(图3b和图4)。

然而，PTC和上皮标记物在之后的时间点是下调的，并且在第15天以相对低的水平表达(除了WT1)，中胚层和间充质标记物T和OSR1在该时间点强烈上调(图3a)。同样，在之后的时间点，在细胞团中成肌纤维细胞标记物SMA以渐增的水平表达(图3b和图4)。以前当HPTC在体外培养持续延长的时间时观察到相似的过程，并且SMA的上调与PTC的上皮间质转化(EMT)相关。T涉及在EMT中起关键作用。在之后的时间点T、OSR1和SMA的上调(图3)与当培养延长时间的hiPSC衍生的HPTC样细胞中(如在HPTC中)也发生的EMT相一致。应注意的是，最终分化的近端小管细胞也保持了高度的可塑性，并且能够很容易在上皮和间充质状态间转换；这种可塑性与其在组织再生中的作用有关。

表征hiPSC衍生第8天的细胞：进一步检测第8天的细胞，结果表明在第7天至第9天hiPSC衍生细胞上调典型的PTC特异性标记物基因(图3a)，并且形成汇合的上皮，并在第8天表达PTC特异性标记物蛋白的模式(图3b和图4)。使用独立衍生批次的分化细胞重复免疫染色实验确认在第8天iPS(包皮)-4和iPSIMR90-4衍生细胞形成汇合的肾上皮(图5)。几乎所有的细胞表达PTC特异性标记物蛋白，包括AQP1、Na+/K+ATP酶、OAT3、PEPT1、SGLT1、GLUT1、URO10和ZO-1(图5)。FACS实验显示在大多数情况下大于90％的细胞表达标记物蛋白，并且这适于所有的三种hiPSC系衍生的细胞(图4和5)。因此不需要为了体外应用而进一步纯化这些细胞。

iPS(包皮)-4衍生第8天的细胞具有典型的HPTC形态和功能特性，并且显示圆顶的形成，具有顶端刷状缘的极化和小管发生(图6a-f；在基质胶和组织培养塑料制品上，使用HPTC和hESC衍生HPTC样细胞观察到相似的小管发生过程)。另外，衍生自所有三种hiPSC系的细胞显示GGT活性，尽管hiPSC衍生细胞的GGT活性低于HPTC(图7)。与其它结果(图3)相一致，iPS(包皮)-4和iPS IMR90-4衍生细胞在之后的时间点GGT活性下降。当测试衍生自这两种hiPSC系的第8天的细胞的转运蛋白活性时，结果表明在两种情况中，外排转运蛋白(efflux transporters)(MDR1、MRP2、BCRP)无活性。然而，iPS(包皮)-4衍生第8天细胞的有机阳离子摄取转运蛋白OCT2是有活性的(图7d)，并且高百分比的该类细胞表达有机阴离子摄取转运蛋白OAT3(图5)。因此，选择iPS(包皮)-4衍生细胞进一步表征。

通过qPCR详细表征iPS(包皮)-4衍生第8天细胞的标记物表达模式，并且在另外独立分化的这种HPTC样细胞批次中和在HPTC中，确定31种标记物的表达水平(图6g)。该结果确认在两种细胞类型中均表达KSP-CAD以及SLC34A1。这种基因编码II型钠/磷酸盐协同转运蛋白，其仅在完全分化的PTC中表达。还表达其它PTC特异性转运蛋白，涉及钠、碳酸氢盐和葡萄糖转运(NBC1、SGLT2和GLUT5)。此外，表达所有测试的药物转运蛋白。HPTC样细胞中，主要的有机阴离子摄取转运蛋白OAT1和OAT3的表达水平(与HPTC相比)分别高～15倍(P＝0.0004)或～5倍(P＝0.0157)。在OCT2的情况中观察到约2倍高的表达水平(P＝0.0005)，OCT2对于通过PTC的多种肾毒物包括顺铂的摄取是重要的。HPTC样细胞以高～2倍(P＝0.0001)和～26倍(P＝0.0041)的水平表达PEPT1和MEG。MEG对肾毒性氨基苷类抗生素的摄取是重要的。在两种细胞类型中，以相似的水平表达有机阳离子摄取转运蛋白OCTN2(P＝0.1608)，并且在HPTC中以更高的水平表达外排转运蛋白MDR1(～39倍；P＝0.0003)。这与在iPS(包皮)-4衍生的HPTC样细胞中外排转运蛋白没有检测到活性的观察相一致，与摄取转运蛋白相反(图7和8)。

与其它结果相一致，在该批次的iPS(包皮)-4衍生的HPTC样细胞和HPTC中还表达多种其它的PTC特异性标记物(AQP1、CD13、GGT、VIT D3、Na+K+ATP酶)以及上皮标记物(ZO-1、N-CAD、E-CAD；图6g)。还表达PAX2和WT1。这两种标记物在肾和肾元祖以及在体外培养的HPTC中表达。通过免疫染色确认PAX2、WT1以及肾泡(renal vesicle)标记物JAG131的表达(图9)。此外，观察到肾脏损伤标记物(NGAL、KIM-1、VIM)和SMA的表达(图6g)。同时，在体外条件下的PTC中发生肾脏损伤标记物以及E-CAD和SMA的表达(随时间增加)。需注意的是，在HPTC样细胞中PAX2和NGAL分别(比HPTC)表达低约34倍(P＝0.00003)或者122倍(P＝0.0002)的水平，并且在该细胞类型中KIM-1和VIM分别(比HPTC)表达低约3倍(P＝0.0002)至4倍(P＝2.4x 10-7)的水平。

这两种细胞类型还表达在体外条件下其它肾上皮细胞类型特异性的标记物：PODXL(足细胞)、NCCT(远端小管)、NKCC2(髓袢(Henle's loop)升支粗段)、UMOD(Tamm-Horsfall糖蛋白，髓袢升支粗段)以及AQP3(集合管；图6g)。这也通常在体外条件下发生，并且以前已经在HPTC和hESC衍生HPTC样细胞中观察到。在本文中，通过免疫染色确认PTC标记物AQP1和集合管标记物AQP3被相同的细胞共表达(数据未显示)。因此，混合的标记物表达模式不是由于不同细胞群的存在。这与在大多数情况中大于90％的细胞表达PTC特异性标记物的事实相一致(图5)。

作为比较，还在iPS IMR90-4和iPS DF19-9-11T.H衍生第8天细胞中确定14种选择的标记物的表达水平，并且在图9中显示衍生自所有三种hiPSC系的第8天细胞和HPTC的结果。结果显示被所有4种细胞类型表达的所有的标记物。在大多数情况中，iPS(包皮)-4衍生细胞显示最高表达水平。

药物摄取和药物诱导的白介素表达：在HPTC和hESC衍生的HPTC样细胞中，对PTC有毒的化合物特异地增加IL6和/或IL8表达。基于这种增加IL6/IL8表达的特性，以前开发了一种用于预测在人中PTC毒性的方法。在本文中，测试对PTC有毒性的化合物是否在iPS(包皮)-4衍生第8天细胞中增加IL6和/或IL8表达。在多孔板中照常分化细胞，并且在第8天晚上使用PTC特异性肾毒物橘霉素和利福平处理16小时。然后通过qPCR确定IL6和IL8水平(图1中提供步骤的流程图)。利福平提高IL-6表达～17倍和IL8表达～18倍(图8)。橘霉素提高IL6表达～6倍，然而未观察到IL8表达提高(图8)。以前结果显示在hESC衍生HPTC样细胞中，橘霉素也不诱导IL8，并且典型的不是每种药物诱导两种白介素。

橘霉素被PTC摄取是通过OAT1和OAT3介导的。这些转运蛋白被丙磺舒抑制。使用橘霉素和丙磺舒共同孵育显著地降低橘霉素诱导的IL6表达水平～31％(图8)。该结果显示，橘霉素的摄取通过OAT1和OAT3介导，与在iPS(包皮)-4衍生第8天细胞中这些转运蛋白的表达一致(图5和图6g)。

使用利福平进行了相似的实验。这种药物通过PTC摄取是由OCT2介导的，被西咪替丁抑制。与西咪替丁共孵育分别降低了40％和26％的利福平诱导的IL6和IL8表达的增加(图8)。这些结果表明利福平诱导IL6和IL8诱导依赖于转运蛋白介导的药物摄取。该结果与iPS(包皮)-4衍生第8天的细胞中OCT2的表达(图6g)和活性(图7)相一致。

预测性能：接下来解决是否能够使用hiPSC衍生的HPTC样细胞预测药物的PTC特异性肾毒性。这个问题使用基于IL6/IL8的测定进行处理(全部步骤参见图1)。简略地，iPS(包皮)-4衍生第8天细胞过夜暴露于30种化合物(表2和3)。这些可以被分成两组。组1含有在人中对PTC直接有毒的18种肾毒物(表2和3)。组2含有在人中对PTC没有毒的化合物。这组包含4种非肾毒性化合物和8种不直接损害PTC的肾毒物(表2和3)。除了损害PTC的化合物马兜铃酸之外，所有的化合物在以前报道的研究中被使用，并且提供了在人中化合物的肾毒性的详细信息(Li等人,Toxicol.Res.2(2013),352-362；Li等人.Mol.Pharm.11(2014),1982-1990)。在暴露过夜之后，通过qPCR确认IL6和IL8的水平变化。表2和3显示以所有测试浓度、所有30种化合物IL6和IL8表达水平的结果。在测试期间所有化合物是未揭盲的(blinded)。

表2.在iPS(包皮)-4衍生第8天细胞中化合物诱导的IL-6表达

表3.在iPS(包皮)-4衍生第8天的细胞中化合物诱导的IL-8表达

在第8天晚上处理细胞所使用的化合物列在表2和表3的左侧。组1(对PTC直接有毒的肾毒物)包含化合物1-18。组2(对PTC无毒的化合物)包含化合物19-30。化合物19-26是不直接损害PTC的肾毒物，以及化合物27-30是在人中无肾毒性的。每种化合物以1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml和1,000μg/ml的浓度应用。0代表载体对照(化合物浓度：0μg/ml)。在第9天早上，通过qPCR确定IL6和IL8表达水平。在一些情况中，由于大量细胞死亡不能确定(ND)IL6或IL8表达水平。该结果显示平均值+/-s.d.(n＝3)。所有结果以各自的载体对照归一化，并且载体对照的平均值被设置为1。

然后，对于每种化合物，使用对数逻辑模型估算其IL6和IL8剂量反应曲线，并且根据估算的曲线确定最高测试剂量的反应(IL6最高和IL8最高，图10a)。基于这些特征，使用称为支持向量机(SVM)的自动分类器将化合物分类至组1和组2。

最后，使用交叉验证步骤将所有化合物随机划分至两种不重叠的子集，以其中一个子集训练分类器，并以另一个未使用的子集测试训练分类器。发现HPTC样细胞具有与使用HPTC获得的平均值相似的预测准确度(交叉验证平衡准确度＝88％对比87％，表4)。我们还使用所有化合物训练了最终的SVM分类器，并且发现在HPTC样细胞和3个批次的HPTC中的2个的情况中，分类器可以完美地分离两组(最终准确度＝100％，图10b)

表4.交叉验证的肾毒性预测性能

使用标准的3倍交叉验证步骤以10次随机试验估算SVM分类器的性能。显示的平均值是源自不同供体的3个批次的HPTC(HPTC1、HPTC2、HPTC3)的平均值。为便于比较，平均的HPTC值和使用HPTC样细胞获得的值以粗体印刷。

综上，这些结果显示hiPSC衍生的HPTC样细胞结合SVM分类器可以被用于预测药物的PTC特异性肾毒性。

在本说明书中提及的所有出版物和专利申请都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇出版物或专利申请被具体地且单独地指出以被引用作为参考那样。任何出版物的引用为在申请日前公开的内容，并且不应将其解释为由于先于本发明而承认本发明不早于这些公开。

如在本说明书和所附权利要求书中所用的单数形式的“一(a)”、“一种(an)”和“该(the)”包括复数含义，除非文意另有明确表示。在本申请说明书和所附权利要求书中，所用术语“包括(comprise)”、“包含(comprising)”、“含有(comprises)”和这些术语的其它形式意指非限定的包含含义，换言之，在没有排除其它任何元素或成分的情况下，包括具体所述元素或成分。如在本说明书和所附权利要求书中所用的所有给定的范围或列举旨在包含其含有的任何一个中间值或范围或任何子集。除非另外定义，本文所用全部技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

虽然通过用于清楚理解目的的说明和实施例已经在一定程度上详细描述了前述发明，对本领域普通技术人员来说，显而易见的是，鉴于本发明的教导，在没有脱离所附权利要求的实质或范围的情况下，可以另外进行一些变化和修改。

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Claims (27)

1.一种使诱导性多能干细胞(iPSC)分化成肾近端小管细胞(PTC)样细胞的方法，所述方法包括：

在足以诱导iPSC分化成PTC样细胞的条件下，在存在一种或更多种细胞外基质(ECM)分子、骨形态形成性蛋白2(BMP2)和骨形态形成性蛋白7(BMP7)的肾上皮细胞培养介质中，培养未分化的iPSC，持续约8天至约10天的时间。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述iPSC是人iPSC。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述一种或更多种ECM分子包括低生长因子的基质胶基质。

4.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其中所述肾上皮细胞培养介质包括肾上皮细胞生长介质。

5.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其中初始以约5000至约10000活细胞/cm²的密度接种所述iPSC。

6.根据权利要求5所述的方法，其中初始以约8000活细胞/cm²的密度接种所述iPSC。

7.根据权利要求1至5任一项所述的方法，其中，在所述培养之前，在存在ROCK抑制剂且不存在BMP2和BMP7时初始接种所述iPSC。

8.根据权利要求1至6任一项所述的方法，其中在所述培养期间BMP2以约1ng/ml至约25ng/ml的浓度存在。

9.根据权利要求1至7任一项所述的方法，其中在所述培养期间BMP7以约0.25ng/ml至约10ng/ml的浓度存在。

10.根据权利要求1至9任一项所述的方法，其中在初始接种iPSC后约12至约24小时，将BMP2和BMP7添加至肾上皮细胞培养介质。

11.根据权利1所述的方法，其中所述方法包括：

在无BMP2和BMP7且包含约5μM至约15μM ROCK抑制剂的肾上皮细胞生长介质中，以约8000活细胞/cm²的密度接种未分化的iPSC，持续约12小时至约24小时以允许未分化的iPSC附着至包被有低生长因子基质胶基质的培养支持物；

将肾上皮细胞生长介质更换为无ROCK抑制剂、且包含约2.5ng/ml至约15ng/ml的BMP2和约1ng/ml至约5ng/ml的BMP7的新鲜的肾上皮细胞生长介质；

在足以诱导iPSC分化成PTC样细胞的条件下，在约37℃的温度和在约5％的CO₂中，在包含BMP2和BMP7的肾上皮细胞生长介质中培养iPSC持续约8至约10天的时间；

其中，iPSC是人iPSC。

12.一种PTC样细胞群，其分化自诱导性多能干细胞(iPSC)群，所述诱导性多能干细胞(iPSC)以约5000至约10000活细胞/cm²的密度接种在肾上皮细胞培养介质中持续约7天至约10天的时间，所述肾上皮细胞培养介质存在一种或更多种细胞外基质分子、骨形态形成性蛋白2和骨形态形成性蛋白7。

13.根据权利要求12所述的细胞群，其通过权利要求1至11任一项所述的方法制备。

14.根据权利要求12或13所述的细胞群，其中约90％或以上的细胞表达AQP1、PEPT1、OAT3和GLUT1。

15.根据权利要求12至14任一项所述的细胞群，其包含在人工生物肾脏装置的中空纤维生物反应器中。

16.根据权利要求12至14任一项所述的细胞群，其包含在水凝胶中。

17.根据权利要求12至14任一项所述的细胞群，其包含在生物工程化的组织中。

18.一种生物工程化的组织接枝物，其包含接种有权利要求12至14任一项所述的细胞群的基质。

19.根据权利要求18所述的组织接枝物，其中基质是脱细胞化的基质。

20.根据权利要求18所述的组织接枝物，其中基质是生物工程化的3D肾基质。

21.一种用于筛选化合物的肾毒性的体外方法，该方法包括：

使测试化合物与权利要求12至14任一项的测试细胞群接触；以及

与没有接触测试化合物的对照细胞群比较，确定测试化合物的作用。

22.根据权利要求21所述的方法，其中评估测试群的测试化合物对细胞活力、细胞数量、标记物基因的表达、细胞形态学、细胞骨架成分的排列、细胞因子的易位、ATP耗竭、线粒体损伤、谷胱甘肽(GSH)耗竭、膜损伤、活性氧的产生或DNA损伤的作用。

23.根据权利要求21或22所述的方法，其中根据权利要求1至11任一项所述的方法制备测试细胞群，并且在约8天至约10天的分化之后对测试群进行所述接触，在所述接触前不经收集。

24.一种制备人工生物肾脏装置的方法，该方法包括用权利要求12至14任一项所述的细胞群接种装置。

25.一种在受试者中治疗肾相关疾病的方法，其包括外部连接含有权利要求12至14任一项所述的细胞群的人工生物肾脏装置。

26.一种治疗有需要的受试者中的肾相关疾病的方法，该方法包括将有效量的权利要求12至14、权利要求16和17中任一项所述的细胞群、或者权利要求18至20任一项所述的生物工程化的组织接枝物移植至受试者需要PTC样细胞的部位。

27.根据权利要求25或26所述的方法，其中肾相关疾病包括急性肾损伤、慢性肾脏疾病、终末期肾疾病、肾病、糖尿病肾病、肾病变、布赖特氏病、肾功能不全、肾小球炎、肾小球硬化、或肾炎。