BRPI0813729B1 - Métodos de preparação de massas celulares de cardiomiócitos purificados derivados de células-tronco pluripotentes e de uma película de massas celulares de cardiomiócitos, bem como dispositivo médico e uso das referidas massas celulares - Google Patents

Métodos de preparação de massas celulares de cardiomiócitos purificados derivados de células-tronco pluripotentes e de uma película de massas celulares de cardiomiócitos, bem como dispositivo médico e uso das referidas massas celulares Download PDF

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Abstract

patente de invenção: "métodos de preparação de massas celulares de cardiomiócitos purificados derivados de células-tronco pluripotentes e de uma película de massas celulares de cardiomiócitos, bem como dispositivo médico e uso das referidas massas celulares". a presente invenção refere-se a melhorara da taxa de enxertia pós-transplante de cardiomiócitos que foram purificados em tal proporção que eles estão livres de não-cardiomiócitos e quaisquer componentes derivados de outras espécies. para solucionar o problema, os presentes inventores estudaram a possibilidade de construir massas celulares de cardiomiócitos purificados. como resultado, eles mostraram que o problema declarado poderia ser solucionado pelo fornecimento de um método de preparação de massas celulares de cardiomiócitos derivados de célulastronco pluripotentes, caracterizado pelo fato de que as massas celulares de células agregadas que contêm os cardiomiócitos que foram diferenciados e induzidos a partir de células-tronco pluripotentes, que foram dispersos como células isoladas para se obter, dessa maneira, cardiomiócitos purificados, que foram cultivados depois em um meio de cultura sob condições sem soro, possam ser reagregados.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para MÉTODOS DE PREPARAÇÃO DE MASSAS CELULARES DE CARDIOMIÓCITOS PURIFICADOS DERIVADOS DE CÉLULAS-TRONCO PLURIPOTENTES E DE UMA PELÍCULA DE MASSAS CELULARES DE CARDIOMIÓCITOS, BEM COMO DISPOSITIVO MÉDICO E USO DAS REFERIDAS MASSAS CELULARES.
CAMPO TÉCNICO [001] A presente invenção refere-se principalmente a um método de preparação de massas celulares pela agregação de cardiomiócitos purificados derivados de células-tronco pluripotente obtidas pela dispersão de células isoladas, assim como um método para tratamento de doença cardíaca pela indução de massas de células preparadas de cardiomiócitos para serem enxertadas no tecido cardíaco, e um método de preparação de películas de massas celulares usando as massas celulares de cardiomiócitos.
Antecedentes da Técnica [002] Cardiomiócitos em adultos perdem a atividade proliferativa e o transplante cardíaco é a única maneira de tratar doenças cardíacas graves tais como o infarto do miocárdio e a cardiomiopatia. De fato, entretanto, devido ao problema de falta de doadores de tecido cardíaco, há uma necessidade premente de desenvolver um método de tratamento diferente do transplante cardíaco.
[003] Em contraposição, o uso de cardiomiócitos preparados fora do organismo vivo para suprir com eles parte dos cardiomiócitos doentes é considerado ser a maneira mais promissora de salvar pacientes que têm que depender do transplante cardíaco. Essa abordagem de tratamento é denominada terapia celular no coração. Para trazer essa terapia para a realidade, vários experimentos e erros foram conduzidos. Os métodos sob revisão incluem: usar cardiomiócitos ou mioblastos esqueléticos e células da medula óssea ou similares que foram exPetição 870180135037, de 27/09/2018, pág. 8/73
2/58 traídas de fetos, recém-nascidos ou adultos; usar células-tronco embrionárias diferenciadas; e obter células-tronco (tais como célulastronco somáticas) que são sugeridas existir no organismo vivo e induzir sua diferenciação (Documento de Não-Patente 1: Zhonghua Yi Xue Za Zhi 2003, 83, 1818-22).
[004] Esses métodos podem ser divididos em duas abordagens. Uma abordagem envolve transplantar cardiomiócitos como células isoladas e nesse método os cardiomiócitos dispersos como células isoladas são injetados diretamente em um tecido através de uma agulha de injeção (esse método é referido daqui por diante como um método de injeção). A outra abordagem envolve construir um tecido ou um órgão fora do organismo vivo (que é referida daqui por diante como um método de manipulação de tecido) e esse tecido ou órgão artificial é transferido para o corpo para o tratamento.
[005] Várias tentativas têm sido feitas para implementar o método de manipulação de tecido, e elas incluem: 1) um método no qual os cardiomiócitos são moldados em uma estrutura similar a uma película, que são então acoplados sobre um tecido (Documento de Não-Patente 2: Circulation Research 2002, 90(3):e-40); 2) um método no qual cardiomiócitos e não-cardiomiócitos são misturados nas mesmas proporções como eles existem no tecido cardíaco e uma estrutura tridimensional formada pela mistura é usada para substituir o tecido; 3) um método no qual uma estrutura tridimensional é formada a partir de cardiomiócitos dispersos como células isoladas, com uma estrutura vascular sendo construída posteriormente e a estrutura tridimensional é substituída pelo tecido; e 4) um método no qual, em vez de substituir o tecido cardíaco, um novo órgão auxiliar que ajuda na função inerente do órgão é transplantado para um local ectopicamente (Documento de Não-Patente 3: Circulation Research 2007 2, 100:263-272).
[006] Entretanto, no estágio atual onde vários experimentos e erPetição 870180135037, de 27/09/2018, pág. 9/73
3/58 ros estão a caminho em direção a aplicação terapêutica clínica, nenhum método exibiu ainda dados práticos. Isso é por que o transplante de cardiomiócitos para o coração envolve vários problemas, tais como a inclusão de células diferentes dos cardiomiócitos, baixa taxa de enxerto dos cardiomiócitos transplantados e a inabilidade para excluir componentes derivados de outras espécies.
[007] São conhecidos métodos para usar massas celulares de cardiomiócitos em transplante que são capazes de construir massas celulares que incluem cardiomiócitos fetais ou neonatais de roedor e, de acordo com um relato recente, as massas celulares foram construídas usando células totais (incluindo não-cardiomiócitos) que eram derivadas do coração fetal (Documento de Não-Patente 4: Developmental Dynamics 235;2200-2209, 2006). Com relação ao transplante de cardiomiócitos, foi relatado um caso onde cardiomiócitos fetais de camundongo foram transplantados para corações de camundongos adultos, e que foram confirmados estar enxertados (Documento de NãoPatente: Science 1994, 264(5155):98-101). Entretanto, esse método de transplante de cardiomiócitos envolveu o uso de células totais, as quais no coração fetal completo eram dispersas por meio de colagenase, e assim as células transplantadas eram compostas por uma população de células que compreende uma mistura de cardiomiócitos e não-cardiomiócitos. Também é sabido que cardiomiócitos não purificados derivados de um organismo vivo podem ser transplantados para o coração (Documento de Não-Patente 5: Science 1994, 264(5155):98101; Documento de Não-Patente 1: Zhonghua Yi Xue Za Zhi 2003, 83, 1818-22).
[008] Também é conhecido um método no qual, no processo de diferenciação de corpos embrioides a partir de células ES, os corpos embrioides são tratados incompletamente com uma enzima proteolítica, e como conseqüência uma população que compreende massas
Petição 870180135037, de 27/09/2018, pág. 10/73
4/58 celulares que são ricas e aquelas que não são ricas em cardiomiócitos é obtida e depois é submetida à centrifugação com gradiente de densidade, obtendo-se dessa maneira massas celulares que contêm até cerca de 70% de cardiomiócitos (Documento de Patente 1: US20050214938A).
[009] Entretanto, cada um desses métodos envolve o uso de uma população de células que também contém células diferentes dos cardiomiócitos e a contaminação de tais células por outras diferentes dos cardiomiócitos pode ter o potencial de causar sérios efeitos colaterais imprevisíveis que podem ameaçar a vida de um paciente após o transplante. Sob essas circunstâncias, é considerado necessário que os cardiomiócitos a serem submetidos à terapia de transplante devam ser usados após a purificação.
[0010] Vários relatos descreveram avanços no transplante de cardiomiócitos não purificados derivados de célula ES para o coração e deixando-os para ser enxertados depois (Documento de Não-Patente 6: Cardiovasc. Res. 17 de Maio de 2007; Documento de Não-Patente 7: Stem Cells. 31 de Maio de 2007; e Documento de Não-Patente 8: FASEB J. 13 de Abril de 2007). De acordo com um documento recente, que discutiu a purificação de cardiomiócitos derivados de células ES e a injeção deles no coração, a taxa de enxertia dos cardiomiócitos transplantados foi extremamente baixa e nenhum cardiomiócito foi encontrado estar enxertado (isto é, aqueles que sobreviveram dentro do órgão hospedeiro e permaneceram aderidos a ele por um período de tempo prolongado); como se constatou mais tarde, os cardiomiócitos derivados de célula ES purificados não foram capazes de ser enxertados depois que eles foram transplantados para um indivíduo (organismo vivo) (Documento de Não-Patente 9: J. Exp. Med. 2006; 203:231527).
[0011] Esse relato trouxe clareza para a dificuldade de induzir que
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5/58 cardiomiócitos purificados sejam enxertados após o transplante. A fim de solucionar esse problema, foi descoberto, no mesmo relato, um método que envolve o transplante de cardiomiócitos derivados de célula ES em mistura com fibroblastos embrionários de camundongo com o propósito de intensificar sua taxa de enxertia após o transplante (Documento de Não-Patente 9: J. Exp. Med. 2006; 203:2315-27). Esse mostra que nenhum dos métodos conhecidos é capaz de transplantar cardiomiócitos derivados de célula ES purificados que permaneçam enxertados enquanto mantêm sua pureza.
[0012] Além disso, a fim de preparar transplantes de célula que são pretendidos para uso em terapia sobre o corpo humano, o soro e outros fatores que são derivados de outros animais devem ser excluídos. No método de preparação de cardiomiócitos a serem usados no transplante, a cultura é geralmente realizada na presença de soro; mas sabe-se que sob condições sem soro, as células ES humanas podem formar corpos embrioides, que contêm cardiomiócitos em quantidades comparáveis àquelas obtidas pela cultura comum na presença de soro (Documento de Não-Patente 10: Stem cells and development 15:931-941, 2006). Entretanto, nenhum outro relato conhecido incluindo esse relato descreveu um caso de transplante de cardiomiócitos que foram preparados sem o uso de fatores, tais como o soro, que eram derivados de outros animais.
[0013] Assim, a fim de que os cardiomiócitos possam ser transplantados com sucesso para o coração, vários problemas, tais como a inclusão de células diferentes dos cardiomiócitos, a baixa taxa de enxertia de cardiomiócitos transplantados e a inabilidade para excluir componentes derivados de outras espécies, devem ser solucionados todos juntos.
[0014] Além disso, em conexão com seu transplante para o tecido cardíaco, é considerado transplantar cardiomiócitos na forma das asPetição 870180135037, de 27/09/2018, pág. 12/73
6/58 sim chamadas películas de células. Com relação à preparação de películas de células, sabe-se que cardiomiócitos neonatais são usados para formar uma película de camada única e até três de tais películas podem ser estratificadas in vitro (Documento de Não-Patente 11: FASEB J. Abril de 2006; 20(6):708-10). Entretanto, esse documento também estabelece que, devido à permeabilidade limitada ao oxigênio, essas películas de células não podem ser feitas de qualquer espessura sem a neovascularização para a película de células e não é possível ainda preparar uma película de células desejada que se ajuste ao tecido doente do coração.
[0015] Como descrito acima, o estágio atual da técnica é tal que a preparação de cardiomiócitos a serem usados em transplante e o transplante desses cardiomiócitos necessitam de aperfeiçoamentos adicionais do ponto de vista da viabilidade prática.
Documento de Patente 1: US 2005-0214938 A
Documento de Não-Patente 1: Zhonghua Yi Xue Za Zhi 2003, 83, 1818-22
Documento de Não-Patente 2: Circulation Research 2002, 90(3):e-40 Documento de Não-Patente 3: Circulation Research 2007 2, 100: 263272
Documento de Não-Patente 4: Developmental Dynamics 235; 2200-2209, 2006
Documento de Não-Patente 5: Science 1994, 264(5155): 98-101 Documento de Não-Patente 6: Cardiovasc Res. 2007 May 17 (Flk1(+) cardiac stem/progenitor cells derived from embryonic stem cells improve cardiac function in a dilated cardiomyopathy mouse model) Documento de Não-Patente 7: Stem Cells. 2007 May 31 (Differentiation in vivo of Cardiac Committed Human Embryonic Stem Cells in Post-Myocardial Infarcted Rats)
Documento de Não-Patente 8: FASEB J. 2007 Apr 13 (Identification
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7/58 and selection of cardiomyocytes during human embryonic stem cell differentiation)
Documento de Não-Patente 9: J Exp Med. 2006 Oct 2; 203(10): 231527
Documento de Não-Patente 10: Stem Cell and Development 15: 931941,2006
Documento de Não-Patente 11: FASEB J. 2006 Apr; 20(6): 708-10 DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
Problemas a serem Resolcidos pela Invenção [0016] Portanto, os presentes inventores estudaram as condições essenciais que são adotadas, pelo menos no momento, para o uso clínico de cardiomiócitos cultivados e encontraram, como resultado, os seguintes problemas:
(1) purificação de cardiomiócitos: quando os cardiomiócitos são obtidos de organismo vivo ou de células-tronco pluripotentes, não se pode garantir com segurança se eles estão contaminados por células desconhecidas, assim em qualquer que seja o caso, é essencial que os cardiomiócitos sejam altamente purificados. A fim de manter a pureza de tais cardiomiócitos altamente purificados de uma maneira consistente, pode ser necessário que o cardiomiócito obtido do organismo vivo ou de células-tronco pluripotentes seja disperso como células distintas (como células isoladas), as células individuais sendo distinguidas de um outro tipo de célula tal que apenas os cardiomiócitos possam ser selecionados.
(2) Origem dos cardiomiócitos: as diferenças nas propriedades dos cardiomiócitos que existem entre as espécies causam não apenas o problema da rejeição imune e problemas éticos, mas também influenciam seriamente na segurança e eficácia clínicas, assim é importante usar células de um doador da mesma espécie do indivíduo receptor.
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8/58 (3) Exclusão de fatores derivados de animais de outras espécies: para evitar a imunogenicidade e a contaminação por patógenos desconhecidos, contaminantes, tais como o soro, que são derivados de animais de outra espécie devem ser excluídos.
(4) Enxerto de cardiomiócitos transplantados: Cardiomiócitos transplantados são demandados funcionar da mesma maneira como os cardiomiócitos do hospedeiro, mas em primeiro lugar, eles devem ser enxertados nos cardiomiócitos do hospedeiro (mantidos enxertados por um período de tempo prolongado).
(5) As células devem amadurecer (crescer até um tamanho maior) no próximo estágio.
[0017] Resumidamente, o objetivo da presente invenção é fornecer um meio pelo qual os cardiomiócitos que foram purificados em tal grau que eles estão isentos de não-cardiomiócitos e de quaisquer componentes derivados de outras espécies possam ser transplantados com uma taxa de enxertia aperfeiçoada que promova a maturação. MEIOS PARA SOLUCIONAR OS PROBLEMAS [0018] A fim de aperfeiçoar a taxa de enxertia de cardiomiócitos que eram derivados de um organismo vivo ou de células-tronco pluripotentes e que eram purificados em tal grau que eles estavam isentos de não-cardiomiócitos e de quaisquer componentes derivados de outras espécies, os presentes inventores estudaram a possibilidade de construir massas celulares a partir dos cardiomiócitos purificados. Como resultado, revelou-se que o objetivo estabelecido acima pode ser solucionado pelo fornecimento de um método de preparação de massas celulares de cardiomiócitos derivadas de células-tronco embrionárias pluripotentes (células ES) ou de células-tronco pluripotentes induzidas (células iPS), caracterizado pelo fato de que as massas celulares que contêm os cardiomiócitos que tenham sido diferenciados e induzidos a partir de células ES ou de células iPS, sejam dispersas como
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9/58 células isoladas para dessa maneira se obter cardiomiócitos purificados, que eram então cultivados em um meio de cultura sob condições sem soro, tal que eles eram reagregados.
[0019] Os inventores da presente invenção usaram primeiro cardiomiócitos derivados de um organismo vivo e estudaram a possibilidade de solucionar o objetivo acima estabelecido. Para ser mais específico, usando os cardiomiócitos derivados de um organismo vivo que tenham sido purificados em tal grau que eles estavam isentos de nãocardiomiócitos e de quaisquer componentes derivados de outras espécies, os presentes inventores estudaram a possibilidade de aperfeiçoar a taxa de enxertia de tais cardiomiócitos após o transplante.
[0020] Como se constatou mais tarde, os cardiomiócitos purificados derivados de um organismo vivo não foram capazes de formar massas celulares mesmo depois de um intervalo de 24 horas de cultura em um meio de cultura contendo 10% de soro. Esse resultado sugeriu fortemente que o método conhecido de formação de massas celulares de cardiomiócitos, como os derivados do organismo vivo, que foi efetuado em um estado impuro, era acentuadamente dependente da ação auxiliar de não-cardiomiócitos. Em um estudo experimental posterior conduzido para ver como os cardiomiócitos purificados derivados de um organismo vivo se comportavam sob condições sem soro, essas células foram incapazes de construir massas celulares; pelo contrário, elas próprias sofreram morte celular. Esses resultados levaram à conclusão de que a construção de massas celulares de cardiomiócitos não purificados derivados de um coração de um organismo vivo é uma técnica improvável e que até é impossível predizer o comportamento, em uma condição isenta de soro, de cardiomiócitos purificados derivados do coração de um organismo vivo.
[0021] Depois, nos métodos conhecidos de preparação de massas celulares de cardiomiócitos agregados, as células derivadas do coraPetição 870180135037, de 27/09/2018, pág. 16/73
10/58 ção de animais recém-nascidos ou fetais foram usadas, as quais foram cultivadas em um meio de cultura contendo soro. Isso é baseado no conhecimento comum de que o soro tem geralmente um forte efeito protetor, independente da espécie da célula. Entretanto, como mencionado antes, se a terapia é realizada no corpo humano, o uso de fatores derivados de outros animais (tais como o soro) deve ser evitado. Portanto, usando meios isentos de soro que foram suplementados com vários aditivos contendo substitutos de soro em vez do soro, os presentes inventores estudaram a habilidade de agregação dos cardiomiócitos derivados de um organismo vivo. Entretanto, sob qualquer uma das condições sem soro testadas, os cardiomiócitos derivados de um organismo vivo foram incapazes de construir as massas celulares desejadas e sua taxa de sobrevivência também foi pequena.
[0022] Considerando um relato que estabelece um método conhecido que quando cardiomiócitos derivados de um organismo vivo eram cultivados como massas celulares, a sobrevivência dos cardiomiócitos era mantida por um período de tempo prolongado, os presentes inventores fizeram uma tentativa de formar massas celulares de cardiomiócitos purificados, como os derivados do organismo vivo, sob condições sem soro. Entretanto, como foi constatado mais tarde, nenhuma massa celular pode ser formada após cinco dias de cultura. Esse resultado experimental forneceu uma nova descoberta de que, sob condições sem soro, os cardiomiócitos purificados derivados de um organismo vivo não eram capazes de construir massas celulares.
[0023] Portanto, os presentes inventores especularam que seria possível ultrapassar essa dificuldade técnica com a alteração de fonte de fornecimento de cardiomiócitos. Como resultado da realização de estudos similares com várias fontes de fornecimento, os presentes inventores revelaram que cardiomiócitos derivados de células-tronco embrionárias purificadas se agregam bastante rapidamente em apePetição 870180135037, de 27/09/2018, pág. 17/73
11/58 nas 12 horas mesmo em condições sem soro, através do que massas tridimensionais de células puderam ser construídas, e que elas já tinham começado a se contrair sincronicamente naquele momento. [0024] Isso mostra que cardiomiócitos derivados de células-tronco embrionárias são capazes de construção de adesão celular eficiente entre cardiomiócitos purificados e isso também mostra que os cardiomiócitos purificados derivados de células-tronco embrionárias têm grande habilidade de agregar sob condições sem soro. Como essa descoberta foi reproduzida com mais de uma espécie usando célulastronco embrionárias derivadas das respectivas espécies, o achado descrito acima pode ter uma natureza que é comum aos cardiomiócitos derivados de humanos e alternativamente derivados de célulastronco embrionárias. Baseado na natureza específica para essa célulatronco embrionária sob condições sem soro, os presentes inventores formaram, com sucesso, massas celulares de cardiomiócitos purificados sob condições sem soro pela primeira vez na técnica.
[0025] Adicionalmente, foi predito a partir de um relato conhecido, que cardiomiócitos derivados de células-tronco embrionárias que tinham taxa de enxertia baixa após o transplante também poderiam ter baixa capacidade de se reagregar (Transplantation 70:1310-1317, 2000); por outro lado, foi predito que a simples tentativa de agregar os cardiomiócitos derivados de células-tronco embrionárias poderia ser difícil de realizar, fazendo acreditar que eles não poderiam ser agregados. Não obstante, contrariamente a essa predição, os presentes inventores mostraram pela primeira vez na técnica que os cardiomiócitos purificados derivados de células-tronco embrionárias poderiam construir massas celulares sem o auxílio de outras células e que uma melhora significativa na taxa de enxertia celular poderia ser atingida pelo uso das massas celulares construídas no transplante. Resumidamente, os presentes inventores descobriram, com sucesso, que os cardio
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12/58 miócitos derivados de células-tronco embrionárias tinham características totalmente diferentes dos cardiomiócitos derivados do coração no organismo vivo por que eles podiam ser purificados como células isoladas e eles podiam construir massas celulares mesmo em condições sem soro.
[0026] Além disso, com a intenção de descobrir um método pelo qual massas celulares mais adequadas para o transplante pudessem ser preparadas a partir do cardiomiócitos derivados de células-tronco embrionárias, os presentes inventores estudaram aditivos que pudessem ser adicionados aos meios de cultura como um recurso pelo qual os cardiomiócitos derivados das células-tronco embrionárias pudessem construir massas celulares mais eficientemente sob condições sem soro. Como resultado, quando a insulina, transferrina e selênio (ITS) foram adicionados como aditivos, as massas celulares mostraram uma pulsação espontânea mais acentuada do que as massas celulares as quais ITS não foi adicionado e esse fenômeno foi observado com boa reprodutibilidade. Resumidamente, a adição de ITS (em particular de insulina) foi mostrada ser desejável para a construção de massas celulares usando os cardiomiócitos purificados derivados das células-tronco embrionárias. Observa-se que a insulina é o fator mais importante de ITS, com a transferrina e o selênio desempenhando um papel auxiliar.
[0027] Na próxima etapa, os presentes inventores adicionaram ITS a um meio de cultura basal sem soro (daqui por diante referido como o meio de cultura basal) e adicionaram depois um fator de crescimento básico de fibroblasto (bFGF) e/ou um fator de crescimento 1 similar à insulina (IGF1) ao meio de cultura basal; como se constatou mais tarde, quando bFGF sozinho foi adicionado, as massas celulares no dia 5 após a sua formação tiveram um aumento significativo no diâmetro, indicando que as células de interesse foram protegidas. Esse fenômePetição 870180135037, de 27/09/2018, pág. 19/73
13/58 no não foi observado sob condições de cultura contendo soro sob as quais bFGF foi adicionado sozinho. Era sabido que bFGF tinha uma ação protetora da célula, uma ação que promovia o crescimento celular e similares sobre os cardiomiócitos sendo cultivados sob tais condições experimentais que a cultura plana foi realizada na presença de soro suplementado (J Mol Cell Cardiol Janeiro de 2007; 42(1):222-33; e Cardiovasc Res. 2004; 64:516-25), mas era totalmente desconhecido que o crescimento prolongado e a proteção dos cardiomiócitos pudessem ocorrer sob condições sem soro.
[0028] Esse efeito foi maior do que aquele observado quando as massas celulares foram formadas usando um meio de cultura suplementado com 10% de soro; por outro lado, no caso onde bFGF foi adicionado mas as massas celulares não se formaram na cultura planar, o efeito de interesse foi menor do que aquele que foi observado quando massas celulares eram formadas usando o meio de cultura suplementado com 10% de soro. A partir dos resultados desses dois experimentos, foi presumido que, a fim de assegurar que bFGF pudesse produzir os efeitos de proteção da célula e promoção de crescimento maiores do que aqueles obtidos pela formação de massas celulares usando o meio de cultura suplementado com 10% de soro, ele era essencial para construir massas celulares.
[0029] Portanto, a fim de confirmar se a construção de massas celulares era uma condição essencial para que aqueles efeitos fossem exibidos, os presentes inventores realizaram uma cultura planar aderente de cardiomiócitos derivados de células-tronco embrionárias purificadas de camundongo, com bFGF adicionado ao meio de cultura, e analisaram os resultados do bFGF adicionado.
[0030] Na cultura planar, onde não se formaram massas celulares, os cardiomiócitos dificilmente poderiam sobreviver em tal ambiente que ITS foi adicionado ao meio de cultura basal. Entretanto, após a
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14/58 adição de bFGF, mais células foram encontradas vivas e aderidas à placa de cultura. Essa ação foi menor do que o efeito que foi observado quando as massas celulares eram formadas usando o meio de cultura suplementado com 10% de soro.
[0031] No caso da construção de massas celulares de cardiomiócitos purificados derivados das células-tronco embrionárias, a atuação da condição de sem soro + ITS + bFGF foi comparada com a atuação de 10% de soro após uma cultura prolongada; no meio cultura que contém 10% de soro, o tamanho das massas celulares diminuiu significativamente enquanto que ele aumentou significativamente no grupo sem soro + ITS + bFGF. Isso indicou que a ação de bFGF, como descoberta pelos presentes inventores, era o efeito sinérgico dos três elementos, purificação, sem soro e massas celulares.
[0032] A partir desse resultado, os presentes inventores descobriram que a adição de ITS e/ou bFGF ao meio de cultura sem soro permitiu que as massas celulares de cardiomiócitos mantivessem seu estado por um período de tempo prolongado. Em virtude dessa descoberta, a taxa de sobrevivência dos cardiomiócitos pode ser aumentada em 90% ou mais, um aperfeiçoamento excelente sobre o valor de 60 a 70% do método de cultura planar convencional.
[0033] Antes da realização da presente invenção, as massas celulares de cardiomiócitos não podiam ser construídas sob condições sem soro e de alta pureza; entretanto, com base no precedente, os presentes inventores resolveram essa dificuldade pelo uso de cardiomiócitos derivados das células-tronco embrionárias; também descobriu-se que massas celulares de cardiomiócitos poderiam ser construídas mais eficientemente na presença de ITS ou bFGF adicionados.
[0034] Assim, em uma das modalidades, a presente invenção também fornece um método de preparação de massas celulares de cardiomiócitos derivados das células-tronco embrionárias, caracterizaPetição 870180135037, de 27/09/2018, pág. 21/73
15/58 do pelo fato de que os cardiomiócitos purificados derivados das células-tronco embrionárias obtidos pela dispersão de massas celulares agregadas que contêm cardiomiócitos diferenciados e induzidos a partir de células-tronco embrionárias como células isoladas são cultivados em um meio de cultura sob condições em soro tal que eles são reagregados. O meio de cultura a ser usado para a cultura acima descrita é desejavelmente suplementado pelo menos com insulina entre ITS e, em uma modalidade mais desejável, bFGF também pode ser fornecido. No método descrito acima, as massas celulares dispersas como células isoladas não precisam ser cultivadas em um espaço isolado como nos métodos conhecidos, mas elas podem ser divididas em grupos de 10.000 células no máximo e cultivadas em um número correspondente de espaços independentes.
[0035] Se contaminadas por não-cardiomiócitos proliferativos, massas celulares de células agregadas crescerão até um tamanho extremamente grande e também alterarão a morfologia. Em adição a esse indicador, a coloração com um corante fluorescente que se acumula na mitocôndria pode ser usada para identificar as células proliferativas como aquelas nas quais o corante encontra dificuldade para se acumular. As massas celulares contaminadas por tais nãocardiomiócitos podem ser rejeitadas para uso na terapia com transplante ou similares de maneira a assegurar que a menor contaminação por não-cardiomiócitos proliferativos está excluída das células implantadas.
[0036] Além disso, foi descrito previamente que cardiomiócitos purificados derivados das células-tronco embrionárias dispersos como células desagregadas (células isoladas) não eram enxertados se transplantados como tal para o tecido cardíaco de um indivíduo (o organismo vivo) e os presentes inventores obtiveram o mesmo resultado. Na técnica anterior, esse problema foi solucionado pela mistura de
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16/58 cardiomiócitos purificados derivados das células-tronco embrionárias com células auxiliares, mostrando claramente que a ação protetora de não-cardiomiócitos no organismo vivo é essencial para a sobrevivência dos cardiomiócitos. Entretanto, a contaminação de não-cardiomiócitos pode causar potencialmente efeitos colaterais sérios imprevisíveis que podem ameaçar a vida de um paciente após o transplante, e portanto os presentes inventores especularam uma maior segurança e um maior efeito terapêutico poderiam ser assegurados se os cardiomiócitos purificados pudessem ser transplantados em um indivíduo (o organismo vivo) sem misturá-los com células auxiliares, mas mantendo-os em alta pureza.
[0037] Portanto, os presentes inventores tiveram a idéia de utilizar as massas celulares de cardiomiócitos purificados derivados das células-tronco embrionárias obtidas pelo método acima descrito e descobriram que pelo transplante daquelas massas celulares para o tecido cardíaco de um indivíduo (o organismo vivo), a taxa de enxertia após o transplante poderia ser significativamente melhorada. Em outras palavras, os presentes inventores descobriram que quando os cardiomiócitos purificados derivados das células-tronco embrionárias obtidos pela dispersão de massas celulares em células isoladas eram cultivados em um meio de cultura sob condições sem soro, tal que elas eram reagregadas para formar massas celulares, a taxa de enxertia dos cardiomiócitos purificados derivados das células-tronco embrionárias após o transplante poderia ser significativamente melhorada.
[0038] Portanto, outra modalidade da presente invenção refere-se a um método para tratar doença cardíaca, caracterizado pelo fato de que as massas celulares obtidas pela reagregação de cardiomiócitos que são derivados de células-tronco embrionárias e que foram purificados pela dispersão em células isoladas são transplantados para o tecido cardíaco (especialmente, uma parte doente do tecido cardíaco)
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17/58 em um indivíduo (o organismo vivo) tal que eles sejam enxertados. A expressão enxerto como usada aqui significa sobrevivência dentro do organismo hospedeiro e ficar aderido nele por um período de tempo prolongado.
[0039] Além disso, como descrito acima, houve um método conhecido que possibilitou que até três películas de monocamadas de cardiomiócitos neonatais fossem estratificadas, mas nenhuma película mais espessa de cardiomiócitos pode ser preparada.
[0040] Para solucionar esse problema, os presentes inventores tiveram a idéia de utilizar as massas de cardiomiócitos purificados derivados das células-tronco embrionárias obtidas pelo método acima. As massas celulares de interesse foram construídas pelo método acima e as massas celulares obtidas foram recuperadas e semeadas sobre a superfície de um recipiente com paredes divididas, não-aderente às células, sem espaço entre massas celulares tal que as massas celulares adjacentes puderam estar continuamente em contato uma com a outra, seguido pela cultura em suspensão. Como resultado, as massas celulares foram conjugadas juntas ao longo do tempo para formar uma película de massas celulares de cardiomiócitos com uma espessura de 50 a 300 pm; foi descoberto então que uma assim chamada película de célula que tem uma espessura maior do que o limite da técnica anterior poderia ser preparada fora do organismo vivo. Assim, tornou-se claro que, nos moldes do pedido atual, um número desejado de massas celulares em um tamanho desejado de cardiomiócitos purificados derivados das células-tronco embrionárias poderia ser usado para preparar uma película de células de um tamanho desejado.
[0041] Portanto, uma modalidade adicional da presente invenção refere-se a um método para a preparação de uma película de massas celulares de cardiomiócitos (película de célula), caracterizado pelo fato de que as massas de células de cardiomiócitos purificados derivados
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18/58 das células-tronco embrionárias são submetidas à cultura em suspensão conforme elas são colocadas em intervalos pequenos no mesmo plano e a cultura em suspensão é realizada até que as massas celulares sejam unidas para ter uma espessura desejada entre 50 e 300 pm. [0042] A presente invenção revelou que as massas celulares de cardiomiócitos purificados derivados das células-tronco embrionárias que possuem as características descritas acima podem ser transplantadas para o tecido cardíaco tal que elas são enxertadas. Essas massas celulares podem ser usadas como um dispositivo médico para transplante que pode ser transplantado para corpos de animais incluindo o corpo humano.
[0043] Portanto, em uma modalidade adicional da presente invenção, é fornecido um dispositivo médico que compreende massas celulares de cardiomiócitos derivados das células-tronco embrionárias que foram preparadas por um método que compreende a preparação de massas celulares de células agregadas que contêm cardiomiócitos diferenciados e induzidos a partir de células-tronco embrionárias, dispersando as massas celulares em células isoladas para se obter dessa maneira cardiomiócitos purificados derivados das células-tronco embrionárias e cultivando os cardiomiócitos em um meio de cultura sob condições sem soro tal que eles são reagregados. Esse dispositivo médico tem uso pretendido no transplante tal que ele é transplantado para o tecido cardíaco de um indivíduo de modo a ser enxertado; ele exibe um efeito significativo por que ele pode ser aplicado a um paciente que necessita de transplante cardíaco.
[0044] Portanto, os presentes inventores fizeram estudos intensivos sobre condições de cultura que podem permitir um aperfeiçoamento significativo da taxa de sobrevivência de cardiomiócitos derivados das células-tronco embrionárias que foram dispersos como células desagregadas (células isoladas) para se tornarem completamente purifiPetição 870180135037, de 27/09/2018, pág. 25/73
19/58 cados; como resultado, descobriu-se que os cardiomiócitos que têm tal característica nova se agregam para formar massas celulares quando eles são cultivados em um meio de cultura sob condições que não contêm soro derivado de animal (isto é, condições sem soro), preferivelmente em um meio de cultura que contém insulina, mais preferivelmente em um meio de cultura que contém transferrina, selênio e/ou fator de crescimento básico de fibroblastos além da insulina. Os presentes inventores transplantaram essas células para o tecido cardíaco de um indivíduo (organismo vivo) e obtiveram uma nova descoberta, de que sua taxa de enxertia no tecido foi significativamente melhorada. Os presentes inventores obtiveram outra descoberta nova de que, usando essas células, poderia ser obtida uma película de massas celulares de cardiomiócitos que tem uma espessura maior do que aquela esperada a partir da técnica conhecida, assim como um dispositivo médico que compreende essas massas celulares; essas descobertas levaram à realização da presente invenção.
[0045] Essas descobertas foram obtidas pelo cultivo de células embrionárias e descobertas similares também podem ser obtidas pelo uso de outras células-tronco pluripotentes em vez das células-tronco embrionárias. Para expressar mais especificamente, quando as células-tronco pluripotentes que foram dispersas como uma suspensão de células desagregadas (células isoladas) para se tornarem completamente purificadas, foram cultivadas em um meio de cultura sob condições que não contêm soro derivado de animal (isto é, condições sem soro), preferivelmente em um meio de cultura que contém insulina, mais preferivelmente em um meio de cultura que contém transferrina, selênio e/ou fator de crescimento básico de fibroblastos além da insulina, essas células foram capazes de se agregar para formar massas celulares e a taxa de sobrevida dos cardiomiócitos pode ser consideravelmente melhorada. As células-tronco pluripotentes que podem ser
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20/58 usadas incluem não apenas as células-tronco embrionárias, mas também todas as outras células-tronco pluripotentes que têm características similares àquelas das células-tronco embrionárias, como as derivadas de órgãos e tecidos adultos em mamíferos, assim como suas células da medula óssea, células sanguíneas e até células embrionárias e fetais; são exemplos as células germinativas embrionárias (células EG), as células-tronco da linhagem germinativa (células GS) e células-tronco pluripotentes induzidas (células iPS).
[0046] Portanto, a presente invenção refere-se aos seguintes assuntos:
(1) um método de preparação de massas celulares de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes, caracterizado pelo fato de que os cardiomiócitos purificados derivados de célulatronco pluripotente obtidos pela dispersão de massas de células agregadas que contêm cardiomiócitos diferenciados e induzidos a partir de células-tronco pluripotentes (tais como as células-tronco embrionárias, células germinativas embrionárias, as células-tronco da linhagem germinativa e células-tronco pluripotentes induzidas) em células isoladas são cultivados em um meio de cultura sob condições sem soro de maneira que elas são reagregadas.
(2) O método de acordo com (1) acima, em que o meio de cultura contém insulina.
(3) O método de acordo com (1) ou (2) acima, em que o meio de cultura contém pelo menos uma substância selecionada do grupo que consiste em transferrina, selênio, um fator de crescimento básico de fibroblasto (bFGF), um fator de crescimento de célula epitelial (EGF), um fator BB de crescimento derivado de plaqueta (PDGFBB) e endotelina-1 (ET-1).
(4) O método de acordo com qualquer um de (1) a (3) acima, em que o conteúdo do meio de cultura é de 0,1 a 10 mg/l de insu
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21/58 lina, 0,1 a 10 pg/l de transferrina, 0,1 a 10 pg/l de selênio, 1 ng/ml a 100 ng/ml do fator de crescimento básico de fibroblasto, 1 ng/ml a 1000 ng/ml do fator de crescimento de célula epitelial, 1 ng/ml a 1000 ng/ml do fator de crescimento derivado de plaqueta e 1 x 10-8 a 1 x 106 M de endotelina-1 (ET-1).
(5) Um método de tratamento de doença cardíaca, caracterizado pelo fato de que as massas celulares obtidas pela reagregação de cardiomiócitos que são derivados de células-tronco pluripotentes dispersas como células isoladas são transplantadas para o tecido cardíaco de um indivíduo, tal que elas são enxertadas.
(6) O método de acordo com (5) acima, em que as massas celulares de cardiomiócitos são aquelas obtidas pelo método de acordo com qualquer um de (1) a (4) acima.
(7) O método de acordo com (5) ou (6) acima, em que o transplante compreende injetar massas celulares de cardiomiócitos no tecido cardíaco.
(8) O método de acordo com (5) ou (6) acima, em que o transplante compreende transplantar uma película de massas celulares de cardiomiócitos sobre o tecido cardíaco.
(9) Um método de preparação de uma película de massas celulares de cardiomiócitos, caracterizado pelo fato de que as massas celulares de cardiomiócitos purificados derivados de células-tronco pluripotentes são semeadas sobre a superfície de um recipiente de parede dividida, não-aderente à célula, sem espaço entre as massas celulares tal que massas celulares adjacentes estarão em contato continuamente uma com a outra, seguido pela cultura em suspensão que é mantida até que as massas celulares estejam unidas para ter uma espessura desejada de 50 a 300 Mm.
(10) O método de acordo com (9) acima, em que as massas celulares de cardiomiócitos são aquelas obtidas pelo método de
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22/58 acordo com qualquer um de (1) a (4) acima.
(11) Um dispositivo médico que compreende massas celulares de cardiomiócitos derivados de célula-tronco pluripotente, para uso em transplante para o tecido cardíaco de um indivíduo, tal que elas são enxertadas, em que o dispositivo médico é preparado por um método que compreende preparar massas celulares de células agregadas que contêm cardiomiócitos diferenciados e induzidos a partir de células-tronco pluripotentes, dispersar as massas celulares em células isoladas para se obter dessa maneira cardiomiócitos purificados derivados das células-tronco pluripotentes e cultivar os cardiomiócitos em um meio de cultura sob condições sem soro tal que eles são reagregados.
(12) O dispositivo médico de acordo com (11) acima, em que o transplante compreende injetar as massas celulares de cardiomiócitos no tecido cardíaco.
(13) O dispositivo médico de acordo com (11) acima, em que o transplante compreende transplantar uma película de massas celulares de cardiomiócitos sobre tecido cardíaco.
VANTAGENS DA INVENÇÃO [0047] Foi descoberta pela presente invenção uma característica que descreve que cardiomiócitos derivados de célula-tronco pluripotente que foram purificados pela dispersão como células isoladas têm a habilidade de re-agregar quando eles são cultivados sob condições sem soro. Com a construção de massas celulares pelo método da presente invenção, os cardiomiócitos de interesse podem ser cultivados por um período de tempo prolongado com sua taxa de sobrevivência ou capacidade de crescimento sendo mantida em um nível elevado. Além disso, quando esses cardiomiócitos foram transplantados para o tecido cardíaco de um indivíduo (o organismo vivo), sua taxa de enxertia no tecido foi encontrada estar significativamente aumentada e eles
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23/58 permaneceram enxertados dentro do tecido cardíaco por um período de tempo prolongado sem se misturar com outras células. Essa técnica tem dado praticabilidade a um método que traz uma promessa na terapia celular e um dispositivo médico que compreende massas celulares de cardiomiócitos.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0048] Figura 1 mostra um método de construção de massas celulares de cardiomiócitos usando cardiomiócitos purificados de célulastronco embrionárias que expressam a proteína verde-fluorescente intensificada (EGFP) de camundongo e massas celulares obtidas usando entre 313 e 10.000 cardiomiócitos purificados de células-tronco embrionárias de camundongo.
[0049] A Figura 2 mostra a construção de massas celulares de cardiomiócitos usando cardiomiócitos purificados de células-tronco embrionárias derivadas de mico, tanto 24 horas (Figura 2A) quanto 48 horas (Figura 2B) após a desagregação.
[0050] A Figura 3 mostra os resultados da cultura planar de cardiomiócitos purificados derivados de células-tronco embrionárias de camundongo, em particular, a identificação de um substrato adesivo ótimo para uso na cultura planar baseado na comparação da taxa de sobrevivência celular em substratos adesivos (Figura 3A) e a comparação de massas celulares e a taxa de sobrevivência de cardiomiócitos em cultura planar dependendo da presença de soro no meio de cultura (Figuras 3B e 3C).
[0051] A Figura 4 mostra o método (1) de detecção de célulastronco embrionárias que estão contaminadas nas massas celulares formadas de cardiomiócitos purificados derivados de células-tronco embrionárias de camundongo; as massas celulares marcadas pelas molduras vermelhas foram encontradas conter massas de células gigantes como resultado da proliferação celular.
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24/58 [0052] A Figura 5 mostra o método (2) de detecção de célulastronco embrionárias que estão contaminadas nas massas celulares formadas de cardiomiócitos purificados derivados de células-tronco embrionárias de camundongo; os não-cardiomiócitos contaminados e proliferados podem ser detectados baseados em um sinal fluorescente fraco derivado de TMRM (um reagente que marca especificamente a mitocôndria), tornando claro que, em contraste com massas celulares de cardiomiócitos normais (Figura 5A), as massas celulares de cardiomiócitos anormais estavam contaminadas por não-cardiomiócitos proliferados.
[0053] A Figura 6A mostra que, quando cultivados em uma placa de fundo redondo com 96 poços, não-aderente à célula, os cardiomiócitos purificados derivados de coração neonatal de rato não foram capazes de construir massas celulares mesmo depois de 24 horas de cultura e a Figura 6B mostra que os cardiomiócitos purificados derivados de coração neonatal de rato quando cultivados sob condições sem soro não formaram massas celulares, mas morreram após a passagem de 5 dias.
[0054] A Figura 7 mostra os resultados de uma cultura em uma placa de fundo redondo com 96 poços, não-aderente à célula usando meios sem soro aos quais ITS, bFGF e vários outros aditivos foram adicionados; o efeito de proteção da célula e a atividade promotora de crescimento desses aditivos foram detectados pelos efeitos relevantes que eles tiveram sobre o aumento no diâmetro das massas celulares.
[0055] A Figura 8 mostra os resultados da cultura planar adesiva de cardiomiócitos purificados derivados de células-tronco embrionárias de camundongo em uma placa de cultura revestida com fibronectina; a viabilidade celular era significativamente baixa no grupo sem soro +
ITS e no grupo ITS + bFGF.
[0056] A Figura 9 mostra os resultados da medição da viabilidade
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25/58 de células em tecido de cardiomiócitos isolados purificados derivados de células-tronco embrionárias de camundongo após eles terem sido transplantados para o coração sem a aplicação do método reagregante, já que eles permaneceram como células dispersas.
[0057] A Figura 10 mostra que, quando cardiomiócitos purificados derivados de células-tronco embrionárias de camundongo formados em massas celulares pelo método de reagregação foram marcados com um corante vermelho (Mitotracker Red) e transplantados para o coração, os cardiomiócitos sobreviveram eficientemente.
[0058] A Figura 11 mostra os resultados do transplante para o coração de massas celulares de cardiomiócitos purificados derivados de células-tronco embrionárias de camundongo que expressam EGFP após a reagregação; Figuras 11A e 11B mostram o resultado da análise da taxa de sobrevivência das células no tecido cardíaco pela medição da contagem celular no tecido cardíaco, e as Figuras 11C e 11D mostram que as massas de cardiomiócitos de camundongo permaneceram enxertadas no coração do hospedeiro por um período prolongado e puderam amadurecer com o passar do tempo.
[0059] A Figura 12 mostra o resultado da preparação de massas celulares de cardiomiócitos purificados derivados de células-tronco embrionárias de mico sob uma condição sem soro (Figura 12A), uma condição sem soro e suplementada com KSR (Figura 12B) e uma condição sem soro e suplementada com ITS (Figura 12C).
[0060] A Figura 13 mostra a preparação de películas de cardiomiócitos dos tamanhos desejados que têm a espessura desejada, usando massas celulares de cardiomiócitos purificados derivados de células-tronco embrionárias de mico.
[0061] A Figura 14 mostra que as massas celulares de cardiomiócitos derivados de células-tronco embrionárias purificadas humanas podem ser preparadas sob uma condição sem soro.
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26/58 [0062] A Figura 15 mostra que cardiomiócitos derivados de células-tronco humanas que foram transplantados para o coração de camundongos imunodeficientes puderam sobreviver no tecido cardíaco por 2 semanas.
[0063] A Figura 16 mostra que cardiomiócitos derivados de células-tronco humanas que foram transplantados para o coração de camundongos imunodeficientes puderam sobreviver no tecido cardíaco por 5 semanas, como demonstrado por um corante vermelho usado para rastrear as células transplantadas.
[0064] A Figura 17 mostra que cardiomiócitos derivados de células-tronco humanas que foram transplantados para o coração de camundongos imunodeficientes puderam sobreviver no tecido cardíaco por 5 semanas, como demonstrado por corantes (Mitotracker Red; cor vermelha), Mkx 2.5 (verde-água) e um anticorpo anti-actina sarcomérica (verde) que foram usados para rastrear as células transplantadas.
[0065] A Figura 18 mostra que cardiomiócitos derivados de células-tronco humanas que foram transplantados para o coração de camundongos imunodeficientes puderam sobreviver no tecido cardíaco por 5 semanas, como demonstrado pelos corantes Mkx 2.5 (verdeágua) e um anticorpo anti-humano (verde).
[0066] A Figura 19 mostra o resultado da preparação de massas de cardiomiócitos purificados derivados de células iPS de camundongo pela cultura sob uma condição sem soro, uma condição sem soro e suplementada com ITS e uma condição sem soro e suplementada com KSR.
[0067] A Figura 20 mostra o resultado da cultura de cardiomiócitos purificados derivados de células ES humanas sob condições sem soro na presença de bFGF adicionado ou outros fatores de crescimento;
bFGF foi preferido nos efeitos de proteção e ativação do crescimento celular.
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27/58 [0068] A Figura 21 mostra a expressão de genes para bFGF, EGF, PDGE-BB e ET-1 no coração do hospedeiro conforme ela se refere ao mecanismo de maturação para o caso onde as massas celulares de cardiomiócitos de camundongo permanecem enxertadas no coração do hospedeiro por um período de tempo prolongado.
MELHOR MODO DE EXECUTAR A INVENÇÃO [0069] A fim de executar a presente invenção, aqueles versados na técnica que necessitem saber sobre os métodos de biologia molecular, métodos de engenharia genética tais como a tecnologia de DNA recombinante, métodos gerais de biologia celular assim como a técnica anterior podem, a menos que orientados de outra maneira, reportarse para livros padronizados naquelas áreas. Exemplos de tais livros incluem: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition (Sambrook & Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001); Current Protocols in Molecular biology (Ed. by Ausubel et al., John Wiley & Sons, 1987); Methods in Enzymology in series (Academic Press); PCR Protocols: Methods in Molecular Biology (Ed. by Bartlett & Striling, Humana Press, 2003); Animal Cell Culture: A Practical Approach, 3rd Edition (Ed. by Masters, Oxford University Press, 2000); and Antibodies: A Laboratory Manual (Ed. by Harlow et al. & Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1987). Os reagentes e kits para uso em cultura celular e experimentos em biologia celular que são referidos aqui, são disponibilizados por fornecedores comerciais tais como Sigma Aldrich, Invitrogen/GIBCO, Clontech e Stratagene.
(1) Células-tronco pluripotentes [0070] A fim de executar a presente invenção, aqueles versados na técnica que necessitam saber sobre cultura celular usando célulastronco pluripotentes e métodos gerais para experimentos em desenvolvimento e biologia celular podem, a menos que orientados de outra maneira, reportar-se para livros padronizados naquelas áreas. ExemPetição 870180135037, de 27/09/2018, pág. 34/73
28/58 plos de tais livros incluem: Guide to Techniques in Mouse Development (Ed. by Wasserman et al., Academic Press, 1993); Embryonic Stem Cell Differentiation in vitro (M.V. Wiles, Meth. Enzymol. 225:900, 1993); Manipulating the Mouse Embryo: A laboratory manual (Ed. by Hogan et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994); Embryonic Stem Cells (Ed. by Turksen, Humana Press, 2002). Os reagentes e kits para uso em cultura celular e experimentos em desenvolvimento e biologia celular que são referidos aqui são disponibilizados por fornecedores comerciais tais como Invitrogen/GIBCO e Sigma.
[0071] Para os métodos de preparação, cultivo seriado e preservação de células-tronco pluripotentes de camundongo ou humanas, os protocolos padronizados já estão bem estabelecidos e aqueles versados na técnica que querem executar a presente invenção são capazes de usar essas células-tronco pluripotentes consultando uma pluralidade de documentos de referência e similares, além dos livros de referência listados nas seções precedentes. Tais documentos incluem os seguintes: Matsui et al., Cell 70:841, 1992; Thomson et al., Patente dos Estados Unidos 5.843.780; Thomson et al., Science 282: 114, 1998; Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998; Shamblott et al., Patente dos Estados Unidos 6.090.622; Reubinoff et al., Nat. Biotech. 18:399, 2000; e Publicação Internacional WO 00/27995 A1. Para outras espécies de animais, tal como o macaco (Thomson et al., Patente dos Estados Unidos 5.843.780; e Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 7844, 1996), rato (Iannaccone et al., Dev. Biol. 163:288, 1994; e Loring et al., Publicação Internacional WO 99/27076 A1), galinha (Pain et al., Development 122:2339, 1996; Patente dos Estados Unidos 5.340.740; e Patente dos Estados Unidos 5.656.479), e suíno (Wheeler et al., Reprod. Fertil. Dev. 6:563, 1994; e Shim et al., Biol. Reprod. 57:1089, 1997), são conhecidos métodos que podem es
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29/58 tabelecer células pluripotentes, tais como células-tronco embrionárias e células similares à célula-tronco embrionária que podem ser usadas na presente invenção e que podem ser preparadas ou usadas de acordo com os métodos descritos nesses documentos.
[0072] O método da presente invenção pode ser aplicado a células-tronco pluripotentes derivadas de quaisquer mamíferos. Por exemplo, ele pode ser aplicado a células-tronco pluripotentes derivadas de camundongo, bovinos, cabra, cão, gato, mico, macaco rhesus e ser humano; entretanto, ele não está limitado a células-tronco pluripotentes derivadas dessas espécies de animais. As células-tronco pluripotentes a serem usadas na presente invenção podem ser exemplificadas pelas células-tronco embrionárias (células ES) derivadas de mamíferos tais como o camundongo, macaco e ser humano que já são amplamente usadas como células de cultura.
[0073] Exemplos específicos de células-tronco embrionárias derivadas de camundongo incluem a célula EB3, a célula E14, célula D3, célula CCE, célula R1, célula 129SV e a célula J1. As células-tronco embrionárias derivadas de camundongo de acordo com a presente invenção são disponibilizadas pela American Type Culture Collection (ATCC), Chemico, Cell & Molecular Technologies, etc.
[0074] Para as células-tronco embrionárias derivadas de macaco, as linhagens celulares estabelecidas a partir de macaco rhesus (Macaca mulatta) (Thomson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995; 92:7844), macaco cynomolgus (Macaca fascicularis) (Suemori et al., Dev. Dyn. 2001; 222: 273-279) e mico comum (Callithrix jacchus) (Sasaki et al., Stem Cells. 2005; 23: 1304-1313) foram descritas e estão disponíveis. Por exemplo, células-tronco embrionárias de mico também são disponibilizadas pelo Central Institute for Experimental Animals (uma fundação judicial).
[0075] Atualmente, mais do que várias dezenas de linhagens de
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30/58 células-tronco embrionárias derivadas de seres humanos foram definidas no mundo; por exemplo, na lista do US National Institutes of Health (http://stemcells.nih.gov/reqistrv/index.asp), numerosas linhagens celulares estão registradas para uso público e outras linhagens celulares estão disponíveis a partir de fontes comerciais incluindo Cellartis, ES Cell International, Wisconsin Alumni Research Foundatio, etc. No Japão, linhagens de células-tronco derivadas de humanos também são disponibilizadas pelo Stem Cell Research Center, instalações anexas ao Institute for Frontier Medical Sciences, Universidade de Kioto (corporação universitária nacional) (Suemori et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 2006; 345:926-932).
[0076] Também já foi descrito que linhagens de célula-tronco embrionária foram definidas para bovinos (Mitalipova et al., Cloning 2001; 3: 59-67), aves (Petitte et al., Mech. Dev. 2004; 121: 1159-1168), e zebrafish (Fishman, M. C., Science 2001; 294: 1290-1291).
[0077] Embora as linhagens de células-tronco embrionárias sejam geralmente estabelecidas pela cultura de embriões jovens, elas também podem ser preparadas a partir de embriões jovens nos quais o núcleo das células somáticas foi transferido (Munsie et al., Curr. Biol. 10:989, 2000; Wakayama et al., Science 292:740, 2001); e Hwang et al., Science 303:1669, 2004). Também já foi descrita uma tentativa de desenvolver embriões partenogenéticos para um estágio comparável ao estágio de blastocisto e para preparar células-tronco embrionárias a partir desse estágio (Publicação de Patente dos Estados Unidos 02/168763 A1; e Vrana K et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:119116) e um método no qual uma célula-tronco embrionária é fundida a uma célula somática para fazer uma célula-tronco embrionária que carregue a informação genética do núcleo de uma célula somática (Publicação Internacional WO 00/49137 A1; e Tada et al., Curr. Biol. 11:1553, 2001). As células-tronco embrionárias que podem ser usadas
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31/58 na presente invenção também incluem aquelas que foram preparadas pelos métodos descritos acima, assim como aquelas nas quais os genes localizados em seus cromossomos tenham sido modificados pelas técnicas de engenharia genética.
[0078] As células-tronco pluripotentes que podem ser usadas no método de acordo com a presente invenção não estão limitadas a células-tronco embrionárias, mas também incluem todas as outras células-tronco pluripotentes que têm características similares àquelas células-tronco embrionárias, como as derivadas de células de órgãos e tecidos de mamíferos adultos, assim como suas células da medula óssea, células sanguíneas e até células embrionárias e fetais. Nesse caso, as características similares àquelas das células-tronco embrionárias podem ser definidas pelas propriedades celulares biológicas que são específicas para as células-tronco embrionárias, como exemplificadas pela presença de um marcador de superfície (antígeno) específico para células-tronco embrionárias, expressão de um gene específico para células-tronco embrionárias, assim como a capacidade de formação de teratoma e capacidade de formação de camundongo quimérico. Exemplos específicos de outras células-tronco embrionárias pluripotentes aplicáveis incluem as células germinativas embrionárias (células EG) preparadas a partir de células germinativas primordiais, células-tronco da linhagem germinativa (células GS) preparadas a partir de células germinativas no testículo e células-tronco pluripotentes induzidas (células iPS) preparadas a partir de células somáticas, tais como fibroblastos por uma manipulação de gene especial. Exemplos de células-tronco pluripotentes induzidas incluem aquelas que podem ser preparadas pela introdução de fatores específicos em células somáticas e elas podem ser preparadas pelos métodos descritos em um documento escrito pelo grupo de pesquisa do Professor Shinya Yamanaka da Universidade de Kioto (K. Takahashi, et al., Induction of Plu
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32/58 ripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors Cell 2007 131: 861-872) e um documento escrito pelo grupo de pesquisa de Thomson da Wisconsin University (J. Yu, et al., Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic Cells Science 2007 318:1917-1920). Especificamente, pelo menos um gene selecionado a partir dos genes de Oct3/4, Sox2, c-Myc, Klf4, Nanog e LIN28 é transferido para uma dada célula somática, a expressão de qualquer gene ou proteína que seja específica para células-tronco pluripotentes é detectada e aquelas células que expressam tal gene ou proteína são selecionadas como células-tronco pluripotentes. Como as célulastronco embrionárias, células-tronco pluripotentes induzidas assim preparadas podem ser cultivadas junto com um fator de crescimento básico de fibroblasto na presença de fibroblastos de camundongo desativados para o crescimento ou células que podem ser substituídas por elas e as células cultivadas podem ser usadas como células-tronco pluripotentes, similares a células-tronco embrionárias.
[0079] Foi revelado, portanto que as células-tronco pluripotentes induzidas descritas acima têm as mesmas propriedades das célulastronco embrionárias com relação as características de diferenciação em vários tecidos e aquelas de expressão de gene dentro das células (Park I.H. et al., Nature, 2008, 451, 141-147) e as condições para indução de diferenciação de células-tronco embrionárias em uma variedade de tecidos podem ser aplicadas diretamente às células-tronco pluripotentes induzidas (Takahashi e Yamanaka, Saibou Kogaku (Cell Engineering), Vol. 27, N°3, 252-253, 2008).
(2) Métodos para indução de diferenciação de células-tronco pluripotentes em cardiomiócitos [0080] A descrição a seguir refere-se a células-tronco embrionárias (células ES) como um exemplo de células-tronco pluripotentes. Quando as células-tronco embrionárias capazes de diferenciação em
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33/58 cardiomiócitos são submetidas a um tratamento apropriado para indução de diferenciação em cardiomiócitos, elas começam a se diferenciar em cardiomiócitos. Por exemplo, a diferenciação de células-tronco embrionárias de camundongo em cardiomiócitos pode ser induzida pelo método de gota suspensa, no qual as células-tronco embrionárias são submetidas a uma cultura em suspensão em um meio de cultura sem o fator de inibição de leucemia (LIF) até que as massas celulares (corpos embrioides) sejam formadas. Alternativamente, células-tronco embrionárias de mico ou células-tronco embrionárias de humano podem ser submetidas, da mesma maneira, a um tratamento para indução de diferenciação em cardiomiócitos. Para induzir a diferenciação de células-tronco embrionárias em cardiomiócitos, qualquer um dos métodos conhecidos pode ser empregado. Por exemplo, um método para induzir a diferenciação na presença de uma substância que suprima a sinalização de BMP (WO2005/033298) e um método para induzir a diferenciação na presença de uma substância que estimule a ativação da via de sinalização canônica de Wnt (PCT/JP2007/59242, publicada como WO2007/126077).
(3) Purificação de cardiomiócitos [0081] Após a indução da diferenciação de células-tronco embrionárias em cardiomiócitos pelo método descrito em (2) acima, os cardiomiócitos podem ser purificados (selecionados) por qualquer método que seja capaz de dispersar cardiomiócitos em células desagregadas (células isoladas) e purificá-los como cardiomiócitos individuais. Por exemplo, um método de seleção usando mitocôndrias em cardiomiócitos como um índice (WO2006/022377) e um método para selecionar células que podem sobreviver sob condições com poucos nutrientes (PCT/JP2007/051563, publicada como WO2007/088874) podem ser usados para purificar (selecionar) apenas cardiomiócitos.
(4) Preparação de massas celulares de cardiomiócitos
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34/58 [0082] Os cardiomiócitos purificados derivados de células-tronco embrionárias que foram obtidos através da dispersão como células isoladas de acordo com o método descrito em (3) acima, podem ser cultivados sob condições sem soro tal que eles são agregados para preparar massa celulares de cardiomiócitos derivados de célulastronco embrionárias. Preferivelmente, o meio de cultura usado para essa cultura contém pelo menos uma substância selecionada do grupo que consiste em insulina (0,1 a 10 mg/l), transferrina (0,1 a 10 pg/l), selênio (0,1 a 10 pg/l), um fator de crescimento básico de fibroblasto (bFGF; 1 ng/ml a 100 ng/ml), um fator de crescimento de célula epitelial (1 ng/ml a 1000 ng/ml), um fator de crescimento derivado de plaqueta (1 ng/ml a 1000 ng/ml) e endotelina-1 (ET-1) (1 x 10-8 a 1 x 10-6 M).
[0083] As massas celulares de cardiomiócitos purificados derivados de células-tronco embrionárias que foram obtidas pelo método descrito acima contêm células proliferativas em um pequeno número como contaminantes; se tais células proliferativas são excluídas das células para o transplante, pode ser garantida uma segurança adicional. Os métodos atualmente conhecidos para a purificação de cardiomiócitos envolvem preliminarmente a introdução de certos genes marcadores no genoma das células-tronco (FASEB J. 2000; 14:25402548). Todos esses métodos podem fornecer 99% de pureza, mas eles são incapazes de garantir 100±0% de pureza. Por exemplo, se 1011 cardiomiócitos são necessários para tratar um infarto do miocárdio em ser humano, 99% de pureza significam contaminação por 109 de não-cardiomiócitos. Assim, mesmo um método que pode ser descrito como um meio quase perfeito de purificação a luz do situação atual da técnica não possibilita 100% de purificação de cardiomiócitos e deve ser combinado com métodos adicionais de purificação ou aplicado por outros métodos que garantam segurança.
[0084] Portanto, os presentes inventores replicaram o método
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35/58 descrito acima mencionado após misturar intencionalmente as massas celulares de cardiomiócitos não diferenciados com células-tronco embrionárias. Como foi constatado mais tarde, as células-tronco embrionárias não-diferenciadas que foram mais capazes de crescer do que os cardiomiócitos, construíram grandes massas celulares separadas fora das massas celulares de cardiomiócitos. As massas celulares de cardiomiócitos contaminadas pelas células-tronco embrionárias nãodiferenciadas, puderam ser claramente detectadas pela avaliação dos tamanhos globais das massas celulares. Os presentes inventores também adicionaram um indicador mitocondrial (por exemplo, TMRM) nas massas celulares de interesse, e imediatamente após os cardiomiócitos que eram ricos em mitocôndrias foram encontrados com brilho, enquanto que as células-tronco embrionárias e outras células proliferativas que não eram ricas em mitocôndrias foram encontradas escuras. A exclusão de massas celulares que têm grande diferença na fluorescência pode ser realizada automaticamente fazendo uso de Arrayscan (Cellomics), Incell 1000 (GE/Amersham Biosciences, Cardiff, UK), Scanalyzer (Scanalyzer LemnaTec, Aachen Germany), ImageXpress MICRO (Molecular Devices, Union City, USA), Pathway HT (Becton Dickinson Biosciences), ScanAR (Olympus Soft Imaging Solutions, Germany), etc. Assim, o método descrito acima fornece uma maneira simples e automática de identificar a contaminação pelas células-tronco embrionárias não-diferenciadas. Resumidamente, as células proliferativas que se misturam discretamente com os cardiomiócitos purificados derivados de células-tronco embrionárias, que formaram agregados como massas celulares sob condições de cultura sem soro podem ser identificados usando o tamanho e a forma de tais massas celulares como índices que é opcionalmente combinado com marcação com indicador de mitocôndrias subsequente indendificação usando intensidade fluorescência e sua distribuição dentro de massas
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36/58 celulares como índices. Dessa maneira, as massas celulares contaminadas por não-cardiomiócitos são excluídas das células para transplante, para se obter dessa maneira maior segurança.
(5) Transplante de massas celulares de cardiomiócitos para o tecido cardíaco e seu enxerto [0085] Usando as massas celulares obtidas através da agregação pelo método descrito acima, ou seja, as massas celulares de cardiomiócitos purificados derivados de células-tronco embrionárias, pode-se transplantar apenas os cardiomiócitos para o tecido cardíaco de um indivíduo (o organismo vivo). Por exemplo, os cardiomiócitos podem ser diretamente injetados no tecido cardíaco através de uma seringa; nesse caso a injeção é praticável usando uma agulha fina (calibre 29 ou 30), portanto, menos invasiva. A taxa de enxertia dos cardiomiócitos transplantados pelo método descrito acima é significativamente melhorada em relação aos métodos conhecidos. A expressão enxerto significa que as células transplantadas sobrevivem dentro do órgão hospedeiro e permanecem aderentes dentro do órgão por um período de tempo prolongado.
(6) Películas para transplante feitas de massas celulares de cardiomiócitos [0086] Através de métodos conhecidos, uma película de cardiomiócitos mais espessa do que três células de espessura não pode ser preparada em um momento, mesmo se são usados cardiomiócitos neonatais. Entretanto, na presente invenção, após a construção de massas celulares de cardiomiócitos purificados derivados de células-tronco embrionárias, as massas celulares obtidas são recuperadas, semeadas sobre a superfície de um recipiente de parede dividida, nãoaderente a célula, sem espaço entre as massas celulares tal que as massas celulares adjacentes estarão continuamente em contato uma com a outra e submetidas a cultura em suspensão, imediatamente
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37/58 após o que as massas celulares de cardiomiócitos são conjugadas ao longo do tempo para formar uma película de massas celulares de cardiomiócitos (película de células) que tem uma espessura de 50 a 300 pm. Portanto, uma cultura é realizada até que a espessura desejada seja obtida. Como resultado, nos moldes da utilização atual, as massas celulares de cardiomiócitos purificados derivados de células-tronco embrionárias de tamanho desejado podem ser usadas em um número desejado para preparar uma película de células de um tamanho desejado.
EXEMPLOS [0087] A presente invenção está ilustrada em maiores detalhes pela referencia aos seguintes exemplos.
Exemplo 1: Preparação de Cardiomiócitos Derivados de Célulastronco Embrionárias de Camundongo e Purificação dos Cardiomiócitos Usando o Método da Mitocôndria [0088] Os propósitos desse Exemplo foram preparar cardiomiócitos de células-tronco embrionárias de camundongo e estudar se era possível purificar os cardiomiócitos preparados usando um indicador mitocondrial.
[0089] Foi usada a linhagem celular EB3 (Niwa H, et al., Nat Genet 2000; 24: 372-376) como células-tronco embrionárias. Uma unidade que expressa EGFP foi introduzida na linhagem celular EB3 através de um plasmídeo e as células que expressavam EGFP foram obtidas e definidas como uma linhagem celular. Portanto, as células-tronco embrionárias que expressavam EGFP (células EB3) foram suspensas em um meio de cultura α-MEM (Sigma) tal que a concentração de célulastronco embrionárias atingiu 75 células/35 pl; o meio de cultura α-MEM foi suplementado com soro fetal bovino inativado pelo calor (55°C X 30 min) para uma concentração final de 10%. Subsequentemente, a suspensão de células-tronco embrionárias de camundongo assim prepa
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38/58 radas foi distribuída em uma placa de cultura celular comercial de 384 poços (produto da Greiner, Modelo 788161; i.d. de cada abertura de poço 3,0 mm) e os corpos embrioides foram preparados de acordo com o seguinte método.
[0090] A placa de 384 poços tinha um volume líquido nominal disponível de 25 pl por poço, mas a fim de elevar o nível líquido acima das aberturas dos poços pelo efeito de tensão superficial, a suspensão foi distribuída em um volume de 35 pl por poço. Como resultado, 75 células-tronco embrionárias foram distribuídas por poço. Nesse caso, a suspensão teve que ser suplementada em um volume de 28 pl a fim de atingir o nível horizontal em cada abertura e em um volume adicional de 7 pl para ultrapassar aquele nível horizontal. Para a distribuição da suspensão uma pipeta de multicanais da Theremo Labsystems (Lote N° 4610070) ou uma máquina distribuidora da BioTech Co. Ltda (modelo LD-01) foi usada.
[0091] A placa na qual o meio de cultura contendo as célulastronco embrionárias foi distribuído até alcançar as aberturas dos poços foi invertida de cabeça para baixo, tal que o meio de cultura foi projetado para baixo a partir das margens inferiores das aberturas dos poços. Conforme ela foi mantida nessa posição, a placa foi coberta com uma tampa e a cultura foi realizada em uma incubadora a 37°C em uma atmosfera com 5% de CO2, até que as células-tronco embrionárias crescessem nas projeções a partir das margens inferiores das aberturas dos poços. Um dia após o início da cultura, a placa com o nível líquido projetado do meio de cultura de revestimento foi segurada com pinças limpas ou similar e todas as projeções do meio de cultura foram colocadas em contato com a superfície de um meio de cultura αMEM (Sigma) que preenchia um grande recipiente separado que foi suplementado com soro fetal bovino inativado pelo calor (55°C x 30 min) até uma concentração final de 10%; as massas celulares foram
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39/58 deixadas precipitar sob seu próprio peso no meio de cultura do recipiente maior, recobrindo dessa maneira os corpos embrioides ou as massas celulares derivadas das células-tronco embrionárias.
[0092] Os corpos embrioides recuperados foram cultivados em uma placa não-aderente a célula (Asahi Techno Glass, placa de Petri estéril #SH90-15; ou Eiken Chemical Co. Ltd., placa de Petri retangular estéril tipo 2) por um adicional de 2 ou 3 dias. Os corpos embrioides cultivados foram recuperados em um tubo de centrífuga e depois de substituir a suspensão por um meio de cultura sem soro (meio de cultura α-MEM (#MO644 da Sigma) suplementado com uma solução de ITS (GIBCO #41400-045) após uma diluição de 1/100 (a solução de ITS usada na presente invenção continha 1g/l de insulina, 0,55 g/l de transferrina e 0,67 mg/l de cloreto de selênio)),os corpos embrioides foram cultivados em uma placa de cultura aderente a célula, estéril (FALCON #353003).
[0093] O meio de cultura foi substituído em dias alternados até o 15° dia de cultura para diferenciação. Na amostra no dia 15, foi adicionado um indicador mitocondrial TMRM (Invitrogen #T668) em uma concentração final de 10 mM, que foi incubado por 2 horas. Depois disso, usando um tampão fisiológico (NaCl a 116 mM, Hepes a 20 mM, NaH2PO4 a 12,5 mM, glicose a 5,6 mM, KCl a 5,4 mM, MgSO4 a 0,8 mM, pH 7,35) contendo colagenase (Wortington Tipo 3)e tripsina (DIFCO #215240) cada uma adicionada em uma concentração final de 0,1%, as células cultivadas foram dispersas como células isoladas com o meio de cultura sendo agitado. A amostra ou a suspensão de células isoladas foi carregada em um purificador celular que avalia a emissão de fluorescência (FACS) para recuperar dessa maneira grupos celulares altamente fluorescentes (WO2006/022377). As células purificadas foram quantificadas em número de células viáveis e mortas por meio de um hematocitometro. Como constatado mais tarde, a proPetição 870180135037, de 27/09/2018, pág. 46/73
40/58 porção de células viáveis era de cerca de 75%.
Exemplo 2: Preparação de Massas Celulares Usando Cardiomiócitos Derivados de Células-tronco Embrionárias de Camundongo [0094] O propósito desse Exemplo foi mostrar se era possível preparar massas celulares usando os cardiomiócitos derivados de célulatronco embrionária de camundongo que foram preparados no Exemplo
1.
[0095] Os cardiomiócitos purificados derivados de célula-tronco embrionária de camundongo que foram preparados no Exemplo 1 foram distribuídos em placas de 96 poços não-aderentes a célula, de fundo redondo (SUMITOMO BAKELIKE CO. LTD.; CELLFECTIGHT SPHEROID) tal que 10.000, 5000, 2500, 1250, 625 ou 313 células estivessem presentes em cada poço. O meio de cultura foi α-MEM suplementado com soro fetal bovino a 10%. As células distribuídas foram observadas periodicamente; 10 horas mais tarde, as massas celulares se formaram e começaram a pulsar espontaneamente de uma maneira sincrônica. Vinte e quatro horas mais tarde, cada uma das massas celulares assumiu uma forma esférica quase perfeita e 10 dias mais tarde ocorreu um batimento rítmico, sincrônico e espontâneo (Figura 1).
[0096] Esses resultados mostraram que, após os cardiomiócitos derivados de célula-tronco embrionária de camundongo terem sido dispersos como células isoladas, eles puderam se re-agregar para formar massas celulares.
Exemplo 3: Preparação de Massas Celulares Usando Cardiomiócitos Derivados de Células-tronco de Mico [0097] O propósito desse Exemplo foi mostrar se era possível preparar massas celulares usando os cardiomiócitos derivados de célulatronco embrionária de mico que foram preparados de acordo com o método do Exemplo 1.
[0098] As células-tronco embrionárias de mico foram obtidas do
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Central Institute for Experimental Animals (Sasaki E. et al., Stem Cells 2005; 23(9):1304-13). Usando fibroblastos embrionários de camundongo (MEF) que foram cultivados e inativados pelo tratamento com mitomicina C, essas células tronco embrionárias de mico foram cultivadas tal que eles puderam permanecer indiferenciadas. O meio de cultura era composto por KO-DMEM (GIBCO), KO-SERUM a 20% (GIBCO), L-glutamina a 1,6 mM, aminoácidos não essenciais a 0,1 mM (MEM), β-mercaptoetanol a 0,2 mM (2-ME; Sigma), penicilina a 100 IU/ml, sulfato de estreptomicina a 100 pg/ml, e 8 ng/ml de cada um dos fatores inibitório recombinante de leucemia humana (LIF; Chemicon) e um fator recombinante de crescimento básico de fibroblasto humano (bFGF; Peprotech). Para a passagem seriada, as colônias de células-tronco embrionárias foram separadas pelo tratamento com colagenase tipo III a 0,1% (Wortington) a 37°C por 10 minutos.
[0099] Subsequentemente, a fim de separar as células-tronco embrionárias de MEF, o meio de cultura contendo as massas celulares foi passado através de uma peneira com um tamanho de poro de 100 pm, que foi passado depois através de uma peneira com tamanho de poro de 40 pm para descartar a fração menor do que o normal; as massas celulares na fração maior foram recuperadas. As massas celulares recuperadas foram aquelas de células-tronco embrionárias puras. Para a diferenciação, 50 a 1000 células-tronco embrionárias por EB foram cultivadas como corpos embrioides em uma placa não-aderente a célula (Asahi Techno Glass; Placa de Petri estéril) por um total de 15 a 30 dias tal que elas se diferenciassem em corpos embrioides incluindo cardiomiócitos. O meio de cultura usado para essa diferenciação foi o mesmo identificado acima, exceto que ele não continha bFGF, isto é, ele era composto por KO-DMEM (GIBCO), KO-SERUM a 20% (GIBCO), L-glutamina a 1,6 mM, aminoácidos não-essenciais a 0,1 mM
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42/58 (MEM), β-mercaptoetanol 0,2 mM (2-ME; Sigma), penicilina a 100 lU/ml, sulfato de estreptomicina a 100 pg/ml, e 8 ng/ml de fator inibitório recombinante de leucemia humana (LIF; Chemicon).
[00100] Um a dois meses depois de sua preparação, os corpos embrioides foram removidos e tratados pelo método descrito na WO 2006/022377 para purificar os cardiomiócitos. Para ser mais específico, os corpos embrioides foram tratados com colagenase e tripsina para fornecer células isoladas desagregadas. Ao meio de cultura como uma suspensão celular, um indicador mitocondrial TMRM (Invitrogen #T66) foi adicionado em uma concentração final de 10 mM e a mistura foi deixada repousar a 37°C por 15 minutos, lavada três vezes e imediatamente submetida a análise por FACS. As células (cardiomiócitos) que exibiam uma intensidade fluorescente maior do que a população principal de células foram separadas e recuperadas.
[00101] Os cardiomiócitos separados foram tratados pelo mesmo método do Exemplo 2 para preparar massas celulares de cardiomiócitos. Para ser mais específico, os cardiomiócitos purificados derivados de células-tronco embrionárias de mico foram distribuídos em uma placa de 96 poços não-aderente a célula de fundo redondo (SUMITOMO BAKELIKE CO. LTD.; CELLFECTIGHT SPHEROID), tal que 2000 células estivessem presentes em cada poço. As células distribuídas foram observadas periodicamente; 24 horas mais tarde, as massas celulares se formaram (Figura 2A) e começaram a pulsar espontaneamente de uma maneira sincrônica. Quarenta e oito horas mais tarde, cada uma das massas celulares assumiu uma forma esférica quase perfeita (Figura 2B) e 10 dias mais tarde ocorreu um batimento rítmico, sincrônico e espontâneo (Figura 2).
[00102] Esses resultados mostraram que, depois que os cardiomiócitos derivados de células-tronco embrionárias de mico foram dispersas em células isoladas, elas puderam ser reagregadas para formar
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43/58 massas celulares.
Exemplo 4: Medida da Taxa de Sobrevivência Celular das Massas Celulares Formadas pelo Uso dos Cardiomiócitos Derivados de Célulastronco Embrionária de Camundongo e Comparação com o Resultado da Cultura Adesiva [00103] Os propósitos desse Exemplo foram estudar o substrato adesivo com a potencia da ação protetora sob condições de cultura planar sendo usada como um índice e comparar a taxa de sobrevivência de cardiomiócitos purificados derivados de célula-tronco entre a cultura planar adesiva e a cultura de massa celular; a cultura planar adesiva foi realizada usando soro que tem acentuada ação de proteção celular e a cultura da massa celular foi realizada na condição com ou sem soro; a ação de proteção celular foi descoberta ser superior quando a cultura da massa celular foi realizada em condições sem soro.
[00104] No Exemplo 4, os cardiomiócitos derivados de célulastronco embrionárias foram purificados de acordo com o Exemplo 1.
[00105] Os cardiomiócitos purificados foram semeados em placas de cultura de plástico (produto da BD), revestidas tanto com (1) gelatina ou com (2) fibronectina, na presença de soro (Figura 3A). Além disso, com a intenção de formar massas celulares, (3) os cardiomiócitos purificados foram distribuídos em uma placa de 96 poços de fundo redondo e não-aderente a célula de acordo com o Exemplo 2, tal que 1000 células pudessem estar presentes em cada poço e as suspensões foram centrifugadas a 120 g por 5 minutos. Além disso, mais tarde, (4) os cardiomiócitos purificados foram distribuídos em uma placa de 96 poços de fundo redondo e não-aderente a célula de acordo com o Exemplo 2, exceto pelo uso de condições sem soro para construir massas celulares, tal que 1000 células pudessem estar presentes em um poço e as suspensões foram centrifugadas a 120 g por 5 minutos.
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As amostras de (1) a (4) foram cultivadas na mesma incubadora por 12 horas e 4 dias. Quatro dias mais tarde,o número de células aderentes a cada placa (contagem de células viáveis) e aquele de células não-aderentes mas em suspensão (contagem de célula morta) foram medidos. Os resultados estão descritos na figura 3 (vide Figura 3A para as condições de (1) e (2) e vide também as Figuras 3B e 3C para as condições de (3) e (4), respectivamente).
[00106] Como foi constatado mais tarde, a viabilidade celular na cultura de massa celular sob condições sem soro foi obviamente maior do que o valor máximo da cultura planar adesiva na presença de soro (ca. 60% no caso de (2)), isto é, 99,2% viáveis no caso de (3) e 90,4% viáveis no caso de (4).
Exemplo 5: Preparação de Massas Celulares usando Cardiomiócitos Derivados de Célula-tronco Embrionárias de Camundongo Purificados e Detecção de Células-tronco Embrionárias Contaminadas [00107] O propósito desse Exemplo foi detectar não-cardiomiócitos que estavam contaminados nas massas celulares de cardiomiócitos purificados derivados de células-tronco embrionárias de camundongo.
[00108] As massas celulares de cardiomiócitos purificados foram preparadas pelos métodos dos Exemplos 1 e 2, com a condição de que antes da semeadura final da placa de 96 poços, 2% de célulastronco embrionárias não-diferenciadas foram adicionados a suspensão de cardiomiócitos. As massas celulares foram cultivadas em uma solução sem soro de α-MEM que continha 1 mg/ml de insulina e 10 nM de TMRM; 14 dias mais tarde, imagens fluorescentes e imagens com contraste de fase foram obtidas de todos os poços.
[00109] Como resultado, em dois poços que representavam cerca de 2% dos poços, uma massa celular grande (mais do que duas vezes o tamanho de massas celulares normais) foi observada (Figura 4) e foi descoberto que parte dessas massas celulares não-esféricas formaPetição 870180135037, de 27/09/2018, pág. 51/73
45/58 vam uma população celular que emitia um sinal fluorescente fraco derivado de TMRM (isto é, não-cardiomiócitos) e que era composta por cardiomiócitos anormais (Figura 5B). O total de massas celulares de cardiomiócitos normais emitiu um sinal fluorescente derivado de TMRM (Figura 5A).
[00110] Assim, o método fornecido pelo Exemplo 5 possibilitou que não-cardiomiócitos fossem identificados com alta sensibilidade.
Exemplo 6: Preparação de Massas Celulares Usando Cardiomiócitos Purificados Derivados de Células de Coração de Rato Recém-nascido [00111] O propósito desse Exemplo foi saber se era possível preparar massas celulares usando cardiomiócitos purificados derivados de células de coração de rato recém-nascido.
[00112] Ratos recém-nascidos com 0-2 dias após o nascimento foram anestesiados com éter. O coração foi removido e o tecido cardíaco foi disperso em células desagregadas com colagenase a 0,1% (Wortington). As células foram, coradas com TMRM 10 nM e então tratadas por FACS para purificar os cardiomiócitos.
[00113] O número de cardiomiócitos purificados foi contado e cultivados em uma placa não-aderente a celula de 96 poços (SUMITOMO BAKELITE) com 3000 células sendo semeadas por poço. O meio de cultura consistiu em DMEM-glicose elevada (Invitrogen) suplementado com FBS a 10% (JRH).
[00114] A aparência das células depois de 24 horas de cultura está mostrado na figura 6. Os cardiomiócitos purificados derivados de coração de rato recém-nascido não formaram massas celulares, mas se alinharam ao longo do fundo arredondado de cada poço (Figura 6A). Os cardiomiócitos purificados derivados do coração de rato recémnascido no dia 5 da cultura estavam virtualmente mortos (Figura 6B) sob condições sem soro (exclusivamente com o meio de cultura basal α-MEM (painel esquerdo da Figura 6B ou com α-MEM+ITS (painel di
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46/58 reito da Figura 6B)).
Exemplo 7:Composição do Meio de Cultura Ótimo para a Formação de Massas Celulares Usando Cardiomiócitos Derivados de Células-tronco Embrionárias de Camundongo [00115] O propósito desse Exemplo foi analisar as várias propriedades de cardiomiócitos primários de rato recém-nascido e cardiomiócitos derivados de células-tronco embrionárias de camundongo de maneira a encontrar um meio de cultura mais adequado para os cardiomiócitos derivados de células-tronco embrionárias.
[00116] Os cardiomiócitos purificados derivados de células-tronco embrionárias de camundongo e cardiomiócitos purificados de rato recém-nascido foram preparados como descrito acima; depois eles foram cultivados em cada uma de 10 condições diferentes: uma foi composta exclusivamente por α-MEM e as outras nove consistiram de aMEM+ITS, a-MEM + ITS + 50 ng/ml de bFGF (Peprotech), a-MEM + ITS + 50 ng/ml de IGF-1 (Wako), a-MEM + ITS + 50 ng/ml de bFGF + 50 ng/ml de IGF-1, a-MEM + KSR a 5% (knockout serum replacement: Invitrogen), a-MEM + KSR a 10% (knockout serum replacement: Invitrogen), a-MEM + FBS a 1% (Equitech Bio), a-MEM + FBS 5%, e a-MEM + FBS a 10%, respectivamente.
[00117] Quando os cardiomiócitos purificados derivados de célulastronco embrionárias de camundongo foram cultivados em uma placa de 96 poços de fundo arredondado, não-aderente a célula, as massas celulares se formaram em todos os meios de cultura em apenas 12 horas (Figura 7A). Entretanto, os cardiomiócitos de rato recém-nascido falharam em formar massas celulares mesmo após 24 horas sob todas as condições de cultura. Um meio de cultura suplementado com 10% de soro é dado como um exemplo. Após 4 dias, os cardiomiócitos de rato recém-nascido formaram massas celulares apenas nos meios suplementados com FBS a 5% e FBS a 10%, respectivamente.
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47/58 [00118] As massas celulares de cardiomiócitos purificados derivados de célula-tronco embrionária de camundongo que se formaram após 6 dias de cultura em uma placa de 96 poços de fundo arredondado, não-aderente a célula foram observadas (Figura 7B); um aumento significativo no diâmetro das massas celulares, quando comparado com aquele das massas recém- formadas, foi encontrado apenas no meio de cultura com α-MEM + ITS + 50 ng/ml de bFGF (vide Figura 7C, em particular, a coluna marcada com o asterisco). Até nos meios que continham soro, o diâmetro das massas celulares foi cerca da metade do valor para o estágio precoce (Figura 7C).
[00119] A partir do precedente, acredita-se que o meio de cultura sem soro suplementado com ITS e bFGF tem uma ação protetora celular muito acentuada e exibe uma propriedade única de induzir a proliferação de cardiomiócitos.
Exemplo 8: Composição do Meio de Cultura Ótimo para a Formação de Massas Celulares Usando Cardiomiócitos Derivados de Célulastronco Embrionárias de Camundongo [00120] No Exemplo 7, foi revelado que o meio de cultura sem soro suplementado com ITS e bFGF teve uma ação protetora celular muito acentuada e exibiu uma propriedade única de induzir a proliferação de cardiomiócitos. Portanto, o Exemplo 8 foi realizado a fim de mostrar quais as ações que bFGF e insulina, um componente da solução ITS, poderiam ter sobre o aumento no diâmetro das massas celulares.
[00121] Basicamente, os experimentos foram conduzidos como no Exemplo 7, exceto que os seguintes meios de cultura foram usados: aMEM sozinho; a-MEM +50 ng/ml de bFGF; a-MEM + 10 pg/ml de insulina + 5 ng/ml de bFGF; e a-MEM + 1 pg/ml de insulina + 1 ng/ml de bFGF.
[00122] Seis dias mais tarde, as massas celulares de cardiomiócitos derivados de célula-tronco embrionária de camundongo foram obserPetição 870180135037, de 27/09/2018, pág. 54/73
48/58 vados; como resultado, em cada um de α-MEM +50 ng/ml de bFGF; aMEM + 10 gg/ml de insulina + 5 ng/ml de bFGF e a-MEM + 1 gg/ml de insulina + 1 ng/ml de bFGF foi visto um aumento significativo no diâmetro das massas celulares quando comparadas com as massas celulares no meio de cultura que consistia de a-MEM sozinho (Figura 7B). Além disso, o efeito sobre a atividade contrátil dos cardiomiócitos foi acentuada e igual como o que foi obtido quando ITS foi adicionado no Exemplo 7.
[00123] A partir do precedente, acredita-se que o meio de cultura sem soro suplementado com bFGF ou insulina + bFGF tem uma acentuada ação protetora da célula e exibe uma propriedade única de induzir a proliferação de cardiomiócitos.
Exemplo 9: Ações de Sem Soro e bFGF no Sistema de Cultura Planar Adesiva de Cardiomiócitos Purificados Derivados de Célulastronco Embrionárias de Camundongo [00124] Cardiomiócitos derivados de células-tronco embrionárias de camundongo foram purificados de acordo com o Exemplo 1. Os cardiomiócitos purificados foram semeados nas mesmas quantidades sobre placas de cultura revestidas com fibronectina e submetidos a cultura planar adesiva em uma variedade de meios de cultura. Os vários meios de cultura compreendiam, todos, α-MEM como meio de cultura basal, mas eles tiveram os seguintes componentes adicionados: FBS a 10% sozinho, FBS a 10%+50 ng/ml de bFGF, KSR 10% (knockout serum replacement:Invitrogen), ITS e ITS + 50 ng/ml de bFGF. As células semeadas sob essas condições foram cultivadas por um total de 5 dias e então fotografadas (Figura 8A). Como pode ser constatado, os grupos sem soro com ITS e com ITS+bFGF tiveram uma viabilidade celular significativamente menos do que os grupos suplementados com FBS a 10% ou KSR 10%.
Exemplo 10: Transplante de Cardiomiócitos Purificados Derivados de
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Célula-tronco Embrionária de Camundongo Para o Tecido Miocárdico de Rato Imunodeficiente e Medida de sua Taxa de Enxertia [00125] Para começar, o seguinte experimento foi conduzido a fim de medir a taxa de sobrevivência de cardiomiócitos purificados derivados de célula-tronco embrionária de camundongo para o caso onde o método de reagregação não foi aplicado.
[00126] Um total de 2 x 105 células foi transplantado para a parede livre do ventrículo esquerdo de um camundongo imunodeficiente (NOD-SCID). A anestesia foi induzida com éter sobre o camundongo e mantida usando ar contendo isoflurano a 2% fornecido através de um respirador artificial. O camundongo foi submetido a toracotomia (no terceiro espaço intercostal) sob anestesia profunda e o saco cardíaco foi rompido com pinças, para expor o coração. Solução salina fisiológica (30 pl) contendo massas celulares de cardiomiócitos foi injetada através de uma seringa com uma agulha de 3G. Para injetar, a agulha foi inserida no ápice cardíaco, a partir do qual ela foi avançada através da parede livre cardíaca por aproximadamente 3 mm em direção a base cardíaca. Após o transplante, o tórax foi rapidamente fechado e, após a recuperação dos batimentos espontâneos, o rato retornou para a gaiola.
[00127] Três semanas após o transplante, o coração foi fixado sob perfusão e seções congeladas foram preparadas. As seções foram imunocoradas com um anticorpo antiactinina sarcomérica e imagens microscópicas fluorescentes foram tiradas (Figura 9A). Como pode ser constatado, os transplantes de células viáveis foram dificilmente visualizados e apenas a reação com o corante marcador vermelho pode ser encontrada (Figuras 9A e 9D).
[00128] Na próxima etapa, as massas celulares, cada uma consistindo em 2000 cardiomiócitos construídos sob condições sem soro como descrito no Exemplo 7 (um número total de 2 x 105 células), foPetição 870180135037, de 27/09/2018, pág. 56/73
50/58 ram transplantadas para a parede livre do ventrículo esquerdo de um camundongo imunodeficiente (NOD-SCID). Após o transplante ter sido realizado como no experimento descrito acima e três semanas depois, o coração foi fixado sob perfusão e seções congeladas foram preparadas. As seções foram imuno-coradas com um anticorpo antiactinina sarcomérica e imagens microscópicas fluorescentes foram tiradas (Figura 10). Baseado nas imagens microscópicas fluorescentes, o número de células enxertadas sobre o tecido cardíaco do hospedeiro contido em uma massa celular foi contado.
[00129] Como pode ser constatado, presumindo que cada uma das massas celulares transplantadas consistia exatamente de 2000 cardiomiócitos, 92,05± a 11,1% dos cardiomiócitos foram encontrados enxertados (n=4) (Figuras 11A e 11B). Em contraste, quando as células purificadas desagregadas foram injetadas como tal (dispersas), nenhuma célula enxertada pode ser encontrada. Esse resultado significa que a taxa de enxertia pós-transplante de cardiomiócitos melhorou dramaticamente entre 0% a 92%.
[00130] Adicionalmente, com a intenção de verificar a alteração dos cardiomiócitos durante um transplante de longa duração, a investigação baseada na imunocoloração do coração foi realizada 3 e 8 semanas após o transplante. Como pode ser constatado, o volume citoplasmático dos cardiomiócitos aumentou acentuadamente 3 e 8 semanas após o transplante, quando comparado com os cardiomiócitos antes do transplante (Pre na figura 11C) e, mais ainda, os cardiomiócitos transplantados se alinharam na mesma direção como os cardiomiócitos do hospedeiro (Figuras 11C e 11D). Isso mostra que as massas celulares transplantadas de cardiomiócitos amadurecem no tecido cardíaco do hospedeiro.
Exemplo 11: Preparação de Massas Celulares Usando Cardiomiócitos Purificados Derivados de Células-tronco Embrionárias de Mico
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51/58 [00131] O propósito desse Exemplo foi preparar massas celulares de cardiomiócitos purificados derivados de célula-tronco embrionária de mico sob condições sem soro com a adição de ITS ou KSR.
[00132] Resumidamente, massas celulares de cardiomiócitos purificados derivados de células-tronco embrionárias de mico foram preparadas de acordo com o Exemplo 3, contanto que as massas celulares foram cultivadas em um meio de cultura sem soro apenas (Figura 12A) ou em um meio de cultura sem soro suplementado com KSR a 10% (Figura 12B) ou ITS (Figura 12C). As massas celulares construídas tanto 12 horas quanto 3 dias após o início do transplante são mostradas na figura 12.
Exemplo 12: Construção de Películas Celulares Espessas Usando as Massas Celulares de Cardiomiócitos Purificados Derivados de Célulastronco Embrionárias de Mico [00133] As massas celulares de cardiomiócitos purificados derivados de célula-tronco embrionária de mico que foram preparadas no Exemplo 11, eram cultivadas em suspensão no mesmo plano. Com um intervalo de tempo durante um período de 0 a 12 horas, as massas celulares adjacentes são conjugadas juntas para formar uma película celular espessa de cardiomiócitos. O Exemplo 12 descreve um experimento de modelo pretendido para demonstrar a aplicabilidade do método da presente invenção. Nas modalidades reais de aplicação, as massas celulares em um tamanho desejado de cardiomiócitos purificados derivados de células-tronco embrionárias podem ser usadas em um número desejado para construir uma película celular do tamanho desejado (Figura 13). Além disso, uma película celular de uma espessura desejada pode ser formada dependendo do tamanho das massas celulares a serem usadas.
Exemplo 13: Transplante de Cardiomiócitos Derivados de Célulatronco Embrionária Humana para o Coração de Rato Imunodeficiente
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52/58 [00134] Nesse Exemplo, os experimentos eram para determinar se as massas celulares de cardiomiócitos que foram preparadas pela diferenciação de células-tronco embrionárias humanas em cardiomiócitos teriam a habilidade de serem enxertadas no tecido cardíaco.
[00135] As células-tronco embrionárias humanas foram obtidas do Stem Cell Research Center, instalações anexas ao Institute for Frontier Medical Sciences, Universidade de Kyoto (Embryonic Stem Cell Center financiado pelo National Bio-resource Project).
[00136] Usando fibroblastos embrionários de camundongo (MEF) que fora cultivados inativados pelo tratamento com mitomicina C, essas células-tronco embrionárias humanas foram cultivadas tal que elas puderam permanecer indiferenciadas. O meio de cultura era composto por F12/DMEM (1:1) (SIGMA, Lote N° D6421), KO-SERUM a 20% (GIBCO), L-glutamina a 1,6 mM, aminoácidos não-essenciais a 0,1 mM (MEM), β-mercaptoetanol a 0,1 mM (2-ME; Sigma), penicilina 100 lU/ml, sulfato de estreptomicina a 100 pg/ml, e um fator recombinante de crescimento básico de fibroblasto humano (bFGF; Peprotech). Para a passagem seriada, as colônias de células-tronco embrionárias foram separadas pelo tratamento com colagenase tipo III a 0,1% (Wortington) a 37°C por 10 minutos.
[00137] Subsequentemente, a fim de separar as células-tronco embrionárias de MEF, o meio de cultura contendo as massas celulares foi passado através de uma peneira com um tamanho de poro de 40 pm e as massas celulares na fração maior foram recuperadas. As massas celulares recuperadas foram aquelas de células-tronco embrionárias puras. Para a diferenciação, 50 a 1000 células-tronco embrionárias por EB foram cultivadas como corpos embrioides em uma placa com bactéria não-aderente a célula (Asahi Techno Glass; Placa de Petri estéril) por um total de 15 a 30 dias tal que elas se diferenciassem em corpos embrioides incluindo cardiomiócitos. O meio de cultura usado para es
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53/58 sa diferenciação foi o mesmo identificado acima, exceto que ele não continha bFGF, isto é, ele era composto por F12/DMEM (1:1) (SIGMA, lote no D6421) (GIBCO), KO-SERUM a 20% (GIBCO), L-glutamina a 1,6 mM, aminoácidos não-essenciais a 0,1 mM (MEM), βmercaptoetanol a 0,1 mM (2-ME; Sigma), penicilina a 100 IU/ml e sulfato de estreptomicina a 100 pg/ml.
[00138] Os cardiomiócitos derivados de células-tronco humanas foram purificados de acordo com o Exemplo 1. Depois, de acordo com os resultados do Exemplo 8, as massas celulares cada uma contendo 1000 cardiomiócitos purificados, foram preparadas usando uma solução de α-MEM sem soro que continha 1 pg/ml de insulina e 1 ng/ml de bFGF (vide Figura 14).
[00139] Depois, as massas celulares foram transplantadas para o tecido cardíaco de um camundongo imunodeficiente de acordo com o Exemplo 10. Duas semanas depois do transplante, seções congeladas foram preparadas de acordo com o Exemplo 10. As seções assim preparadas foram imuno-coradas com Nkx2.5 e um anticorpo antiactinina sarcomérica e imagens microscópicas fluorescentes foram obtidas.
[00140] Algumas massas celulares foram encontradas estarem coradas com o corante vermelho usado como marcador de células transplantadas. As seções foram rastreadas para Nkx2.5 e um anticorpo antiactinina sarcomérica por um método imunológico. Os resultados são mostrados na figura 15. As células transplantadas, sendo coradas com o corante vermelho, foram mostradas estar predominantemente coloridas em vermelho. A imuno-coloração com actinina também mostrou a coloração das estrias. Também foi mostrado que Nkx2.5, um marcador de cardiomiócitos, era predominantemente encontrado nos núcleos dos cardiomiócitos transplantados. Esse é um fenômeno peculiar para cardiomiócitos imaturos. Além disso, os núcleos dos cardiomiócitos derivados de células-tronco embrionárias humanas eram
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54/58 maiores do que os cardiomiócitos de camundongo circundantes e, portanto, podiam ser distinguidos desses últimos (Figura 15).
[00141] Adicionalmente, 5 semanas depois do transplante, as seções congeladas foram preparadas de acordo com o Exemplo 10. Algumas massas celulares foram encontradas estarem coradas com o corante vermelho usado como marcador das células transplantadas (Figura 16). As seções assim preparadas foram imuno-coradas com Nkx2.5 (azul-água) e um anticorpo antiactinina sarcomérica (verde) ou corante Nkx2.5 (azul-água) e um antígeno anti-nuclear humano (verde: ligação a um antígeno que não estava presente nos núcleos do camundongo, mas presente apenas em primatas) e as imagens microscópicas fluorescentes foram obtidas. Os resultados são mostrados nas figuras 17 e 18. As mitocôndrias das células transplantadas foram coradas com um corante marcador, permitindo que o corante vermelho fosse detectado como pontos. A imuno-coloração com actinina também mostrou a coloração das estrias (Figura 17). Para mostrar que essas populações celulares que compõem a mesma região eram derivadas de células humanas, foi realizada a detecção usando um anticorpo anti-humano e novamente ele demonstrou que as células transplantadas eram células humanas, em particular, cardiomiócitos que foram cocorados com Nkx2.5 (Figura 18).
Exemplo 14: Preparação de Massas Celulares Usando Cardiomiócitos Purificados Derivados de Células-tronco Pluripotentes Induzidas (iPS) de Camundongo [00142] O propósito desse Exemplo foi o de preparar massas celulares de cardiomiócitos purificados derivados de células iPS de camundongo sob condições sem soro com ou sem a adição de ITS ou KSR.
[00143] As células iPS de camundongo foram fornecidas pelo Institute for Frontier Medical Sciences, Universidade de Kyoto. A diferenciPetição 870180135037, de 27/09/2018, pág. 61/73
55/58 ação das células iPS de camundongo em cardiomiócitos foi realizada como no Exemplo 1. Naquele exemplo, foi encontrado ser ótimo que 1000 células fossem usadas como as células iniciais para a composição de um corpo embrioide.
[00144] A Figura 19A mostra o resultado de uma análise FACS conduzida com o indicador mitocondrial TMRM a fim de purificar os cardiomiócitos. O retângulo no gráfico representa a região dos cardiomiócitos. Os cardiomiócitos assim purificados foram submetidos a cultura adesiva e imunocorados (com actinina e Nkx2.5); o resultado é mostrado na figura 19B. Como os cardiomiócitos derivados de iPS induzidos de camundongo não mostraram formar massas celulares agregadas, foi mostrado que as frações celulares recuperadas por FACS consistiam em aproximadamente 100% de cardiomiócitos. Além disso, a Figura 19C mostra o aspecto dos cardiomiócitos purificados 24 horas depois que eles foram semeados em uma placa de cultura de 96 poços não-aderente a células. Nesse caso, foi usado um meio de cultura sem soro. Como pode ser constatado, os cardiomiócitos purificados derivados de células iPS de camundongo também podem ser usados para a construção de massas celulares pelo método da presente invenção.
Exemplo 15: Composição do Meio de Cultura Ótimo para Formar Massas Celulares Usando Cardiomiócitos Derivados de Célula-tronco Embrionárias Humanas [00145] No Exemplo 7, foi mostrado que o meio de cultura sem soro suplementado com ITS e bFGF tem uma forte ação protetora sobre células derivadas de camundongo e exibe uma propriedade única de induzir a proliferação de cardiomiócitos. Portanto, o Exemplo 15 foi realizado a fim de mostrar a eficácia de bFGF em cardiomiócitos derivados de células ES humanas e rever sua eficácia mais atentamente pela comparação com outros fatores de crescimento.
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56/58 [00146] Basicamente, α-MEM+ITS foi usado como meio de cultura. Esse meio de cultura basal foi suplementado com 25 ng/ml de bFGF (Peprotech, Inc. Rocky Hill, NJ, USA), 25 ng/ml de FGF ácido (aFGF), 25 ng/ml de FGF-4, 20 ng/ml de fator de crescimento de queratinócito (KGF), 100 ng/ml de fator de célula-tronco (SCF), 100 ng/ml de fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), 10 ng/ml de fator de inibição de leucemia (LIF) (Millipore Corporation, Billerica, MA, USA), 100 ng/ml de fator neutrófico derivado da linhagem células gliais (GDNF), 20 ng/ml de fator do crescimento de hepatócito (HGF), 10 ng/ml de fator de crescimento similar a insulina (IGF)-1, 100 ng/ml de fator de crescimento epidérmico (EGF), 1x10-7 M de endotelina-1 (ET-
1), 10 ng/ml de fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF)-AA, ou 100 ng/ml de PDGF-BB (aqueles reagentes sem indicação de onde serem obtidos foram todos adquiridos de R&D systems). As células ES humanas foram cultivadas usando cada um dos meios de cultura para preparar agregados celulares.
[00147] O diâmetro das massas celulares foi medido 3, 8, 25 e 40 dias depois da preparação das massas celulares. Como pode ser constatado, a massa celular preparada na presença de bFGF tinha o diâmetro maior em cada um dos dias (Figura 20A). Também foi encontrado que essa ação de proteção era contínua ao longo dos 40 dias. Em vez de bFGF, cada uma das várias substâncias mencionadas acima foi adicionada ao meio de cultura e avaliada quanto ao seu efeito sobre a formação de massas celulares; EGF, PDFG-BB e ET-1 foram encontradas serem eficazes, embora não tão eficazes quanto bFGF (Figura 20B).
[00148] Como resultado, foi constatado que, até no caso de diferenciação de cardiomiócitos derivados de célula ES humana, bFGF tem atividades protetora e promotora do crescimento celular sob condições sem soro e que essas ações são mais acentuadas do que
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57/58 aquelas de outros fatores de crescimento.
[00149] Adicionalmente, a fim de elucidar o mecanismo pelo qual os cardiomiócitos transplantados para o coração hospedeiro podem amadurecer no tecido cardíaco após o transplante, bFGF, EGF, PDGF-BB e ET-1 foram testados por PCR em tempo real (Applied Biosystems) quanto a possibilidade de expressão de gene no coração hospedeiro. Os iniciadores e sondas para os respectivos genes foram adquiridos de Applied Biosystems (ensaios de expressão de gene TaqMan); para ser mais específico, foram usados bFGF (Mm0128715_m1), EGF (Mm01316967_m1), PDGF-BB (Mm01298577_m1), e ET-1 (Mm01351840_g1). Os reagentes usados para análise e para o procedimento operacional estavam de acordo com o manual de instruções fornecido por Applied Biosystems. Como resultado, pode ser constatado que os genes mencionados acima foram expressos no coração hospedeiro (Figura 21).
[00150] Os resultados do Exemplo 15 sugeriram que o grupo de fatores de crescimento necessários para a sobrevivência e maturação das massas celulares de cardiomiócitos transplantados para o coração são fornecidos pelo coração do hospedeiro.
APLICABILIDADE INDUSTRIAL [00151] De acordo com a presente invenção, foi encontrado que cardiomiócitos derivados de célula-tronco embrionária que foram purificados pela dispersão em células isoladas, têm uma nova característica tal que eles são capazes de agregação quando eles são cultivados sob condições sem soro. Pela construção de massas celulares usando o método da presente invenção, a cultura a longo prazo pode ser realizada com a taxa de sobrevivência ou capacidade proliferativa desses cardiomiócitos sendo mantidas em níveis elevados. Foi mostrado ainda que, quando essas células são transplantadas para o tecido cardíaco de um indivíduo (o organismo vivo), sua taxa de enxertia no tecido
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58/58 cardíaco é significativamente aumentada, com o resultado de que os cardiomiócitos não se misturarão com não-cardiomiócitos e podem ser enxertados por um período prolongado de tempo dentro do tecido cardíaco. Assim, a presente invenção aperfeiçoou a praticabilidade do fornecimento de cardiomiócitos para transplante, assim como um método de terapia celular para o coração que é alternativo ao transplante cardíaco, como um tratamento de doença cardíaca pelo transplante de cardiomiócitos que foram preparados fora do organismo vivo e um dispositivo médico compreendendo massas celulares de cardiomiócitos.

Claims (17)

  1. reivindicações
    1. Método de preparação de massas celulares de cardiomiócitos purificados derivados de células-tronco pluripotentes, caracterizado pelo fato de que os cardiomiócitos purificados derivados de célula-tronco pluripotente são obtidos pela dispersão de agregados de massas celulares que contêm cardiomiócitos diferenciados e induzidos a partir de células-tronco pluripotentes em células isoladas, e cultivar os cardiomiótcitos dispersos em um meio de cultura sob condições de ausência de soro em condições de cultura em suspensão em um poço de fundo redondo de não aderência à células de maneira que elas são reagregadas.
  2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que que as células-tronco pluripotentes são selecionadas a partir do grupo que consiste em células-tronco embrionárias, células germinativas embrionárias, células-tronco da linhagem germinativa e células-tronco pluripotentes induzidas.
  3. 3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura contém insulina.
  4. 4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura contém pelo menos uma substância selecionada a partir do grupo que consiste em transferrina, selênio, um fator de crescimento de fibroblasto básico (bFGF), um fator de crescimento de célula epitelial (EGF), um fator de crescimento BB derivado de plaqueta (PDGF-BB) e endotelina-1 (ET-
    1).
  5. 5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o conteúdo do meio de cultura é de 0,1 a 10 mg/L de insulina, 0,1 a 10 pg/L de transferrina, 0,1 a 10 pg/L de selênio, 1 ng/mL a 100 ng/mL do fator de crescimento de fibroblasto básico, 1 ng/mL a 1000 ng/mL do fator de crescimento de
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    2/3 célula epitelial, 1 ng/mL a 1000 ng/mL do fator de crescimento derivado de plaqueta e 1 x 10-8 a 1 x 10-6 M de endotelina-1 (ET-1).
  6. 6. Uso de massas celulares de cardiomiócitos purificados derivados de células-tronco pluripotentes, caracterizado pelo fato de que é para o preparo de um dispositivo médico para o tratamento de doença cardíaca, em que os cardiomiócitos não contém contaminação de não-cardiomiócitos.
  7. 7. Uso de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que as células-tronco pluripotentes são selecionadas a partir do grupo que consiste em células-tronco embrionárias, células germinativas embrionárias, células-tronco da linhagem germinativa e células-tronco pluripotentes induzidas.
  8. 8. Uso de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que as massas celulares de cardiomiócitos são aquelas obtidas pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5.
  9. 9. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, caracterizado pelo fato de que as massas celulares de cardiomiócitos são injetadas.
  10. 10. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, caracterizado pelo fato de que as massas celulares de cardiomiócitos estão na forma de uma película, e a película é preparada pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 11 a 13.
  11. 11. Método de preparação de uma película de massas celulares de cardiomiócitos, caracterizado pelo fato de que as massas celulares de cardiomiócitos purificados derivados de células-tronco pluripotentes são semeadas sobre a superfície de um recipiente de parede dividida, não-aderente a célula, sem espaço entre as massas celulares de tal forma que as massas celulares adjacentes estarão em contato continuamente umas com as outras, seguido pela cultura em suspensão que é mantida até que as massas celulares estejam unidas para
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    3/3 terem uma espessura desejada de 50 a 300 pm.
  12. 12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que as células-tronco pluripotentes são selecionadas a partir do grupo que consiste em células-tronco embrionárias, células germinativas embrionárias, células-tronco da linhagem germinativa e células-tronco pluripotentes induzidas.
  13. 13. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que as massas celulares de cardiomiócitos são aquelas obtidas pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5.
  14. 14. Dispositivo médico, caracterizado pelo fato de que compreende massas celulares de cardiomiócitos purificados diferenciados a partir de células-tronco pluripotentes, para uso no tratamento de uma doença cardíaca, em que os cardiomiócitos purificados não contém contaminação de não-cardiomiócitos.
  15. 15. Dispositivo médico de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que as células-tronco pluripotentes são selecionadas a partir do grupo que consiste em células-tronco embrionárias, células germinativas embrionárias, células-tronco da linhagem germinativa e células-tronco pluripotentes induzidas.
  16. 16. Dispositivo médico de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que o dispositivo médico é para a injeção das massas celulares de cardiomiócitos.
  17. 17. Dispositivo médico de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que as massas celulares de cardiomiócitos estão na forma de uma película, e a película é preparada pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 11 a 13.
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