WO2016052657A1 - 万能性幹細胞の培養方法 - Google Patents

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WO2016052657A1
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spheroids
culture
cell
stem cells
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壽公 植村
由衣 小野村
尚史 津村
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国立研究開発法人産業技術総合研究所
株式会社ジェイテック
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    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
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    • C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus
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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/72—Transferases (EC 2.)
    • C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
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    • C12N2525/00—Culture process characterised by gravity, e.g. microgravity
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    • C12N2531/00—Microcarriers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2539/00—Supports and/or coatings for cell culture characterised by properties

Definitions

  • the present invention relates to a method for culturing universal stem cells.
  • iPS cells artificial pluripotent stem cells
  • Non-Patent Documents 1 to 3 The discovery of artificial pluripotent stem cells (herein often referred to as “iPS cells”) (Non-Patent Documents 1 to 3) has increased the momentum for the practical application of regenerative medicine.
  • iPS cells are universal stem cells that can be differentiated into various tissues and organs like embryonic stem cells (ES cells), they have many advantages over embryonic stem cells.
  • ES cells embryonic stem cells
  • embryonic stem cells are established from fertilized eggs and have ethical problems
  • iPS cells can be established from somatic cells, so ethical problems do not arise.
  • embryonic stem cells often undergo rejection after transplantation due to differences in major histocompatibility antigens (MHC), whereas iPS cells are established from cells derived from transplant recipients, so there is almost no rejection.
  • MHC major histocompatibility antigens
  • iPS cells for the use of iPS cells in regenerative medicine, etc., the number of cells used in the laboratory is only about 10 6 , and the number of cells in the order of 10 9 to 10 10 is necessary for clinical application.
  • the mass culture technique has not been well established.
  • feeder cells such as mouse embryo-derived primary cultured fibroblasts (MEF) and STO cells in order to maintain and maintain an undifferentiated state.
  • MEF mouse embryo-derived primary cultured fibroblasts
  • STO cells contamination of feeder cells is a major obstacle to use in regenerative medicine. Therefore, feeder-free cell culture methods are also being researched.
  • Feeders can be developed by culturing iPS cells on the surface of a matrix coated with Matrigel, or by using a culture method using laminin or laminin partial peptide coating. Methods have been developed that can be cultured without the presence of cells. Further, instead of ordinary dish culture, culture using a bag is also performed. However, even in a feeder-free culture system, it is necessary to repeat the culture on the coated substrate, so that the culture process is complicated, and the cost of the culture is significantly increased, so that one patient can be treated. There is a serious problem that the cost of the system becomes enormous. A method for efficiently mass-culturing stable iPS cells retaining undifferentiated properties has not been developed yet.
  • An object of the present invention is to provide a safer and more efficient method for culturing universal stem cells.
  • the present inventors have cultivated universal stem cells in a pseudo-microgravity environment, so that even in the absence of feeder cells and coating agents, undifferentiated properties
  • the present inventors have found that pluripotent stem cells maintaining the above can be proliferated and spheroids can be formed, and the present invention has been completed.
  • iPS cells grow on feeder cells or on coating agents such as Matrigel, and it was considered difficult to grow in an environment without feeder cells or coating agents.
  • the inventors' discovery that iPS cells can be easily cultured in large quantities and can produce spheroids was surprising.
  • the pluripotent stem cells can be proliferated in a closed system with a low risk of contamination by this culture method, so that safety can be improved.
  • the present invention includes the following. [1] including culturing isolated pluripotent stem cells in a pseudo-microgravity environment, allowing pluripotent stem cells to proliferate in an undifferentiated state, and forming and growing spheroids of pluripotent stem cells A method for culturing universal stem cells.
  • the pseudo microgravity environment is obtained by using a single-axis rotating bioreactor that realizes the pseudo microgravity environment on the ground by offsetting the gravity of the earth by the stress generated by the rotation [1]
  • FIG. 1 is a photograph showing a phase contrast image of spherical spheroids produced by rotating culture of 253G1 cells in an RWV bioreactor in the presence of a ROCK inhibitor for 3 days.
  • the bar in the figure indicates 500 ⁇ m.
  • FIG. 2 shows the diameter distribution of spherical spheroids produced by rotationally culturing 253G1 cells in an RWV bioreactor in the presence of a ROCK inhibitor for 3 days.
  • FIG. 3 shows the results of flow cytometry analysis of the expression of pluripotent stem cell markers in spherical spheroid-derived cells produced by rotational culture for 3 days in an RWV bioreactor.
  • A is the FSC-A / SSC-A dot plot
  • B is the SSC-A / PI dot plot
  • C is the SSEA-4 / TRA-1-60 dot plot
  • D is the area defined in Figures 3A, B, and C. Shows the number of events and their ratio.
  • FIG. 4 shows the analysis results of the negative control of flow cytometry.
  • A is the FSC-A / SSC-A dot plot
  • B is the SSC-A / PI dot plot
  • C is the SSEA-4 / TRA-1-60 dot plot
  • D is the area defined in Figures 4A, B, and C Shows the number of events and their ratio.
  • FIG. 5 shows the expression levels of undifferentiated marker genes Nanog, Oct3 / 4 and Sox2 in globular spheroid-derived 253G1 cells prepared by rotational culture (three-dimensional culture) for 3 days using an RWV bioreactor, and in two-dimensionally cultured 253G1 cells It is the graph which compared the expression level. The left is the result of two-dimensional culture and the right is the result of three-dimensional culture.
  • FIG. 6 shows the result of staining the spherical spheroid-derived 253G1 cells prepared by rotational culture (three-dimensional culture) for 3 days with an RWV bioreactor using a three germ layer differentiation kit.
  • FIG. 7 is a schematic diagram of a test in which 253G1 cells are continuously subcultured using a 50 ml vessel.
  • FIG. 8 is a photograph showing a phase contrast image of small spheroids obtained by pulverizing spherical spheroids prepared by culturing 253G1 cells for 3 days using a 50 ml vessel through a 70 ⁇ m filter.
  • A Phase contrast image at low magnification. The bar in the figure indicates 1000 ⁇ m.
  • FIG. 9 shows the results of real-time PCR measurement of the expression level of undifferentiated markers after collecting spherical spheroids after continuous culture of 253G1 cells using 50 ml vessels.
  • the expression levels of the undifferentiated marker genes Nanog, Oct3 / 4, and Sox2 were compared with the expression levels in the two-dimensionally cultured 253G1 cells.
  • 2D represents the result of two-dimensional culture.
  • P5, P6, P7, and P8 represent the results after each passage from planar culture (see also schematic diagram in FIG. 7).
  • FIG. 10 shows the result of immuno-antibody staining targeting neuronal differentiation marker Pax6 (upper) and undifferentiation marker Oct3 / 4 (lower) on spheroid cells cultured in neuronal differentiation medium after rotational culture in RWV bioreactor.
  • FIG. 11 shows the results of real-time PCR analysis of spheroid cells cultured in a neuronal differentiation medium after rotational culture in an RWV bioreactor.
  • A shows Nanog
  • B shows Pax6, and C shows Sox1 expression in a culture time-dependent manner.
  • the present invention relates to a method for culturing (proliferating) a universal stem cell, which comprises culturing the universal stem cell in a state of maintaining undifferentiation by culturing the isolated universal stem cell in a pseudo-microgravity environment. I will provide a.
  • “pseudo-microgravity environment” means a simulated microgravity environment artificially created by simulating a microgravity environment in outer space or the like. Such a pseudo microgravity environment is realized, for example, by offsetting the earth's gravity by the stress generated by the rotation. Since a rotating object receives a force expressed by the vector sum of the gravity and stress of the earth, its size and direction change with time. Eventually, a rotating object will have a much smaller gravitational force than the Earth's gravity (1 g) on a time average, and a “pseudo microgravity environment” that is very similar to outer space will be realized. .
  • the “pseudo-microgravity environment” in the present invention is capable of proliferating without allowing universal stem cells to settle in the culture medium (medium), and the generated three-dimensional cell aggregates (spheroids) float in the liquid without sedimentation. It is preferable to adjust so that it may become a state.
  • the culture system can be rotated at a rotational speed that minimizes the effect of the earth's gravity on the cells. Specifically, it is preferable to set the rotation speed so that the microgravity applied to the cultured cells is reduced to a gravity equivalent to about 1/10 to 1/100 of the earth's gravity (1 g) on a time average.
  • a pseudo-microgravity environment can be realized using a rotating bioreactor.
  • a rotating bioreactor examples include RWV (Rotating-Wall Vessel: US Patent No. 5,002,890), RCCS (Rotary Cell Culture System TM : Synthecon Incorporated), 3D-clinostat, and JP-A-8-173143, Examples thereof include those described in 9-37767 and JP-A-2002-45173.
  • multi-axis rotation type for example, 2-axis type clinostat, etc.
  • the shear stress cannot be minimized, and the sample itself also rotates. This is because it is impossible to reproduce the floating state.
  • RWV and RCCS are excellent in that they have a gas exchange function.
  • the RWV bioreactor is a uniaxial rotating bioreactor developed by NASA with a gas exchange function. After filling the culture medium in the horizontal cylindrical bioreactor and seeding cells, the horizontal axis direction of the cylinder Is a single-axis rotary culture apparatus that performs culture while rotating along the axis.
  • the earth's gravity is offset by the stress caused by rotation, and a much smaller (about 1/100) microgravity environment is realized compared to the gravity on the ground, and the cells are suspended in the culture medium. It grows in the state which was done, and three-dimensional culture
  • the universal stem cells suspended in the culture medium efficiently proliferate and aggregate to form spheroids (three-dimensional cell aggregates; typically spherical, cell aggregates). be able to.
  • the spheroid of a universal stem cell can be grown into a larger size spheroid by culture
  • a culture vessel for example, a vessel for culturing universal stem cells in a pseudo microgravity environment is not particularly limited, but can have any shape or capacity that can be used in a single-axis rotating bioreactor, such as an RWV bioreactor.
  • the culture vessel can be used.
  • the culture vessel eg, vessel
  • the culture vessel is not limited to the following, but may have a capacity of, for example, 5 ml to 5000 ml, 10 ml to 2000 ml, or 10 ml to 100 ml.
  • the preferred rotation speed when using an RWV bioreactor can be set as appropriate according to the diameter of the vessel and the size and mass of the spheroid to be produced, but a vessel up to a capacity of about 100 ml, for example, an RWV vessel with a diameter of 5 cm. In the case of using (volume 10 ml), it is preferable to adjust to about 5 to 15 rpm, 7 to 15 rpm, for example, 7.5 to 8.5 rpm or 6 to 8.5 rpm.
  • the rotation speed is constant, the flow velocity increases in proportion to the radius from the rotation center.
  • a person skilled in the art adjusts the rotation speed to an appropriate rotation speed in the direction of decreasing the rotation speed. can do.
  • the gravity acting on the cells in the vessel is approximately 1/10 to 1/100 of the ground gravity (1 g), and the spheroids are floating without being settled. Can be maintained.
  • the universal stem cells cultured by the method of the present invention are not limited, but preferably induced pluripotent stem cells, also called iPS cells, or ES cells It may be an embryonic stem cell called.
  • iPS cells are pluripotent stem cells that are induced by reprogramming somatic cells by introducing reprogramming factors (typically by introducing one or more reprogramming-inducing genes). Is well known. Examples of the reprogramming factor include, but are not limited to, the Oct family, Klf family, Sox family, Myc family, Nanog family, and Lin family.
  • reprogramming factors include, but are not limited to, Oct3 / 4, Klf4, Klf2, Sox1, Sox2, Sox3, Sox15, Sox17, c-Myc, N-Myc, L-Myc, T58A, Nanog, Lin28 Fbx15, ERas, ECAT15-2, Tcl1, ⁇ -catenin, Lin28b, Sall1, Sall4, Esrrb, Nr5a2, Tbx3, p53shRNA, and Glis1. It is preferable to introduce at least the Oct family, particularly Oct3 / 4, as a reprogramming factor into somatic cells.
  • the reprogramming factor can be introduced by introducing a gene encoding a reprogramming factor (reprogramming induction gene) into a somatic cell.
  • iPS cells can be prepared by introducing an Oct family gene, a Klf family gene, and a Sox family gene and / or a Myc family gene (for example, Oct3 / 4, Sox2, and Klf4).
  • iPS cells may also be prepared by other methods.
  • iPS cells are typically derived from animals, preferably from mammals, for example, primates such as humans and monkeys, rodents such as mice and rats, and those derived from dogs, cats, rabbits and the like. It is done.
  • the iPS cell may be derived from any tissue (somatic cell), and examples thereof include, but are not limited to, those derived from skin, bone marrow, nose, digestive tract, liver and the like.
  • ES cells are pluripotent cells obtained by removing and culturing the inner cell mass of a blastocyst.
  • iPS cells and ES cells can be obtained from, for example, RIKEN BioResource Center Cell Materials Development Office (RIKEN BRC CELL BANK) (Japan), ATCC (American Type Culture Collection), iPS Academia Japan Co., Ltd. (Japan), etc.
  • RIKEN BRC CELL BANK (Japan)
  • ATCC American Type Culture Collection
  • iPS Academia Japan Co., Ltd. Japan
  • apan a person skilled in the art can also prepare it by a conventional method.
  • isolated with respect to the universal stem cell of the present invention means that the cell is a cell taken from a living body or a cell line prepared from a cell taken from a living body.
  • An “isolated” universal stem cell may be a single cell, a cell mass, a spheroid, or the like.
  • the pluripotent stem cells can be rotationally cultured using any ES / iPS medium (medium for maintaining undifferentiation) for proliferation and spheroid production.
  • ES / iPS medium medium for maintaining undifferentiation
  • examples of such a medium include mTeSR1 medium, TeSR1 medium (Stem Cell Technologies), Essensial 8 TM medium, Essential 6 TM medium (Gibco), StemPro (R) -34 SFM (Life Technologies), etc. It is not limited.
  • the pluripotent stem cells for example 1x10 4 ⁇ 1x10 5 cells / cm 3, more preferably 3x10 4 ⁇ 8x10 4 cells / cm 3, more preferably at a cell density of 4x10 4 ⁇ 6x10 4 cells / cm 3
  • a pseudo-microgravity environment typically, rotation culture
  • efficient cell proliferation and spheroid formation can be brought about.
  • Seeding at this cell density is particularly preferred, for example in vessels with a diameter of 4-6 cm, for example vessels with a diameter of 5 cm (volume 10 ml).
  • seeding at such a cell density is not limited to a vessel of the above-mentioned size.
  • a universal stem cell can be efficiently proliferated even with a vessel of 10 to 2000 ml.
  • pluripotent stem cells can be detached by any cell dispersion method such as mechanical, chemical, or biological after culturing under normal culturing conditions, and used for the above-described rotational culture or the like.
  • EDTA for example, 1 to 10 mM EDTA
  • TryPLE TM Select Accutase TM , collagenase, dispase, trypsin, trypsin / EDTA, trypsin / collagenase, ReLeSR TM (STEMCELL), etc.
  • the cells may be dispersed by using as a stripping solution.
  • the spheroids of universal stem cells formed by suspension culture may be mechanically pulverized by passing through a filter and the like to disperse the cells, and may be used for the above-described rotary culture or the like.
  • the number of pluripotent stem cells is about 3 to 1,000 cells, preferably about 5 to 600 cells, more preferably about 5 to 300 cells, such as about 30 to 200 cells, 10 to 100 cells, or about 20 to 40 cells.
  • the seeds separated and dispersed may be seeded and cultured in a pseudo microgravity environment such as rotational culture.
  • a pseudo microgravity environment such as rotational culture.
  • a small spheroid consisting of preferably 5 to 300 cells, more preferably 10 to 100 cells, and even more preferably 20 to 40 cells.
  • Cells separated and dispersed may be seeded and cultured in a pseudo microgravity environment such as rotating culture.
  • Universal stem cell small spheroids produced by chemical disruption, such as with cell detachment fluid typically have a diameter of less than 300 ⁇ m, for example about 50-200 ⁇ m.
  • the spheroid formation and growth can be promoted by culturing the universal stem cells seeded in the form of small spheroids under a pseudo-microgravity environment.
  • small spheroid means a relatively small cell mass composed of a relatively small number of cells, and typically about 3 to 1,000 cell masses such as 5 to 600. Cell masses of 30 to 200 cells, 10 to 100 cells or 20 to 40 cells are included.
  • the small spheroids may be spherical or elongated, or other shapes.
  • spheroid-shaped universal stem cells or universal stem cells dispersed in individual cells may be cultured in a pseudo microgravity environment (rotation culture or the like) as described above.
  • Universal stem cells may be cultured in a pseudo microgravity environment such as rotational culture in the presence of an apoptosis inhibitor.
  • an apoptosis inhibitor ROCK (lock
  • ROCK inhibitors are effective for ES cell survival and are known to contribute to the induction of apoptosis (Watanabe K., Nat. Biotechnol., (2007) 25 (6), p.681-686; Ohgushi M , et al., Cell Stem Cell, (2010) 7 (2), p.225-239).
  • ROCK inhibitors include Y27632 ((R)-(+)-trans-N- (4-pyridyl) -4- (1-aminoethyl) -cyclohexanecarboxamide ⁇ 2HCl ⁇ H 2 O) (eg Calbiochem, WAKO Pure Chemicals, etc.), Fasudil (1- (5-isoquinolinesulfonyl) homopiperazine hydrochloride) (for example, Calbiochem) and the like.
  • the apoptosis inhibitor may in one embodiment be at a concentration of 1 ⁇ M to 100 ⁇ M, preferably 3 ⁇ M to 30 ⁇ M, more preferably 5 ⁇ M to 15 ⁇ M in the culture medium.
  • spheroid refers to a cell mass in which a large number of cells aggregate, and typically refers to a cell mass having a diameter of 300 ⁇ m or more, for example, 300 to 2000 ⁇ m.
  • the culture temperature of the universal stem cells is not particularly limited, but is preferably 36.0 to 38.0 ° C, more preferably 36.5 to 37.5 ° C.
  • Rotational culture using a bioreactor is not particularly limited, but can be preferably performed for 2 to 7 days, more preferably 2 to 5 days, for example 3 to 5 days, and further preferably 3 to 4 days.
  • the cells are preferably transferred every 2 to 7 days, more preferably 2 to 5 days, for example 3 to 5 days, and further preferably every 3 to 4 days. It can be cultured for a long time.
  • pluripotent stem cell spheroids (mainly spherical spheroids) can be produced in a large amount in the culture medium by the culture as described above.
  • the spheroids obtained after 3 days of culture have a diameter mainly in the range of 300-1000 ⁇ m, most often in the range of 700-900 ⁇ m.
  • the cells constituting the pluripotent stem cells or spheroids obtained by culturing as described above retain undifferentiated properties. Retention of undifferentiation can be confirmed by detecting the expression of an undifferentiated marker by flow cytometry or the like.
  • undifferentiated markers include SSEA-4, TRA-1-60, NanogNOct3 / 4, Sox2, REX-1, LIN28, LEFTB, GDF3, ZFP42, FGF4, ESG1, DPPA2, TERT, KLF4, c-Myc
  • SSEA-4 SSEA-4, TRA-1-60, NanogNOct3 / 4, Sox2, REX-1, LIN28, LEFTB, GDF3, ZFP42, FGF4, ESG1, DPPA2, TERT, KLF4, c-Myc
  • SSEA-4 SSEA-4, TRA-1-60, NanogNOct3 / 4, Sox2, REX-1, LIN28, LEFTB, GDF3, ZFP42, FGF4, ESG1, DPPA2,
  • the expression state of the undifferentiation marker gene For confirmation of cell undifferentiation, it is more preferable to analyze the expression state of the undifferentiation marker gene.
  • the analysis of the expression state of the undifferentiated marker gene can be suitably performed, for example, by quantification using real-time PCR.
  • a universal stem cell in the culture method of the present invention, can be rotationally cultured without using a cell scaffold material, and can be proliferated while maintaining undifferentiation.
  • the cell scaffold material refers to any cell scaffold material (scaffold) that can be used in cell culture such as collagen, polymer, gel, glass, plastic, fiber, film, and beads.
  • the spheroids of universal stem cells generated by culturing under a pseudo microgravity environment may be separated and dispersed into a smaller number of cells, for example, small spheroids, and further cultured. Separation and dispersion of cells from spheroids can be performed as described above, for example, by any mechanical, chemical, or biological method.
  • the cells dispersed from the spheroids can be further cultured in a pseudo microgravity environment as described above (typically, rotation culture) to grow a large number of cells and generate a large number of spheroids.
  • distributed from the spheroid may be culture
  • the spheroids (typically globular spheroids) produced by culturing in a pseudo-microgravity environment in the above method may be any mechanical (mechanical), chemical, or biological.
  • the process of crushing by the method and further culturing the generated small spheroids in a pseudo-microgravity environment to form and grow spheroids is repeated once or twice (multiple times, for example, 2 to 30 times). It is also preferable.
  • the small spheroids that are further cultured in a pseudo microgravity environment may be a mixture of small spheroids obtained by different grinding methods.
  • spheroids produced by culturing in a pseudo-microgravity environment in the above method are typically crushed through a filter, and small spheroids obtained by the mechanical (mechanical) crushing are simulated.
  • the process of further culturing in a microgravity environment to form and grow spheroids can be repeated once or twice or more.
  • the spheroids may be passed through a filter by applying pressure using a pipette or the like.
  • a filter having a filtration particle size capable of crushing the produced spheroids into smaller spheroids having a smaller size can be used, and one having a filtration particle size of 40 to 100 ⁇ m, preferably 60 to 80 ⁇ m, for example 70 ⁇ m. preferable.
  • small spheroids obtained by crushing through a filter generally have an elongated shape.
  • small spheroids obtained by crushing through a 70 ⁇ m filter are generally equal to or larger than small spheroids obtained by chemical crushing.
  • the spheroids may be crushed once or twice (multiple times, for example, 2 to 30 times) through a filter.
  • a filter having the same filtration particle size may be used at the time of passing through each filter, or filters having different filtration particle sizes may be used.
  • the crushed spheroids may be further crushed through a filter having a larger filtration particle size, whereby the size of the resulting small spheroids (In particular, the major axis) can be arranged in a narrower range.
  • the culture period of pulverized spheroids (small spheroids) in a pseudo microgravity environment is not limited to the following, but is preferably 2 to 7 days, preferably 2 to 5 days, for example 3 to 5 days or 3 to 4 days. Is more preferable.
  • the culture amount in each culture step in a pseudo microgravity environment that is, the size of the culture vessel and the amount of the medium may be the same or different for each culture. In the case of mass culture, it may be scaled up for each culture.
  • universal stem cells such as iPS cells are obtained by a method of repeatedly forming and growing spheroids by culturing in a pseudo-microgravity environment, disrupting spheroids generated thereby, and reseeding small spheroids generated by disruption. It can be maintained and propagated in an undifferentiated state for a very long time. As a result, mass production of universal stem cells such as iPS cells becomes easier.
  • differentiation induction of those cells may be performed. It can. For example, inducing differentiation into ectoderm, mesoderm, or endoderm by culturing universal stem cells in a differentiation induction medium such as ectoderm differentiation medium, mesoderm differentiation medium, or endoderm differentiation medium, etc. Can do.
  • the ectoderm differentiation medium, the mesoderm differentiation medium, and the endoderm differentiation medium are commercially available, and examples include those contained in the three germ layer differentiation kit Stem Cell Kit: Human Pluripotent Stem Cell Functional Identification Kit (R & D Systems).
  • the pluripotent stem cells seeded in the differentiation-inducing medium may be small spheroids or dispersed in single cells.
  • the culture in the differentiation-inducing medium may be performed on a feeder cell such as MEF or a cell scaffold material such as a coating agent, or may be performed by rotational culture in a pseudo microgravity environment as described above.
  • the present invention implements the above-described method for culturing pluripotent stem cells, and differentiates the pluripotent stem cells obtained thereby (universal stem cells that have been expanded or dispersed from the generated spheroids) and / or spheroids.
  • a method for inducing differentiation of pluripotent stem cells (a method for producing differentiated cells from pluripotent stem cells), which further comprises culturing in an induction medium.
  • Culturing in the differentiation induction medium may be performed by culturing in a pseudo-microgravity environment as described above (rotary culture or the like), or by other cell culture methods used for differentiation induction.
  • ectoderm marker genes include Otx2, Nestin, TP63, etc.
  • mesoderm marker genes include Brachyury
  • endoderm marker genes include Sox17, AFP, GATA-4, and PDX-1.
  • the spheroid of universal stem cells obtained by the method of the present invention that is, the method for culturing universal stem cells in an undifferentiated maintenance medium using culture in a pseudo-microgravity environment as described above. Is further cultured in a differentiation-inducing medium, and differentiation of cells in the spheroid can be induced while maintaining the spheroid morphology.
  • the culture in the differentiation induction medium may be performed by culturing in a pseudo microgravity environment, or may be performed by another cell culture method used for differentiation induction.
  • the pluripotent stem cells (undifferentiated cells) constituting the spheroids can be differentiated into target cells (cells targeted by the differentiation induction medium used).
  • target cells cells targeted by the differentiation induction medium used.
  • the spheroids are transferred to a differentiation-inducing medium and cultured, for example, cultured in a pseudo-microgravity environment.
  • the pluripotent stem cells (undifferentiated cells) constituting the spheroids may be differentiated into target cells by rotating culture or the like.
  • the present invention provides a method for inducing the differentiation of pluripotent stem cells, comprising performing the above-described method for culturing pluripotent stem cells and further culturing the spheroids obtained thereby in a differentiation induction medium, and the method Also provided are methods for producing spheroids comprising cells differentiated from universal stem cells.
  • any differentiation-inducing medium for the purpose of inducing differentiation into a predetermined cell can be used for inducing differentiation of pluripotent stem cells.
  • a differentiation induction medium may be, for example, a neural differentiation medium, an osteoblast differentiation medium, a cardiomyocyte differentiation medium, an adipocyte differentiation medium, an intestinal epithelial cell differentiation medium, or the like.
  • pluripotent stem cells can be differentiated into neural cells by culturing pluripotent stem cells or spheroids using a neural differentiation medium as a differentiation induction medium.
  • the differentiation induction medium may be an ectoderm differentiation medium, a mesoderm differentiation medium, or an endoderm differentiation medium.
  • Various commercial products can be used as these differentiation-inducing media.
  • 253G1 cells were used as human induced pluripotent stem cells (hiPSCs).
  • 253G1 cells (introduced Oct3 / 4, Sox2, and Klf4; non-patent document 3) were purchased from RIKEN BioResource Center Cell Materials Development Office (RIKEN BRC CELL BANK) (Japan) under cell number HPS0002.
  • Example 1 Spheroid production from induced pluripotent stem cells (iPS cells) by three-dimensional culture using RWV bioreactor
  • spherical spheroids 253G1 cells were cultured in human ES / iPS cell maintenance medium mTeSR1 (STEMCELL Technologies) using a 6 cm or 10 cm culture dish coated with Matrigel (BD Matrigel TM , BD Biosciences). The culture medium was changed every day, and maintained using 5 mM EDTA and 0.5x TrypLE TM Select (Life Technologies).
  • 253G1 cells used for seeding were detached into small spheroids (loose cell mass having a diameter of about 50 ⁇ m to 200 ⁇ m) consisting of about 20 to 40 cells using 5 mM EDTA.
  • a phase contrast image of spherical spheroids generated in the culture solution was taken using an inverted microscope Axio Observer (Carl Zeiss) (FIG. 1). Moreover, the diameter of spherical spheroids was measured and the size distribution was examined (FIG. 2).
  • spherical spheroids were collected and crushed by pipetting using a pipette to disperse the cells.
  • the number of cells was counted using an automatic cell counter Countess TM (Invitrogen). From the total cell number in the culture, the multiplication factor (total cell number / 4.9 ⁇ 10 5 cells) relative to the seeded cell number (4.9 ⁇ 10 5 cells) was calculated.
  • FIG. 1 In the vessel using the ROCK inhibitor-containing medium, many spherical spheroids were formed (FIG. 1). The total number of cells was 3.1 ⁇ 10 6 cells, and the multiplication factor was 6.5 times. The diameter distribution of the spherical spheroids had a peak at 700 to 900 ⁇ m (Fig. 2). On the other hand, in the vessel using the ROCK inhibitor-free medium, spherical spheroids were not formed, and the suspension was only a single cell.
  • spherical spheroids can be produced from iPS cells by rotary culture using an RWV bioreactor in a ROCK inhibitor-containing medium.
  • ROCK inhibitor concentration 253G1 cells were rotationally cultured for 3 days under the same conditions as above except that three types of ROCK inhibitor concentrations of 3 ⁇ M, 10 ⁇ M, or 30 ⁇ M were used. . After culturing, the number of produced spherical spheroids was 10 at 3 ⁇ M, 50 at 10 ⁇ M, and 20 at 30 ⁇ M.
  • the same experiment was repeated several times, and as a result, the growth rate was remarkably high when the initial cell density was 4 ⁇ 10 5 to 6 ⁇ 10 5 cells, that is, 4 ⁇ 10 4 to 6 ⁇ 10 4 cells / cm 3 per 10 ml medium. It was shown that. Cell growth was observed even in the ROCK inhibitor-free medium, but the growth rate was significantly increased in the ROCK inhibitor-containing medium.
  • 253G1 cells exfoliated into small spheroids consisting of approximately 20 to 40 cells using 5 mM EDTA alone are seeded in 10 ml RWV vessel at the seeding number in the above-mentioned preferable range, and 3 ⁇ m in 10 ⁇ M ROCK inhibitor Y27632-containing mTeSR1 medium (10 ml). Rotated culture for days.
  • Table 2 shows examples of results obtained using only 5 mM EDTA for cell detachment.
  • Example 2 Characteristic evaluation of iPS cells cultured in RWV bioreactor
  • 253G1 cells detached using 5 mM EDTA were seeded in 10 ml vessels and contained in mTeSR1 medium containing 10 ⁇ M ROCK inhibitor Y27632. And then cultivated by rotation for 3 days using an RWV bioreactor. After culturing, the produced spheroids were treated with Accutase TM to form single cells, seeded in a 24-well plate coated with matrigel, and cultured for 3 days. After culturing, analysis by flow cytometry was performed to analyze the expression of pluripotent stem cell markers in 253G1 cells.
  • Flow cytometry is performed using a flow cytometer Attune (R) Acoustic Focusing Cytometer (Applied Biosystems), a fluorescently labeled antibody that stains pluripotent stem cells (anti-SSEA-4 antibody: Alexa Fluor488 anti-human SSEA4 (Cat330441, BioLegend), And anti-TRA-1-60 antibody: PE anti-human TRA-1-60 (Cat330609, BioLegend)) (test sample).
  • Negative control was performed using Alexa Fluor 488 Mouse IgG3, ⁇ IsoType Ctrl (Cat401323, BioLegend) and PE Mouse IgM, ⁇ IsoType Ctrl (Cat401609, BioLegend).
  • Example 3 Evaluation of expression of iPS cell marker gene by real-time PCR
  • analysis using real-time PCR was performed.
  • Undifferentiated marker genes Nanog, Oct3 / 4 (Pou5f1), and Sox2 were targeted.
  • Real-time PCR measurement was performed by the following procedure using StepOne TM Real-Time PCR System (Life Technologies, Applied Biosystems).
  • 253G1 cells detached using 5 mM EDTA as in Examples 1 and 2 were rotationally cultured in mTeSR1 medium containing 10 ⁇ M ROCK inhibitor Y27632 for 3 days using an RWV bioreactor, and the resulting spheroids were recovered and obtained.
  • the resulting cell pellet was frozen at -80 ° C.
  • 253G1 cells detached with 5 mM EDTA were seeded in a culture dish coated with Matrigel, cultured in mTeSR1 medium for 3 days (two-dimensional culture), and then centrifuged to collect the cells.
  • the cell pellet was frozen at -80 ° C.
  • the cell pellet stored frozen at ⁇ 80 ° C. was freeze-thawed on ice, and total RNA (total RNA) was extracted using RNeasy (R) Mini Kit (QIAGEN).
  • RNeasy (R) Mini Kit QIAGEN
  • the RNA concentration was measured using a spectrophotometer NanoDrop 1000 Spectrophotometer (Thermo Fischer Scientific). From 1.5 ⁇ g of total RNA, cDNA was synthesized in a 20 ⁇ l reaction system using High-Capacity RNA-to-cDNA Kit (Applied Biosystems).
  • RNA in real-time PCR was measured according to the manufacturer's protocol, and analyzed by ⁇ CT method using Applied Biosystems StepOne TM Real-Time PCR System Software v2.2.2.
  • FIG. 5 shows the results of comparing the expression levels based on real-time PCR and relative quantification by the ⁇ CT method.
  • three typical spherical spheroids (right of FIG. 5) constructed by rotational culture (three-dimensional culture) are used, compared to the case where normal two-dimensional culture is performed (left of FIG. 5).
  • the expression level of the undifferentiated marker gene was high. Similar experiments were performed multiple times, but always showed similar results. Therefore, it was shown that rotational culture using an RWV bioreactor has an advantage in terms of culture that maintains undifferentiation compared to two-dimensional culture.
  • Example 4 Differentiation experiment of iPS cells derived from spherical spheroids produced by rotary culture using RWV bioreactor According to the method described in Example 1, 253G1 cells detached using 5 mM EDTA were seeded in 10 ml vessels. Rotating culture was carried out for 3 days in an mTeSR1 medium containing 10 ⁇ M ROCK inhibitor Y27632 using an RWV bioreactor to prepare spherical spheroids.
  • the differentiation into three germ layers was observed using a three germ layer differentiation kit Stem Cell Kit: Human Pluripotent Stem Cell Functional Identification Kit (R & D Systems).
  • the medium is replaced with the ectodermal differentiation medium (Ectoderm Differentiation Media) included in the kit (Day 1), and the medium is further replaced with the ectoderm differentiation medium on the second and third days. After culturing, fluorescent antibody staining with an antibody for detecting the expression of the ectoderm marker Otx2 was performed on the 4th day.
  • the medium is changed to the mesoderm differentiation medium (Mesoderm Differentiation Media) included in the kit (Day 1), and after 12 to 16 hours, the medium is similarly cultured in the mesoderm differentiation medium.
  • fluorescent antibody staining with an antibody that detects the expression of the mesoderm marker Brachyury was performed 24-36 hours after the first medium change to the differentiation-inducing medium.
  • the medium is changed to Endoderm Differentiation Media I (Endoderm Differentiation Media I) included in the above kit (Day 1), and the endoderm is 16 to 24 hours after the first medium change to the differentiation induction medium.
  • Change to differentiation medium II Endoderm Differentiation Media II
  • culture on the 3rd day while changing to endoderm differentiation medium II Endoderm Differentiation Media II
  • detect expression of endoderm marker Sox17 was performed.
  • cell fixation and staining were performed by washing a 24-well dish after culturing with PBS, treating with 4% paraformaldehyde / PBS for 20 minutes at room temperature, fixing, and then washing with 1% BSA / PBS.
  • Example 5 Propagation experiment of iPS cells by RWV bioreactor using 50 ml vessel According to the method described in Example 1 (1), 253G1 cells exfoliated into small spheroids using 5 mM EDTA were seeded in a 50 ml vessel. Rotating culture was carried out in an mTeSR1 medium containing 10 ⁇ M ROCK inhibitor Y27632 using an RWV bioreactor at a rotational speed of 8 rpm for 3 days to produce spherical spheroids.
  • the growth rate was highest when a total of 2.5 ⁇ 10 6 cells were seeded in a 50 ml vessel, that is, about the same as a 10 ml vessel.
  • the seeding density (5.0 ⁇ 10 4 cells / cm 3 ) showed a particularly high growth rate.
  • the growth rate was 3.8 to 4.5 times in 3 days.
  • Example 6 Continuous subculture test
  • a continuous subculture test was performed. The procedure is schematically shown in FIG.
  • 253G1 cells (2.5 ⁇ 10 6 cells) exfoliated into small spheroids using 5 mM EDTA were seeded in a 50 ml vessel using an RWV bioreactor in mTeSR1 medium containing 10 ⁇ M ROCK inhibitor Y27632. Rotating culture was performed for 3 days to produce spherical spheroids.
  • spherical spheroids were collected from a 50 ml vessel using a pipette, and passed through a filter (BD Falcon (R) 70 ⁇ m Cell Strainer Nylon REF 352350; BD BIosciences) with a filtration particle size of 70 ⁇ m. Crushed into.
  • the obtained small spheroids (small spheroids obtained by mechanical pulverization) were seeded in a new 50 ml vessel and rotationally cultured at 8 rpm for 3 days to produce spherical spheroids. Thereafter, grinding with a 70 ⁇ m filter, seeding in a new 50 ml vessel, and rotation culture for 3 days were repeated (continuous subculture).
  • FIG. 8 shows an image of a small spheroid immediately after pulverization with a 70 ⁇ m filter.
  • 8A shows a phase difference image at a low magnification
  • FIG. 8B shows a phase difference image at a high magnification.
  • Small spheroids after pulverization with a filter are elongated and have a short diameter of 70 to 100 ⁇ m and a long diameter of 70 to 400 ⁇ m (number of cells per cell is approximately 30 to 200). Was forming. By seeding this small spheroid in a new vessel and rotating and culturing for 3 days, a larger spherical spheroid could be obtained.
  • Example 7 Evaluation on maintenance of undifferentiation by continuous subculture
  • each rotation culture (3D culture; P5 to P8)
  • a portion of spherical spheroids before filtering was collected and analyzed using real-time PCR.
  • Undifferentiated marker genes Nanog, Oct3 / 4 (Pou5f1), and Sox2 were targeted.
  • the experimental method for real-time PCR is the same as in Example 3.
  • iPS cells can be cultured in large quantities while maintaining undifferentiation by the method of the present invention.
  • Example 8 Differentiation induction test According to the method described in Example 5, using an RWV bioreactor using 50 ml vessel, 253G1 cells were rotated at 37 ° C for 3 days in mTeSR1 medium containing 10 ⁇ M ROCK inhibitor Y27632 at 8 rpm. Rotating culture was performed at a speed to prepare spherical spheroids (iPS spheroids). Thereafter, the mTeSR1 medium was completely replaced with a neural differentiation medium (STEMdiff TM Neural Induction Medium, STEMCELL Technologies Inc., cat # 05835) (day 0), and the culture was continued under the same conditions.
  • a neural differentiation medium STEMdiff TM Neural Induction Medium, STEMCELL Technologies Inc., cat # 05835
  • the immunizing antibody staining the iPS spheroids Akyutaze TM (Accutase TM; Innovative Cell Technologies , Inc.) was dispersed into the cells using, seeding it to 3cm dishes were cultured for 20 hours by neuronal differentiation medium, universal Immunostaining was performed according to the protocol (ABC method).
  • anti-Pax6 antibody BioLegend, rabbit polyclonal anti-Pax-6 antibody
  • anti-Oct3 / 4 antibody hES / iPS Cell Characterization Kit, Applied StemCell, cat # ASK-3006
  • the evaluation by the real-time PCR method was performed using the analysis method by the ⁇ CT method as in Example 3.
  • Nanog was used as an undifferentiated marker for iPS cells.
  • the primer and probe set used was Taqman Gene Expression assay (ID: Hs04260366_g1). Specifically, Pax6 and Sox1 were selected as markers for neural differentiation, and products of Taqman Gene Expression assay: Hs00240871_m1 and Hs01057642_s1 were used for each.
  • GAPDH glycose hydrochloride-3-phosphate dehydrogenase
  • FIG. 10 The results of immunoantibody staining are shown in FIG. As shown in FIG. 10, immunostaining with anti-Pax6 antibody and anti-Oct3 / 4 antibody on days 7, 10, and 12 (the culture start date in the neuronal differentiation medium is day 0) Compared. Staining with anti-Oct3 / 4 antibody is hardly observable on days 7, 10, and 12, but staining with anti-Pax6 antibody is weakly observed on day 7, followed by days 10 and On day 12, it showed stronger strength over time. A comparison between the results of staining on the 12th day and the results of nuclear staining with DAPI showed that approximately 90% of the cells were positive for staining with anti-Pax6 antibody.
  • Fig. 11 shows the results of real-time PCR analysis.
  • cells were seeded in RWV vessels on day -3 (3 days ago), on day 0 on which the first medium change to neuronal differentiation medium was performed, and on days 3, 7 and 10
  • the expression levels of Nanog (FIG. 11A), Pax6 (FIG. 11B), or Sox1 (FIG. 11C) on days 13 and 13.
  • the expression level of Nanog an undifferentiated marker of iPS cells, increased about 3 times after seeding in RWV vessel after 3 days of culture in undifferentiated maintenance medium (mTeSR1) (Day 0).
  • mTeSR1 undifferentiated maintenance medium
  • the expression level decreased to about 1/10 of the 0th day 3 days after the change to the culture medium, and the expression level decreased on the order of two orders of magnitude compared to the 0th day after the 7th day.
  • expression of Pax6, which is a neuronal differentiation marker was not observed during the culture period (from day -3 to day 0) in the medium for maintaining undifferentiation, but rapidly after 3 days after replacement with the neuronal differentiation medium. An increasing tendency was observed until the 13th day.
  • Sox1 which is one of the neural differentiation markers, only a slight expression was observed during the culture period in the medium for maintaining undifferentiation, whereas, as in Pax6, 3 The expression level increased after the day, and the expression level increased until the 13th day.
  • iPS spheroids were differentiated into nerve cells by culturing in the nerve differentiation medium. From this, after constructing iPS spheroids by culturing iPS cells in an RWV bioreactor in an undifferentiated maintenance medium in a pseudo-microgravity environment, the medium is simply replaced with a neuronal differentiation medium and cultured. It has been shown that iPS cells constituting iPS spheroids lose their undifferentiated state while maintaining their spheroid morphology and are induced to differentiate into neurons.
  • the present invention can be used to proliferate pluripotent stem cells such as induced pluripotent stem cells and efficiently produce spheroids.
  • the method of the present invention can be used to cultivate pluripotent stem cells in a safer and more stable manner while maintaining undifferentiation without using feeder cells or coating agents.
  • the present invention can be used for mass production of cells differentiated from universal stem cells.

Abstract

　万能性幹細胞のより安全性が高く効率的な培養方法が提供される。本発明は、単離された万能性幹細胞を擬微小重力環境下で培養することにより、万能性幹細胞を未分化性を保持した状態で増殖させ、万能性幹細胞のスフェロイドを形成及び成長させることを含む、万能性幹細胞の培養方法、及びその方法を用いた万能性幹細胞の分化誘導方法に関する。

Description

万能性幹細胞の培養方法
　本発明は、万能性幹細胞の培養方法に関する。
　人工多能性幹細胞（本明細書では、しばしば「iPS細胞」と称する）の発見（非特許文献１～３）により、それを用いた再生医療の実用化の機運が高まっている。iPS細胞は、胚性幹細胞（ES細胞）と同様に様々な組織や器官に分化が可能な万能性幹細胞であるが、胚性幹細胞と比較して多くの利点を有している。例えば胚性幹細胞は受精卵から樹立されるため倫理的問題を伴うのに対して、iPS細胞は体細胞からの樹立が可能であるため、倫理的問題は生じない。また胚性幹細胞は主要組織適合抗原（MHC）の相違により移植後の拒絶反応がしばしば生じるのに対し、iPS細胞は移植対象者由来の細胞から樹立されるため拒絶反応もほとんど生じることはない。
　一方で、再生医療等におけるiPS細胞の利用には、実験室で用いられる細胞数106個程度の量では到底不十分であり、臨床応用する上では109～1010オーダーの細胞数が必要であるが、その大量培養技術はまだ十分に確立されていない。またiPS細胞の場合、一般的に未分化状態を保持して培養するためにマウス胎児由来初代培養線維芽細胞（MEF）やSTO細胞などのフィーダー細胞上で培養する必要があるとされているが、フィーダー細胞の混入は再生医療に用いる上で大きな妨げとなる。そこで、フィーダーフリーでの細胞培養法の研究も行われており、マトリゲルでコーティングした基材表面上でiPS細胞を培養する手法や、ラミニンやラミニンの部分ペプチドによるコーティングを利用した培養法により、フィーダー細胞の存在がなくとも培養可能な方法が開発されている。また、通常のディッシュ培養ではなく、バッグを用いた培養も行われている。しかし、フィーダーフリーで培養可能な系においてもコーティングした基材上で培養を繰り返す必要があるため、培養工程が複雑であり、また培養にかかるコストが顕著に増大し、一患者の治療を行うための費用が莫大となるという深刻な問題を有している。未分化性を保持した安定なiPS細胞を効率的に大量培養する方法は未だ開発されていない。
　ところで、細胞から３次元組織の構築を行う場合、通常適当な足場材料を用いて３次元培養を行うか、撹拌培養を行う必要がある。しかし、従来の撹拌培養では、細胞に与えられる機械的刺激や損傷が強く、大きな組織を得ることは困難か、あるいは得られたとしても内部で壊死を起こしていることが多かった。これに対し、重量を最適化するために設計された一連のバイオリアクターが存在する。その一つであるRWV（Rotating Wall Vessel）バイオリアクターは、NASAが開発したガス交換機能を備えた回転式バイオリアクターである。本発明者らは、以前からこのRWVバイオリアクターを用いた３次元培養による骨髄細胞等からの軟骨再生技術等の研究開発を行ってきた（特許文献１～３）。
　しかしフィーダー細胞やコーティング剤等の足場の存在しない環境では未分化状態での生育が難しいと考えられているiPS細胞を効率的に３次元培養する方法については未だ開発されていない。
国際公開ＷＯ２００５／０５６０７２号 特開２００９－１５９８８７号公報 国際公開ＷＯ２００６／１３５１０３号
Takahashi, K. and Yamanaka, S., (2006) Cell 126, p.663-676 Takahashi K., et al., (2007) Cell 131, p.862-872 Nakagawa M., et al. (2008) Nat. Biotechnol., 26(1): p.101-106
　本発明は、万能性幹細胞のより安全性が高く効率的な培養方法を提供することを課題とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、擬微小重力環境下で万能性幹細胞を培養することにより、フィーダー細胞やコーティング剤の不在下であっても、未分化性を維持した万能性幹細胞を増殖させ、スフェロイドを形成させることができることを見出し、本発明を完成するに至った。特にiPS細胞は、フィーダー細胞上で又はマトリゲルなどのコーティング剤の上で生育し、フィーダー細胞やコーティング剤の存在しない環境での生育は難しいと考えられていたことから、そのような細胞足場材料なしでiPS細胞を簡便に大量培養でき、スフェロイドを生成できるという本発明者らの発見は驚くべきものであった。本発明では、この培養方法によりコンタミネーションのリスクの少ない閉鎖系で万能性幹細胞を増殖させることができるため、安全性を高めることもできる。
　より具体的には、本発明は以下を包含する。
[1]単離された万能性幹細胞を擬微小重力環境下で培養することにより、万能性幹細胞を未分化性を保持した状態で増殖させ、万能性幹細胞のスフェロイドを形成及び成長させることを含む、万能性幹細胞の培養方法。
[2]万能性幹細胞がiPS細胞である、上記[1]に記載の方法。
[3]細胞足場材料の不在下で前記培養を行う、上記[1]又は[2]に記載の方法。
[4]万能性幹細胞が4x104～6x104細胞／cm3の細胞密度で播種される、上記[1]～[3]のいずれかに記載の方法。
[5]アポトーシス阻害因子の存在下で培養を行う、上記[1]～[4]のいずれかに記載の方法。
[6]アポトーシス阻害因子がROCKインヒビターである、上記[5]に記載の方法。
[7]擬微小重力環境が、時間平均して地球の重力の1/10～1/100に相当する重力を物体に与える環境である、上記[1]～[6]のいずれかに記載の方法。
[8]擬微小重力環境が、回転で生じる応力により地球の重力を相殺することにより擬微小重力環境を地上で実現する１軸回転式バイオリアクターを用いて得られるものである、上記[1]～[7]のいずれかに記載の方法。
[9]前記１軸回転式バイオリアクターがRWVバイオリアクターである、上記[8]に記載の方法。
[10]スフェロイドから細胞を分散させ、培養することをさらに含む、上記[1]～[9]に記載の方法。
[11]スフェロイドをろ過粒度40～100μmのフィルターを通して１回又は２回以上破砕し、破砕されたスフェロイドを擬微小重力環境下で培養してスフェロイドを形成及び成長させる工程を１回又は２回以上繰り返すことを含む、上記[10]に記載の方法。
[12]前記の破砕されたスフェロイドを擬微小重力環境下で２～７日間培養してスフェロイドを形成及び成長させる、上記[11]に記載の方法。
[13]上記[1]～[12]のいずれかに記載の方法を実施し、得られた万能性幹細胞及び／又はスフェロイドを分化誘導培地でさらに培養することを含む、万能性幹細胞の分化を誘導する方法。
[14] 分化誘導培地での培養を、擬微小重力環境下で行う、上記[13]に記載の方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2014-201875号及び2015-017679号の開示内容を包含する。
　本発明によれば、未分化性を維持した万能性幹細胞をより安全かつ効率的に増殖させることができる。
図１は253G1細胞をROCKインヒビター存在下でRWVバイオリアクターにより３日間回転培養して作製した球状スフェロイドの位相差像を示す写真である。図中のバーは500μmを示す。 図２は253G1細胞をROCKインヒビター存在下でRWVバイオリアクターにより３日間回転培養して作製した球状スフェロイドの直径分布を示す。 図３はRWVバイオリアクターにより３日間回転培養して作製した球状スフェロイド由来の細胞における多能性幹細胞マーカーの発現をフローサイトメトリーにより解析した結果を示す。AはFSC-A/SSC-Aドットプロット、BはSSC-A/PIドットプロット、CはSSEA-4/TRA-1-60ドットプロット、Dは図３A、B、Cで定義された各領域におけるイベント数とその割合を示す。 図４はフローサイトメトリーのネガティブコントロールの解析結果を示す。AはFSC-A/SSC-Aドットプロット、BはSSC-A/PIドットプロット、CはSSEA-4/TRA-1-60ドットプロット、Dは図４A、B、Cで定義された各領域におけるイベント数とその割合を示す。 図５はRWVバイオリアクターにより３日間回転培養（３次元培養）して作製した球状スフェロイド由来の253G1細胞における未分化マーカー遺伝子Nanog、Oct3/4及びSox2の発現量と、２次元培養した253G1細胞における発現量とを比較したグラフである。左が２次元培養、右が３次元培養の結果である。 図６はRWVバイオリアクターにより３日間回転培養（３次元培養）して作製した球状スフェロイド由来の253G1細胞を三胚葉分化キットを用いて染色した結果を示す。抗Otx2抗体（外胚葉染色用）、抗Brachyury抗体（中胚葉染色用）、及び抗Sox17抗体（内胚葉染色用）を染色に用いた。 図７は50mlベッセルを用いて253G1細胞を連続継代培養する試験の模式図である。 図８は50mlベッセルを用いて253G1細胞を３日間培養し作製した球状スフェロイドを、70μmフィルターを通すことにより砕いた小スフェロイドの位相差像を示す写真である。A：低倍率での位相差像、図中のバーは1000μmを示す。B：高倍率での位相差像、図中のバーは500μmを示す。 図９は50mlベッセルを用いた253G1細胞を連続培養した後の球状スフェロイドを採取し、未分化マーカーの発現量についてリアルタイムPCR測定を行った結果を示す。未分化マーカー遺伝子Nanog、Oct3/4及びSox2の発現量と、２次元培養した253G1細胞における発現量とを比較した。2Dは２次元培養の結果を表す。P5、P6、P7、及びP8は、平面培養からの各継代後（図７の模式図も参照されたい）の結果を表す。 図１０はRWVバイオリアクターでの回転培養後に神経分化培地で培養したスフェロイドの細胞に対する、神経分化マーカーPax6（上段）及び未分化マーカーOct3/4（下段）を標的とした免疫抗体染色の結果を示す。 図１１はRWVバイオリアクターでの回転培養後に神経分化培地で培養したスフェロイドの細胞に対するリアルタイムPCRによる解析結果を示す。AはNanog、BはPax6、CはSox1の発現量の培養時間依存的変化を示す。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明は、単離された万能性幹細胞を擬微小重力環境下で培養することにより、万能性幹細胞を未分化性を保持した状態で増殖させることを含む、万能性幹細胞の培養（増殖）方法を提供する。
1. 擬微小重力環境及びバイオリアクター
　本発明において、「擬微小重力環境」とは、宇宙空間等における微小重力環境を模して人工的に作り出された微小重力（simulated microgravity）環境を意味する。こうした擬微小重力環境は、例えば、回転で生じる応力によって地球の重力を相殺することにより実現される。回転している物体は、地球の重力と応力のベクトル和で表される力を受けるため、その大きさと方向は時間により変化する。回転している物体には、結局、時間平均すると物体には地球の重力（1g）よりもはるかに小さな重力しか作用しないこととなり、宇宙空間によく似た「擬微小重力環境」が実現される。
　本発明における「擬微小重力環境」は、培養液（培地）中で万能性幹細胞が沈降することなく増殖でき、かつ生成した３次元細胞凝集体（スフェロイド）が沈降せずに液中に浮いた状態となるように調節されることが好ましい。例えば培養系に細胞に対する地球の重力の影響を最小化する回転速度で回転をかけることができる。具体的には、培養細胞にかかる微小重力を、時間平均して地球の重力（1g）の1/10～1/100程度に相当する重力に低減するような回転速度とすることが好ましい。
　本発明では、回転式のバイオリアクターを使用して、擬微小重力環境を実現することができる。そのようなバイオリアクターとしては、例えば、RWV（Rotating-Wall Vessel: US特許No.5,002,890）、RCCS（Rotary Cell Culture SystemTM: Synthecon Incorporated）、3D-clinostat、並びに特開平8-173143号、特開平9-37767号、及び特開2002-45173号に記載されているようなものを挙げることができる。本発明では１軸回転式のバイオリアクターを用いることが好ましい。多軸回転式（例えば、２軸式のclinostat等）では、ずれ応力（シェアストレス）を最小化することができず、またサンプル自体も回転するため、１軸回転式のようにベッセル内にふわふわと浮かんだ状態を再現することができないからである。なかでも、RWV及びRCCSはガス交換機能を備えているという点で優れている。
　RWVバイオリアクターは、NASAによって開発されたガス交換機能を備えた１軸回転式のバイオリアクターであり、横向き円筒形バイオリアクター内に培養液を満たし、細胞を播種した後、その円筒の水平軸方向に沿って回転しながら培養を行う１軸回転式の回転培養装置である。RWVバイオリアクター内では、回転による応力のため地球の重力が相殺され、地上の重力に比較してはるかに小さい（100分の1程度）微小重力環境が実現され、細胞は培養液中に懸濁された状態で増殖し、３次元培養が可能となる。この擬微小重力環境下において、培養液中に懸濁された万能性幹細胞は効率よく増殖し、凝集してスフェロイド（３次元細胞凝集体；典型的には球状の、細胞凝集塊）を形成することができる。また擬微小重力環境下での培養により、万能性幹細胞のスフェロイドはより大きなサイズのスフェロイドに成長することができる。
　万能性幹細胞を擬微小重力環境下で培養するための培養容器（例えば、ベッセル）としては、特に限定されないが、１軸回転式のバイオリアクター、例えばRWVバイオリアクターで使用可能な任意の形状又は容量の培養容器を使用することができる。培養容器（例えば、ベッセル）は、以下に限定するものではないが、例えば5ml～5000ml、10ml～2000ml、又は10ml～100mlの容量を有するものであってもよい。
　RWVバイオリアクターを用いた場合の好ましい回転速度は、ベッセルの直径及び作製しようとするスフェロイドの大きさや質量に応じて適宜設定することができるが、容量100ml程度までのベッセル、例えば直径5cmのRWVベッセル（容量10 ml）を用いた場合であれば5～15rpm程度、7～15 rpm程度、例えば7.5～8.5 rpm又は6～8.5rpmに調整することが好ましい。回転速度が一定の場合は回転中心からの半径に比例して流速が早くなる。そのため、容量がさらに大きいベッセル、例えば250ml、500ml、1000ml、及び2000mlなどの大きな容量及び直径を有するベッセルを用いる場合は、当業者であれば、回転速度を低下させる方向で適切な回転速度に調節することができる。このような回転速度で培養を行うとき、ベッセル内の細胞に作用する重力は実質的に地上の重力（1g）の1/10～1/100程度となり、スフェロイドが沈降せず浮遊している状態を維持することができる。
2. 万能性幹細胞とその培養条件
　本発明の方法で培養する万能性幹細胞は、限定するものではないが、好ましくはiPS細胞とも呼ばれる人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cells）、又はES細胞と呼ばれる胚性幹細胞であってよい。iPS細胞は体細胞に初期化因子を導入して（典型的には１つ又は複数の初期化誘導遺伝子を導入して）リプログラミングすることによって誘導される多能性幹細胞であり、当業者には周知である。初期化因子としては、Octファミリー、Klfファミリー、Soxファミリー、Mycファミリー、Nanogファミリー、Linファミリー等が挙げられるが、これらに限定されない。初期化因子の具体例としては、以下に限定されないが、Oct3/4、Klf4、Klf2、Sox1、Sox2、Sox3、Sox15、Sox17、c-Myc、N-Myc、L-Myc、T58A、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、β-カテニン、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3、p53shRNA、及びGlis1が挙げられる。初期化因子として、少なくともOctファミリー、特にOct3/4を体細胞に導入することが好ましい。初期化因子の導入は、初期化因子をコードする遺伝子（初期化誘導遺伝子）を体細胞に導入することにより、行うことができる。
　例えばiPS細胞は、Octファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、並びにSoxファミリー遺伝子及び／又はMycファミリー遺伝子（例えば、Oct3/4、Sox2、及びKlf4）を導入することにより作製することができる。iPS細胞はまた他の方法により作製したものであってもよい。iPS細胞は典型的には動物由来であり、好ましくは哺乳動物由来であり、例えば、ヒト、サル等の霊長類、マウス、ラット等のげっ歯類、イヌ、ネコ、ウサギ等由来のものが挙げられる。iPS細胞は、任意の組織（体細胞）由来であってよく、例えば皮膚、骨髄、鼻、消化管、肝臓等由来のものが挙げられるが、これらに限定されない。ES細胞は胚盤胞の内部細胞塊を取り出して培養することによって得られる多能性細胞である。iPS細胞やES細胞は、例えば、理化学研究所バイオリソースセンター細胞材料開発室（RIKEN BRC CELL BANK）（日本）、ATCC（American Type Culture Collection）、iPSアカデミアジャパン株式会社（日本）等から入手することができるが、当業者であれば常法により作製することもできる。なお本発明の万能性幹細胞に関して「単離された」とは、当該細胞が生体から取り出された細胞又は生体から取り出された細胞から作製された細胞株であることを意味する。「単離された」万能性幹細胞は、単一細胞であっても、細胞塊やスフェロイド等であってもよい。
　本発明の方法において、万能性幹細胞は、増殖及びスフェロイド生成のためには、任意のES/iPS用培地（未分化維持用培地）を用いて回転培養することができる。そのような培地としては、mTeSR1培地、TeSR1培地（Stem Cell Technologies）、Essensial 8TM培地、Essential 6TM培地（Gibco）、StemPro(R)-34 SFM（Life Technologies）等が挙げられるが、これらに限定されない。
　一実施形態では、万能性幹細胞を、例えば1x104～1x105 細胞／cm3、より好ましくは3x104～8x104細胞／cm3、さらに好ましくは4x104～6x104細胞／cm3の細胞密度で培養液に播種し、それを擬微小重力環境下で培養（典型的には回転培養）することにより、細胞の効率的な増殖及びスフェロイド生成（スフェロイドの形成及び成長）をもたらすことができる。例えば直径4～6cmのベッセル、例えば直径5cm（容量10ml）のベッセルにおいて、この細胞密度での播種はとりわけ好ましい。しかしこのような細胞密度での播種は、前記のサイズのベッセルに限定されず、例えば10～2000mlのベッセルでも万能性幹細胞を効率よく増殖させることができる。
　播種する万能性幹細胞は、常法により調製したものを用いることができる。例えば、万能性幹細胞は、通常の培養条件での培養後、例えば機械的、化学的、又は生物学的な任意の細胞分散法により剥離し、上記回転培養等に用いることができる。具体的には、限定するものではないが、EDTA（例えば1～10mM EDTA）、TryPLETM Select、アキュターゼTM、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、トリプシン、トリプシン／EDTA、トリプシン／コラゲナーゼ、ReLeSRTM(STEMCELL)等を細胞剥離液として使用して細胞を分散させてもよい。あるいは、浮遊培養で形成された万能性幹細胞のスフェロイドを、フィルター通過などにより機械的に粉砕し、それにより細胞を分散させて、上記回転培養等に用いてもよい。
　万能性幹細胞は、3～1,000個程度、好ましくは5～600細胞程度、より好ましくは5～300細胞、例えば30～200細胞、10～100細胞又は20～40細胞程度の小スフェロイド（細胞塊）に分離し分散させたものを播種して、回転培養等の擬微小重力環境下での培養を行ってもよい。擬微小重力環境下での１回目の培養（１回目の継代後の培養）では、好ましくは5～300細胞、より好ましくは10～100細胞、さらに好ましくは20～40細胞からなる小スフェロイド（細胞塊）に分離し分散させたものを播種し、回転培養等の擬微小重力環境下での培養を行ってもよい。細胞剥離液などを用いた化学的破砕により生成された万能性幹細胞の小スフェロイドは、典型的には300μm未満、例えば約50～200μmの直径を有する。小スフェロイドの形態で播種した万能性幹細胞を、擬微小重力環境下で培養することにより、スフェロイドの形成及び成長を促進することができる。なお本明細書において用いる「小スフェロイド」とは、比較的少数の細胞から構成される比較的サイズの小さな細胞塊を意味し、典型的には3～1,000個程度の細胞塊、例えば5～600細胞、30～200細胞、10～100細胞又は20～40細胞の細胞塊が包含される。小スフェロイドは球状であっても細長い形状であってもよく、あるいはそれ以外の形状であってもよい。あるいは、スフェロイドの形態の万能性幹細胞又は個々の細胞に分散させた万能性幹細胞を、上述のように擬微小重力環境下で培養（回転培養等）してもよい。
　万能性幹細胞は、回転培養等の擬微小重力環境下での培養をアポトーシス阻害剤の存在下で行ってもよい。アポトーシス阻害剤としては、限定するものではないが、ROCK（ロック; Rho-associated kinase; Rho結合キナーゼ）インヒビターを好適に用いることができる。ROCKインヒビターはES細胞の生存に有効であり、アポトーシスの誘導に寄与することが知られている（Watanabe K., Nat. Biotechnol., (2007) 25(6), p.681-686; Ohgushi M., et al., Cell Stem Cell, (2010) 7(2), p.225-239）。ROCKインヒビターとしては、Y27632（(R)-(+)-トランス-N-(4-ピリジル)-4-(1-アミノエチル)-シクロヘキサンカルボキサミド・2HCl・H2O）（例えば、Calbiochem、WAKO Pure Chemicalsなど）、Fasudil（1-(5-イソキノリンスルホニル）ホモピペラジンハイドロクロリド）（例えば、Calbiochem）等が挙げられる。アポトーシス阻害剤は、一実施形態では、培養液中、1μM～100μM、好ましくは3μM～30μM、より好ましくは5μM～15μMの濃度であってよい。アポトーシス阻害剤の存在下で培養することにより、万能性幹細胞のスフェロイドの形成及び成長を促進することができる。本発明において「スフェロイド」とは、多数の細胞が凝集した細胞塊を指し、典型的には300μm以上、例えば300～2000μmの直径を有する細胞塊を指す。
　万能性幹細胞の培養温度は、特に限定されないが、好ましくは36.0～38.0℃、より好ましくは36.5～37.5℃である。バイオリアクターを用いた回転培養は、特に限定されないが、好ましくは２～７日間、より好ましくは２～５日間、例えば３～５日間、さらに好ましくは３～４日間行うことができる。より長期間培養する場合は、以下に限定するものではないが、好ましくは２～７日間、より好ましくは２～５日間、例えば３～５日間、さらに好ましくは３～４日間毎に細胞を継代しながら培養することができる。
　本発明では、以上のような培養により、培養液中に、万能性幹細胞のスフェロイド（主に球状スフェロイド）を大量に生成させることができる。一実施形態では、３日間の培養後に得られるスフェロイドは、主に300～1000μmの範囲の直径を有し、最も多くが700～900μmの範囲の直径を有する。
　以上のような培養によって得られる万能性幹細胞又はスフェロイドを構成する細胞は、未分化性を保持している。未分化性の保持は、未分化マーカーの発現をフローサイトメトリー等により検出することによって確認することができる。未分化マーカーとしては、例えば、SSEA-4、TRA-1-60、Nanog Oct3/4、Sox2、REX-1、LIN28、LEFTB、GDF3、ZFP42、FGF4、ESG1、DPPA2、TERT、KLF4、c-Myc等が挙げられるが、これらに限定されない。
　細胞の未分化性の確認のためには、未分化マーカー遺伝子の発現状態を解析することがさらに好ましい。未分化マーカー遺伝子の発現状態の解析は、例えば、リアルタイムPCRを用いた定量により好適に行うことができる。
　本発明の培養方法では、細胞足場材料を使用することなく、万能性幹細胞を回転培養し、未分化性を保持しながら増殖させることもできる。本発明において細胞足場材料とは、コラーゲン、ポリマー、ゲル、ガラス、プラスチック、ファイバー、フィルム、ビーズ等の細胞培養において使用可能な任意の細胞足場材料（スキャホールド）をいう。
　本発明では、擬微小重力環境を実現する回転式バイオリアクター、例えばRWVバイオリアクターを用いて回転培養することにより、コンタミネーションのリスクの少ない閉鎖系で万能性幹細胞を増殖させることができ、それにより安全性を高めることもできる。
　本発明の培養方法では、擬微小重力環境下での培養により生成した万能性幹細胞のスフェロイドをより少数の細胞、例えば小スフェロイドに分離し分散させ、さらに培養してもよい。スフェロイドからの細胞の分離及び分散は、上述のとおり、例えば機械的、化学的、又は生物学的な任意の方法により行うことができる。
　スフェロイドから分散させた細胞は、上述のような擬微小重力環境下でさらに培養（典型的には回転培養）することにより、大量の細胞を増殖させ、多数のスフェロイドを生成させることができる。あるいはスフェロイドから分散させた細胞は、フィーダー細胞上で通常の幹細胞培養法により培養してもよく、それにより多数の細胞コロニーを作製することができる。
　本発明の好ましい実施形態では、上記方法において擬微小重力環境下での培養により生成したスフェロイド（典型的には球状スフェロイド）を、機械的（力学的）、化学的、又は生物学的な任意の方法により破砕し、生成された小スフェロイドを擬微小重力環境下でさらに培養してスフェロイドを形成及び成長させる工程を１回、又は２回以上（複数回、例えば、２～３０回）繰り返して行うことも好ましい。擬微小重力環境下でさらに培養する小スフェロイドは、異なる粉砕方法で得られた小スフェロイドの混合物であってもよい。好ましい一実施形態では、例えば、上記方法において擬微小重力環境下での培養により生成したスフェロイドを、典型的にはフィルターを通して破砕し、その機械的（力学的）破砕で得られた小スフェロイドを擬微小重力環境下でさらに培養してスフェロイドを形成及び成長させる工程を１回、又は２回以上繰り返して行うことができる。スフェロイドのフィルター通過はピペット等を用いて圧力をかけて行ってもよい。フィルターは、生成したスフェロイドをより小さいサイズを有する小スフェロイドに破砕することができるろ過粒度を有するものを使用することができ、ろ過粒度40～100μm、好ましくは60～80μm、例えば70μmを有するものが好ましい。なおフィルター通過による破砕で得られる小スフェロイドは一般的には細長い形状となる。例えば70μmのフィルターを通した破砕で得られる小スフェロイドは、一般的には、化学的破砕により得られる小スフェロイドと同等又はそれより大きめである。スフェロイドは、フィルターを通して１回又は２回以上（複数回、例えば、２～３０回）破砕してもよい。フィルター通過による破砕を２回以上行う場合、それぞれのフィルター通過の際に、ろ過粒度が同一のフィルターを用いてもよいし、ろ過粒度が異なるフィルターを用いてもよい。例えば、フィルターに通してスフェロイドを破砕した後、破砕されたスフェロイド（小スフェロイド）を、より大きなろ過粒度を有するフィルターに通してさらに破砕してもよく、それによって、得られる小スフェロイドの大きさ（とりわけ長径）をより狭い範囲に揃えることができる。粉砕されたスフェロイド（小スフェロイド）の擬微小重力環境下での培養期間は、以下に限定されないが、２～７日間、好ましくは２～５日間が好ましく、例えば３～５日間又は３～４日間がより好ましい。擬微小重力環境下での各培養工程における培養量、すなわち培養容器のサイズ及び培地量は、培養毎に同じでもよいし、異なっていてもよい。大量培養する場合には培養の度にスケールアップしてもよい。本発明では、擬微小重力環境下での培養によるスフェロイドの形成及び成長、それにより生成したスフェロイドの破砕、及び破砕で生じた小スフェロイドの再播種を繰り返す方法により、iPS細胞等の万能性幹細胞を非常に長期にわたって未分化状態のまま維持し、増殖させることができる。その結果、iPS細胞等の万能性幹細胞の大量生産がより容易になる。
3. 分化誘導
　本発明の方法により培養した万能性幹細胞（増殖させた万能性幹細胞又は生成させたスフェロイドから分散させた万能性幹細胞）やスフェロイドを得た後、それらの細胞を分化誘導することができる。例えば、万能性幹細胞を、外胚葉分化培地、中胚葉分化培地、又は内胚葉分化培地等の分化誘導培地で培養することにより、それぞれ外胚葉、中胚葉、又は内胚葉への分化を誘導することができる。外胚葉分化培地、中胚葉分化培地、及び内胚葉分化培地は市販されており、例えば、三胚葉分化キットStem Cell Kit: Human Pluripotent Stem Cell Functional Identification Kit（R&D Systems）に含まれるものが挙げられる。分化誘導培地に播種する万能性幹細胞は、小スフェロイドであっても単一細胞に分散させたものであってもよい。分化誘導培地での培養は、MEF等のフィーダー細胞上又はコーティング剤等の細胞足場材料上で行ってもよいし、上述のような擬微小重力環境下での回転培養により実施してもよい。分化誘導培地での培養により、万能性幹細胞の目的の胚葉又は細胞への分化を誘導し、万能性幹細胞から分化した細胞を作製することができる。したがって本発明は、上記の万能性幹細胞の培養方法を実施し、それによって得られた万能性幹細胞（増殖させた万能性幹細胞又は生成したスフェロイドから分散させた万能性幹細胞）及び／又はスフェロイドを分化誘導培地でさらに培養することを含む、万能性幹細胞の分化を誘導する方法（万能性幹細胞から分化した細胞を作製する方法）も提供する。分化誘導培地での培養は、上述のような擬微小重力環境下での培養（回転培養等）により行ってもよいし、分化誘導のために用いられる他の細胞培養法により行ってもよい。
　外胚葉、中胚葉、又は内胚葉への分化は、それぞれのマーカー遺伝子の発現を検出することにより、確認することができる。外胚葉マーカー遺伝子としてはOtx2、Nestin、TP63等が挙げられ、中胚葉マーカー遺伝子としてはBrachyuryが挙げられ、内胚葉マーカー遺伝子としてはSox17、AFP、GATA-4、PDX-1等が挙げられる。これらのマーカー遺伝子の強い発現が確認された場合、それぞれの胚葉への分化が示される。
　好ましい一実施形態では、本発明の方法により、すなわち、上述のような擬微小重力環境下での培養を用いる未分化維持用培地における万能性幹細胞の培養方法により得られた、万能性幹細胞のスフェロイドを、分化誘導培地でさらに培養することにより、スフェロイド形態を保持したまま、スフェロイド中の細胞の分化を誘導することができる。分化誘導培地での培養は、擬微小重力環境下での培養により行ってもよいし、分化誘導のために用いられる他の細胞培養法により行ってもよい。例えば、擬微小重力環境下で未分化維持用培地における培養（回転培養等）を行い、スフェロイドを得た後、培地を分化誘導培地に交換して擬微小重力環境下での培養を継続することにより、スフェロイドを構成する万能性幹細胞（未分化細胞）を目的の細胞（使用した分化誘導培地が目的とする細胞）へと分化させることができる。これにより、万能性幹細胞から分化させた細胞を含むスフェロイドを作製することができる。あるいは、擬微小重力環境下で未分化維持用培地における培養（回転培養等）を行ってスフェロイドを得た後、そのスフェロイドを分化誘導培地に移して培養、例えば、擬微小重力環境下で培養（回転培養等）することにより、スフェロイドを構成する万能性幹細胞（未分化細胞）を目的の細胞へと分化させてもよい。したがって本発明は、上記の万能性幹細胞の培養方法を実施し、それにより得られたスフェロイドを分化誘導培地でさらに培養することを含む、万能性幹細胞の分化を誘導する方法、及び、その方法により、万能性幹細胞から分化させた細胞を含むスフェロイドを製造する方法も提供する。
　本発明の方法において、万能性幹細胞の分化誘導には、所定の細胞への分化誘導を目的とした任意の分化誘導培地を使用することができる。そのような分化誘導培地は、例えば、神経分化培地、骨芽細胞分化培地、心筋細胞分化培地、脂肪細胞分化培地、腸上皮細胞分化培地等であってもよい。例えば、分化誘導培地として神経分化培地を使用して万能性幹細胞又はスフェロイドを培養することにより、万能性幹細胞を神経系細胞に分化させることができる。あるいは、分化誘導培地は、外胚葉分化培地、中胚葉分化培地、又は内胚葉分化培地であってもよい。これらの分化誘導培地としては様々な市販品を用いることができる。
　以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
　なお、以下の実施例ではヒト人工多能性幹細胞（hiPSCs）として253G1細胞を用いた。253G1細胞（Oct3/4、Sox2、及びKlf4導入; 非特許文献３）は細胞番号HPS0002の下で理化学研究所バイオリソースセンター細胞材料開発室（RIKEN BRC CELL BANK）（日本）より購入した。
［実施例１］RWVバイオリアクターを用いた３次元培養による人工多能性幹細胞（iPS細胞）からのスフェロイド作製
（１）球状スフェロイドの構築
　253G1細胞は、マトリゲル（BD MatrigelTM, BD Biosciences）をコートした6cm又は10cm培養ディッシュを用いて、ヒトES/iPS細胞維持用培地mTeSR1（STEMCELL Technologies）中で培養し、毎日培養液交換を行い、5mM EDTAと0.5x TrypLETM Select（Life Technologies）を用いて継代維持した。
　３次元培養を行うため、播種に用いる253G1細胞を、5mM EDTAを用いておよそ20～40細胞からなる小スフェロイド（直径およそ50μm～200μmのルーズな細胞塊）に剥離した。4.9x105細胞の剥離した253G1細胞（化学的粉砕により得た小スフェロイド）を、10ml RWVベッセル（直径5cm; Synthecon）中、ROCK（ロック; Rho-associated kinase; Rho結合キナーゼ）インヒビターY27632（WAKO Pure Chemicals、10μM）含有mTeSR1培地（10ml）、又はROCKインヒビターY27632不含有mTeSR1培地（10ml）に播種し、RWVバイオリアクター（Synthecon）を用いて37℃、8rpmで３日間回転培養した。培養後、培養液中に生成した球状スフェロイドの位相差像を倒立顕微鏡Axio Observer（Carl Zeiss）を用いて撮影した（図１）。また、球状スフェロイドの直径を計測し、サイズ分布を調べた（図２）。
　続いて球状スフェロイドを採取し、ピペットを用いてピペッティングにより砕き、細胞を分散させた。自動セルカウンターCountessTM（Invitrogen）を用いて細胞数をカウントした。培養液中の全細胞数から、播種した細胞数（4.9x105細胞）に対する増殖倍率（全細胞数／4.9x105細胞）を算出した。
　ROCKインヒビター含有培地を用いたベッセルでは、球状スフェロイドが多数形成された（図１）。全細胞数は3.1x106細胞であり、増殖倍率は6.5倍であった。また球状スフェロイドの直径の分布は700～900μmにピークを持っていた（図２）。一方、ROCKインヒビター不含有培地を用いたベッセルでは、球状スフェロイドは形成されず、単一細胞のみの懸濁液であった。
　この結果から、ROCKインヒビター含有培地でのRWVバイオリアクターを用いた回転培養により、iPS細胞から球状スフェロイドを作製できることが示された。
（２）ROCKインヒビター濃度の検討
　より好適なROCKインヒビター濃度について調べるため、3μM、10μM、又は30μMの３種類のROCKインヒビター濃度を用いること以外は上記と同じ条件で、253G1細胞を３日間回転培養した。培養後、生成した球状スフェロイドの数は、3μMで10個、10μMで50個、30μMで20個であった。
　この結果から、３種類の条件の中ではROCKインヒビター10μMの濃度条件が最も球状スフェロイドを多く得るのに適していることが示された。
（３）細胞播種数の検討
　より好適な細胞播種数を調べるため、10ml RWVベッセルに、5mM EDTAとTrypLETM Selectを用いておよそ20～40細胞からなる小スフェロイドに剥離した253G1細胞を4.27x105細胞、8.55x105細胞、又は1.28x106細胞播種し、ROCKインヒビターY27632（10μM）含有又は不含有のmTeSR1培地中で上記（１）と同様の方法で５日間回転培養した。培養後、上記と同様にして細胞数をカウントし、増殖倍率を算出した。結果を以下の表１に示す。
　さらに同様の実験を複数回繰り返して行った結果、10ml培地に対し播種数4x105～6x105細胞、すなわち4x104～6x104細胞／cm3の初期細胞密度の場合に、増殖倍率が顕著に高いことが示された。なおROCKインヒビター不含有培地でも細胞増殖が認められたが、ROCKインヒビター含有培地では増殖倍率が顕著に増加した。
　さらに、5mM EDTAのみを用いておよそ20～40細胞からなる小スフェロイドに剥離した253G1細胞を上記の好ましい範囲の播種数で10ml RWVベッセルに播種し、10μM ROCKインヒビターY27632含有mTeSR1培地（10ml）で３日間回転培養した。細胞剥離に5mM EDTAのみを用いて得られた結果の例を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　この結果から、細胞剥離条件にかかわらず、上記の好ましい細胞播種数の範囲で特に良好な増殖倍率を得ることができることが示された。
［実施例２］RWVバイオリアクターで培養したiPS細胞の特性評価
　実施例１に記載の方法に従い、5 mM EDTAを用いて剥離した253G1細胞を10mlベッセルに播種し、10μM ROCKインヒビターY27632含有mTeSR1培地中でRWVバイオリアクターを用いて３日間回転培養した。培養後、生成したスフェロイドをアキュターゼTMで処理して単一細胞にし、マトリゲルでコートした24ウエルプレートに播種し、３日間培養した。培養後、253G1細胞における多能性幹細胞マーカーの発現を解析するため、フローサイトメトリーによる解析を行った。フローサイトメトリーは、フローサイトメーターAttune(R) Acoustic Focusing Cytometer（Applied Biosystems）により、多能性幹細胞を染色する蛍光標識抗体（抗SSEA-4抗体：Alexa Fluor488 anti-human SSEA4（Cat330441, BioLegend）、及び抗TRA-1-60抗体:PE anti-human TRA-1-60（Cat330609, BioLegend））を使用して行った（試験サンプル）。ネガティブコントロールはAlexa Fluor 488 Mouse IgG3,κIsoType Ctrl（Cat401323, BioLegend）及びPE Mouse IgM,κIsoType Ctrl（Cat401609, BioLegend）を用いて行った。
　その結果を図３（試験サンプル）及び図４（ネガティブコントロール）に示す。SSEA-4、TRA-1-60のマーカーはいずれも陽性であったことから（図３）、RWVバイオリアクターで培養した253G1細胞がiPS細胞としての未分化性を保持していることが示された。
［実施例３］リアルタイムPCRによるiPS細胞マーカー遺伝子の発現の評価
　RWVバイオリアクターで培養した253G1細胞におけるiPS細胞のマーカー遺伝子の発現状態を評価するため、リアルタイムPCRを用いた解析を行った。未分化マーカー遺伝子Nanog、Oct3/4（Pou5f1）、及びSox2をターゲットとした。
　リアルタイムPCR測定は、StepOneTM Real-Time PCR System（Life Technologies, Applied Biosystems）を用いて、以下の手順で行った。まず、実施例１及び２と同様に5 mM EDTAを用いて剥離した253G1細胞を10μM ROCKインヒビターY27632含有mTeSR1培地中でRWVバイオリアクターを用いて３日間回転培養し、生成したスフェロイドを回収し、得られた細胞ペレットを-80℃で凍結した。並行して、5 mM EDTAを用いて剥離した253G1細胞をマトリゲルでコートした培養ディッシュに播種し、mTeSR1培地中で３日間培養（２次元培養）した後、遠心分離にかけて細胞を回収し、得られた細胞ペレットを-80℃で凍結した。-80℃で凍結保存しておいた細胞ペレットを氷上で凍結融解し、RNeasy(R) Mini Kit（QIAGEN）を使用してTotal RNA（総RNA）を抽出した。抽出したTotal RNAのサンプルについて、分光光度計NanoDrop 1000 Spectrophotometer（Thermo Fischer Scientific）を使用してRNA濃度を測定した。1.5 μgのTotal RNAから、High-Capacity RNA-to-cDNA Kit（Applied Biosystems）を使用して20 μlの反応系でcDNAの合成を行った。続いて、DNAポリメラーゼ、基質及びバッファー等が含まれた酵素反応プレミックス溶液であるTaqMan(R) Fast Universal PCR Master Mix (2x), No AmpErase UNG（Applied Biosystems）と、上記の各ターゲット遺伝子のReal-Time PCR測定用に予め調製されたプライマーとプローブを含むアッセイミックス（TaqMan(R) Gene Expression Assays, Inventoried（Applied Biosystems））とを混合して反応ミックスを調製した。TaqMan(R)Gene Expression Assaysとしては、ターゲットの未分化マーカー遺伝子NanogについてはAssay ID: Hs04260366_g1、Oct3/4（Pou5f1）についてはAssay ID: Hs04260367_gH、Sox2についてはAssay ID: Hs01053049_s1の製品を使用した。内在性コントロール（リファレンス遺伝子）として用いるGAPDH（グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ）については、Assay ID: Hs99999905_m1の製品を使用した。
　リアルタイムPCRにおけるRNA量測定はメーカーのプロトコールに従って行い、Applied Biosystems StepOneTM Real-Time PCR System Software v2.2.2を用いてΔΔCT法により解析を行った。
　３日間のRWVバイオリアクターでの回転培養により253G1細胞から得た球状スフェロイドと、マトリゲル上で同時に３日間２次元培養した253G1細胞との間で、未分化マーカー遺伝子Nanog、Oct3/4、及びSox2のリアルタイムPCR及びΔΔCT法による相対定量に基づいて発現量を比較した結果を図５に示す。図５から明らかなように、通常の２次元培養を行った場合（図５左）よりも、回転培養（３次元培養）によって構築した球状スフェロイド（図５右）の方が３つの代表的な未分化マーカー遺伝子の発現量が高かった。同様の実験を複数回行ったが、常に同様の結果が示された。したがって、RWVバイオリアクターを用いた回転培養は、２次元培養と比べて未分化性を維持した培養の点で優位性を持つことが示された。
［実施例４］RWVバイオリアクターを用いた回転培養により作製した球状スフェロイド由来のiPS細胞の分化実験
　実施例１に記載の方法に従い、5 mM EDTAを用いて剥離した253G1細胞を10mlベッセルに播種し、10μM ROCKインヒビターY27632含有mTeSR1培地中でRWVバイオリアクターを用いて３日間回転培養し、球状スフェロイドを作製した。
　得られたスフェロイドについて、三胚葉分化キットStem Cell Kit: Human Pluripotent Stem Cell Functional Identification Kit（R&D Systems）を用いて三胚葉への分化を観察した。まず、スフェロイドをアキュターゼTMを用いて単一細胞に分散させ、Culture BME（Cultrex*PathClear*BME Reduced Growth factor Basement Membrane Extract、R&D Systems）でコートした24ウエルディッシュ中、4ng/ml FGF Basicを含むMEF馴化培地に、1.1x105細胞／cm2の細胞密度で播種した。細胞を50％コンフルエントになるまで培養した後、外胚葉、中胚葉、又は内胚葉への分化誘導培地を用いて分化誘導を行った。外胚葉分化誘導では、上記キットに付属する外胚葉分化培地（Ectoderm Differentiation Media）に培地を交換（１日目）し、２日目及び３日目も同様に外胚葉分化培地にさらに培地交換しながら培養した後、４日目に外胚葉マーカーOtx2の発現を検出する抗体による蛍光抗体染色を行った。中胚葉分化誘導では、上記キットに付属する中胚葉分化培地（Mesoderm Differentiation Media）に培地を交換（１日目）し、12～16時間後に同様に中胚葉分化培地にさらに培地交換しながら培養して、分化誘導培地への最初の培地交換の24～36時間後に中胚葉マーカーBrachyuryの発現を検出する抗体による蛍光抗体染色を行った。内胚葉分化誘導では、上記キットに付属する内胚葉分化培地I（Endoderm Differentiation Media I）に培地を交換（１日目）し、分化誘導培地への最初の培地交換から16～24時間後に内胚葉分化培地II（Endoderm Differentiation Media II）に交換し、さらに３日目に内胚葉分化培地II（Endoderm Differentiation Media II）に交換しながら培養して、４日目に内胚葉マーカーSox17の発現を検出する抗体による蛍光抗体染色を行った。細胞固定と染色は、具体的には、培養後の24ウエルディッシュをPBSで洗浄し、室温で4％パラホルムアルデヒド／PBSで20分間処理して固定し、その後1％BSA／PBSで洗浄し、0.3％ Triton X-100、1％ BSA及び10%ロバ血清を含むPBS溶液でブロッキングした後、１次抗体としてのヤギ抗ヒトOtx2抗体（外胚葉マーカー検出用）、ヤギ抗ヒトBrachyury抗体（中胚葉マーカー検出用）、又はヤギ抗ヒトSOX17抗体（内胚葉マーカー検出用）とのインキュベート（室温、３時間）を行い、1％BSA／PBSで洗浄した後、NL557結合ロバ抗ヤギ２次抗体（R&D NL001）（1:200希釈）を加えて室温で60分インキュベートした。洗浄後、細胞サンプルのスライドを作製し、蛍光顕微鏡観察を行った。蛍光測定は、同じ光源強度、同じ感度での撮影を行った。なおコントロールとして、１次抗体として抗体を入れないバッファーのみを用いたインキュベーションを行い同様の実験を行った。
　結果を図６に示す。蛍光強度の差異から、外胚葉分化培地、中胚葉分化培地、及び内胚葉分化培地を用いた培養においてそれぞれOtx2、Brachyury、及びSOX17の発現が確認された（図６）。このことから、RWVバイオリアクターによる回転培養で得られた球状スフェロイドを構成するiPS細胞は、分散後、外胚葉、中胚葉、及び内胚葉に分化する能力を保持していることが示された。
［実施例５］50mlベッセルを用いたRWVバイオリアクターによるiPS細胞の増殖実験
　実施例１（１）に記載の方法に従い、5 mM EDTAを用いて小スフェロイドに剥離した253G1細胞を50mlベッセルに播種し、10μM ROCKインヒビターY27632含有mTeSR1培地中でRWVバイオリアクターを用いて３日間、8rpmの回転速度で回転培養し、球状スフェロイドを作製した。実施例１（３）の記載と同様の方法で細胞の好適な播種密度を検討した結果、50mlベッセルにトータル2.5x106個播種した場合に最も増殖倍率が高く、すなわち、10mlベッセルと同程度の播種密度（5.0x104細胞／cm3）で特に高い増殖倍率を示した。その増殖率は３日間で3.8～4.5倍であった。
［実施例６］連続継代培養試験
　本実施例では連続継代培養試験を行った。その手順を模式的に図７に示す。
　実施例５に記載の方法に従い、5 mM EDTAを用いて小スフェロイドに剥離した253G1細胞（2.5x106個）を50mlベッセルに播種し、10μM ROCKインヒビターY27632含有mTeSR1培地中でRWVバイオリアクターを用いて３日間回転培養し、球状スフェロイドを作製した。
　続いて、50mlベッセルからピペットを用いて球状スフェロイドを採取し、ろ過粒度70μmのフィルター（BD Falcon(R) 70μm Cell Strainer Nylon REF 352350；BD BIosciences）にピペットの圧力で通すことにより球状スフェロイドを小スフェロイドに砕いた。得られた小スフェロイド（機械的粉砕により得た小スフェロイド）を、新しい50mlベッセルに播種し8rpmにて３日間回転培養し、球状スフェロイドを作製した。その後、70μmフィルターによる粉砕、新しい50mlベッセルへの播種、３日間の回転培養を繰り返した（連続継代培養）。
　70μmフィルターにより粉砕した直後の小スフェロイドの画像を図８に示す。図８Ａは低倍率での位相差像、図８Ｂは高倍率での位相差像を示す。フィルターによる粉砕後の小スフェロイドは、細長い形状となり、短径70～100μm、長径70～400μm（１個当たりの細胞数およそ30～200個）の大きさを持ち、形態学的に明らかに小スフェロイドを形成していた。この小スフェロイドを、新しいベッセルに播種し、３日間回転培養することにより、球状のより大きなスフェロイドを得ることができた。
　上記のようにして継代培養を９回（P9；トータルの培養期間は３０日間）まで繰り返したが、常に同程度の3～5倍の増殖倍率を得た（図７）。
［実施例７］連続継代培養による未分化性の維持に関する評価
　50mlベッセルを用いたRWVバイオリアクターで連続継代培養した253G1細胞におけるiPS細胞マーカー遺伝子の発現状態を評価するため、各回転培養（３次元培養；P5～P8）後にフィルターにかける前の球状スフェロイドを一部採取し、リアルタイムPCRを用いた解析を行った。未分化マーカー遺伝子Nanog、Oct3/4（Pou5f1）、及びSox2をターゲットとした。リアルタイムPCRの実験手法は、実施例３と同じである。
　結果を図９に示す。Nanog、Oct3/4、Sox2のいずれについても発現量の顕著な減衰は観察されず、P9まで２次元培養と同程度の未分化性を維持することが示された。
　各培養段階で3～5倍の増殖倍率が得られたことから、P9まで培養細胞全量を用いて連続培養を繰り返せば、計算上、2.5x106個からスタートして1010個以上のiPS細胞を未分化性を維持した状態で得られることになる。すなわち本発明の方法により、iPS細胞を未分化性を維持したまま大量に培養できることが示された。
［実施例８］分化誘導試験
　実施例５に記載の方法に従い、50mlベッセルを用いたRWVバイオリアクターを用いて、253G1細胞を10μM ROCKインヒビターY27632含有mTeSR1培地中で37℃で３日間、8rpmの回転速度で回転培養し、球状スフェロイド（iPSスフェロイド）を作製した。その後、mTeSR1培地を神経分化培地（STEMdiffTM Neural Induction Medium, STEMCELL Technologies Inc., cat#05835）に全交換し（０日目）、同じ条件で培養を継続した。その後の培地交換は、３日目、５日目、７日目及び１０日目に行い、１２日目まで回転培養を行った。iPSスフェロイドを構成する細胞の神経細胞への分化の評価は、免疫抗体染色法及びリアルタイムPCR法により行った。
　免疫抗体染色法では、iPSスフェロイドをアキュターゼTM（AccutaseTM; Innovative Cell Technologies, Inc.）を用いて細胞へと分散させ、それを3cmディッシュに播種し、神経分化培地により20時間培養した後、汎用プロトコール（ABC法）に従い免疫染色した。免疫染色には、抗Pax6抗体（BioLegend, rabbit polyclonal anti-Pax-6 antibody）を神経細胞の指標として、また抗Oct3/4抗体（hES/iPS Cell Characterization Kit, Applied StemCell, cat# ASK-3006）をiPS未分化の指標として用いた。
　リアルタイムPCR法による評価は、実施例３と同様にΔΔCT法による解析手法を用いて行った。iPS細胞の未分化マーカーとしてNanogを用いた。使用したプライマー＆プローブセットはTaqman Gene Expression assay(ID: Hs04260366_g1)である。具体的には、神経分化のマーカーとしてPax6及びSox1を選択し、それぞれについてTaqman Gene Expression assayのID: Hs00240871_m1、Hs01057642_s1の製品を用いた。内在性コントロール（リファレンス遺伝子）として用いるGAPDH（グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ）のプライマー＆プローブセットとしては、Assay ID:　Hs99999905_m1の製品を使用した。
　免疫抗体染色の結果を図１０に示す。図１０に示されるように、７日目、１０日目、及び１２日目（神経分化培地での培養開始日を０日目とする）の抗Pax6抗体及び抗Oct3/4抗体による免疫染色を比較した。７日目、１０日目、及び１２日目のいずれにおいても、抗Oct3/4抗体による染色は殆ど観察できないが、抗Pax6抗体による染色は、７日目に弱く観察され、その後１０日目及び１２日目には時間が経つにつれてより強い強度を示した。なお、１２日目の染色結果とDAPIによる核染色の結果との比較から、ほぼ９０％の数の細胞で抗Pax6抗体による染色が陽性であることが示された。
　リアルタイムPCRによる解析結果を図１１に示す。これらの図には、細胞をRWVベッセルに播種した－３日目（３日前）、神経分化培地への最初の培地交換を行った０日目、さらに３日目、７日目、１０日目及び１３日目のNanog（図１１Ａ）、Pax6（図１１Ｂ）、又はSox1（図１１Ｃ）の発現レベルが示されている。iPS細胞の未分化マーカーであるNanogの発現量は、RWVベッセルへの播種後、３日間の未分化維持用培地（mTeSR1）での培養により３倍程度増加したが（０日目）、神経分化用培地への交換の３日後には発現レベルは０日目の10分の1程度まで減少し、さらに７日目以降は０日目と比較しておよそ二桁オーダーで発現量が減少した。一方、神経分化マーカーであるPax6の発現は、未分化維持用培地での培養期間（－３日目～０日目）は見られなかったが、神経分化培地への交換後の３日間で急激に上昇し、１３日目まで増加傾向が観察された。神経分化マーカーの一つであるSox1に関しても、未分化維持用培地での培養期間は若干の発現が見られたのみであったのに対し、Pax6と同様に、神経分化培地への交換の3日後には発現量が上昇し、１３日目までその発現レベルが増加した。
　以上の結果は、神経分化培地での培養によりiPSスフェロイド中の細胞が神経細胞に分化したことを示している。このことから、RWVバイオリアクターを用いた未分化維持用培地中でのiPS細胞の擬微小重力環境下での培養によりiPSスフェロイドを構築した後、培地を神経分化培地に交換して培養するだけで、iPSスフェロイドを構成するiPS細胞が、スフェロイドの形態を保ったまま、未分化性を失い、神経細胞に分化誘導されることが示された。
　本発明は、人工多能性幹細胞などの万能性幹細胞を増殖し、またスフェロイドを効率よく作製するために用いることができる。本発明の方法は、万能性幹細胞を、フィーダー細胞やコーティング剤などを用いる必要なく、未分化性を保持したまま、より安全かつ安定に大量培養するために用いることができる。さらに本発明は、万能性幹細胞から分化させた細胞を大量生産するために用いることができる。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (14)

  1. 　単離された万能性幹細胞を擬微小重力環境下で培養することにより、万能性幹細胞を未分化性を保持した状態で増殖させ、万能性幹細胞のスフェロイドを形成及び成長させることを含む、万能性幹細胞の培養方法。
  2. 　万能性幹細胞がiPS細胞である、請求項１に記載の方法。
  3. 　細胞足場材料の不在下で前記培養を行う、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　万能性幹細胞が4x104～6x104細胞／cm3の細胞密度で播種される、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　アポトーシス阻害因子の存在下で培養を行う、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　アポトーシス阻害因子がROCKインヒビターである、請求項５に記載の方法。
  7. 　擬微小重力環境が、時間平均して地球の重力の1/10～1/100に相当する重力を物体に与える環境である、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　擬微小重力環境が、回転で生じる応力により地球の重力を相殺することにより擬微小重力環境を地上で実現する１軸回転式バイオリアクターを用いて得られるものである、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 　前記１軸回転式バイオリアクターがRWVバイオリアクターである、請求項８に記載の方法。
  10. 　スフェロイドから細胞を分散させ、培養することをさらに含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 　スフェロイドをろ過粒度40～100μmのフィルターを通して１回又は２回以上破砕し、破砕されたスフェロイドを擬微小重力環境下で培養してスフェロイドを形成及び成長させる工程を１回又は２回以上繰り返すことを含む、請求項１０に記載の方法。
  12. 　前記の破砕されたスフェロイドを擬微小重力環境下で２～７日間培養してスフェロイドを形成及び成長させる、請求項１１に記載の方法。
  13. 　請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法を実施し、得られた万能性幹細胞及び／又はスフェロイドを分化誘導培地でさらに培養することを含む、万能性幹細胞の分化を誘導する方法。
  14. 　分化誘導培地での培養を、擬微小重力環境下で行う、請求項１３に記載の方法。
     
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