WO2009017254A1 - 心筋細胞の細胞塊作製方法及び当該心筋細胞塊の用途 - Google Patents

心筋細胞の細胞塊作製方法及び当該心筋細胞塊の用途 Download PDF

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Fumiyuki Hattori
Keiichi Fukuda
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    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a cell mass by aggregating pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes purified by unicellularization, and a method for treating heart disease comprising engrafting the cardiomyocyte mass in heart tissue And a method for producing a sheet-like cell mass using the cardiomyocyte mass.
  • Cardiomyocytes in adults have lost proliferative activity, and heart diseases such as severe myocardial infarction and cardiomyopathy have to rely on heart transplantation.
  • heart diseases such as severe myocardial infarction and cardiomyopathy have to rely on heart transplantation.
  • cardiac cell therapy This treatment policy is called cardiac cell therapy.
  • Various trials and errors have been conducted to realize the treatment.
  • Non-Patent Document 1 Zhonghua Yi Xue Za Zhi 2003, 83, 1818-22).
  • injection method a method in which cardiomyocytes are used for transplantation in the form of cells, in which cardiomyocytes dispersed into single cells are directly injected into a tissue using an injection needle.
  • tissue engineering method a method in which tissues and organs are constructed outside the body, and these artificial tissues and human organs are transferred into the body for treatment.
  • Cardiomyocytes are formed into a sheet shape and affixed onto the tissue (Non-patent Document 2: Circuit Technology 2002, 90 (3): e-40) 2) Cardiomyocytes and non-cardiomyocytes are mixed at the same rate as in the heart tissue and formed in a three-dimensional manner to replace the tissue. 3) The cardiomyocytes dispersed into a single cell are three-dimensional. Formation, and even blood Tubular structure is also constructed and tissue replacement is performed, or 4) Method of ectopically transplanting and using as a new auxiliary organ to assist original organ function instead of replacing heart tissue (non-patented) Reference 3: Science at Research 2007 2, 100: 263-272) has been attempted.
  • cardiomyocytes In order to use cardiomyocytes as a cell mass for transplantation, a method of constructing a cell mass containing fetal and neonatal rodent cardiomyocytes is known, and recent reports show that all cells derived from fetal heart (non-cardiomyocytes) (Including non-patent document 4: Developmental dynami cs 235; 2200-2209, 2006). Regarding the transplantation of cardiomyocytes, there have been reports of cases in which engraftment was confirmed by transplanting fetal mouse cardiac muscle cells into the heart of adult mice (non-specialty).
  • Non-patent document 5 Science 1994, 264 (5155): 98-101
  • Non-patent document 1 Zhonghua Yi Xue Za Zh i 2003, 83
  • both of these methods utilize cell populations that include cells other than cardiomyocytes, and contamination of cells other than cardiomyocytes is a serious and unexpected side effect that affects the life of patients after transplantation. May cause. Therefore, it is considered necessary to purify cardiomyocytes before use for transplantation treatment. So far, there has been a report that engraftment of ES cell-derived unpurified cardiomyocytes after transplantation into the heart (Non-patent document 6: Cardiovasc Res. 2007 May 17; Non-patent document 7: Stem Cells. 2007 May 31; Non-Patent Document 8: FASEB J. 2007 Ar 13). On the other hand, recently, myocardial cells derived from ES cells were purified and injected into the heart.
  • Non-Patent Document 9 1 Exp Med. 2006: 203: 2315-27.
  • Non-Patent Document 9 ⁇ Exp Med. 2006 Oct 2: 203 (10): 2315-27. This shows that it is impossible to transplant and engraft purified ES cell-derived cardiomyocytes while maintaining their purity by a known method.
  • cardiomyocyte engraftment is low, derived from other species It is necessary to solve all the problems such as the inability to eliminate the components.
  • Non-patent Document 11 FASEB J. 2006 Apr; 20 (6): 708-10) 0
  • acid Since there is a limit to the permeability of the element, it is stated that the thickness of the cell sheet cannot be increased without vascularization, and any cell sheet can be selected according to the size of the affected tissue of the heart. Has not yet been made.
  • the present situation is that further improvement is required from the viewpoint of practicality for the production of cardiomyocytes used for transplantation and transplantation of cardiomyocytes.
  • Patent Document 1 US2005-0214938A
  • Non-Patent Literature 1 Zhonghua Yi Xue Za Zhi 2003, 83, 1818-22
  • Non-Patent Document 4 Developmental dynamics 235: 2200-2209, 2006
  • Non-Patent Document 6 Cardiovasc Res. 2007 May 17 (Flkl (+) cardiac stem / progenitor eel Is derived from embryonic stem eel Is improve cardiac function in a dilated cardiomyopathy mouse model)
  • Non-Patent Document 7 Stem Cells. 2007 May 31 (Differentiation in vivo of Cardiac Committed Human Embryonic Stem Cells in Post-myocardial Infarcted Rats)
  • Non-Patent Document 8 FASEB J. 2007 Apr 13 (Identification and selection of cardiomyocytes during human embryonic stem cell differentiation)
  • Non-Patent Document 9 J Exp Med. 2006 Oct 2; 203 (10): 2315-27
  • Non-Patent Document 10 Stem cell and development 15: 931-941, 2006
  • Non-Patent Literature 1 1 FASEB J. 2006 Apr; 20 (6): 708-10
  • transplanted cardiomyocytes need to function in the same way as the host cardiomyocytes, but first engraft in the host cardiomyocytes (keep living for a long time) This is necessary.
  • the present invention improves the engraftment rate after transplantation and promotes maturation after transplantation of cardiomyocytes purified so as not to contain cells other than cardiomyocytes and other components derived from other species. , Is an issue.
  • cardiomyocytes differentiated and induced from embryonic stem cells (Embryoni c Stem cel ls: ES cells) and induced pluripotent stem cells (iPS cells) that are pluripotent stem cells Embryonic properties characterized by culturing purified myocardial cells obtained by dispersing a cell mass containing the mixture into single cells and using a medium under serum-free conditions to aggregate the cells. It was clarified that the above problem can be solved by providing a method for producing a cell mass of stem cell-derived or induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.
  • the inventors of the present invention first examined whether or not the above-mentioned problems could be solved by using living body-derived cardiomyocytes.
  • transplantation is performed using living body-derived cardiomyocytes that are purified so as not to contain cells other than cardiomyocytes and other components.
  • the purified biological cardiomyocytes could not form cell masses even after 24 hours despite being in a culture medium containing 10% serum. This result strongly suggested that the cell mass formation of known living cardiomyocytes performed unpurified was strongly dependent on the auxiliary action of non-cardiomyocytes. Furthermore, when experimentally examining how the purified cardiomyocytes derived from living organisms behave under serum-free conditions, the cells themselves were killed as well as the cell mass. From these facts, it is clear that “construction of unpurified cardiomyocyte mass derived from living heart” is a technology that cannot be realized, and it is not even possible to predict the behavior of purified living heart cardiomyocytes in a serum-free situation. did.
  • the cells to be used were neonatal or fetal heart-derived cells, which were cultured using a medium containing serum. This is due to the common recognition that sera generally have a strong protective effect regardless of cell type.
  • serum animal derived from other species
  • biologically derived cardiomyocytes were not able to construct a sufficient cell mass under any serum-free condition, and the cell viability was low.
  • cardiomyocytes can be maintained for a long period of time by culturing living cardiomyocytes as a lump. An attempt was made to lumps. However, cell masses could not be formed even after 5 days of culture. Based on the experimental results obtained this time, new findings were obtained that purified cardiomyocytes derived from living organisms could not build cell clusters under serum-free conditions.
  • the present inventors thought that this technical difficulty could be overcome by changing the supply source for obtaining cardiomyocytes.
  • the purified embryonic stem cell-derived cardiomyocytes are slightly affected even in serum-free conditions.
  • cardiomyocytes derived from embryonic stem cells with low engraftment ability after transplantation were predicted to have low reaggregation ability (Transpl antat i on 70: 1310-1317, 2000). Therefore, it was predicted that it was difficult to aggregate the purified embryonic stem cell-derived cardiomyocytes, and it was thought that the cells could not be aggregated. Nevertheless, contrary to such a prediction, the present inventors can construct a cell mass without the assistance of other cells by using purified embryonic stem cell-derived cardiomyocytes, and use this for transplantation. It was shown for the first time that this would dramatically improve the survival rate.
  • the present inventors can construct a cell mass more efficiently under serum-free conditions in an embryonic stem cell-derived cardiomyocyte.
  • the condition of the additive to the medium was examined.
  • insulin, transferrin, and selenium (ITS) were added as additives, it was reproducibly observed that the cell cluster autonomous pulsation was strong against the cell cluster without ITS addition.
  • ITS particularly insulin
  • the most important factor in ITS is insulin, and transferrin and selenium play an auxiliary role.
  • basal medium serum-free basal medium
  • IGF1 insulin-like growth factor 1
  • the present inventors performed planar adhesion culture of purified mouse embryonic stem cell-derived cardiomyocytes, and applied to the medium. bFGF was added and the effect was analyzed.
  • the present invention has found that the state of cardiomyocyte mass can be maintained for a long time by adding ITS and / or bFGF to a serum-free medium. This finding has made it possible to dramatically improve the survival rate of cardiomyocytes to over 90% compared to 60-70% in the conventional planar culture method.
  • the present inventors used an embryonic stem cell-derived cardiomyocyte to construct a myocardial cell mass under serum-free conditions and highly purified conditions that could not be achieved by conventional techniques. And found that the cardiomyocyte mass can be constructed most efficiently under the condition of adding ITS and bFGF.
  • one aspect of the present invention is a purified embryonic stem cell-derived myocardium obtained by dispersing an aggregated cell mass including cardiomyocytes differentiated and induced from embryonic stem cells into a single cell.
  • a method for producing a cell mass of embryonic stem cell-derived cardiomyocytes which comprises culturing cells using a medium under serum-free conditions and reaggregating the cells.
  • the medium used for the culture is preferably ITS to which at least insulin is added, and further to which bFGF is further added.
  • the unicellular cell mass is not cultured in a single space as in the known method, but can be divided into up to 10,000 cell groups and cultured in an independent space. .
  • proliferating non-cardiomyocytes When proliferating non-cardiomyocytes are mixed, the size of the aggregates becomes extremely large, and the morphology also changes. Furthermore, in addition to this index, staining with a fluorescent dye that accumulates in mitochondria allows proliferating cells to be identified as cells that are difficult to accumulate dye. By rejecting such cell clusters mixed with non-cardiomyocytes for transplantation therapy, it is possible to exclude slightly mixed proliferative non-cardiomyocytes from the transplanted cells.
  • the use of the purified embryonic stem cell-derived cardiomyocyte mass obtained by the above method Invented it was found that engraftment after transplantation can be dramatically improved by transplanting the cell mass into the heart tissue of an individual (living body).
  • purified embryonic stem cell-derived cardiomyocytes obtained by dispersing the cell mass into single cells are cultured using a medium under non-blood serum conditions, and the cells are re-aggregated to produce a cell mass. It was found that the engraftment after transplantation of the purified embryonic stem cell-derived cardiomyocytes can be dramatically improved by forming the cells.
  • a cell mass obtained by reaggregating myocardial cells derived from embryonic stem cells purified by singularization is transplanted into the heart tissue (particularly affected area) of an individual (living body).
  • the present invention also relates to a method for treating a heart disease characterized by being engrafted.
  • engraftment means to survive in a transplanted organ for a long period of time and remain adhered to the organ.
  • up to three single-layer sheets of neonatal cardiomyocytes can be stacked with the known method, but a cardiomyocyte sheet with a thickness greater than that can be produced. could not.
  • the inventors have conceived the use of purified embryonic stem cell-derived cardiac muscle cell mass obtained by the above method.
  • the cell mass is constructed by the above method, collecting the obtained cell mass, seeding the cell mass so that the cell mass continues to contact each other on the surface of the cell non-adhesive container partitioned by the wall surface, and floating Culture was performed.
  • the cell mass is joined with the passage of time, and a sheet-like cell mass having a thickness of 50 to 300 m is obtained, so-called having a thickness exceeding the limit of the prior art.
  • a “cell sheet” can be produced in vitro.
  • a cell sheet of any size can be produced using an arbitrary number of purified embryonic stem cell-derived cardiomyocyte clusters having an arbitrary size. Became.
  • purified embryonic stem cell-derived cardiomyocyte masses are densely arranged in the same plane and subjected to suspension culture, and the cell masses are joined to each other.
  • the present invention relates to a method for producing a sheet-like cell mass (cell sheet), characterized in that the culture is performed until it has an arbitrary thickness.
  • a cell mass of purified embryonic stem cell-derived cardiomyocytes having the above-described characteristics can be transplanted and engrafted in heart tissue.
  • Such a cell mass can be used as a medical device for transplantation that can be transplanted into an animal body including a human body.
  • an embryonic stem cell-derived cardiomyocyte purified by dispersing an aggregated cell mass containing myocardial cells differentiated and induced from embryonic stem cells into a single cell is obtained.
  • a medical device including a cell mass of embryonic stem cell-derived cardiomyocytes produced by culturing the cardiomyocytes using a medium under serum-free conditions and aggregating the cells is provided.
  • Such a medical device is intended to be transplanted and engrafted in the heart tissue of an individual, and has a remarkable effect that it can be used for a patient who requires heart transplantation.
  • the present inventors have intensively studied culture conditions for greatly improving the survival rate of embryonic stem cell-derived cardiomyocytes that have been dispersed (single-celled) and completely purified.
  • a medium under the condition that no animal-derived serum is used ie serum-free condition
  • the medium containing insulin, more preferably transferrin, selenium, and Z or basic fibroblast growth factor By culturing using the medium, the inventors have newly found a characteristic that the cells aggregate to form a cell mass.
  • the present invention has been completed by newly finding the use of the cells to obtain a sheet-like cell mass having a thickness greater than expected compared to known techniques, and a medical device containing such a cell mass. It came to do.
  • a pluripotent stem cell completely dispersed and dispersed (single cell) and completely purified from a medium under the condition that no animal-derived serum is used (ie, serum-free condition), preferably the medium containing insulin,
  • the medium preferably the medium containing insulin
  • the cells can aggregate to form a cell mass, and Survival rate can be greatly improved.
  • pluripotent stem cells are similar to embryonic stem cells derived from mammalian adult organs and tissues, bone marrow cells, blood cells, embryonic embryo cells, etc. in addition to embryonic stem cells Shape All pluripotent stem cells with quality can be used, for example embryonic germ stem cells
  • Embryonic Germ cells EG cells
  • germline stem cells Germline Stem cells: GS cells
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • the present invention relates to the following matters.
  • a purified pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte is cultured using a medium under serum-free conditions, and the cell is aggregated.
  • the medium is transferrin, selenium, basic fibroblast growth factor (bFGF), epidermal growth factor (EGF), platelet-derived growth factor-BB (PDGF-BB) and endothelin-1
  • the content in the medium is insulin 0.1 to 10 mg / L, transferrin 0 to 10 g / L, selenium 0.1 to 10 g / L, basic fibroblast growth factor 1 ng / ml to 100 ng / mK epidermal growth factor 1 ng / ml ⁇ 1000 ng / mU platelet-derived growth factor 1 ng / ml ⁇ 1000 ng / mK endothelin - 1 (ET-1) 1 ⁇ 10- 8 ⁇ 1 ⁇ 1 ( ⁇ 6 is ⁇ above ( 1)
  • a method for treating heart disease characterized by transplanting a cell mass obtained by aggregating pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes purified by unicellularization into an individual's heart tissue and engrafting it. ;
  • transplantation comprises injecting a cardiomyocyte mass into heart tissue
  • transplantation consists of transplanting a rod-shaped cell mass onto the heart tissue Described method
  • Purified cardiomyocyte clusters derived from pluripotent stem cells are seeded in a line without gaps so that the cell clusters continue to contact each other on the surface of a cell non-adhesive container partitioned by wall surfaces, and suspension culture is performed.
  • a characteristic has been found that has the ability to aggregate when cardiomyocytes derived from pluripotent stem cells purified by singularization are cultured under serum-free conditions.
  • a method of culturing for a long period of time while maintaining a high survival rate or proliferation ability of the cardiomyocytes was obtained.
  • the cells are transplanted into the heart tissue of an individual (living body), it has been found that the engraftment ratio to the tissue is dramatically increased, and the cells are not mixed with other cells in the heart tissue. Can be engrafted for a long time.
  • a promising treatment method for cardiac cell therapy and the practicality of a medical device including a cell mass of cardiomyocytes could be realized.
  • FIG. 1 shows a method for constructing a myocardial cell mass using purified cardiomyocytes derived from mouse embryonic stem cells expressing Enhanced Green Fluid Protein (EGFP) and mouse The cell mass when using embryonic stem cell-derived purified cardiomyocytes from 10000 cells to 313 cells is shown.
  • EGFP Enhanced Green Fluid Protein
  • FIG. 2 shows the construction of cardiomyocyte clusters using purified marmoset embryonic stem cell-derived cardiomyocytes 24 hours after dispensing (FIG. 2A) or 48 hours after (FIG. 2B).
  • FIG. 3 shows the identification of the optimal adhesion substrate in planar culture (Fig. 3A) and the cell mass based on comparison of cell viability with adhesion matrix using mouse embryonic stem cell-derived purified cardiomyocytes. A comparison of cardiomyocyte viability in planar culture is shown ( Figure 3B and Figure 3C).
  • FIG. 4 shows a method (1) for finding mixed embryonic stem cells in the formation of cell clusters using purified mouse embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. In the cell cluster indicated by the red frame, a huge cell cluster due to cell proliferation was found.
  • FIG. 5 shows a method (2) for finding mixed embryonic stem cells in the formation of cell clusters using purified mouse embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Shows detection of contaminating non-myocardial proliferating cells using the weak fluorescence signal derived from TMRM (a reagent that specifically stains mitochondria), and in contrast to normal cardiomyocytes (Figure 5A) It was revealed that myocardial proliferating cells were contaminated (Fig. 5B).
  • TMRM a reagent that specifically stains mitochondria
  • FIG. 6 shows that when cultured in non-cell-adhesive round bottom 96-well dishes, purified cardiomyocytes derived from neonatal rat heart were unable to construct cell clusters even after 24 hours.
  • FIG. 6B shows that purified cardiomyocytes derived from neonatal rat heart did not form a cell mass after 5 days and died under serum-free conditions.
  • Fig. 7 shows that when cultured in a serum-free medium supplemented with various additives such as ITS and bFGF in a non-cell-adhesive round bottom 96-well dish, these additives By clarifying what effect it has on the increase in diameter, it is shown that cytoprotective action and growth promoting activity by these additives were detected.
  • additives such as ITS and bFGF
  • Figure 8 shows that the results of planar adhesion culture of mouse embryonic stem cell-derived purified cardiomyocytes on a fibronectin-coated cell culture dish show that cell viability is significantly lower in the serum-free ITS and ITS + bFGF groups Indicates.
  • Figure 9 shows the cell viability in tissues after transplantation of purified unicellular cardiomyocytes derived from mouse embryonic stem cells when reaggregation was not applied and transplanted into the heart as dispersed cells. The measured results are shown.
  • Fig. 10 shows the case where mouse embryonic stem cell-derived purified cardiomyocytes are formed into cell masses by reaggregation, labeled with red dye (Mi tot racker Red), and transplanted into the heart. It shows that the cells survived efficiently.
  • FIG. 11 (A) and (B) show the number of cells in the heart tissue of EGFP-expressing mouse embryonic stem cell-derived purified cardiomyocytes transplanted after reaggregation. As a result, the result of analyzing the survival rate of cells in the tissue is shown.
  • Figures 11 (0 and (D) show that mouse cardiomyocyte masses can engraft for a long time in the transplanted heart and mature over time.
  • Fig. 12 shows the production of purified cardiomyocyte mass derived from mamosets embryonic stem cells in serum-free (Fig. 12A) or serum-free KSR (Fig. 12B) or ITS (Fig. 120) .
  • FIG. 13 shows the preparation of cardiomyocyte cells of arbitrary size having arbitrary thickness using purified cardiomyocyte mass derived from marmoset embryonic stem cells.
  • FIG. 14 shows that purified human embryonic stem cell-derived cardiomyocyte clusters can be prepared under serum-free conditions.
  • FIG. 15 shows that transplanted human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes can survive in the heart tissue of immunodeficient mice for 2 weeks.
  • Figure 16 shows that transplanted human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes can survive in the heart tissue of immunodeficient mice for 5 weeks using the red dye used to trace the transplanted cells. .
  • Fig. 17 shows the transplantation using the dye (Mi to t racker Red: red), Nkx2.5 (light blue) and anti-sarcomactinin antibody (green) used for tracing the transplanted cells.
  • dye Mo to t racker Red: red
  • Nkx2.5 light blue
  • anti-sarcomactinin antibody green
  • Figure 18 shows that transplanted human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes using Nkx2.5 (light blue) and anti-human antibody (green) can survive in the heart tissue of immunodeficient mice for 5 weeks. Show.
  • Figure 19 shows serum-free or serum-free conditions with ITS or KSR added. The results of preparation of mouse iPS cell-derived purified cardiomyocyte mass are shown.
  • FIG. 20 shows that bFGF has superiority in the cell protection and proliferation activation effect of purified human ES cell-derived cardiomyocytes when bFGF and other growth factors are added under serum-free conditions. Show.
  • Fig. 21 shows the gene expression of bFGF, EGF, PDGF-BB, and ET-1 in the host heart regarding the maturation mechanism when mouse cardiomyocyte masses are engrafted in the transplanted heart for a long period of time.
  • pluripotent stem cells such as embryonic stem cells and embryonic stem cell-like cells
  • Methods for establishing stem cells are known, and pluripotent stem cells that can be used in the present invention can be produced or used according to the methods described in the methods described above. It can also be applied to pluripotent stem cells, such as pluripotent stem cells derived from mice, ushi, goats, inu, cats, marmosets, rhesus monkeys, and humans.
  • pluripotent stem cells used in the present invention are derived from mammals such as mice, monkeys, and humans that are already widely used as cultured cells. Examples include embryonic stem cells (ES cells).
  • mouse-derived embryonic stem cells include EB3 cells, E14 cells, D3 cells, CCE cells, R1 cells, 129SV cells, J1 cells and the like.
  • mouse-derived embryonic stem cells according to the present invention include American Type Culture Collection (ATCC), Chemicon, Cell & It can be obtained from Molecular Technologies.
  • marmoset embryonic stem cells can also be obtained from the Institute for Experimental Animal Research.
  • Embryonic stem cells are generally established by culturing early embryos, but embryonic stem cells can also be produced from early embryos in which somatic cell nuclei have been transferred (Munsie et al., Curr.
  • parthenogenetic embryos are developed to the same stage as the blastocyst stage, and embryonic stem cells are produced therefrom (US Patent Publication No. 02/168763; Vrana Ket al., Proc.
  • Embryonic stem cells that can be used in the present invention include embryonic stem cells produced by such a method or those obtained by modifying genes on the chromosome of embryonic stem cells by genetic engineering techniques.
  • the pluripotent stem cells that can be used in the method according to the present invention are not limited to embryonic stem cells, but include mammalian adult organ and tissue cells, bone marrow cells, blood cells, and embryonic fetal cells.
  • All pluripotent stem cells derived from that have similar traits to embryonic stem cells are included.
  • the characteristics similar to those of embryonic stem cells are the presence of surface (antigen) markers specific for embryonic stem cells, the expression of embryonic stem cell-specific genes, or the ability to form teratoma. It can be defined with cell biological properties specific to embryonic stem cells. Specific examples include embryonic germ stem cells (EG cells) produced from primordial germ cells, germ stem cells (GS cells) produced from testicular germ cells, and somatic cells such as fibroblasts.
  • EG cells embryonic germ stem cells
  • GS cells germ stem cells
  • somatic cells such as fibroblasts.
  • induced pluripotent stem cells produced by Examples of induced pluripotent stem cells include induced pluripotent stem cells that can be prepared by introducing a specific factor into somatic cells, and these cells are based on the literature of Professor Shinya Yamanaka (K. Takahashi). , et al., "Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors” Cell 2007 131: 861-872) and literature on the Thomson group at the University of Wisconsin (J. Yu, et al., "Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic Cells "Science 2007 318: 1917-1920).
  • At least one gene of 0ct3 / 4, Sox2, c-Myc, Klf4, Nanog, and LIN28 is introduced into any somatic cell, and it is a gene specific for pluripotent stem cells. And protein expression can be detected and selected.
  • Induced pluripotent stem cells produced in this way are cultured with basic fibroblast growth factor in the presence of proliferation-inactivated mouse fibroblasts or cells that can replace them, in the same manner as embryonic stem cells. It can be used as a pluripotent stem cell as well as an embryonic stem cell.
  • this induced pluripotent stem cell has the same characteristics as embryonic stem cells in terms of the characteristics of differentiation into various tissues and the characteristics of gene expression in the cells.
  • Park IH et al. Nature, 2008, 451, 14 ⁇ 147
  • differentiation induction conditions from embryonic stem cells to various tissues can be directly applied to induced pluripotent stem cells (Takahashi and Yamanaka, Cell Engineering, Vol.27, No.3, 252-253, 2008).
  • embryonic stem cells are described as examples of pluripotent stem cells.
  • embryonic stem cells capable of differentiating into cardiomyocytes
  • differentiation into cardiomyocytes occurs. That is, for example, mouse embryonic stem cells are removed from the leukemia inhibitory factor (LIF) from the culture medium and suspended in suspension, and the embryonic stem cells are converted to cardiomyocytes by the hanging drop method in which a cell mass (embryoid body) is formed. Differentiation can be induced.
  • LIF leukemia inhibitory factor
  • differentiation induction from embryonic stem cells into cardiomyocytes can be performed using marmoset embryonic stem cells or human embryonic stem cells.
  • a known method can be used as a method for inducing differentiation of cardiomyocytes from embryonic stem cells, and is not particularly specified.
  • differentiation induction in the presence of a substance that suppresses BMP signaling WO2005 / 033298
  • differentiation induction in the presence of a substance that promotes canonical Wnt signaling pathway PCT / JP2007 / 59242, published as WO2007 / 126077
  • PCT / JP2007 / 59242 published as WO2007 / 126077
  • the cardiomyocytes are dispersed (single cells) by the action of the enzyme to form individual cardiomyocytes.
  • Any method that can be purified is not particularly specified. For example, myocardium using a method of selecting mitochondria in cardiomyocytes as an index (WO2006 / 022377), a method of selecting cells that can survive under low nutrient conditions (PCT / JP2007 / 051563, published as W02007 / 08887) Only cells can be purified (selected).
  • the cultured embryonic stem cell-derived cardiac muscle cells obtained by singularization by the method of (3) above are cultured under serum-free conditions to aggregate the cells, and the embryonic stem cell-derived cardiac muscle cell mass Can be produced.
  • insulin 0.1 to 10 mg / s
  • transferrin 0.1 to 10 g / l
  • selenium 0.1 to 10 xg / L
  • basic fibroblast proliferation is used as a medium for the culture.
  • bFGF bFGF
  • epidermal growth factor 1 ng / ml to 100 ng / ml
  • epidermal growth factor (1 ng / ml) ⁇ 1000 ng / ml
  • platelet-derived growth factor (1 ng / ml ⁇ 1000 ng / ml
  • ET-1 endothelin -1 It is desirable to include one material.
  • undifferentiated embryonic stem cells were intentionally mixed with the above method. Then, undifferentiated embryonic stem cells, which have a higher proliferative capacity than cardiomyocytes, constructed a large cell mass outside the cardiomyocyte mass.
  • the cardiomyocyte mass containing the mixed embryonic stem cells can be automatically discriminated by determining the size of the whole cell mass. Furthermore, when a mitochondrial indicator (eg TMRM) is added to the cell mass, cardiomyocytes with many mitochondria are bright, and embryonic stem cells and other proliferating cells without many mitochondria are found dark. I was able to.
  • TMRM mitochondrial indicator
  • Excluding cell masses with large differences in fluorescence intensity within this cell mass can be obtained by using Arrayscan (Cel lomics), Incel 11000 (GE / Amersham Biosciences, Cambridge, UK), Scanalyzer (Scanalyzer LemnaTec, Aachen Germany) and ImageXpress MICRO (Molecular Devices, Union City, USA), "Pathway HT” (Becton Dickinson Biosciences), “Scan'R” (Olympus Soft Imaging Solutions, Germany), etc.
  • the above method can easily and automatically identify contamination of undifferentiated embryonic stem cells, i.e., a small amount of purified cardiomyocyte mass derived from embryonic stem cells cultured and aggregated under serum-free conditions.
  • Proliferating cells that are mixed are stained with a mitochondrial indicator in addition to the size and shape of the cell mass.
  • the fluorescence intensity and the fluorescence intensity distribution in the cell mass can be identified as indicators. In this way, safety can be improved by excluding cell clusters mixed with cells other than cardiomyocytes from cells for transplantation. (5) transplantation and engraftment of heart muscle cell mass into heart tissue
  • cardiomyocytes can be transplanted into the heart tissue of an individual (living body).
  • cardiomyocytes can be directly injected into heart tissue by injection, and in this case, it can be applied to injection with a thin, minimally invasive needle of 29 or 30 gauge.
  • the engraftment rate of the transplanted cardiomyocytes by this method is dramatically improved compared to the known methods.
  • “engraftment” means to survive in the transplanted organ for a long period of time and adhere and remain in the organ.
  • a cardiomyocyte sheet having a thickness of 3 cells or more cannot be produced at a time.
  • the obtained cell mass is recovered and the cell mass is collected on the surface of the cell non-adhesive container cut by the wall surface.
  • the myocardial cell mass is joined to the cell mass over time, and the cell mass is 50 to 300 / zm.
  • a sheet-like cell mass (cell sheet) having a thickness can be formed. Therefore, culture is performed until an arbitrary thickness is formed.
  • a cell sheet of any size can be constructed using any number of purified embryonic stem cell-derived cardiomyocyte clusters having an arbitrary size.
  • Example 1 Preparation of mouse embryonic stem cell-derived cardiomyocytes and purification of cardiomyocytes using the mitochondrial method
  • the purpose of this example was to examine the possibility of producing cardiomyocytes from mouse embryonic stem cells and whether the cardiomyocytes could be purified using a mitochondrial indicator.
  • EGFP expression unit As an embryonic stem cell, using the EB3 cell line (Niwa H, et al., Nat Gene t 2000; 24: 372-376), the EGFP expression unit was introduced into the EB3 line using a plasmid, and EGFP was introduced into the cell. The expressing cells were obtained '. EGFP expression-embryonic stem cells (EB3 cells) obtained in this way were immobilized at 10% final concentration (55, 30 minutes) ⁇ - ⁇ culture medium supplemented with urchin fetal serum (manufactured by Sigma) And diluted so that the number of embryonic stem cells was 75/35 // L.
  • EB3 cells EGFP expression-embryonic stem cells obtained in this way were immobilized at 10% final concentration (55, 30 minutes) ⁇ - ⁇ culture medium supplemented with urchin fetal serum (manufactured by Sigma) And diluted so that the number of embryonic stem cells was 75/35 // L.
  • mice embryonic stem cells prepared above were dispensed onto a commercially available 384 well plate for cell culture (manufactured by Greiner, model 788161; inner diameter of the opening 3.0 mm), and the following method was used. Embryoid bodies were prepared.
  • the nominal solution allowance on the 384-well plate used was 25 per well, but was dispensed per well to increase the liquid level. As a result, 75 embryonic stem cells were dispensed per well. At this time, the amount of solution required up to the horizontal surface of the opening was 28 L, and the amount of solution required for the pumping was 7 fi i.
  • a culture solution containing embryonic stem cells was dispensed, and the plate with the culture solution raised was turned over to create a protruding portion of the culture solution at the lower open end. While keeping this state, the lid was covered and cultured in an incubation oven at 37, under 5% CO 2 conditions, and embryonic stem cells were proliferated in the protruding portion of the lower end opening.
  • the medium was changed every other day until the 15th day after the start of differentiation culture.
  • Physiological buffer containing trypsin (DIFC0 # 215240) at a final concentration of 0.1% 116 mM NaCl, 20 mM Hepes, 12.5 mM NaH 2 P0 4 , 5.6 mM glucose, 5.4 mM KCl
  • This example was carried out for the purpose of clarifying whether or not a cell mass could be produced using the mouse embryonic stem cell-derived cardiomyocytes prepared in Example 1.
  • Purified cardiomyocytes derived from embryonic stem cells prepared in Example 1 were 10000, 5000, 2500, 1250, 625, and 313 cells non-adherent round-bottom 96-well plates (Sumitomobe Crit: Self-Ex (Tights pheroid) was dispensed to exist in 1 uel.
  • the culture medium is MEM containing 10% fetal calf serum.
  • Example 3 Preparation of cell mass using marmoset embryonic stem cell-derived cardiomyocytes The purpose of this example was to clarify whether or not a cell mass can be prepared using marmoset embryonic stem cell-derived cardiomyocytes prepared according to the method of Example 1.
  • Marmoset embryonic stem cells were obtained from the Central Laboratory for Experimental Animals (Sasaki E, et al., Stem Cells. 2005; 23 (9): 1304-13). The marmoset embryonic stem cells were cultured in an undifferentiated state using mouse embryonic fibroblast (MEF) cells that had been grown and inactivated by treatment with mitomycin C.
  • MEF mouse embryonic fibroblast
  • a passing solution of a mesh having a pore size of 100 zm was obtained, and a non-passing cell mass having a pore size of 40 m was obtained.
  • This cell mass is a pure embryonic stem cell mass.
  • embryonic stem cell clusters per EB were cultured as embryoid bodies on a non-adherent bacterial dish (Asahi Technograss: sterile petri dish) for a total of 15-30 days, and embryoid bodies containing cardiomyocytes Differentiated into The culture broth used at this time was the same as the culture broth described above in this example, except for bFGF [KO-DMEM (GIBC0), 20% KO-SERUM (GIBC0), 1.6 mM L-glutamine, 0.1 mM Non-essential amino acids (MEM), 0.2 mM / 3-mercaptoethanol (2- ME; Sigma), 100 IU / ml penicillin, 100 // g / ml streptomycin sulfate, and 8 ng / ml recombinant human leukemia inhibitory factor (LIF; Chemicon)].
  • Cardiomyocytes were purified using the method described in W02006 / 022377 using embryoid bodies that had passed 1 to 2 months after the preparation of embryoid bodies. That is, the embryoid body was treated with collagenase and trypsin to obtain discrete single cells. Mitochondria indicator for cell culture broth
  • TMRMClnvitrogen # T66 was added at a final concentration of 10 nM, exposed at 37 for 15 minutes, washed 3 times, and immediately subjected to FACS analysis. Cells that show higher fluorescence than the main cell population (cardiomyocytes) Separated and recovered.
  • a cardiomyocyte mass was prepared from the separated cardiomyocytes using the same method as in Example 2.
  • the purified cardiomyocytes derived from mamoset embryonic stem cells were dispensed so that 2000 cells existed in one well of a non-adhesive round bottom 96 well plate (Sumitomo Bakelite: Self-Extite Spheroid). .
  • Fig. 2A When the dispensed cells were observed over time, after 24 hours (Fig. 2A), they formed a cell mass and synchronized autonomously. After 48 hours (Fig. 2B), an almost perfect sphere was formed, and after 10 days, rhythmic synchronized autonomous pulsations were observed (Fig. 2). From this result, it was clarified that cardiomyocytes re-aggregate and form a cell mass after the cardiomyocytes derived from the momoset embryonic stem cells were made into single cells.
  • Example 4 Measurement of cell viability during cell mass formation using cardiomyocytes derived from mouse embryonic stem cells and comparison with adhesion method
  • mouse embryonic stem cell-derived cardiomyocytes were purified according to Example 1. Purified cardiomyocytes can be transformed into (1) gelatin and (2) fibronectin-coated plastics.
  • Example 5 Production of cell clusters using purified mouse embryonic stem cell-derived cardiomyocytes and detection of mixed embryonic stem cells
  • the purpose of this example was to detect non-cardiomyocytes mixed in a cell cluster using purified mouse embryonic stem cell-derived cardiomyocytes.
  • Purified cardiomyocyte masses were prepared using the methods of Examples 1 and 2. However, 2% of undifferentiated embryonic stem cells were added to the cardiomyocyte suspension before the final seeding on 10 96 well plates. The cell mass was cultured in a-MEM solution containing serum-free + l mg / ml Insul in, and 10 nM TMRM, and fluorescence and phase contrast images of all wells were obtained after 14 days.
  • the method provided in this example was able to identify non-cardiomyocyte contamination with high sensitivity.
  • Example 6 Production of cell mass using purified cardiomyocytes derived from newborn rat heart
  • the purpose of this example was to clarify whether a cell cluster using purified cardiomyocytes derived from the heart of a newborn rat can be produced.
  • Newborn rats from 0 to 2 days after birth were anesthetized with ether.
  • the heart was removed, and the cells were dispersed using 0.1% collagena 25 (wort ington). After staining this with 10 nM TMRM, cardiomyocytes were purified using FACS.
  • the number of purified cardiomyocytes was counted and cultured in a non-adherent 96-well dish (Sumitomo Beklite) every 3000 cells.
  • the culture medium is DMEM- containing 10% FBS (JRH). High glucose (Invitrogen) was used.
  • FIG. 6A The state of the cells after 24 hours is shown in the figure.
  • Newborn rat-derived purified cardiomyocytes did not form cell clusters and existed along the round bottom (Fig. 6A).
  • Purified cardiomyocytes derived from neonatal rat hearts on the 5th day of culture are serum-free (only basal medium a-MEM (Fig. 6B left), or HI-MEM + ITS (Fig. 6B right)). It was almost dead ( Figure 6B).
  • Figure 6B Example 7: Optimal Medium Composition for Cell Mass Formation Using Mouse Embryonic Stem Cell-Derived Cardiomyocytes
  • various properties of neonatal rat primary cardiomyocytes and mouse embryonic stem cells-derived cardiomyocytes were analyzed and the embryos were analyzed. The purpose was to find the most suitable culture medium for sex stem cell-derived cardiomyocytes.
  • Mouse embryonic stem cell-derived purified cardiomyocytes and neonatal rat purified cardiomyocytes were prepared as described above. ⁇ - ⁇ only, o; -MEM + ITS, a -MEM + ITSI50 ng / ml bFGF (peprotech), ⁇ - ⁇ + ITS + 50 ng / ml IGF-1 (Wako), a-MEM + ITS + 50 ng / ml bFGF
  • Example 8 Optimal Medium Composition for Cell Aggregation Using Mouse Embryonic Stem Cell-Derived Cardiomyocytes
  • a medium supplemented with ITS and bFGF under serum-free conditions has a very cell protective effect.
  • insulin which is one of the components of bFGF and ITS solution, increases the cell mass diameter because it has been clarified that it exhibits strong and unique properties that induce cardiomyocyte proliferation. The purpose of this study was to clarify what kind of effect it has on the above.
  • ⁇ -MEM only, ⁇ - ⁇ + 50 ng / ml bFGF, ⁇ - ⁇ + 10 g / ml insulin + 5 ng / ml bFGF, hi-MEM + 1 xg / ml insulin + 1
  • ng / ml bFGF was used.
  • Example 9 Effects of serum-free and bFGF on purified cardiomyocytes derived from mouse embryonic stem cells in a planar adhesion culture system
  • mouse embryonic stem cell-derived cardiomyocytes were purified. The same number of cells were seeded in a cell culture dish in which the purified cardiomyocytes were coated with fibronectin, and planar adhesion culture was performed using various culture media.
  • the various culture media are all basal media using ⁇ -MEM, 10% FBS, 10% FBS + 50 ng / ml bFGF, 10% KSR (Knockout Serum
  • a total of 2 ⁇ 10 5 cells were transplanted into the left ventricular free wall of an immunodeficient mouse (NOD-SC ID). Mice were anesthetized with ether and treated with air containing 2% forene continuously through a ventilator. The mouse was opened under deep anesthesia (3rd intercostal space), the pericardium was broken with tweezers, and the heart was exposed. Using a syringe with a 30G needle, physiological saline 30 I containing a myocardial cell mass was sucked. The injection needle was injected from the apex to the base of the heart through the heart free wall by about 3 mm. The chest was closed immediately after transplantation, and after returning to the autonomic beat, it was returned to the cage.
  • NOD-SC ID immunodeficient mouse
  • a total of 2 ⁇ 10 5 cells of 2000 cardiomyocyte clusters constructed under serum-free conditions described in Example 7 were transplanted into the left ventricular free wall of immunodeficient mice (N0D-SCID).
  • transplantation was performed, and 3 weeks after transplantation, the heart was fixed by perfusion and subjected to frozen sections.
  • the sections were immunostained with an anti-sarcomactinin antibody to obtain a fluorescence microscope image (Fig. 10). Based on the fluorescence microscope image, the number of cells engrafted in the host heart tissue contained in one cell cluster was emphasized.
  • transplanted cell mass consists of exactly 2000 cardiomyocytes
  • This example was performed for the purpose of producing a purified myocardial cell mass derived from moss embryo embryonic stem cells under the condition of serum-free or serum-free ITS or KSR added.
  • FIG. 12A serum medium
  • FIG. 12B is, 10% KSR serum free medium except using (FIG. 12B) or ITS (Fig. 12C), according to Example 3, marmoset embryonic stem cells derived from purified A cardiomyocyte mass was prepared.
  • Figure 12 shows the cell mass constructed 12 hours or 3 days after the start of culture.
  • Example 12 Construction of a thick cell sheet using a marmoset embryonic stem cell-derived purified cardiomyocyte mass
  • the purified cardiomyocyte mass derived from mamoset embryonic stem cells prepared in Example 11 was suspended and cultured in the same plane.
  • the suspension-cultured myocardial cell mass joined the cell mass over time from 0 to 12 hours, and constructed a cell sheet as if having a thickness.
  • This example is a model experiment aimed at demonstrating the method.
  • an arbitrary number of purified embryonic stem cell-derived cardiomyocyte masses having an arbitrary size are used, and an arbitrary size is used.
  • a cell sheet can be constructed ( Figure 13). Further, if the size of the cell mass to be used is changed, a cell sheet having an arbitrary thickness can be formed.
  • Example 13 Transplantation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes into immunodeficient mouse heart
  • cardiomyocytes are differentiated from human embryonic stem cells, and it is examined whether the cardiomyocyte mass thus produced has the ability to engraft in heart tissue. The experiment was conducted for the purpose.
  • Human embryonic stem cells were obtained from the Center for Stem Cell Medicine, Institute for Regenerative Medicine, Kyoto University (Embryonic Stem Cell Center by National BioResource Project).
  • the human embryonic stem cells were cultured in an undifferentiated state using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) that were proliferated and inactivated by mitomycin C treatment.
  • the culture solution includes F12 / DMEM (1: 1) (SIGMA, product number D6421), 20% KO-SERUM (GIBC0),
  • embryonic stem cell clusters per EB are cultured as embryoid bodies on a non-adherent bacterial dish (Asahi technograss: sterile petri dish) for a total of 15 to 30 days and differentiated into embryoid bodies containing cardiomyocytes. It was.
  • the culture broth used at this time was the culture broth described above in this example except for bFGF (ie, F12 / DMEM (1: 1) (SIGMA, product number D6421),
  • Example 1 human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes were purified. Subsequently, according to the results of Example 8, a cell mass containing 1000 purified cardiomyocytes was prepared using an a-MEM solution containing insulin lzg / ml and bFGF 1 ng / ml but not serum (Fig. 14).
  • Example 10 transplantation into the heart tissue of an immunodeficient mouse was performed. Two weeks after transplantation, frozen sections were prepared according to Example 10. The section prepared in this way
  • Example 14 Preparation of cell mass using mouse-derived pluripotent stem cells (iPS) cell-derived purified cardiomyocytes
  • the purpose of this example was to produce a purified mouse cardiomyocyte mass derived from mouse iPS cells under serum-free conditions or under the condition where ITS or KSR was added under serum-free conditions.
  • Mouse iPS cells were transferred from the Institute of Regenerative Medicine, Kyoto University.
  • the cardiomyocyte differentiation of mouse iPS cells was performed in the same manner as in Example 1. In this case, the optimal number of initial cells constituting one embryoid body was 1000.
  • Figure 19 shows the FACS analysis results using TMRM, a mitochondrial indicator, for purification purposes. The squares in the figure indicate cardiomyocyte regions. Figure 19 shows the results of adhesion culture of purified cardiomyocytes and immunostaining (actinin, Nkx2.5).
  • FIG. 19 (C) shows a state 24 hours after seeding the purified cardiomyocytes in a non-adherent 96-well culture dish. In this case, serum-free medium was used. As a result, it was found that the cell mass can be constructed by this method even with mouse iPS cell-derived purified cardiomyocytes.
  • Example 15 Optimal medium composition for cell cluster formation using human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes
  • a medium supplemented with ITS and bFGF under serum-free conditions protected against mouse-derived cells
  • the purpose of this study was to demonstrate the effectiveness of bFGF 10 in human ES cell-derived cardiomyocytes, and to demonstrate its unique properties that induce cardiomyocyte proliferation. The objective was to compare the efficacy in more detail with other growth factors.
  • ⁇ - ⁇ + ITS was used as the culture medium. 25 ng / ml bFGF (Peprotech, Inc., Rocky Hill, J, USA), 25 ng / ml acidic FGF (aFGF), 25 ng / ml FGF-4, 20 ng / ml keratinocyte growth factor (kerat inocyte) growth factor; KGF),
  • SCF stem cell factor
  • VEGF vascular endotherial growth factor
  • LIF leukemia inhibitory factor
  • GDNF glial cell line-derived neurotrophic factor
  • HGF hepatocyte growth factor
  • IGF insulin-like growth factor
  • the diameter of the cell mass was measured 3 days, 8 days, 25 days, and 40 days after the production of the aggregate. As a result, it was found that the cell mass to which bFGF was added was the largest in any schedule.
  • ET-1 was found to be effective (Figure 20B). From this, it was found that bFGF also has cytoprotective / proliferation promoting activity under serum-free conditions in the differentiation of human ES cell-derived cardiomyocytes, and this action is stronger than other growth factors. .
  • a characteristic has been found in which embryonic stem cell-derived cardiomyocytes purified by unicellularization have the ability to aggregate when cultured under serum-free conditions.
  • a method of culturing for a long period of time while maintaining a high survival rate or proliferation ability of the cardiomyocytes was obtained.
  • the engraftment rate on the heart tissue is dramatically increased. It was possible to engraft in the tissue for a long time.
  • a cardiac cell therapy method which is a method for treating cardiac disease by transplanting cardiomyocytes produced outside the body as a method for providing cardiac muscle cells for transplantation or other than cardiac transplantation, and The feasibility of providing a medical device including a cell mass of cardiomyocytes was improved.

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Abstract

　本発明は、心筋細胞以外の細胞を含まず、また他種由来の成分を含まないように精製された心筋細胞の、移植後の生着率を改善することを課題とする。　本発明者らは、上記課題を解決するために、精製された心筋細胞について細胞塊が構築できるか検討を行った。その結果、多能性幹細胞から分化、誘導された心筋細胞を含む凝集された細胞塊を分散させて単細胞化することにより得られる精製された多能性幹細胞由来の心筋細胞を無血清条件下の培地を用いて培養し、当該細胞を凝集させることを特徴とする、多能性幹細胞由来心筋細胞の細胞塊を作製する方法を提供することにより、上記課題を解決することができることを明らかにした。

Description

明細書
心筋細胞の細胞塊作製方法及び当該心筋細胞塊の用途 技術分野
本発明は、単細胞化して精製された多能性幹細胞由来の心筋細胞を凝集させて細胞 塊を作製する方法、並びに当該心筋細胞塊を心臓組織に生着させることからなる心疾 患の治療方法及び当該心筋細胞塊を用いたシート状細胞塊の作製方法などに関する。
背景技術
成体における心筋細胞は増殖活性を喪失しており、 重症な心筋梗塞、 心筋症などの 心疾患では心臓移植に頼らざるを得ない。 しかし、 現状では心臓のドナ一不足の問題 を克服するには至っておらず、 心臓移植以外の治療方法を見出すことが急務である。 これに対して、 心筋細胞を体外で作製し、 心筋細胞の補充に充てることは、 心臓移 植に頼らなくてはならない患者を救済する最も有望な方法と予想されている。 当該治 療方針は、 心臓の細胞治療と呼ばれる。 当該治療を実現させるために、 様々な試行錯 誤が行われている。たとえば、実験的に胎仔、新生仔、成体から、心筋細胞もしくは、 骨格筋芽細胞、 及び骨髄細胞等を摘出し用いる方法、 胚性幹細胞を分化させて用いる 方法、 並びに生体内に存在することが示唆されている幹細胞 （体性幹細胞） を取り出 し、分化を誘導する方法などが検討されている（非特許文献 1： Zhonghua Yi Xue Za Zh i 2003, 83， 1818-22)。
これらを分類すると主に 2つの方向性があげられる。 ひとつは、 心筋細胞を細胞の まま移植に用いるもので、単一の細胞へと分散させた心筋細胞を注射針を用いて直接 組織内へ注入する方法（以後「インジェクション法」 と記載）である。もうひとつは、 体外で組織や臓器を構築し（以後、 Ti ssue engineer i ng法と記載）、 この人工組織や人 ェ臓器を体内に移して治療するという方法である。
この Ti ssue engineer ing法においては、 1) 心筋細胞をシート状に形成して組織上 に貼り付ける方法（非特許文献 2： Ci rcu l at i on Research 2002, 90 (3) : e- 40)、 2) 心 筋細胞と非心筋細胞を心臓組織内と同様の割合で混合し、立体的に形成して組織を置 換する方法、 3) 単一の細胞へと分散させた心筋細胞を立体的に形成し、 さらには血 管構造も構築し、 組織置換するもの、 もしくは、 4) 心臓組織を置換するのではなく 本来の臓器機能を補助するために新たな補助臓器として異所的に移植して用いる方 法 (非特許文献 3： Ci rcul at i on Research 2007 2， 100 : 263-272) などが試みられて いる。
5 しかしながら、現段階では臨床治療応用に向けた様々な試行錯誤が行われている段 階であって、 どの方法も十分に実用的なデータを示していない。 心筋細胞を心臓に移 植するためには、 いくつかの問題点、 たとえば、 心筋細胞以外の細胞が包含されるこ と、 心筋細胞の生着性が低いこと、 他種由来の成分を排除できないこと、 などの問題 点が存在するためである。
10 心筋細胞を細胞塊として移植に用いるために、胎仔や新生仔齧歯類心筋細胞を含む 細胞塊の構築方法が知られており、 最近の報告では、 胎仔心臓由来の全細胞 （非心筋 細胞を含む） を用いて細胞塊が構築されている （非特許文献 4： Deve lopmental dynami cs 235； 2200-2209, 2006)。 そして心筋細胞の移植に関しては、 胎仔マウス心 筋細胞を成体マウスの心臓内に移植して、 生着を確認した例も報告されている（非特
15 許文献 5： Sc i ence 1994， 264 (5155)： 98- 101)。 但し、 当該心筋細胞の調製方法では、 胎仔の心臓をコラゲナーゼによって分散させた全細胞を用いているため、移植された 細胞は心筋細胞と非心筋細胞が混合された細胞集団である。 また、 未精製の生体由来 心筋細胞を心臓へ移植することが可能であることも知られている（非特許文献 5： Sc i ence 1994, 264 (5155)： 98-101、 非特許文献 1： Zhonghua Yi Xue Za Zh i 2003, 83,
20 1818-22)。
また、 ES細胞の胚様体分化の過程において、胚様体を不完全にタンパク質分解酵素 で処理し、その結果心筋細胞を多く含む細胞塊とそうでない細胞塊を含む細胞塊集団 を得、それを密度勾配遠心法で分離することによって、心筋細胞を最大で 70%程度含 有する細胞塊を得る方法が知られている （特許文献 1： US2005-0214938A)。
25 しかしながら、 これらの方法はいずれも、 心筋細胞以外の細胞も包含される細胞集 団を利用する方法であり、 心筋細胞以外の細胞混入は、 移植後の患者の生命に関わる 重大な予期できない副作用を引き起こす可能性がある。 そこで、 移植治療に供する場 合は、 心筋細胞を精製してから使用することが必要と考えられている。 これまでに、 ES細胞由来の未精製の心筋細胞を心臓へ移植後に生着させることを達 成した報告がある （非特許文献 6： Cardiovasc Res. 2007 May 17；非特許文献 7： Stem Cells. 2007 May 31；非特許文献 8： FASEB J. 2007 A r 13)。 一方で、 最近、 ES細 胞由来の心筋細胞を精製して心臓にィンジェクションを行ったが、生着率が極めて低 く、生着した（即ち、移植された臓器内に長期間生存し、臓器内に接着して留まった） 心筋細胞を見出すことができなかったことが報告され、 精製された ES細胞由来の心 筋細胞は、 個体 （生体） に移植しても生着できないということが判明した (非特許文 献 9 : 1 Exp Med. 2006:203:2315-27.)。
これらの報告によって、精製された心筋細胞の移植後の生着の難しさが表面化した。 同じ報告で、 このような問題点を解決するために、 精製された ES細胞由来の心筋細 胞の移植後の生着率を高める目的で、マウス胎児性線維芽細胞を混合して移植する方 法が見出された (非特許文献 9：〗 Exp Med. 2006 Oct 2:203 (10) :2315- 27)。 これは、 精製した ES細胞由来の心筋細胞について、 その純度を保持したまま移植して生着さ せることは、 既知の方法では実施できないことを示している。
また、 人体への治療を目的とした移植細胞の調製は、 血清などの、 他動物由来の因 子を排除する必要がある。 移植に用いる心筋細胞の作製方法においては、 通常は有血 清培養を行うが、 無血清条件においては、 ヒト ES細胞が胚様体を形成でき、 その中 に含まれる心筋細胞の量も、 通常の有血清培養と同程度であることが知られている (非特許文献 10： Stem cell and development 15:931-941, 2006) 0 しかしながら、 こ の報告を含む既知の報告では、心筋細胞を血清等の他動物由来の因子を用いずに調製 して移植を行った例については何ら報告されていない。
このように、 上述した様な心筋細胞を心臓に移植するためのいくつかの問題点、 即 ち、 心筋細胞以外の細胞が包含されること、 心筋細胞の生着性が低いこと、 他種由来 の成分を排除できないこと、 などの問題点を、 すべて解決しなければならない。
さらに、 心臓組織への移植に際しては、 所謂 「細胞シート」 の形態で移植すること が考えられているが、 細胞シートの作製については、 新生仔心筋細胞を単層のシ一卜 にした後、 このシートを in vitroでは 3枚まで重ね合わせることができることが知 られている (非特許文献 11： FASEB J. 2006 Apr ;20 (6) :708-10)0 しかしながら、 酸 素の透過性に限界が存在するため、 これ以上は血管の新生なしには細胞シートに厚み をもたせることができないと記載されており、心臓の患部組織の大きさに合わせて任 意の細胞シートを作製するまでには至っていない。
以上のように、 移植に用いる心筋細胞の作製や心筋細胞の移植については、 実用性 の観点から更なる改善が求められているのが現状である。
特許文献 1 ： US2005-0214938A
非特許文献 1 Zhonghua Yi Xue Za Zhi 2003, 83， 1818-22
非特許文献 2 Circulation Research 2002, 90(3)： e-40
非特許文献 3 Circulation Research 2007 2, 100: 263-272
非特許文献 4 Developmental dynamics 235:2200 - 2209, 2006
非特許文献 5 Science 1994, 264(5155)： 98-101
非特許文献 6 Cardiovasc Res. 2007 May 17 (Flkl(+) cardiac stem/progenitor eel Is derived from embryonic stem eel Is improve cardiac function in a dilated cardiomyopathy mouse model)
非特許文献 7 : Stem Cells. 2007 May 31 (Differentiation in vivo of Cardiac Committed Human Embryonic Stem Cells in Post - myocardial Infarcted Rats) 非特許文献 8 ： FASEB J. 2007 Apr 13 (Identification and selection of cardiomyocytes during human embryonic stem cell differentiation)
非特許文献 9 ： J Exp Med. 2006 Oct 2;203 (10) :2315-27
非特許文献 10 ： Stem cell and development 15:931-941, 2006
非特許文献 1 1 ： FASEB J. 2006 Apr ;20 (6) :708-10
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
そこで、 本発明者らは、 培養心筋細胞を臨床に用いるための少なくとも現在想定さ れる最低限の条件を検討し、 以下の課題が明らかになった。
(1) 心筋細胞の精製： 心筋細胞を生体又は多能性幹細胞から得る場合、 未知の 細胞が混入して存在する状態では安全性の保障が不可能であるため、 いずれの場合に おいても心筋細胞の高度な精製は必須である。 この心筋細胞の高度な精製純度を安定 して維持するためには、生体又は多能性幹細胞から得られた心筋細胞をバラバラに分 散 （単細胞化） して、 個々の細胞の種類を判別し、 心筋細胞のみを選抜することが必 要であると考えられる。
(2) 心筋細胞の由来： 免疫拒絶の問題や、 倫理的問題があるばかりではなく、 心筋細胞の性質の種間における相異が臨床上の安全性及び有効性に重大な影響をも たらすため、 レシピエント個体と同じ種由来のドナ一細胞であることが重要である。
(3) 他種の動物由来因子の排除： 免疫原性及び未知の病原体の混入を避けるた め、 血清に代表される他動物由来因子の混入を排除する必要がある。
(4) 移植心筋細胞の生着： 移植された心筋細胞は、 宿主の心筋細胞と同様に機 能する必要があるが、 先ずは宿主の心筋細胞に生着する （生きた状態を長期間保つこ と） 必要がある。
(5) 次の段階では細胞が成熟 （成長し、 大きくなること） が必要である。
即ち、 本発明は、 心筋細胞以外の細胞を含まず、 また他種由来の成分を含まないよ うに精製された心筋細胞の、 移植後の生着率を改善し、 移植後の成熟を促すこと、 を 課題とする。
課題を解決するための手段
本発明者らは、 心筋細胞以外の細胞を含まず、 また他種由来の成分を含まないよう に精製された生体由来又は多能性幹細胞由来の心筋細胞の生着率を改善するために、 精製された心筋細胞について細胞塊が構築できるか検討を行った。 その結果、 多能性 幹細胞である胚性幹細胞 （Embryoni c Stem cel l s： ES 細胞） や誘導多能性幹細胞 (induced plur ipo tent s tem ce l l s： iPS細胞) から分化、 誘導された心筋細胞を含 む細胞塊をいつたん分散させて単細胞化することにより得られる精製された心筋細 胞を、無血清条件下の培地を用いて培養し、当該細胞を凝集させることを特徴とする、 胚性幹細胞由来や誘導多能性幹細胞由来の心筋細胞の細胞塊を作製する方法を提供 することにより、 上記課題を解決することができることを明らかにした。
本発明の発明者らは、 先ず生体由来の心筋細胞を使用して、 上記の課題を解決する ことができるかどうかについて検討を行った。 即ち、 心筋細胞以外の細胞を含まず、 また他種由来の成分を含まないように精製した生体由来の心筋細胞を使用して、移植 後の生着率を高めることができるかどうかを検討した。
具体的には、 精製した生体由来の心筋細胞は、 10%血清を含有する培養液中にも関 わらず 24時間経過後も細胞塊を形成できなかった。 この結果は、 未精製で行われた 既知の生体心筋細胞の細胞塊形成が、非心筋細胞の補助的な作用に強く依存していた ことを強く示唆した。 更に、 精製された生体由来の心筋細胞が無血清条件でどのよう な振る舞いを示すかを実験的に検討したところ、 細胞塊の構築はもとより、 細胞その ものが死滅してしまった。 これらの事実から、 「生体心臓由来の未精製心筋細胞塊の 構築」 は実現できない技術であり、 まして無血清状況においての精製された生体心臓 由来心筋細胞の振る舞いを予想することすらできないことが判明した。
次に、 既知の心筋細胞凝集塊の作製方法では、 使用する細胞が、 新生仔や胎仔の心 臓由来細胞であり、血清を含む培地を用いて培養されていた。これは、一般に血清は、 細胞種によらず保護的な効果が強いという共通認識によるものである。 しかし、 前述 したように、 例えば人体に対する治療を行う場合、 他種動物由来物 （例えば血清） を 用いることは、 避ける必要がある。 そこで、 無血清培地にして、 血清の代わりに血清 代替物を含む様々な添加物を用いて、生体由来の心筋細胞における凝集能力を検討し た。 しかし、 生体由来心筋細胞は、 いずれの無血清条件でも、 十分に細胞塊を構築で きず、 細胞の生存率も低かった。
また、 既知の方法では、 生体由来の心筋細胞を塊として培養することで、 心筋細胞 の生存が長期間維持されるという報告があることから、精製した生体由来の心筋細胞 を無血清条件で細胞塊にする試みを行った。 ところが、 培養 5日後においても、 細胞 塊を形成することができなかった。 今回得られた実験結果により、 無血清条件におい ては、精製した生体由来の心筋細胞は細胞塊を構築できないという新たな知見が得ら れた。
そこで、 本発明者らは、 心筋細胞を得るための供給源を変更すれば、 この技術的困 難を打開できるのではないかと考えた。 そして、 様々な供給源について同様の検討を 行った結果、 精製された胚性幹細胞由来の心筋細胞では、 無血清条件においても僅か
12時間で速やかに互いに結合し、効果的に立体的な心筋細胞塊を構築できること、そ してその時点で既に同期した収縮を開始していたことを明らかにした。 このことは、胚性幹細胞由来の心筋細胞が精製された同細胞間における細胞接着を 効率的に構築できることを示しており、そして精製された胚性幹細胞由来の心筋細胞 が無血清条件下において高い凝集能力を有することを示すものである。 この知見は、 複数の種についてそれぞれの種由来の胚性幹細胞を用いたそれぞれの場合にも再現 されたことから、 このような特徴は、 ヒト由来も含め胚性幹細胞から得られる心筋細 胞に共通する性質であると考えられる。 この無血清条件下における胚性幹細胞特異的 な性質に基づき、 本発明者らは、 初めて無血清条件下で、 精製された心筋細胞を細胞 塊にすることができた。
更に、 既知の報告からは、 移植後の生着能力が低い胚性幹細胞由来の心筋細胞は、 再凝集能力も低いと予測されたが (Transpl antat i on 70 : 1310-1317, 2000)、 一方で、 精製された胚性幹細胞由来の心筋細胞を凝集させること自体が困難であると予測さ れ、 当該細胞を凝集させることができないと考えられていた。 それにも関わらず、 本 発明者らは、 そのような予測に反して、 精製された胚性幹細胞由来の心筋細胞が他の 細胞の介助なしに細胞塊を構築でき、 しかも、 これを移植に用いることによって生着 率の飛躍的向上がもたらされることを初めて示した。 即ち、 胚性幹細胞由来の心筋細 胞が単細胞化して精製された上、 更に無血清条件下でも細胞塊を構築できるという、 生体心臓由来の心筋細胞とは全く異なる特性を有することを見出すことに成功した。 更に、 本発明者らは、 より移植に適した胚性幹細胞由来心筋細胞塊の作製方法を見 出すべく、胚性幹細胞由来の心筋細胞が無血清条件下において更に効率的に細胞塊を 構築できる条件として培地への添加物の検討を行った。 その結果、 添加物としてイン スリン、 トランスフェリン、 セレニウム （ITS) の添加を行ったところ、 細胞塊自律 拍動が ITS未添加の細胞塊に対して強いことが再現よく観察された。 即ち、 ITS (特 にインスリン） を添加することは、 胚性幹細胞由来の精製された心筋細胞にとって望 ましいことであることが示された。 なお、 ITSの中で最も重要な因子はインスリンで あり、 トランスフェリンとセレニウムは補助的な役割を担う。
次に、 無血清である基礎培地 （以下、 基礎培地） に ITSを加えたものに、 塩基性線 維芽細胞増殖因子 （bFGF) 及び/又はインスリン様成長因子 1 (IGF1) の添加を行つ たところ、 bFGF単独添加時に、細胞塊形成後 5日目の細胞塊の直径が有意に増大して おり、 当該細胞が保護されていることが分かった。 これは、 血清を含有する培養条件 では見られず、 bFGFを単独で添加する無血清条件に特有の細胞保護'増殖効果であつ た。 血清添加条件下にて平面培養した実験条件下で培養する心筋細胞に対する bFGF の作用として、細胞保護、細胞増殖促進などが存在することが知られていたが（J Mo l Ce l l Card i o l . 2007 Jan ; 42 (l) : 222-33, Card i ovasc Res. 2004 ; 64 : 516-25. ) , 無血 清条件下で心筋細胞の長期間の増殖や保護が生じることは全く知られていなかった。 また、 この効果は、 10%血清添加培地を用いて細胞塊を形成させた場合の効果より も大きいが、 bFGFを添加しても平面培養により細胞塊を形成させない場合は、 10%血 清添加培地を用いて細胞塊を形成させた場合の効果よりも小さかった。 この 2つの実 験結果から、 bFGFが 10%血清添加培地を用いて細胞塊を形成させた場合の効果を上 回る細胞保護 ·増殖促進効果を得るためには、 細胞塊の構築が必須であると考えられ た。
そこで、 本発明者らは、 上記効果の発揮において、 細胞塊の構築が必須要件である ことを確認するために、精製されたマウス胚性幹細胞由来の心筋細胞を平面接着培養 し、 当該培地に bFGFを添加して、 その影響を解析した。
細胞塊が形成されない平面培養において、 基礎培地に ITSを添加した環境では、 殆 ど精製された心筋細胞は生存できなかった。 しかし、 bFGFを添加することによって、 より多くの細胞が生存接着した状況が見られた。この作用は 10%血清添加培地を用い て細胞塊を形成させた場合の効果よりも小さいものであった。
精製された胚性幹細胞由来の心筋細胞塊を構築した場合に、 無血清 + ITS I bFGF の作用と 10%血清の作用を長期培養後に比較したところ、 10%血清含有培地では、細 胞塊の大きさが有意に縮小していたのに対し、 無血清 + ITS + bFGF群では、 有意に 増大していた。 このことは、 本発明者らが見出した bFGFの作用は、 精製 ·無血清' 細胞塊の全ての要素との相乗効果であることが分かつた。
この結果から即ち、 本発明は、 無血清培地に ITS及び/又は bFGFを添加すること によって、 心筋細胞塊の状態が長期間維持されることを見出した。 この知見により、 心筋細胞の生存率は従来法の平面培養法での 60〜70%に比べて、 90 %以上と飛躍的に 向上させることができるようになった。 以上のことから、 本発明者らは、 従来技術では達成できなかった無血清条件かつ高 度に精製された条件での心筋細胞塊の構築を、胚性幹細胞由来の心筋細胞を用いるこ とによって達成し、 更に ITS及び bFGFを添加する条件で、 最も効率的に心筋細胞塊 を構築できることを見出した。
即ち、 本発明に係る一つの態様は、 胚性幹細胞から分化、 誘導された心筋細胞を含 む凝集された細胞塊を分散させて単細胞化することにより得られる精製された胚性 幹細胞由来の心筋細胞を、 無血清条件下の培地を用いて培養して、 当該細胞を再凝集 させることを特徴とする、胚性幹細胞由来心筋細胞の細胞塊を作製する方法も提供す る。 上記培養に用いる培地には、 ITSのうち少なくともインスリンが添加されている ものが望ましく、更に bFGFが添加されているものが望ましい。また、上記方法では、 単細胞化した細胞塊を既知の方法のように単一の空間で培養せず、 10, 000個までの細 胞群に分割して独立した空間において培養を行うことができる。
増殖性の非心筋細胞が混入した場合、 凝集塊の大きさが極端に大きくなり、 形態も 変形する。 更にこの指標に加えて、 ミトコンドリアに蓄積する蛍光色素を用いて染色 を行うことによって、増殖性の細胞を色素が蓄積しにくい細胞として同定することが できる。 このような非心筋細胞が混入した細胞塊は、 移植治療などへの使用を却下す ることによって、僅かに混入した増殖性非心筋細胞を移植細胞から除外することが可 能である。
また、バラバラに分散（単細胞化）された胚性幹細胞由来の精製された心筋細胞は、 そのまま個体 （生体） の心臓組織に移植しても生着できないことが、 これまでに報告 されており、 本発明者らも同様の結果を得た。 この問題は、 従来技術においては、 精 製された胚性幹細胞由来の心筋細胞に補助細胞を混合することで解決されたことか ら、生体内での非心筋細胞の保護作用が心筋細胞の生存にとって必須であることが明 確に示された。 しかしながら、 非心筋細胞の混入は、 移植後の患者の生命に関わる重 大な予期できない副作用を引き起こす可能性があるため、 本発明者らは、 補助細胞を 混合させることなく、 精製された心筋細胞をそのまま高純度で個体 （生体） 内に移植 することができれば、 より安全性と治療効果が高まると考えた。
そこで、上記方法により得られる精製された胚性幹細胞由来の心筋細胞塊の利用を 着想し、 当該細胞塊を個体 （生体） の心臓組織に移植することにより、 移植後の生着 性を飛躍的に向上させることができることを見出した。換言すると、 細胞塊を分散さ せて単細胞化することにより得られる精製された胚性幹細胞由来の心筋細胞を、無血 清条件下の培地を用いて培養し、 当該細胞を再凝集させて細胞塊を形成させることに より、精製された胚性幹細胞由来心筋細胞の移植後の生着性を飛躍的に向上させるこ とができることを見出した。
即ち、 本発明に係る別の態様は、 単細胞化して精製された胚性幹細胞由来の心筋細 胞を再凝集化して得られた細胞塊を、 個体 （生体） の心臓組織 （特に患部） に移植し て生着させることを特徴とする心疾患の治療方法に関する。本願発明において「生着」 とは、 移植された臓器内に長期間生存し、 臓器内に接着して留まることを意味する。 更に、 上述したように既知の方法では、 新生仔心筋細胞を単層のシートを 3枚まで 重ね合わせることができることが知られていたが、それ以上の厚さを持つ心筋細胞シ ートは作製できなかった。
この課題を解決するため、上記方法により得られる精製された胚性幹細胞由来の心 筋細胞塊の利用を着想した。 上記方法により当該細胞塊を構築し、 得られた細胞塊を 回収して、壁面によって仕切られた細胞非接着性容器の表面に細胞塊同士が接触し続 ける程度に隙間なく並べて播種し、 浮遊培養を行った。 その結果、 当該細胞塊は、 時 間経過に伴って細胞塊同士が接合して、 50〜300 mの厚みをもったシート状の細胞塊 が得られ、 従来技術の限界を超える厚みを有する所謂 「細胞シート」 を生体外で作製 することができることを見出した。 これにより、 実際の応用形態においては、 任意の 大きさを有する精製された胚性幹細胞由来の心筋細胞塊を任意の数用いて、任意の大 きさの細胞シートを作製することができることが明らかになった。
即ち、 本発明に係る更なる態様は、 精製された胚性幹細胞由来の心筋細胞塊を、 同 一平面状に密に並べて浮遊培養を行ない、細胞塊同士が接合して、 50〜300 11の間で 任意の厚みを有するまで当該培養を行うことを特徴とするシート状細胞塊（細胞シー ト） の作製方法に関する。
本発明においては、上述したような特徴を有する精製された胚性幹細胞由来の心筋 細胞の細胞塊を、 心臓組織に移植して生着させることができることを明らかにした。 このような細胞塊は、人体を含む動物の身体に移植することができる移植用の医療機 器として利用することができる。
即ち、 本発明のさらなる態様においては、 胚性幹細胞から分化、 誘導された心筋細 胞を含む凝集された細胞塊を分散させて単細胞化することにより精製された胚性幹 細胞由来の心筋細胞を得、 その心筋細胞を無血清条件下の培地を用いて培養し、 そし て当該細胞を凝集させることにより作製された、胚性幹細胞由来心筋細胞の細胞塊を 含む、 医療機器を提供する。 このような医療機器は、 個体の心臓組織に移植して生着 させることを目的としており、心臓移植を必要とする患者に対して使用することがで きるという顕著な効果を奏するものである。
以上のように、 本発明者らは、 バラバラに分散 （単細胞化） して完全に精製された 胚性幹細胞由来の心筋細胞の生存率を大幅に改善するための培養条件を鋭意検討し た結果、 動物由来血清を使用しない条件 （即ち、 無血清条件） 下の培地、 好ましくは インスリンを含有する当該培地、 更に好ましくはトランスフェリン、 セレニウム、 及 び Z又は塩基性線維芽細胞増殖因子を更に含有する当該培地を用いて培養すること により、 当該細胞が凝集して細胞塊を形成するという特性を新たに見出した。 また、 当該細胞を個体 （生体） の心臓組織に移植したところ、 当該組織への生着率が飛躍的 に高まるという知見を新たに見出した。 更に、 当該細胞を用いると公知技術に比較し て予想以上の厚みを有するシート状の細胞塊、並びにそのような細胞塊を含む医療機 器を得られるという知見を新たに見出し、 本発明を完成するに至った。
このようにして胚性幹細胞を培養することにより得られた知見は、胚性幹細胞の代 わりに、 他の多能性を有する幹細胞を用いても同様の結果となる。 即ち、 バラバラに 分散 （単細胞化） して完全に精製された多能性幹細胞を、 動物由来血清を使用しない 条件 （即ち、 無血清条件） 下の培地、 好ましくはインスリンを含有する当該培地、 更 に好ましくはトランスフェリン、 セレニウム、 及び Z又は塩基性線維芽細胞増殖因子 を更に含有する当該培地を用いて培養することにより、 当該細胞が凝集して細胞塊を 形成することができ、 そして心筋細胞の生存率を大幅に改善することができる。 この ような多能性幹細胞としては、胚性幹細胞の他に、哺乳動物の成体臓器や組織の細胞、 骨髄細胞、 血液細胞、 更には胚ゃ胎児の細胞等に由来する、 胚性幹細胞に類似した形 質を有する全ての多能性幹細胞を用いることができ、 例えば、 胚性生殖幹細胞
(Embryonic Germ cells： EG細胞）、 生殖幹細胞 (Germline Stem cells： GS細胞）、 及び誘導多能性幹細胞 (induced pluripotent stem cells： iPS細胞) 等が挙げられ る。
即ち、 本発明は以下の事項に関する。
(1) 胚性幹細胞、 胚性生殖幹細胞、 生殖幹細胞や誘導多能性幹細胞などの多能性 幹細胞から分化、誘導された心筋細胞を含む凝集された細胞塊を分散させて単細胞化 することにより得られる精製された多能性幹細胞由来の心筋細胞を、無血清条件下の 培地を用いて培養し、 当該細胞を凝集させることを特徴とする、 多能性幹細胞由来心 筋細胞の細胞塊を作製する方法；
(2) 培地がインスリンを含有する培地である上記 （1) 記載の方法；
(3)培地が、 トランスフェリン、セレニウム、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF)、 上皮細胞増殖因子 （EGF)、 血小板由来成長因子- BB (PDGF-BB) 及びエンドセリン - 1
(ET-1)からなる物質群から選択される少なくとも 1つの物質を含有する培地である 上記 （1) 又は （2) 記載の方法；
(4) 培地における含有量が、 インスリン 0.1〜10 mg/L、 トランスフェリン 0· 1〜 10 g/L、セレニウム 0. l〜10 g/L、塩基性線維芽細胞増殖因子 1 ng/ml〜100 ng/mK 上皮細胞増殖因子 1 ng/ml〜1000 ng/mU 血小板由来成長因子 1 ng/ml〜1000 ng/mK エンドセリン- 1 (ET-1) 1Χ10-8〜1Χ1(Γ6 Μである上記 （1) 〜 （3) のいずれか 1 項 に記載の方法；
(5) 単細胞化して精製された多能性幹細胞由来の心筋細胞を凝集させて得られた 細胞塊を、 個体の心臓組織に移植して生着させることを特徴とする心疾患の治療方 法；
(6) 心筋細胞塊が上記 （1) 〜 （4) のいずれか 1 項の方法により得られた心筋細 胞塊である上記 （5) 記載の方法；
(7) 移植が心筋細胞塊を心臓組織内に注入することからなる上記 （5) 又は （6) 記載の方法；
(8)移植がシ一卜状細胞塊を心臓組織上に移植することからなる上記（5)又は（6) 記載の方法；
(9) 精製された多能性幹細胞由来の心筋細胞塊を、 壁面によって仕切られた細胞 非接着性容器の表面に細胞塊同士が接触し続ける程度に隙間なく並べて播種し、浮遊 培養を行ない、 細胞塊同士が接合して 50〜300 mの間で任意の厚みを有するまで当 該培養を行うことを特徴とするシート状細胞塊の作製方法；
(10) 心筋細胞塊が上記 （1) 〜 （4) のいずれか 1項の方法により得られた心筋細 胞塊である上記 （9) 記載の方法；
(1 1) 多能性幹細胞から分化、 誘導された心筋細胞を含む凝集された細胞塊を分散 させて単細胞化することにより精製された多能性幹細胞由来の心筋細胞を得、その心 筋細胞を無血清条件下の培地を用いて培養し、そして当該細胞を凝集させることによ り作製された、 多能性幹細胞由来心筋細胞の細胞塊を含む、 個体の心臓組織に移植し て生着させるための医療機器；
(12) 移植が心筋細胞塊を心臓組織内に注入することからなる、 （1 1 ) 記載の医療 機器。
(13) 移植がシ一卜状細胞塊を心臓組織上に移植することからなる、 （1 1 ) 記載の 医療機器。
発明の効果
本発明により、単細胞化して精製された多能性幹細胞由来の心筋細胞が無血清条件 下で培養した場合に、凝集する能力を有する特性が見出された。本発明の方法により、 細胞塊を構築することにより、 当該心筋細胞の生存率又は増殖能を高く維持しながら 長期間培養する方法が得られた。 また、 当該細胞を個体 （生体） の心臓組織に移植す ると、 当該組織への生着率が飛躍的に高まることが見出され、 当該細胞を他の細胞と 混在することなく心臓組織内に長期間生着させることができた。 これにより、 心臓の 細胞治療において有望な治療方法、及び心筋細胞の細胞塊を含む医療機器の実用性を 可能にすることができた。
図面の簡単な説明
[図 1 ] 図 1は、 Enhanced Green F l uorescen t Pro t e i n (EGFP) 発現マウス胚性 幹細胞に由来する、 精製した心筋細胞を用いて心筋細胞塊を構築する方法及び、 マウ ス胚性幹細胞由来精製心筋細胞 10000細胞から 313細胞を用いた時の細胞塊を示す。
[図 2 ] 図 2は、 分注後 24時間後 （図 2A) 又は 48時間後 （図 2B) におけるマ —モセット胚性幹細胞由来精製心筋細胞を用いた心筋細胞塊の構築を示す。
[図 3 ] 図 3は、 マウス胚性幹細胞由来精製心筋細胞を用い、 接着基質による細 胞生存率の比較に基づき、 平面培養における最適な接着基質の同定 （図 3A) 及び、 細 胞塊と平面培養の心筋細胞生存率の比較 （図 3B及び図 3C) を示す。
[図 4 ] 図 4は、 マウス胚性幹細胞由来精製心筋細胞を用いた細胞塊の形成にお いて、 混在する胚性幹細胞を見出す方法 （1) を示す。 赤枠で示した細胞塊には細胞 増殖による巨大な細胞塊が見出された。
[図 5 ] 図 5は、 マウス胚性幹細胞由来精製心筋細胞を用いた細胞塊の形成にお いて、 混在する胚性幹細胞を見出す方法 （2) を示す。 TMRM (ミトコンドリアを特異 的に染色する試薬）由来の蛍光シグナルが弱いことを利用した混入非心筋増殖細胞の 検出を示し、 正常心筋細胞（図 5A) とは対照的に、 異常心筋細胞塊では非心筋増殖細 胞が混入していることが明らかになった （図 5B)。
[図 6 ] 図 6Aは、 細胞非接着性丸底 96ゥエルディッシュで培養した場合に、 新 生仔ラット心臓由来精製心筋細胞では、 24時間後においても細胞塊を構築できなかつ たことを示し、 図 6Bは、 新生仔ラット心臓由来精製心筋細胞は、 無血清条件下にお いて、 5日後細胞塊を形成せず、 死滅したことを示す。
[図 7 ] 図 7は、 ITS及び bFGFなどの種々の添加物を添加した無血清培地中で、 細胞非接着性丸底 96ゥエルディッシュで培養した場合に、 それらの添加物が細胞塊 の直径増加に対してどのような作用を有するかを明らかにすることにより、それらの 添加物による細胞保護作用及び増殖促進活性が検出されたことを示す。
[図 8 ] 図 8は、 フイブロネクチンでコーティングした細胞培養用ディッシュ上 でマウス胚性幹細胞由来精製心筋細胞を平面接着培養した結果、 無血清 ITS、 ITS + bFGF群で有意に細胞生存率が低いことを示す。
[図 9 ] 図 9は、 再凝集法を適用せず、 分散細胞のまま心臓に移植した場合のマ ウス胚性幹細胞由来の単細胞化した精製心筋細胞の移植後の組織内細胞生存率を計 測した結果を示す。 [図 1 0 ] 図 10は、 マウス胚性幹細胞由来精製心筋細胞を再凝集法により細胞 塊に形成した後に、 赤色色素 (Mi tot racker Red)を用いてラベルし、 心臓に移植した 場合、 心筋細胞は効率的に生存したことを示す。
[図 1 1 ] 図 1 1 (A) 及び （B) は、 再凝集後に移植した EGFP発現マウス胚性幹 細胞由来精製心筋細胞の細胞塊の、 心臓組織内での細胞数を計測し、 その結果として 細胞の組織内生存率の解析を行った結果を示す。 図 1 1 (0 及び（D) は、 マウス心筋 細胞塊が移植心臓内で長期間生着し、そして時間の経過と共に成熟することが出来る ことを示す。
[図 1 2 ] 図 12は、 無血清 （図 12A) 又は、 無血清に KSR (図 12B) 又は ITS (図 120 を添加した条件におけるマ一モセット胚性幹細胞由来精製心筋細胞塊の作製を 示す。
[図 1 3 ] 図 13は、 マ一モセット胚性幹細胞由来精製心筋細胞塊を用いた、 任 意の厚みを有する任意の大きさの心筋細胞シ一卜の作製を示す。
[図 1 4 ] 図 14は、 無血清条件において、 精製ヒト胚性幹細胞由来心筋細胞塊 が作製できることを示す。
[図 1 5 ] 図 15は、 移植したヒト胚性幹細胞由来心筋細胞が、 免疫不全マウス 心臓組織内において 2週間生存できることを示す。
[図 1 6 ] 図 16は、 移植細胞のトレースに用いた赤色色素を使用して、 移植し たヒト胚性幹細胞由来心筋細胞が、免疫不全マウス心臓組織内において 5週間生存で きることを示す。
[図 1 7 ] 図 17は、移植細胞のトレースに用いた色素 (Mi to t racker Red :赤色）、 Nkx2. 5 (水色） 及び抗サルコメァァクチニン抗体 （緑色） を使用して、 移植したヒト 胚性幹細胞由来心筋細胞が、免疫不全マウス心臓組織内において 5週間生存できるこ とを示す。
[図 1 8 ] 図 18は、 Nkx2. 5 (水色） 及び抗ヒト抗体 （緑色） を使用して、 移植 したヒト胚性幹細胞由来心筋細胞が、免疫不全マウス心臓組織内において 5週間生存 できることを示す。
[図 1 9 ] 図 19は、 無血清又は、 無血清に ITS又は KSRを添加した条件におい て、 マウス iPS細胞由来精製心筋細胞塊を作製した結果を示す。
[図 20 ] 図 20は、 ヒト ES細胞由来精製心筋細胞の、 無血清条件における bFGF 及び他の増殖因子を添加した場合の細胞保護及び増殖活性化作用において、 bFGFが優 位性を有することを示す。
[図 2 1] 図 21 は、 マウス心筋細胞塊が移植心臓内で長期生着する際の成熟機構 に関して、 宿主心臓内における bFGF、 EGF、 PDGF-BB、 ET-1 についての遺伝子発現を 示す。
発明を実施するための形態
本発明の実施において、分子生物学や組換え DNA技術等の遺伝子工学の方法及び一 般的な細胞生物学の方法及び従来技術について、 実施者は、 特に示されなければ、 当 該分野の標準的な書籍を参照し得る。 このような書籍としては、 例えば、 「Molecular Cloning： A Laboratory Manual第 3版」 (Sambrook & Russel 1、 Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)；「Current Protocols in Molecular biologyj (Ausubel et aし編、 John Wiley & Sons、 1987) ；「Methods in Enzymology シリーズ」 (Academic Press) ； 「PCR Protocols: Methods in Molecular Biologyj (Bartlett & Striling 編、 Humana Press, 2003)；「 Animal Cell Culture: A Practical Approach第 3版」 (Masters編、 Oxford Universi ty Press, 2000)；「Ant ibodies : A Laboratory ManualJ (Harlow et al. & Lane編、 Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1987) 等が挙 げられる。 また、 本明細書において参照される細胞培養、 細胞生物学実験のための試 薬及びキット類は Sigma 社や Aldrich 社、 Invi trogen/GIBCO 社、 Clontech 社、 Strat agene社等の市販業者から入手可能である。
(1) 多能性幹細胞
多能性幹細胞を用いた細胞培養、及び発生 ·細胞生物学実験の一般的方法について、 実施者は、当該分野の標準的な書籍を参照し得る。これらには、 「Guide to Techniques in Mouse Development (Wasserman et al.編、 Academic Press, 1993)；「Embryonic
Stem Cell Differentiation in vitroj (M.V. Wiles、 Meth. Enzymol. 225:900, 1993)；
「Manipulating the Mouse Embryo： A laboratory mamialj (Hogan et al.編、 Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994)；「Embryonic Stem Cel ls」 (Turksen編、 Humana Press, 2002) が含まれる。 本明細書において参照される細胞培養、 発生 ·細胞生物 学実験のための試薬及びキット類は Invitrogen/GIBCO社や Sigma社等の市販業者か ら入手可能である。
マウスゃヒ卜の多能性幹細胞の作製、 継代、 保存法については、 すでに標準的なプ ロトコールが確立されており、 実施者は、 前項で挙げた参考書籍に加えて、 複数の参 考文献等を参照することにより、 これらの多能性幹細胞を使用し得る。 当該文献とし ては、 以下の文献等が挙げられる： Matsui et aし， Cell 70:841, 1992； Thomson et al.,米国特許第 5, 843， 780号； Thomson et al.， Science 282： 114, 1998； Shamblott et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998； Shamblott et al. , 米国特 許第6，090，622号； 1^111)^(^【 et al., Nat. Biotech. 18:399， 2000；国際公開番号 第 00/27995号。 また、 その他の動物種に関しても、 例えばサル （Thomson et al.，米 国特許第 5,843,780 号； Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 7844， 1996)やラット (Iannaccone et al., Dev. Biol. 163:288, 1994； Loring et al.，国際公開番号第 99/27076号）、 ニヮトリ (Pain et al., Development 122:2339, 1996；米国特許第 5, 340， 740号；米国特許第 5， 656, 479号）、ブ夕 (Wheeler et al., Reprod. Fertil. Dev. 6:563, 1994； Shim et al., Biol. Reprod. 57:1089, 1997) 等に関して胚性幹細胞 や胚性幹細胞様細胞等の多能性幹細胞の樹立方法が知られており、各記載の方法に従 つて、 本発明に用いることができる多能性幹細胞を作製又は使用することができる。 本発明の方法は、 いずれの哺乳動物由来の多能性幹細胞に対しても適用することが できる。 例えば、 マウス、 ゥシ、 ャギ、 ィヌ、 ネコ、 マーモセット、 ァカゲザル、 ヒ ト由来の多能性幹細胞に対して使用することができるが、 これらの動物種由来の多能 性幹細胞だけには限定されない。例えば、本発明に用いられる多能性幹細胞としては、 既に培養細胞として広く使用されているマウス、 サル、 ヒト等の哺乳動物由来胚性幹 細胞 (ES細胞）を挙げることができる。
マウス由来胚性幹細胞の具体例としては、 EB3細胞、 E14細胞、 D3細胞、 CCE細胞、 R1細胞、 129SV細胞、 J1細胞等が挙げられる。本願発明に係るマウス由来胚性幹細胞 は、 例えば American Type Culture Collection (ATCC) や Chemicon 社、 Cell & Molecular Technologies社等から入手することができる。
サル由来胚性幹細胞としては、 ァカゲザル （rhesus monkey： Macaca mulatta)
(Thomson et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995； 92:7844) や力二クイザル
(cynomolgus monkey： Macaca fascicular is) (Suemori et al. , Dev. Dyn. 2001； 222: 273-279)、 コモンマーモセット (common marmoset： Callithrix jacchus) (Sasaki et al., Stem Cells. 2005; 23: 1304-1313) からの樹立が報告されており、 使用可能で ある。 例えば、 マーモセット胚性幹細胞は、 財団法人 ·実験動物中央研究所からも入 手することができる。
ヒト由来胚性幹細胞は、 現在、 全世界で数 10種以上が樹立されており、 例えば、 米国 ·国立衛生研究所のリスト (http://stemcells.nih.gov /registry/ index, asp) には多数の株が登録されて使用可能であるとともに、 Cellartis 社や ES Cell
Internat ional社、 Wisconsin Alumni Research Foundat ion等から 入することも可 能である。 また、 日本の場合、 国立大学法人 ·京都大学再生医科学研究所附属幹細胞 医学研究セン夕一からも入手することができる （Suemori et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. , 2006; 345: 926-932)。
更に、 ゥシ (Mitalipova et al., Cloning 2001; 3: 59-67,), トリ（Pet i t te et al.，
Mech. Dev. 2004; 121: 1159- 1168)、ゼブラフィッシュ (Fishman, M. ， Science 2001;
294: 1290-1291) についても胚性幹細胞の樹立が報告されている。
一般に胚性幹細胞は初期胚を培養することにより樹立されるが、体細胞の核を核移 植した初期胚からも胚性幹細胞を作製することが可能である （Munsie et al.， Curr.
Biol. 10:989, 2000 ; Wakayama et al., Science 292:740, 2001 ； Hwang et al. , Science
303 ： 1669, 2004)。 また、 単為発生胚を胚盤胞期と同等の段階まで発生させ、 そこ から胚性幹細胞を作製する試み（米国特許公開第 02/168763号； Vrana Ket al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 100:11911-6) や、 胚性幹細胞と体細胞を融合させることによ り、 体細胞核の遺伝情報を有した胚性幹細胞を作る方法も報告されている （国際公開 番号第 00/49137号； Tada et al., Curr. Biol. 11:1553, 2001)。 本発明で使用する ことができる胚性幹細胞には、 この様な方法により作製された胚性幹細胞又は胚性幹 細胞の染色体上の遺伝子を遺伝子工学的手法により改変したものも含まれる。 また、本発明に係る方法に使用できる多能性幹細胞には、胚性幹細胞のみに限らず、 哺乳動物の成体臓器や組織の細胞、 骨髄細胞、 血液細胞、 更には胚ゃ胎児の細胞等に 由来する、 胚性幹細胞に類似した形質を有する全ての多能性幹細胞が含まれる。 この 場合、 胚性幹細胞と類似の形質とは、 胚性幹細胞に特異的な表面 （抗原） マーカーの 存在や胚性幹細胞特異的な遺伝子の発現、 又はテラトーマ （teratoma) 形成能ゃキメ ラマウス形成能といった、胚性幹細胞に特異的な細胞生物学的性質をもって定義する ことができる。その具体例としては、始原生殖細胞より作製される胚性生殖幹細胞（EG 細胞)、精巣の生殖細胞より作製される生殖幹細胞（GS細胞)、及び線維芽細胞等の体 細胞から特殊な遺伝子操作により作製される誘導多能性幹細胞 （iPS細胞） 等が挙げ られる。 誘導多能性幹細胞としては、 体細胞に特定の因子を導入することにより作製 することができる誘導多能性幹細胞が挙げられ、 当該細胞は京都大学山中伸弥教授の グループに係る文献 (K. Takahashi, et al. , " Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors" Cell 2007 131: 861-872) や、 Wisconsin 大学の Thomson のグループに係る文献 (J. Yu, et al. , "Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic Cells" Science 2007 318:1917-1920) に記載された方法に従って作製することができる。 具体的には、 任 意の体細胞に対して 0ct3/4、 Sox2、 c- Myc、 Klf4、 Nanog、 LIN28の内、 少なくとも一 つ以上の遺伝子を導入すし、多能性幹細胞に特異的な遺伝子やタンパク質の発現を検 出、 これらを選別することによって作製することができる。 この様にして作製した誘 導多能性幹細胞は、 胚性幹細胞と同様に、 増殖不活性化したマウス線維芽細胞やこれ を代替出来る細胞存在下で、 塩基性線維芽細胞増殖因子と共に培養することができ、 胚性幹細胞と同様に多能性幹細胞として利用することができる。
この誘導多能性幹細胞は、種々の組織への分化の特徴や細胞内での遺伝子発現の特 徴に関して、胚性幹細胞と同様の性状を有していることがこれまでに明らかになって おり （Park I.H. et al., Nature, 2008, 451, 14卜 147)、 胚性幹細胞から種々の組 織への分化誘導条件を、 誘導多能性幹細胞に対してそのまま適用することができる (高橋及び山中、 細胞工学， Vol.27、 No.3, 252-253, 2008)。 (2) 多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法
以下においては、多能性幹細胞として胚性幹細胞 (ES細胞）を例にとって記載する。 心筋細胞への分化能を有する胚性幹細胞に対して、適切な心筋細胞分化誘導処理を行 うと、 心筋細胞への分化が生じる。 即ち、 例えばマウス胚性幹細胞を、 白血病抑制因 子 （LIF) を培養液中から取り除いて浮遊培養させて、 細胞塊 （胚様体） を形成させ るハンギングドロップ法により、胚性幹細胞から心筋細胞への分化誘導を行うことが できる。 又はマ一モセット胚性幹細胞やヒト胚性幹細胞を使用して、 同様に胚性幹細 胞から心筋細胞への分化誘導を行うこともできる。胚性幹細胞から心筋細胞を分化誘 導する方法としては、公知の方法を用いることができ、特に特定されるものではない。 例えば、 BMP シグナル伝達を抑制する物質の存在下で分化誘導を行う方法 (WO2005/033298) や、 カノ二カル Wnt シグナル経路の活性化を促す物質の存在下で 分化誘導を行う方法 (PCT/JP2007/59242, WO2007/126077として公開) を用いて胚性 幹細胞から心筋細胞を分化誘導することができる。 (3) 心筋細胞の精製
上記 （2) の方法により胚性幹細胞から分化誘導された心筋細胞を精製 （選択） す る方法としては、酵素の作用により心筋細胞をバラバラに分散（単細胞化）して、個々 の心筋細胞として精製することができる方法であれば、特に特定されるものではない。 例えば、 心筋細胞内のミトコンドリアを指標として選択する方法 （WO2006/022377)、 低栄養条件で生存することができる細胞を選抜する方法 （PCT/JP2007/051563、 W02007/08887 として公開）を用いて心筋細胞のみを精製（選択)'することができる。
(4) 心筋細胞塊の作製
上記 （3) の方法により単細胞化して得られる精製された胚性幹細胞由来の心筋細 胞を無血清条件下で培養することにより、 当該細胞を凝集させて、 胚性幹細胞由来の 心筋細胞塊を作製することができる。 好ましくは、 当該培養に用いる培地にインスリ ン（0. l〜10 mg /ひ、 トランスフェリン（0. l〜10 g/い、セレニウム（0. l〜10 x g/L)、 塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF； 1 ng/ml〜100 ng/ml)、 上皮細胞増殖因子（1 ng/ml 〜1000 ng/ml)、 血小板由来成長因子 （1 ng/ml〜1000 ng/ml)、 およびエンドセリン -1 (ET-1) (1X10_8〜1X10— 6 M) からなる物質群から選択される少なくとも 1つの物 質が含まれていることが望ましい。
更に、上記の方法により得られる精製された胚性幹細胞由来の心筋細胞塊に僅かに 混在する増殖性細胞を検出して、 移植用細胞から除外することによって、 さらなる安 全性を確保することができる。 現在、 心筋細胞を精製する方法としては、 予め幹細胞 のゲノムに何らかのマ一力一遺伝子の導入を行う方法が知られている （FASEB J. 2000; 14: 2540-2548)。 しかし、 これら全ての方法では 99%純度は提供できても 100 ±0%の純度は保証できない。 例えば、 ヒト心筋梗塞を治療するために 10の 11乗の 心筋細胞が必要であるとするならば、 純度 99%では、 10の 9乗の非心筋細胞が混入 することを意味する。 このように、 既知の技術水準からすれば完全に近い精製と言え る方法であっても完全な心筋細胞の精製が可能となってはいないことから、更なる精 製方法との組み合わせや、 他の安全性を担保する方法の適用が必要とされる。
そこで、上記の方法に対して、あえて未分化胚性幹細胞を混入させてみた。すると、 増殖能力が心筋細胞に比べて高い未分化胚性幹細胞は、心筋細胞塊の外側に大きく別 の細胞塊を構築した。 この混入した胚性幹細胞が存在する心筋細胞塊は、 細胞塊全体 の大きさを判定することによって、 自動的に判別可能である。 更に、 当該細胞塊に対 してミトコンドリア指示薬 （例えば、 TMRM) を添加したところ、 ミトコンドリアを多 く持つ心筋細胞は明るく、 ミトコンドリアを多く持たない胚性幹細胞やその他の増殖 性の細胞は暗く見出すことができた。 この細胞塊内の蛍光強度の差異が大きい細胞塊 を除外することは、 Arrayscan (Cel lomics)、 Incel 11000 (GE/Amersham Biosciences, Cardiff, UK), Scanalyzer (Scanalyzer LemnaTec, Aachen Germany)及ひ ImageXpress MICRO" (Molecular Devices, Union City, USA), "Pathway HT" (Becton Dickinson Biosciences)、 "Scan'R" (Olympus Soft Imaging Solutions, Germany) などを禾用 して自動的に行い得る。 このようにして、 上記の方法は簡単に且つ自動的に未分化胚 性幹細胞の混入を識別することができる。 即ち、 無血清条件で培養して凝集した胚性 幹細胞由来の精製された心筋細胞塊に僅かに混在する増殖性細胞を、 当該細胞塊の大 きさや形状を指標として、更に当該指標に加えてミトコンドリア指示薬により染色を 行い、 蛍光強度と細胞塊内の蛍光強度分布などを指標として識別することができる。 このようにして、心筋細胞以外の細胞が混入した細胞塊を移植用細胞から除外するこ とによって、 安全性を高めることができる。 (5) 心筋細胞塊の心臓組織への移植及び生着
上記方法により凝集して得られた細胞塊、 即ち、 精製された胚性幹細胞由来の心筋 細胞塊を用いて、 心筋細胞のみを個体 （生体） の心臓組織に移植することができる。 例えば、注射により心筋細胞を心臓組織中に直接注入することもでき、この場合、 29、 30ゲージという細く低侵襲性の注射針による注入にも適用可能である。当該方法によ り移植された心筋細胞の生着率は、 既知の方法に比べて、 飛躍的に向上されている。 ここで 「生着」 とは、 移植された臓器内に長期間生存し、 臓器内に接着し留まること を意味する。
(6) 心筋細胞塊の移植用シート
既知の方法では新生仔心筋細胞を用いた場合でも、一度に 3細胞以上の厚さを持つ 心筋細胞シートは作製できない。 しかしながら、 本発明では、 精製された胚性幹細胞 由来の心筋細胞の細胞塊を構築した後、 得られた細胞塊を回収して、 壁面によって仕 切られた細胞非接着性容器の表面に細胞塊同士が接触し続ける程度に隙間なく並べ て播種して、 浮遊培養を行なうことにより、 当該浮遊培養において、 心筋細胞塊は、 時間経過に伴って細胞塊同士が接合して 50〜300 /zmの厚みをもったシート状の細胞 塊 （細胞シート） を形成することができる。 したがって、 任意の厚みを形成するまで 培養を行う。 これにより、 実際の応用形態においては、 任意の大きさを有する精製胚 性幹細胞由来心筋細胞塊を任意の数用いて、任意の大きさの細胞シートを構築するこ とができる。
実施例
本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明する。
実施例 1：マウス胚性幹細胞由来の心筋細胞の作製及び、 ミトコンドリァ法を用い た心筋細胞の精製 本実施例においては、 マウス胚性幹細胞から心筋細胞を作製すること、 そしてミト コンドリア指示薬を使用して心筋細胞を精製することができるかどうかについて検 討を行うことを目的として行った。
胚性幹細胞として、 EB3細胞株 (Niwa H, e t al .， Nat Gene t 2000 ; 24 : 372-376) を用いて、この細胞に EGFP発現ュニットをプラスミドを用いて EB3株に導入し、 EGFP を発現する細胞を取得'株化した。このようにして取得した EGFP発現-胚性幹細胞 (EB3 細胞） を、 最終濃度 10 %の非動化 （55で、 30分） ゥシ胎児血清を加えた α -ΜΕΜ培養 液 （シグマ社製） で、 胚性幹細胞数が 75個 /35 // Lの濃度となるように希釈した。 次 いで、 市販品である細胞培養用 384ゥエルプレート （Gre iner社製、 型式 788161 ;開 口部内径 3. 0 mm) に上記で調製したマウス胚性幹細胞を分注し、 以下の方法に従って 胚様体を作製した。
使用した 384ゥエルプレートにおける公称の溶液許容量は 1ゥエルあたり 25 しで あるが、 液面を盛り上げるために、 1ゥエルあたり を分注した。 これにより、 1 ゥエルあたり胚性幹細胞 75個を分注した。 この時、 開口部水平面までに要した溶液 量は 28 Lであり、 盛り上げに要した溶液量は 7 fi iであった。 分注には、 Theremo Labsys t ems社製のマルチチャンネルピペット （製品番号 4610070)、 又はバイオテツ ク株式会社製の分注機械 （型式 LD-01 ) を用いた。
胚性幹細胞を含む培養液を分注し、培養液が盛り上がった状態のプレートを裏返し て、 下側開口端に培養液の突出部分を作った。 この状態を保ったまま、 蓋をしてイン キュベー夕一内で 37で、 5 %C02条件下にて培養し、前記下端側開口端の突出部分中で 胚性幹細胞を増殖させた。 培養開始後 1 日後に、 突出した培養液面が下になつている 状態のプレートを清潔なピンセッ卜などで保持し、別の大型容器中に満たされた最終 濃度 10 %の非動化 （55 、 30分） ゥシ胎児血清を加えた MEM培養液 （シグマ社） の表面に培養液の突出部分を接触させ、細胞塊を自重で大型容器中の培養液内へ沈降 させることにより、 胚性幹細胞由来の細胞塊である胚様体を回収した。
回収した胚様体を更に 2日から 3日、 非細胞接着ディッシュ （Asah i Techno Gl ass : 滅菌シャーレ # SH90- 1 5、 又は栄研器材株式会社：滅菌角型シャーレ 2型） を用いて 胚様体を培養した。 この胚様体を遠沈管に回収し、溶液を無血清培地（a - MEM (S IGMA 社 #M0644に ITS溶液 （GIBCO #41400- 045) (ここで、 本発明において使用した ITS 溶液中には、 インスリンが l g/L、 トランスフェリンが 0. 55 g/L、 そして塩化セレニ ゥムが 0. 67 mg/L、それぞれ含まれる）を 1/100希釈で加えた）に変換すると同時に、 細胞接着性の滅菌培養ディッシュ （FALCON #353003) において培養した。
分化培養開始 15日目まで、一日おきに培地を交換した。 15日目のサンプルに対し、 'ミトコンドリア指示薬 TMRM (Invi trogen #T668) を終濃度 10 ηΜで加え 2時間培養し た後、コラゲナ一ゼ（Wor t ington Type 3)を終濃度 0. 1 %、 トリプシン（DIFC0 #215240) を終濃度 0. 1 %でそれぞれ加えた生理的バッファ一 （116 mM NaCl、 20 mM Hepes, 12. 5 mM NaH2P04、 5. 6 mMグルコース、 5. 4 mM KCl、 0. 8 mM MgS04、 pH 7. 35) を用い、 ス夕 —ラーを用いて溶液を攪拌しながら、 細胞を単細胞化した。 この単細胞化したサンプ ルを蛍光活性化細胞ソ一夕一 (Fluorescent Act ivated Cel l Sorter； FACS) に供し、 高蛍光細胞群を回収した （WO2006/022377)。 精製した細胞の生細胞数及び死細胞数を 血算盤にて計測した。 その結果、 生細胞の割合は、 約 75%であった。 実施例 2：マウス胚性幹細胞由来の心筋細胞を用いた細胞塊の作製
本実施例は、実施例 1において作製したマウス胚性幹細胞由来の心筋細胞を用いて、 その後細胞塊を作製することができるかどうかを明らかにすることを目的として行 つた。
実施例 1において作製した胚性幹細胞由来の精製心筋細胞を、 10000、 5000、 2500、 1250、 625及び 313個の細胞が細胞非接着性丸底 96ゥエルプレート （住友べ一クライ ト：セルフエクタイトスフエロイド） の 1ゥエルに存在するように分注した。 培養培 地は、 10%牛胎仔血清を含む MEMである。分注した細胞を経時的に観察したところ、 10時間後には、 細胞塊を形成し、 同期して自律拍動した。 24時間後には、 ほぼ完全 な球形をなし、 10日後においては、 リズミカルな同期した自律拍動を示した（図 1)。 この結果から、 マウス胚性幹細胞由来の心筋細胞を単細胞化した後に、 心筋細胞が 再凝集して、 細胞塊を形成する能力を有することが明らかになった。 実施例 3：マーモセット胚性幹細胞由来心筋細胞を用いた細胞塊の作製 本実施例は、実施例 1の方法に準じて作製したマーモセット胚性幹細胞由来の心筋 細胞を用いて、その後細胞塊を作製することができるかどうかを明らかにすることを 目的として行った。
マーモセット胚性幹細胞は、 実験動物中央研究所から入手した （Sasaki E， et al.， Stem Cells. 2005; 23(9) :1304-13)。 このマーモセット胚性幹細胞を、 マイトマイ シン C 処理により増殖不活性化したマウス胚性線維芽細胞 （mouse embryonic fibroblast ;MEF) を用いて未分化維持培養を行った。培養液 [KO-DMEM (GIBC0)、 20% KO-SERUM (GIBC0)、 1.6 mM L-グルタミン、 0.1 mM非必須アミノ酸 （MEM)、 0.2 mM/3- メルカプトエタノール （2-ME； Sigma)、 100 IU/ml ペニシリン、 100 ig/ml硫酸スト レプトマイシン、 及び 8 ng/ml組換えヒト白血病阻止因子 （LIF； Chemicon)、 組換え ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF;Peprotech)]を用いた。植え継ぎに際しては、 0.1%III型コラゲナ一ゼ（Wortington)、 37で10分にて胚性幹細胞コロニーを分離し た。
続いて、 MEFと胚性幹細胞を分離するために、ポアサイズ 100 zmのメッシュの通過 液を取得し、 これをポアサイズ 40 mのメッシュの非通過細胞塊を取得した。 この細 胞塊が即ち純粋な胚性幹細胞塊である。 分化にあたり、 EBあたり 50〜1000個の胚性 幹細胞塊を細胞非接着性バクテリアディッシュ（アサヒテクノグラス：滅菌シャーレ） 上で胚様体として合計 15〜30 日間培養し、 心筋細胞を含む胚様体へと分化させた。 この際に使用した培養液は、本実施例において上述した培養液から、 bFGFを除いたも の [KO-DMEM (GIBC0)、 20% KO-SERUM (GIBC0)、 1.6 mM L -グルタミン、 0.1 mM非必須 アミノ酸 （MEM)、 0.2mM/3-メルカプトエタノール （2 - ME； Sigma)、 100 IU/mlぺニシ リン、 100//g/ml硫酸ストレプトマイシン、 及び 8 ng/ml組換えヒト白血病阻止因子 (LIF； Chemicon)] であった。
胚様体作製後 1〜2ヶ月経過した胚様体を用いて、 W02006/022377に記載の方法を用 いて心筋細胞を精製した。 即ち、 胚様体をコラゲナーゼとトリプシンで処理し、 バラ バラの単細胞を得た。 細胞が分散された培養液に対し、 ミ トコンドリア指示薬
TMRMClnvitrogen #T66)を終濃度 10 nMで加え、 37で、 15分間暴露し、 3回洗浄した 後、 直ちに FACS解析を行った。 主細胞集団に比べて高蛍光を示す細胞 (心筋細胞）を 分離回収した。
この分離した心筋細胞を実施例 2と同様の方法を用いて心筋細胞塊を作製した。即 ち、マ一モセット胚性幹細胞由来の精製心筋細胞 2000細胞が細胞非接着性丸底 96ゥ エルプレート （住友ベークライト：セルフエクタイトスフエロイド） の 1ゥエルに存 5 在するように分注した。 分注した細胞を経時的に観察したところ、 24時間後 （図 2A) には、 細胞塊を形成し、 同期して自律拍動した。 48時間後 （図 2B) には、 ほぼ完全 な球形をなし、 10日後においては、リズミカルな同期した自律拍動をしめした（図 2)。 この結果から、 マ一モセット胚性幹細胞由来の心筋細胞を単細胞化した後に、 心筋 細胞が再凝集して、 細胞塊を形成する能力を有することが明らかになった。
10 ,
実施例 4：マウス胚性幹細胞由来の心筋細胞を用いた細胞塊形成時の細胞生存率の 測定及び接着法との比較
本実施例では、平面培養条件における保護作用の強さを指標とした接着基質の検討、 及び平面接着培養と細胞塊培養における胚性幹細胞由来精製心筋細胞の生存率の比
15 較を、 細胞保護作用の強い血清を用いた平面接着条件と、 有血清条件及び無血清条件 における細胞生存率を比較検討し、細胞塊培養方法の無血清条件における優れた細胞 保護作用を示す目的で実施した。
本実施例においては、実施例 1に従い、マウス胚性幹細胞由来心筋細胞を精製した。 精製した心筋細胞を、 （1) ゼラチン、 （2) フイブロネクチンコートしたプラスチッ
20 ク製培養皿 （BD社） に有血清条件で播種した （図 3A)。 同時に、 細胞塊を形成する目 的で、 実施例 2に従い （3) 細胞非接着性丸底 96ゥエルプレートに 1 , 000細胞毎分注 し、 120 gで 5分遠心操作を行った。 また、 （4) 細胞塊構築において無血清条件を用 いる点を除いて実施例 2に従い細胞非接着性丸底 96ゥエルプレートに 1, 000細胞毎 分注し、 120 gで 5分遠心操作を行った。 （1) 〜 （4) を同一のインキュベーター内で
25 12時間及び 4日間培養を行った。 4日後、 各ディッシュに接着する細胞数 （生細胞数 と、 接着せず浮遊する細胞数 （死細胞数） とを計測した。 その結果を図示する （（1) 及び （2) について図 3A、 (3) 及び （4) についてそれぞれ図 3B及び図 3Cを参照）。 この結果、 細胞塊無血清培養条件における細胞生存率は、 平面接着血清含有条件に おける最大の細胞生存率（（2)の場合の約 60%の生存率） と比べても明らかに高いこ とが明らかになった（（3)の場合について 99. 2%の生存率、 （4)の場合について 90. 4% の生存率)。
5 実施例 5：精製したマウス胚性幹細胞由来の心筋細胞を用いた細胞塊の作製と、 混 在する胚性幹細胞の検出
本実施例は、精製したマウス胚性幹細胞由来の心筋細胞を用いた細胞塊の中に混在 する非心筋細胞を検出することを目的として行った。
実施例 1、 2の方法を用いて精製した心筋細胞塊を作製した。 但し、 この最終的に 10 96ゥエルプレートに播種を行う前段階で、 心筋細胞懸濁液に、 2%の未分化胚性幹細 胞を加えた。 細胞塊は、 無血清 + l mg/mlの Insul in, 及び 10 nM TMRMを含む a- MEM 溶液で培養し、 14日後に全てのゥエルの蛍光像及び位相差像を取得した。
この結果、 約 2%のゥエルである 2ゥエルにおいて、 大型 （正常な細胞塊の 2倍以 上の大きさ） の細胞塊が観察され （図 4)、 この非球形細胞塊の一部が、 弱い TMRM由 15 来の蛍光シグナルを有する細胞集団 （即ち、 非心筋細胞） であり、 異常心筋細胞であ ることが判明した （図 5B)。 なお、 正常の心筋細胞塊は、 細胞塊全体が TERM由来の蛍 光シグナルを発していた （図 5A)。
このように、 本実施例において提供する方法は、 高感度に、 非心筋細胞の混入を識 別す,ることが出来た。
20
実施例 6：新生仔ラッ卜心臓由来精製心筋細胞を用いた細胞塊の作製
本実施例は、 新生仔ラットの心臓由来の、 精製した心筋細胞を用いた細胞塊を作製 することができるかどうかを明らかにすることを目的として行った。
生後 0〜2日の新生仔ラットをエーテル麻酔した。 心臓を摘出し、 0. 1 %コラゲナ一 25 ゼ (wort ington)を用いて細胞をバラバラに分散した。 これを 10 nM TMRMを用いて染 色した後、 FACSを用いて心筋細胞を精製した。
精製した心筋細胞の細胞数を計測し、 3000細胞づっ細胞非接着性 96ゥェルディッ シュ（住友べ一クライト）にて培養した。培養培地は 10%FBS (JRH)を含有する DMEM- 高グルコース (Invitrogen)を用いた。
24時間後の細胞の様子を図に示した。新生仔ラット由来精製心筋細胞は、細胞塊を 形成せず、 丸底に沿って存在していた （図 6A)。 培養 5日目の新生仔ラット心臓由来 精製心筋細胞は、 無血清条件下（基礎培地である a -MEMのみ （図 6B左）、 もしくはひ -MEM + ITS (図 6B右）） では、 細胞がほぼ死滅していた （図 6B)。 実施例 7：マウス胚性幹細胞由来心筋細胞を用いた細胞塊形成に最適な培地組成 本実施例では、 新生仔ラット初代心筋細胞、 及びマウス胚性幹細胞由来心筋細胞の 諸性質を解析し、胚性幹細胞由来心筋細胞に対して最も適した培養培地を見出すこと を目的とした。
マウス胚性幹細胞由来精製心筋細胞及び、 新生仔ラット精製心筋細胞は、 前述のよ うに調製した。 これを、 α-ΜΕΜ のみ、 o;-MEM+ITS、 a -MEM+ ITSI50 ng/ml bFGF (peprotech), α-ΜΕΜ+ ITS + 50 ng/ml IGF- 1 (Wako)、 a-MEM+ITS+50 ng/ml bFGF
+ 50 ng/ml IGF-K -MEM + 5 % KSR (Knockout Serum Replacement: Invitrogen) (Invitrogen), a-MEM+10%KSR (Knockout Serum Replacement： Invi trogen)、
-MEM+1 FBS (Equitech Bio), a- MEM+5%FBS、 a- MEM+10%FBSの計 10種類の培 養培地を用いて解析を行った。
この結果、 マウス胚性幹細胞由来精製心筋細胞を細胞非接着性丸底 96ゥェルディ ッシュで培養したところ、 僅か 12時間で、 全ての培養培地において細胞塊を形成し た （図 7A)。 しかし、 新生仔ラット心筋細胞は、 24時間後、 全ての培養条件で、 細胞 塊を形成することが出来なかった。 10%血清を含有する培地を例示する。 4日後、 新 生仔ラット心筋細胞は、 5%FBS、 及び 10%FBSを含有する培地においてのみ、 心筋細 胞塊を形成した。
一方、 細胞非接着性丸底 96ゥェルディッシュで培養した 6 日後のマウス胚性幹細 胞由来精製心筋細胞塊を観察したところ （図 7B)、 a-MEM+ITS+50 ng/ml bFGF のみ において、細胞塊形成時に比べて有意な細胞塊の直径増加が見られた（図 7 *を付 したカラムを参照）。 血清を含有する培地においても、 細胞塊の直径は、 初期の 1/2 程度となった （図 70。 このことから、 無血清条件下で、 ITS及び、 bFGFを添加した培地は、 非常に細胞保 護作用が強く、 心筋細胞増殖を誘導する特異な性質を発揮すると考えられる。 実施例 8：マウス胚性幹細胞由来心筋細胞を用いた細胞塊形成に最適な培地組成 実施例 7において、 無血清条件下で、 ITS及び、 bFGFを添加した培地が、 非常に細 胞保護作用が強く、心筋細胞増殖を誘導する特異な性質を発揮することが明らかにな つたことから、本実施例では、 bFGFや ITS溶液を構成する成分の一つであるインスリ ンが、細胞塊の直径増加に対してどのような作用を有するかを明らかにすることを目 的として行った。
基本的には、 培養培地として、 α - MEMのみ、 α -ΜΕΜ+ 50 ng/ml bFGF, α -ΜΕΜ+ 10 g/mlインスリン + 5 ng/ml bFGF, ひ- MEM+ 1 x g/mlインスリン + 1 ng/ml bFGFを使 用した以外は、 実施例 7と同様に実験を行った。
この結果、 6日後のマウス胚性幹細胞由来心筋細胞塊を観察したところ、 α -ΜΕΜ+ 50 ng/ml bFGF, α -ΜΕΜ+ 10 / g/ml インスリン + 5 ng/ml bFGF, α -ΜΕΜ+ 1 / g/ml ィ ンスリン + 1 ng/ml bFGFのいずれにおいても、 a -MEMのみの場合の細胞塊と比べて 有意な細胞塊の直径増加が見られた （図 7B)。 また、 心筋細胞の収縮活性も強く、 実 施例 7において ITSを添加した場合と同様の収縮活性に対する効果が見いだされた。 このことから、 無血清条件下で、 bFGF、 又はインスリン + bFGFを添加した培地は、 非常に細胞保護作用が強く、心筋細胞増殖を誘導する特異な性質を発揮すると考えら れる。 実施例 9：マウス胚性幹細胞由来精製心筋細胞の、 平面接着培養系における無血清 及び bFGFの作用
実施例 1に従って、 マウス胚性幹細胞由来心筋細胞を精製した。 この精製した心筋 細胞をフイブロネクチンでコーティングした細胞培養用ディッシュに同数の細胞を 播種し、 種々の培養培地を用いて平面接着培養を行った。 種々の培養培地とは、 全て 基礎培地に α - MEMを用い、 10%FBS、 10%FBS + 50 ng/ml bFGF, 10%KSR (Knockout Serum
Repl acement : Invi t rogen) , ITS, ITS+50 ng/ml bFGFを添加したものである。 これら の条件に播種した細胞を合計 5日間培養した後、それぞれ写真撮影を行つた（図 8A)。 この結果、 無血清 ITS、 ITS + bFGF群では、 10%FBS添加群もしくは、 10%KSR添加群 に比べて有意に細胞生存率が低かった（図 8B)。 実施例 10：マウス胚性幹細胞由来精製心筋細胞の、免疫不全マウス心筋組織内に対 する移植と生着率の計測
先ず、再凝集法を適用しない場合のマウス胚性幹細胞由来精製心筋細胞の生存率を 計測するために、 以下の実験を行った。
合計 2 X 105細胞を免疫不全マゥス（NOD- SC ID)の左室自由壁内に移植した。マウスを エーテルにて麻酔導入し、 2 %フォーレンを含む空気を人工呼吸器を通じて持続的に 処置した。 マウスを深い麻酔下で開胸 （第 3肋間） し、 心嚢をピンセットで破り、 心 臓を露出した。 30G針付きシリンジを用い、 心筋細胞塊を含む生理食塩水 30 Iを吸 入した。注射針を心尖部から心臓自由壁内を心基部に向かって 3讓程進め注入した。 移植後速やかに閉胸し、 自律拍動の回復を待って、 ケージに戻した。
移植 3週間後、 心臓を灌流固定し、 凍結切片に供した。 切片を抗サルコメァァクチ ニン抗体を用いて免疫染色し、 蛍光顕微鏡像を得た （図 9A)。 この結果、 生存する移 植細胞は殆ど見出すことが出来ず、辛うじてトレーサーである赤色色素の反応を見出 した （図 9A、 図 9D)。
次に、実施例 7に記載の無血清条件で構築した 2000個の細胞からなる心筋細胞塊、 合計 2 X 105細胞を免疫不全マウス（N0D-SCID)の左室自由壁内に移植した。上記実験と 同様に、 移植を実施し、 移植 3週間後、 心臓を灌流固定し、 凍結切片に供した。 切片 を抗サルコメァァクチニン抗体を用いて免疫染色し、 蛍光顕微鏡像を得た （図 10)。 蛍光顕微鏡像を元に、ひとつの細胞塊に含まれる宿主心臓組織に生着した細胞数を力 ゥントした。
その結果、 移植した細胞塊が正確に 2000個の心筋細胞からなるとした場合、 92. 05
± 11. 1 %の心筋細胞が生着したことが判明した （n=4) (図 11 (A) 及び （B) )。 これ に対して、 バラバラに分散した精製細胞をそのまま注入した場合は、 生着細胞を見出 すことができなかった。 この結果は、 移植後生着率が 0%から 92%までの劇的な向上 が得られたことを意味する。
さらに長期移植における心筋細胞変化を確認する目的で、 移植後 3週、 8週の心臓 の免疫染色的な調査を行った。 この結果、 移植前の心筋細胞 （図 11 (C) の "Pre") と比べて、 移植後 3週、 8週では、 心筋細胞細胞質体積が顕著に増加し、 しかも、 移 植心筋細胞は宿主の心筋細胞と同一の方向に並んで存在していた（図 11 (C)及び (D) )。 これは、移植した心筋細胞塊が、移植された心臓組織内で成熟したことを表している。 実施例 11：マーモセット胚性幹細胞由来精製心筋細胞を用いた細胞塊の作製
本実施例は、 無血清又は、 無血清に ITS又は KSRを添加した条件におけるマ一モセ ット胚性幹細胞由来精製心筋細胞塊を作製することを目的として行った。
即ち、 無血清メディウム （図 12A) 又 ;は、 無血清メディウムに 10% KSR (図 12B) 又は ITS (図 12C) を用いたことを除き、 実施例 3に従って、 マーモセット胚性幹細 胞由来精製心筋細胞塊を作製した。 培養開始後 12時間又は 3日後に構築された細胞 塊を図 12に示す。 実施例 12：マーモセット胚性幹細胞由来精製心筋細胞塊を用いた、厚みを持った細 胞シートの構築
実施例 11 において作製したマ一モセット胚性幹細胞由来精製心筋細胞塊を、 同一 平面状にて浮遊培養した。 この浮遊培養した心筋細胞塊は、 0〜12時間にかけて時間 経過に伴って細胞塊同士が接合し、 あたかも、 厚みをもった細胞シートを構築した。 この実施例は、 方法の実証を目指したモデル実験であって、 実際の応用形態では、 任 意の大きさを有する精製胚性幹細胞由来心筋細胞塊を任意の数用いて、任意の大きさ の細胞シートを構築できる （図 13)。 また、 用いる細胞塊の大きさを変えれば、 任意 の厚さの細胞シートを形成することができる。 実施例 13：ヒト胚性幹細胞由来心筋細胞の、 免疫不全マウス心臓への移植
本実施例においては、 ヒト胚性幹細胞から心筋細胞を分化させ、 そしてその様にし て作製した心筋細胞塊が心臓組織内で生着する能力を有するかどうかを調べること を目的として実験を行った。
ヒト胚性幹細胞は、 京都大学再生医科学研究所附属幹細胞医学研究センター （ナシ ョナルバイオリソースプロジェクトによる胚性幹細胞センター） から入手した。
このヒト胚性幹細胞を、 マイトマイシン C処理により増殖不活性化したマウス胚性 線維芽細胞 (mouse embryoni c f ibrob l as t； MEF) を用いて未分化維持培養を行った。 培養液としては、 F12/DMEM (1： 1) (SIGMA,製品番号 D6421)、 20%KO-SERUM (GIBC0)、
1. 6 mM L -グルタミン、 0. 1 mM非必須アミノ酸 （MEM)、 0. 1 mM ]3 -メルカプトエタノー ル （2-ME； S igma)、 100 IU/ml ペニシリン、 l OO g/ml 硫酸ストレプトマイシン、 及 び組換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子 （bFGF； Peprotech) の組成の培養液を用い た。 植え継ぎに際しては、 0. 1 % Π Ι型コラゲナーゼ （Wor t ington)、 37Τ 10分にて 胚性幹細胞コロニーを分離した。
続いて、 MEFと胚性幹細胞を分離するために、 ポアサイズ 40 t mのメッシュの非通 過細胞塊を取得した。この細胞塊が、即ち純粋な胚性幹細胞塊である。分化にあたり、
EBあたり 50〜1000個の胚性幹細胞塊を細胞非接着性バクテリアディッシュ （アサヒ テクノグラス：滅菌シャーレ） 上で胚様体として合計 15〜30 日間培養し心筋細胞を 含む胚様体へと分化させた。 この際に使用した培養液は、 本実施例において上述した 培養液から、 bFGFを除いたもの (即ち、 F12/DMEM (1： 1) (SIGMA, 製品番号 D6421)、
20%KO-SERUM (GIBC0)、 1. 6 mM L-グルタミン、 0. I mM非必須アミノ酸 （MEM)、 0. 1 mM
/3 -メルカプトエタノール （2- ME； Sigma)、 100 IU/ml ペニシリン、 及び 100 z g/ml 硫酸ストレプトマイシン） であった。
実施例 1に従い、 ヒト胚性幹細胞由来心筋細胞を精製した。 続いて、 実施例 8の結 果に従い、 インシュリン l z g/ml及び bFGF 1 ng/ml を含むが血清を含まない a - MEM 溶液を用いて、 精製心筋細胞 1000個を含む細胞塊を作製した （図 14を参照)。
さらに、 実施例 10 に従い、 免疫不全マウス心臓組織内への移植を行った。 移植 2 週間後、 実施例 10 に従い、 凍結切片を作製した。 このようにして作製した切片を
Nkx2. 5及び抗サルコメァァクチニン抗体を用いて免疫染色し、 蛍光顕微鏡像を得た。 移植細胞のトレースに用いた赤色色素に染まる細胞塊を見出した。 切片に対し、
Nkx2. 5及び抗サルコメァァクチニン抗体の免疫検出を行った。 結果を図 15に示す。 移植細胞は、 トレーサー色素に染まり、全体的に赤色が強いことが示された。さらに、 ァクチニンの免疫染色によって、 横紋が染め出されていることも示された。 さらに、 心筋細胞マ一カーである Nkx2. 5は、 移植心筋細胞の核内に強く見出されることもま た示された。 これは、 幼弱な心筋細胞に特有の現象である。 また、 ヒト胚性幹細胞由 来心筋細胞の核は、 周囲のマウス心筋細胞に比べて大型で、 区別できる （図 15)。 さらに、 移植 5週間後、 実施例 10に従い、 凍結切片を作製した。 移植細胞のトレ ースに用いた赤色色素に染まる細胞塊を見出した （図 16)。 このようにして作製した 切片を Nkx2. 5 (水色）及び抗サルコメァァクチニン抗体（緑色） もしくは Nkx2. 5 (水 色） 及び抗ヒト核抗原 （緑色：マウス核内には存在しない、 霊長類にのみ存在する抗 原と結合） を用いて免疫染色し、 蛍光顕微鏡像を得た。 結果を図 17、 18に示す。 移 植細胞のミトコンドリアは、 トレーサー色素に染まり、点状に赤色色素が検出された。 ァクチニンの免疫染色によって、 横紋が染め出されていることも示された （図 17)。 また、 この同一の領域を構成する細胞集団がヒ卜細胞由来であることを示すために、 抗ヒト抗体を用いて検出を行った結果、 やはり、 移植された細胞は、 ヒト細胞であり かつ、 Nkx2. 5に共染する心筋細胞であることが証明された （図 18)。 実施例 14：マウス誘導多能性幹細胞 （iPS) 細胞由来精製心筋細胞を用いた細胞塊 の作製
本実施例は、 無血清条件又は、 無血清条件下で ITS又は KSRを添加した条件におい て、 マウス iPS細胞由来の精製心筋細胞塊を作製することを目的として行った。 マウス iPS細胞は、 京都大学再生医科学研究所より譲渡された。 マウス iPS細胞の 心筋細胞分化は、 実施例 1と同様に行った。 この際、 ひとつの胚様体を構成する初期 細胞数は 1000個が最適であった。
図 19 (A) において精製を目的として、 ミトコンドリア指示薬である TMRMを用いた FACS解析結果を示した。 図中の四角は、 心筋細胞の領域を示す。 このようにして精製 した心筋細胞を接着培養し、 免疫染色 （ァクチニン、 Nkx2. 5) を行った結果を、 図 19
(B) に示した。 これによつて、 マウス iPS-誘導心筋細胞の凝集塊が形成されること が示されたことから、 FACSによって分取した細胞画分中にはほぼ 100%心筋細胞が含 まれることが示された。 さらに図 19 (C) には、 精製した心筋細胞を細胞非接着性の 96 well培養ディッシュに播種した 24時間後の様子を示した。 この場合に無血清メデ ィゥムを用いた。 この結果、 マウス iPS細胞由来精製心筋細胞でも、 本方法で細胞塊 の構築が可能であることが分かった。
5
実施例 15：ヒト胚性幹細胞由来心筋細胞を用いた細胞塊形成に最適な培地組成 実施例 7において、 無血清条件下で、 ITS及び、 bFGFを添加した培地が、 マウス由 来細胞に対する保護作用が強く、心筋細胞増殖を誘導する特異な性質を発揮すること が明らかになったことから、 本実施例では、 ヒト ES細胞由来心筋細胞における bFGF 10 の有効性を示すことを目的として、そしてその有効性をさらに詳細に他の増殖因子と 比較することを目的として、 実施した。
基本的には、培養培地として、 α-ΜΕΜ+ITSを用いた。この基礎メディウムに対し、 25 ng/ml bFGF (Peprotech, Inc., Rocky Hill, J, USA), 25ng/ml酸性 FGF (aFGF)、 25ng/ml FGF- 4、 20ng/mlケラチノサイト成長因子（kerat inocyte growth factor ;KGF),
15 100 ng/ml幹細胞因子（st em cell factor ;SCF)、 100 ng/ml血管内皮増殖因子（vascular endotherial growth factor ; VEGF)、 lOng/ml 白血病抑制因子 (LIF) (Millipore Corporation, Billerica, MA, USA), 100 ng/mlグリア細胞株由来神経栄養因子 (glial cell line-derived neurotrophic factor ; GDNF)、 20 ng/ml肝細胞成長因子 （HGF)、 10 ng/mlインスリン様成長因子 （IGF) -1、 100 ng/ml上皮細胞増殖因子 （EGF)、 IX
20 1(Γ7Μエンドセリン- 1 (ΕΤ- 1)、 10 ng/ml血小板由来成長因子 （PDGF) - AA、 100 ng/ml PDGF-BB (上記に入手先の記載が無いものは全て R & D systems より購入した） を添 加し、 培養を行い、 凝集塊を作製した。
凝集塊作製後 3日、 8日、 25日、 40日後の細胞塊の直径を計測した。 この結果、 い ずれの日程においても、 bFGFを添加した細胞塊の大きさが最も大きいことが判明した
25 (図 20A)。 しかも、 この保護作用は、 40 日間という長期に渡って継続されることが 分かった。また、 bFGFの代わりに培養液中に上述した様々な物質のいずれかを添加し てその細胞塊形成に対する効果を調べたところ、 bFGFには劣るものの、 EGF、 PDGF-BB,
ET - 1が有効性を有することが判明した （図 20B)。 このことから、 ヒト ES細胞由来心筋細胞の分化においても、 bFGFは、 無血清条件 下で細胞保護 ·増殖促進活性を有し、 しかも他の増殖因子に比べてこの作用が強いこ とが判明した。
さらに、 移植後宿主心臓内で、 移植した心筋細胞が成熟できる機構を解明するため に、 本実施例において示した、 bFGF、 EGF、 PDGF- BB、 ET- 1について、 宿主心臓内にお ける遺伝子発現の有無をリアルタイム PCR (Apl i ed b i osys tems) によって行った。 そ れそれのプライマ一プロ一ブは Appl i ed Bi osys tems (TaqMan gene express ion assays) より購入し、 詳しくは bFGF (Mm0128715— ml )、 EGF (Mm01316967_ml )、 PDGF-BB
(Mm01298577_ml) , ET- 1 (Mm01351840_gl) を用いた。解析試薬、操作方法は、 Appl i ed Biosys temsの使用説明書に従った。 この結果、宿主心臓において、 上記の遺伝子が発 現されていることが判明した （図 21)。
本実施例の結果から、 心臓内に移植した心筋細胞塊が生存し、 成熟するために必要 な増殖因子群は、 宿主の心臓から供給されることが示唆された。
産業上の利用可能性
本発明により、 単細胞化により精製された胚性幹細胞由来の心筋細胞が、 無血清条 件下で培養した場合に、 凝集する能力を有する特性が見出された。 本発明の方法によ り細胞塊を構築することにより、 当該心筋細胞の生存率又は増殖能を高く維持しなが ら、 長期間培養する方法が得られた。 更に、 当該細胞を個体 （生体） の心臓組織に移 植すると、 心臓組織への生着率が飛躍的に高まることが見出され、 心筋細胞を、 非心 筋細胞と混在することなく、 心臓組織内に長期間生着させることができた。 即ち、 本 発明により、 移植用の心筋細胞の提供や、 心臓移植以外の治療方法として、 体外で作 製した心筋細胞を移植することにより心疾患を治療する方法である心臓の細胞治療 方法、並びに心筋細胞の細胞塊を含む医療機器を提供する実現性を高めることができ た。

Claims

請求の範囲
1 . 多能性幹細胞から分化、 誘導された心筋細胞を含む凝集された細胞塊を分散さ せて単細胞化することにより得られる精製された多能性幹細胞由来の心筋細胞を、無 血清条件下の培地を用いて培養し、 当該細胞を凝集させることを特徴とする、 多能性 幹細胞由来心筋細胞の細胞塊を作製する方法。
2 . 多能性幹細胞が、 胚性幹細胞、 胚性生殖幹細胞、 生殖幹細胞及び誘導多能性幹 細胞から成る群から選択される、 請求項 1に記載の方法。
3 . 培地がィンスリンを含有する培地である請求項 1又は 2に記載の方法。
4 . 培地がトランスフェリン、 セレニウム、 塩基性線維芽細胞増殖因子 （bFGF)、 上 皮細胞増殖因子（EGF)、血小板由来成長因子- BB (PDGF-BB)及び ;エンドセリン -1 (ET-1 ) からなる物質群から選択される少なくとも 1つの物質を含有する培地である請求項 1 〜3のいずれか 1項に記載の方法。
5 . 培地における含有量がインスリン 0. 1〜10 mg/L、 トランスフェリン 0· 1〜10 g/L、 セレニウム 0. l〜10 z g/L、 塩基性線維芽細胞増殖因子 1 ng/ml〜100 ng/ml、 上 皮細胞増殖因子 1 ng/ml〜1000 ng/mK 血小板由来成長因子 1 ng/ml〜1000 ng/mし エンドセリン- 1 (ET-1 ) 1 X 10-8〜1 X 10-6 Mでぁる請求項1〜4のぃずれか1項に記載 の方法。
6 . 単細胞化して精製された多能性幹細胞由来の心筋細胞を凝集させて得られた細 胞塊を、 個体の心臓組織に移植して生着させることを特徴とする心疾患の治療方法。
7 . 多能性幹細胞が、 胚性幹細胞、 胚性生殖幹細胞、 生殖幹細胞及び誘導多能性幹 細胞から成る群から選択される、 請求項 6に記載の方法。
8 . 心筋細胞塊が請求項 1〜5のいずれか 1項の方法により得られた心筋細胞塊であ る請求項 6記載の方法。
9 . 移植が心筋細胞塊を心臓組織内に注入することからなる請求項 6〜8のいずれか 1項に記載の方法。 -
1 0 . 移植がシート状細胞塊を心臓組織上に移植することからなる請求項 6〜8のい ずれか 1項に記載の方法。
1 1 . 精製された多能性幹細胞由来の心筋細胞塊を、 壁面によって仕切られた細胞 非接着性容器の表面に細胞塊同士が接触し続ける程度に隙間なく並べて播種し、浮遊 培養を行ない、 細胞塊同士が接合して 50〜300 mの間で任意の厚みを有するまで当 該培養を行うことを特徴とするシート状細胞塊の作製方法。
1 2 . 多能性幹細胞が、 胚性幹細胞、 胚性生殖幹細胞、 生殖幹細胞及び誘導多能性 幹細胞から成る群から選択される、 請求項 11に記載の方法。
1 3 . 心筋細胞塊が請求項 1〜5のいずれか 1項の方法により得られた心筋細胞塊で ある請求項 1 1記載の方法。
1 4 . 多能性幹細胞から分化、 誘導された心筋細胞を含む凝集された細胞塊を分散 させて単細胞化することにより精製された多能性幹細胞由来の心筋細胞を得、その心 筋細胞を無血清条件下の培地を用いて培養し、そして当該細胞を凝集させることによ り作製された、 多能性幹細胞由来心筋細胞の細胞塊を含む、 個体の心臓組織に移植し て生着させるための医療機器。
1 5 . 多能性幹細胞が、 胚性幹細胞、 胚性生殖幹細胞、 生殖幹細胞及び誘導多能性 幹細胞から成る群から選択される、 請求項 14に記載の医療機器。
1 6 . 移植が心筋細胞塊を心臓組織内に注入することからなる、 請求項 14又は 15 に記載の医療機器。
1 7 . 移植がシート状細胞塊を心臓組織上に移植することからなる、請求項 14又は 15に記載の医療機器。
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