WO2022210824A1 - 心筋細胞塊の製造方法 - Google Patents

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WO2022210824A1
WO2022210824A1 PCT/JP2022/015780 JP2022015780W WO2022210824A1 WO 2022210824 A1 WO2022210824 A1 WO 2022210824A1 JP 2022015780 W JP2022015780 W JP 2022015780W WO 2022210824 A1 WO2022210824 A1 WO 2022210824A1
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cardiomyocyte
cells
culture
cell
mass
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PCT/JP2022/015780
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Inventor
照 河嶋
義和 河井
昌 神林
Original Assignee
株式会社カネカ
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0657—Cardiomyocytes; Heart cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2513/00—3D culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2521/00—Culture process characterised by the use of hydrostatic pressure, flow or shear forces

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing cardiomyocyte clusters.
  • Cardiomyocyte transplantation has been proposed as a treatment for serious heart disease.
  • Cardiomyocytes to be transplanted may be in the form of sheets or clusters of cardiomyocytes.
  • clusters of cardiomyocytes are said to have a high therapeutic effect because they can be directly injected into the heart with an injection needle. Since such transplantation requires a large amount of myocardial cell aggregates, there are high expectations for the establishment of mass production techniques for myocardial cell aggregates.
  • As a method for producing a cardiomyocyte cluster a method of preparing a cardiomyocyte cluster from single-celled cardiomyocytes after purification is known.
  • a method for producing a myocardial cell cluster which comprises a step of aggregating single-cell myocardial cells by culturing them in a vessel in a liquid-suspended state while stirring the cells.
  • the method for producing a cardiomyocyte mass according to (1) wherein the inner surface of the container is non-adherent to cells.
  • the method for producing a cardiomyocyte mass according to (1) or (2) wherein the container has a volume of 5 mL or more.
  • the cardiomyocyte cell concentration in the liquid is 1.0 ⁇ 10 3 cells/mL or more and 1.0 ⁇ 10 8 cells/mL or less.
  • a large amount of cardiomyocyte clusters can be easily obtained by the method of the present invention.
  • the present invention can contribute to the spread of cardiomyocyte transplantation.
  • FIG. 1 is an image showing the state of cardiomyocyte clusters when the wing tip speed is changed in Examples 1 to 3.
  • FIG. FIG. 2 is an image showing the state of cardiomyocyte clusters 3 hours after the start of culture in Examples 4 and 5.
  • FIG. FIG. 3 is an image showing the state of cardiomyocyte clusters at 48 hours after the start of culture in Comparative Examples 1-3.
  • FIG. 4 is an image showing the state of cardiomyocyte clusters at 48 hours after the start of culture in Examples 1-5.
  • 5 is an image showing the state of cardiomyocyte clusters at 24 hours after the start of culture in Example 6.
  • FIG. FIG. 6 is a diagram showing changes in blade tip speed during culture in Examples 1 to 6.
  • FIG. 7 is an image showing the results of Live/Dead assay of cardiomyocyte clusters 48 hours after the start of culture in Example 4.
  • the present invention provides a method for producing a myocardial cell cluster, which comprises a step of aggregating single-cell myocardial cells by culturing them in a vessel in a state of being suspended in a liquid while agitating the cells.
  • the stirring can be carried out, for example, in a container equipped with a stirring blade or a stirring element (hereinafter also referred to as "stirring blade or the like").
  • the culturing can be performed while stirring with a stirring blade or the like, for example.
  • cardiomyocytes used in the present invention will be described.
  • single-celled myocardial cells are used to produce cardiomyocyte clusters.
  • Cardiomyocytes used in the present invention are not limited, but may be, for example, cardiomyocytes collected from living organisms, purified and/or grown cardiomyocytes, or cardiomyocytes induced from stem cells or the like. can be
  • the cardiomyocytes used in the present invention are preferably pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, for example, cardiomyocytes obtained by differentiation induction from pluripotent stem cells, as described later. Conventionally known methods can be used for unicellularization of cardiomyocytes, although not limited thereto.
  • Single-celled cardiomyocytes are preferably purified.
  • Conventionally well-known methods can be used for purification of cardiomyocytes, although not limited thereto.
  • methods for purifying cardiomyocytes include using a medium with a composition that allows only cardiomyocytes to survive, raising the culture temperature, and adding substances that specifically act on pluripotent stem cells.
  • the purity of cardiomyocytes used in the present invention is not limited, but is, for example, 50% or higher, 80% or higher, 90% or higher, or 95% or higher.
  • the rate of cardiac troponin T-positive cells can be mentioned. If the single-celled cardiomyocyte used in the present invention has a cardiac troponin T-positive cell rate of 50% or more, a high-quality cardiomyocyte cluster can be obtained.
  • the T-positive cell rate is preferably 50% or higher, more preferably 80% or higher, particularly preferably 90% or higher, and most preferably 95% or higher.
  • the cardiac troponin T-positive cell rate can be determined by conventionally known immunological techniques such as flow cytometry using fluorescent labeling and electrochemiluminescence immunoassay (ECLIA method).
  • ELIA method electrochemiluminescence immunoassay
  • Cardiomyocytes used in the present invention are more preferably ventricular myocytes.
  • Ventricular muscle markers include MLC2v.
  • Cardiomyocyte transplantation therapy requires a large amount of the above cardiomyocytes.
  • Pluripotent stem cells such as induced pluripotent stem cells (iPS cells) and embryonic stem cells (ES cells) have the property that they can proliferate indefinitely, so they are suitable as raw materials for cardiomyocytes used in the present invention.
  • Non-neoplastic pluripotent stem cells such as are also preferred from a safety standpoint.
  • the cardiomyocytes are preferably derived from human pluripotent stem cells.
  • cardiomyocytes to be used may be thawed immediately prior to use in the methods of the invention.
  • the cell viability at the time of seeding the cardiomyocytes into the container is 50% or more, the proportion of dead cells in the suspension (liquid in which the cardiomyocytes are cultured) is low, and high-quality cardiomyocyte clusters are produced. Therefore, the cell viability at the time of seeding the cardiomyocytes used in the present invention into a container is preferably 50% or higher, more preferably 55% or higher, still more preferably 60% or higher, particularly preferably 65% or higher, and most preferably 65% or higher. is 70% or more.
  • the size of the cardiomyocyte clusters obtained by the present invention will be uniform. is preferably 70% or more, more preferably 80% or more, particularly preferably 85% or more, still more preferably 90% or more, and most preferably 95% or more.
  • the suspension at the start of culture may contain aggregates of 2, 3, 4, or more cardiomyocytes. (Regarding the culture vessel)
  • the culture vessel used in the present invention will be explained.
  • the production of the cardiomyocyte mass of the present invention can be performed in a container equipped with (installed) a stirring blade or the like.
  • the "container equipped with a stirring blade or the like” includes a container in which the stirring blade is integrated with the container and a container in which the stirrer is fixed by magnetic force or the like.
  • the shape of the vessel, stirring blades, etc. is not limited, but those capable of uniformly dispersing the cells are preferred.
  • the shape of the container can be cylindrical.
  • the stirring blades may be, but are not limited to, turbine type, paddle type, propeller type, or the like.
  • the stirrer may be, but is not limited to, rod-shaped, cross-shaped, propeller-shaped, or the like.
  • the mounting position of the stirring blades and the like is not limited, but may be, for example, the bottom surface or the top portion (cover, etc.) of the container.
  • Examples of the container equipped with stirring blades that can be used in the present invention include containers equipped with paddle-type stirring blades on the bottom surface.
  • the paddle-type stirring blade may be, for example, a flat plate (for example, a shape such as a rectangle, square, or triangle, or a shape that widens toward the bottom surface) attached to a rotating shaft.
  • examples of vessels equipped with stirring blades that can be used in the present invention include single-use reactors for stem cell culture from ABLE, disposable spinner flasks from Corning, and BioBLU Single Use Vessel from Eppendorf. is mentioned.
  • cardiomyocytes may adhere to the inner surface of the culture container due to the characteristics of the cardiomyocytes themselves even if no adhesive substrate is added. It is preferably adhesive.
  • the method of treating the inner surface of the container to make it non-adhesive to cells is not limited, but there is a method of coating the inner surface of the container with a cell non-adhesive substance, for example, a hydrophilic agent such as polyhydroxyethylmethacrylate (p-HEMA). a method of coating by dissolving a polar polymer in ethanol, adding it into a container, and drying it. In addition to p-HEMA, phospholipid polymers such as NOF Lipidure can also be used. Also, a culture vessel manufactured using a cell non-adhesive material may be used. Non-cell-adhesive materials include, but are not limited to, polystyrene and the like.
  • the volume of the container used in the present invention can be, for example, 3 mL or more, preferably 5 mL or more. If the volume of the container is 5 mL or more, a large amount of cardiomyocyte clusters can be produced. Therefore, the volume of the container used in the present invention is preferably 5 mL or more, more preferably 15 mL or more, and 50 mL. It is more preferably 100 mL or more for commercial production, and preferably 500 mL or more when used for treatment of relatively small patients, and for relatively large patients.
  • the volume of the container is 70 L or less, cell clusters can be produced with good handling properties, so the volume of the container used in the present invention is preferably 70 L or less, more preferably 30 L or less, and 15 L. It is more preferably 10 L or less, particularly preferably 10 L or less, and most preferably 7 L or less.
  • the container used in the present invention is preferably sterilized, and more preferably disposable.
  • the container used in the present invention is also preferably a container that can ensure sterility during the production of cardiomyocyte clusters (during culture).
  • the cell-suspending liquid used in the step of aggregating the cells by culturing the single-celled cardiomyocytes in a liquid-suspended state with stirring is not limited, but the cardiomyocytes such as carmyA (Myoridge), RPMI medium + B27 (Thermo Fisher Scientific), MEM- ⁇ medium + 5% fetal bovine serum (Fetal Bovine Serum), and the like.
  • the liquid for cell suspension can be exchanged by an operation generally referred to as medium exchange in the art.
  • Medium exchange is not limited, but may be performed periodically, such as every hour, every 4 hours, every 8 hours, every 12 hours, every 24 hours, every 48 hours, or irregularly. good.
  • the amount to be replaced is not limited, but may be substantially the entire amount or half the amount.
  • Medium exchange may be carried out by constantly exchanging a predetermined amount by perfusion.
  • a ROCK (Rho-associated kinase) inhibitor maintains the viability of cardiomyocytes in a unicellular state and promotes aggregation, so it is preferable to add a ROCK inhibitor to the medium.
  • the concentration of the ROCK inhibitor in the medium may be within a range in which the above effects are exhibited and cytotoxicity is not exhibited.
  • the lower limit of the ROCK inhibitor concentration in the medium is not limited, but includes, for example, 1 ⁇ M, 2 ⁇ M, or 3 ⁇ M, and the upper limit of the ROCK inhibitor concentration in the medium is not limited, for example, 50 ⁇ M or 25 ⁇ M , or 10 ⁇ M.
  • the ROCK inhibitor may be continuously added during the culture, but may be removed during the culture. Examples of ROCK inhibitors include, but are not limited to, Y-27632 (N-(4-pyridinyl)-4 ⁇ -[(R)-1-aminoethyl]cyclohexane-1 ⁇ -carbamide).
  • the amount of suspension in the container is preferably the volume recommended by the container manufacturer in consideration of liquid splashing during flow.
  • the amount of suspension in the container is, for example, 3 mL to 70 L, 3 mL to 30 L, 3 mL to 15 L, 3 mL to 10 L, 3 mL to 7.5 L, 3 mL to 3 L, 3 mL to 1.5 L, 3 mL to 500 mL, 3 mL-100 mL, 3 mL-50 mL, 3 mL-30 mL, 3 mL-10 mL, 3 mL-7 mL, 5 mL-70 L, 5 mL-30 L, 5 mL-15 L5 mL-L, 5 mL-7.5 L, 5 mL-3 L, 5 mL-1.
  • the seeding method is not limited, but a method in which a prescribed amount of medium is added to the container in advance and then cardiomyocytes suspended in liquid are added, or cardiomyocytes are suspended in liquid so as to have a predetermined cell density. and a method of adding a predetermined number of myocardial cells to the container and then adding a liquid to a predetermined volume.
  • the method of the invention is characterized in that the cardiomyocytes and/or forming cardiomyocyte clusters are in suspension in a liquid.
  • a certain substance cells or cell aggregates
  • "suspended in a liquid” means a state in which the substance is suspended in a liquid such as a medium, and the substance settles to the bottom of the container. This includes the state where the substance can be released from the inner surface of the container with a slight stimulus. If the cell concentration of cardiomyocytes in the suspension is 1.0 ⁇ 10 3 cells/mL or more, the cost of liquid components such as medium is low, and cells easily form aggregates, so the method of the present invention.
  • the cell concentration of cardiomyocytes in the suspension in is not limited, it is preferably 1.0 ⁇ 10 3 cells/mL or more, more preferably 1.0 ⁇ 10 4 cells/mL or more, It is particularly preferably 1.0 ⁇ 10 5 cells/mL or more, most preferably 1.5 ⁇ 10 5 cells/mL or more.
  • the cardiomyocyte cell concentration in the suspension is 1.0 ⁇ 10 8 cells/mL or less, overaggregation of cardiomyocytes can be easily suppressed.
  • the cell concentration of the cells is not limited, it is preferably 1.0 ⁇ 10 8 cells/mL or less, more preferably 1.0 ⁇ 10 7 cells/mL or less, and 5.0 ⁇ 10 6 cells.
  • the cell concentration of cardiomyocytes in suspension in the method of the present invention is, for example, 1.0 ⁇ 10 3 cells/mL to 1.0 ⁇ 10 8 cells/mL, 1.0 ⁇ 10 3 cells/mL to 1 0 ⁇ 10 7 cells/mL, 1.0 ⁇ 10 3 cells/mL to 1.0 ⁇ 10 6 cells/mL, 1.0 ⁇ 10 3 cells/mL to 5.0 ⁇ 10 5 cells/mL, 1 0 ⁇ 10 4 cells/mL to 1.0 ⁇ 10 8 cells/mL, 1.0 ⁇ 10 4 cells/mL to 1.0 ⁇ 10 7 cells/mL, 1.0 ⁇ 10 4 cells/mL to 1 0 ⁇ 10 6 cells/mL, 1.0 ⁇ 10 4 cells/mL to 5.0 ⁇ 10 5 cells/mL, 1.0 ⁇ 10 5 cells/mL to 1.0 ⁇ 10 8 cells/mL, 1 .0 ⁇ 10 5 cells/mL to 1.0 ⁇ 10 7 cells/mL,
  • the thawed myocardial cells may contain debris, which is a body of dead cells, depending on the cell freezing method, storage method, and thawing method.
  • the suspension containing thawed myocardial cells it is preferable to pass the suspension containing thawed myocardial cells through a cell strainer to remove debris before use. Therefore, in the method of the present invention, the cardiomyocyte-derived debris can be removed in advance using a cell strainer before the culture of the cardiomyocytes is started.
  • the mesh size of the cell strainer should be large enough to remove debris.
  • the opening of the cell strainer is not limited, but it is desirable that single cells can pass through it.
  • the culture temperature in the step of aggregating the cells by culturing the single-celled cardiomyocytes in a state of being suspended in a liquid while stirring is not limited, but is preferably 30 to 45°C. More preferably 36-38°C, most preferably 37°C.
  • the gas composition and concentration in the environment during the culture are not particularly limited, and the culture can be performed, for example, in an incubator under a carbon dioxide gas atmosphere, which is commonly used.
  • the carbon dioxide gas concentration during the culture is not limited, but is preferably 0 to 10%, such as 4 to 6%, such as about 5%.
  • the oxygen concentration during the culture is not limited, but if it is 1% or more, cell death is unlikely to occur, so it is preferably 1% or more, more preferably 10% or more, and 15% or more.
  • the oxygen concentration during the culture is preferably 40% or less, more preferably 30% or less, more preferably 25% or less, since unnecessary cell oxidation can be suppressed if it is 40% or less. is more preferable, 22% or less is particularly preferable, and 21% or less is most preferable.
  • the amount of dissolved oxygen in the suspension of cardiomyocytes in the step of aggregating the cells by culturing the single-celled cardiomyocytes while suspending them in a liquid is not limited.
  • the amount of dissolved oxygen when the liquid component is saturated with a sufficient amount of air is taken as 100, if it is 10 or more, it is easy to suppress cell death, and if it is 100 or less, there is no need for extra ventilation. It is preferably 100 or less, more preferably 25 or more and 100 or less, further preferably 40 or more and 100 or less, particularly preferably 50 or more and 100 or less, and most preferably 80 or more and 100 or less.
  • the culture time of cardiomyocytes is not limited, but is ⁇ 60 hours, can be 24-48 hours.
  • blade tip speed here, the blade tip speed during stirring culture will be explained.
  • the "blade tip speed" of a stirring blade or the like means the peripheral speed of the portion (blade tip) of the stirring blade or the like furthest from the rotating shaft or center of rotation.
  • the method for producing a myocardial cell mass of the present invention is characterized in that it is carried out while the suspension containing the cells is fluidized by rotating a stirring blade or the like in the vessel.
  • a stirring blade or the like for example, by placing the container containing the suspension containing cardiomyocytes on a magnetic stirrer and continuing to stir with a stirring blade or the like to which a magnetic body (permanent magnet, etc.) is fixed to the lower end, the cells eventually aggregate. and cell clusters are formed.
  • the blade tip speed of the agitating blade, etc. can be adjusted according to the cell line and culture medium to be used, and is not limited.
  • the blade tip speed of the stirring blade is not limited, it is preferably 1.9 ⁇ 10 ⁇ 1 m/s or less from the viewpoint of the stability of the cardiomyocyte mass, and is preferably 1.7 ⁇ 10 ⁇ 1 m/s.
  • the rotation speed of the stirring blade etc. is not limited, but is, for example, 1 rpm to 100 rpm, 1 rpm to 80 rpm, 1 rpm to 60 rpm, 1 rpm to 55 rpm, 5 rpm to 100 rpm, 5 rpm to 80 rpm, 5 rpm to 60 rpm, 5 rpm to 55 rpm, 15 rpm.
  • the wing tip speed that promotes aggregation and the wing tip speed that maintains the cardiomyocyte cluster size can be appropriately selected according to the target size of the cardiomyocyte cluster.
  • the present invention also allows the blade tip speed (speed of agitation) to be varied during culture, which allows for more precise control of cardiomyocyte cluster size.
  • the wing tip speed (speed of agitation) is not limited, but can be changed (eg increased) stepwise or continuously during culturing, for example.
  • the blade tip speed is not limited, but can be performed, for example, at the timing when a precursor having a particle size of 500 ⁇ m or more is formed, the timing when a cardiomyocyte cluster close to the target size is formed, or the like.
  • the progenitor referred to herein is a cell aggregate in the preliminary stage of the cardiomyocyte cluster, which later condenses to become the cardiomyocyte cluster.
  • the initial speed of the blade tip speed (speed at the start of culture) is not limited, but is, for example, 7.9 ⁇ 10 ⁇ 3 m/s to 6.0 ⁇ 10 ⁇ 2 m/s, 1.6 ⁇ 10 ⁇ 2 m/s to 6.0 ⁇ 10 ⁇ 2 m/s, 3.2 ⁇ 10 ⁇ 2 m/s to 6.0 ⁇ 10 ⁇ 2 m/s, 3.9 ⁇ 10 ⁇ 2 m/ s to 6.0 ⁇ 10 ⁇ 2 m/s, 4.5 ⁇ 10 ⁇ 2 m/s to 6.0 ⁇ 10 ⁇ 2 m/s, 5.5 ⁇ 10 ⁇ 2 m/s to 6.0 ⁇ 10 ⁇ 2 m/s, 7.9 ⁇ 10 ⁇ 3 m/s to 5.5 ⁇ 10 ⁇ 2 m/s, 1.6 ⁇ 10 ⁇ 2 m/s to 5.5 ⁇ 10 ⁇ 2 m/s , 3.2 ⁇ 10 ⁇ 2 m/s to 5.5 ⁇ 10 ⁇ 2 m/s, 3.9 ⁇ 10
  • the final speed of the blade tip speed (speed at the end of culture) is not limited, but is, for example, 6.5 ⁇ 10 ⁇ 2 m/s to 1.9 ⁇ 10 ⁇ 1 m/s, 7.0 ⁇ 10 ⁇ 2 m/s to 1.9 ⁇ 10 ⁇ 1 m/s, 7.5 ⁇ 10 ⁇ 2 m/s to 1.9 ⁇ 10 ⁇ 1 m/s, 8.0 ⁇ 10 ⁇ 2 m/ s to 1.9 ⁇ 10 ⁇ 1 m/s, 8.5 ⁇ 10 ⁇ 2 m/s to 1.9 ⁇ 10 ⁇ 1 m/s, 6.5 ⁇ 10 ⁇ 2 m/s to 9.5 ⁇ 10 ⁇ 2 m/s, 7.0 ⁇ 10 ⁇ 2 m/s to 9.5 ⁇ 10 ⁇ 2 m/s, 7.5 ⁇ 10 ⁇ 2 m/s to 9.5 ⁇ 10 ⁇ 2 m/s , 8.0 ⁇ 10 ⁇ 2 m/s to 9.5 ⁇ 10 ⁇ 2 m/s, 8.5 ⁇ 10
  • the wing tip speed is 1-48 hours, 1-36 hours, 1-24 hours, 1-16 hours, 1-14 hours, 1-12 hours, 1 ⁇ 10 hours later, 1-8 hours later, 1-6 hours later, 3-48 hours later, 3-36 hours later, 3-24 hours later, 3-16 hours later, 3-14 hours later, 3-12 hours later hours later, 3-10 hours later, 3-8 hours later, 3-6 hours later, 6-48 hours later, 6-36 hours later, 6-24 hours later, 6-16 hours later, 6-14 hours later , 6-12 hours, 6-10 hours, 6-8 hours, 6 hours, 14 hours, or 24 hours.
  • the wing tip speed can be increased multiple times (eg, 2, 3, 4, 5, etc.) during the culture.
  • the method for recovering the suspension containing the cardiomyocyte clusters is not limited, but after making the suspension sufficiently uniform, or after allowing the cardiomyocyte clusters to settle on the bottom surface, using a pipettor, a syringe, or the like. collection method.
  • the amount of suspension to be collected may be the entire amount or a part of the amount in the container. When collecting the entire amount of the suspension in the container, it is also possible to collect the cardiomyocyte clusters remaining in the container after the above operation by washing with the medium.
  • the collected myocardial cell mass may be centrifuged to remove medium components and replaced with a solution or the like used for transplantation.
  • Method for removing single cells that did not form cardiomyocyte clusters Single cells remaining after the formation of cardiomyocyte clusters have a low survival rate and are therefore preferably removed.
  • the method for removing single cells is not limited, but there is a method of sedimenting cardiomyocyte clusters in a culture vessel with a stirring blade or the like stopped and removing only floating single cells, or a method in which only single cells can pass through the entire suspension. a method in which the whole suspension is collected in a centrifugal tube and then centrifuged to separate and remove cardiomyocyte aggregates and single cells; and the like. (Regarding quality of cardiomyocyte clusters)
  • the quality of the myocardial cell mass produced by the method for producing a myocardial cell mass of the present invention (referred to as "the myocardial cell mass of the present invention") will be described.
  • a beating cardiomyocyte mass can be obtained. Therefore, the cardiomyocyte mass of the present invention may be beating.
  • the myocardial cell mass of the present invention is preferably a myocardial cell mass that is uniformly beating as a whole.
  • the term "pulsation" as used herein means that the myocardial cell mass repeats contraction and relaxation at regular intervals or at approximately regular intervals.
  • the production method of the present invention it is possible to obtain a myocardial cell mass with a good shape and high sphericity.
  • an index of the shape for example, an aspect ratio can be mentioned.
  • the aspect ratio can be obtained from the ratio of the minimum ferret diameter to the maximum ferret diameter.
  • the cardiomyocyte mass of the present invention provided by the production method of the present invention preferably has an average aspect ratio of 0.60 or more, more preferably 0.65 or more, still more preferably 0.70 or more, and particularly preferably It can be 0.75 or greater, most preferably 0.80 or greater.
  • cardiomyocyte aggregates of the present invention provided by the production method of the present invention preferably have a standard deviation of cell aggregate size of 50% or less, more preferably 40% or less of the average cell aggregate size. , particularly preferably 30% or less, and most preferably 20% or less.
  • the term “cardiomyocyte cluster” as used herein refers to a cell cluster with a size of 30 ⁇ m or more to which two or more cardiomyocytes are adhered.
  • the average size of the cardiomyocyte clusters of the present invention is not limited, but is preferably 30 ⁇ m or more, more preferably 75 ⁇ m or more, and still more preferably 100 ⁇ m in terms of expression of cardiomyocyte functions (pulsation, etc.). Above, it is particularly preferably 125 ⁇ m or more, and most preferably 150 ⁇ m or more.
  • the average size of the cardiomyocyte clusters of the present invention is preferably 2000 ⁇ m or less, more preferably 1500 ⁇ m or less, even more preferably 1000 ⁇ m or less, and particularly preferably 2000 ⁇ m or less, because it is easy to inject at the time of transplantation if the cardiomyocyte cluster has an average size of 2000 ⁇ m or less. is 500 ⁇ m or less, most preferably 250 ⁇ m or less.
  • the "size of cell mass" as used herein is the average particle diameter on a volume basis, and is obtained by averaging the minimum ferret diameter and the maximum ferret diameter.
  • the seeded viable cells form cardiomyocyte clusters with high efficiency.
  • the total number of cardiomyocytes constituting the cardiomyocyte cluster is preferably 15% or more of the number of viable cells seeded in the vessel (at the start of culture) from the viewpoint of the efficiency of preparation of the cardiomyocyte cluster, and more preferably. 30% or more, more preferably 45% or more, particularly preferably 60% or more, and most preferably 75% or more.
  • cardiomyocyte clusters with few dead cells can be provided.
  • Methods for confirming viable cells and dead cells in the cardiomyocyte mass include, but are not limited to, a method using Live/Dead Cell Staining Kit II (PromoKine).
  • live cells are stained with Calcein-AM and dead cells with EthD-III, respectively.
  • the cell viability of the cardiomyocyte clusters can be evaluated, for example, by double staining the cardiomyocyte clusters with Calcein-AM and EthD-III, and using a phase-contrast microscope or the like to obtain a fluorescence-photographed stained image. It may be evaluated by calculating the ratio of area stained with EthD-III to the area.
  • the cardiomyocyte mass of the present invention is double-stained with Calcein-AM and EthD-III
  • the area of the region stained with EthD-III is the area of the region stained with Calcein-AM: It is preferably 30% or less, more preferably 25% or less, still more preferably 20% or less, particularly preferably 15% or less, and most preferably 10% or less.
  • Another method for confirming viable and dead cells in cardiomyocyte clusters is to prepare frozen sections of cardiomyocyte clusters and perform immunostaining.
  • the frozen section used for staining is preferably a frozen section cut from a plane passing through the center of gravity of the myocardial cell cluster because it most accurately represents the inside of the cell cluster.
  • Apoptosis markers include Cleaved Caspase-3, Cleaved Caspase-7 and the like.
  • the cardiomyocyte cluster is cut so as to pass through the center of gravity of the cardiomyocyte cluster, and the cell viability of the cardiomyocyte cluster is evaluated from the ratio of the number of cells stained with an apoptosis marker in the cross section to the total number of cells in the cross section.
  • this ratio is preferably 50% or less, more preferably 40% or less, and further It is preferably 30% or less, particularly preferably 30% or less, most preferably 10% or less.
  • the cardiomyocyte mass of the present invention can be transplanted into heart tissue of an individual (living body) by various techniques.
  • the cardiomyocyte mass of the present invention can be administered into the myocardium of the heart using an injection or catheter.
  • a cardiomyocyte mass is produced by the method of the present invention without using a special liquid component, it can be used for transplantation without replacing the liquid component of the suspension. It can also be transplanted after substituting with saline).
  • the cardiomyocyte clusters of the present invention have a small size distribution and a good shape, problems such as clogging with injection needles are unlikely to occur. It is preferable to collect and use only myocardial cell clusters that have passed through an injection needle, channel, sieve, or the like having openings. Especially when a less invasive injection needle of 30G or less is desired, it is effective to remove the myocardial cell clusters that do not pass through the injection needle.
  • a method for easily obtaining a large amount of suitable cardiomyocyte clusters at once like the present invention has not been known until now, and it can be said that the present invention is a very excellent and epoch-making invention.
  • Y-27632 in Table 1 is a ROCK inhibitor.
  • Procedure 3 From the vials warmed in Procedure 2), the cell suspensions were each transferred to 50 mL centrifuge tubes without pipetting.
  • Procedure 5) 1 mL of the thawing medium obtained in Procedure 1) was added to the cell suspension obtained in Procedure 4) at 1 drop/2 seconds and shaken.
  • Procedure 7) The cell suspension obtained in Procedure 6) was centrifuged at 300 xg for 3 minutes, and the supernatant was removed. Step 8) The cells precipitated in step 7) were resuspended in 500 ⁇ L of thawing medium and counted using a Thermo Fisher Scientific Countess II FL automatic cell counter. Procedure 9) Based on the cell count results, the cell suspension of Procedure 8) containing 1.0 ⁇ 10 3 viable cells was added to 1 well of a round-bottom 96-well plate (Cell culture plate 96-well, Round Bottom). After seeding, the total volume was adjusted to 100 ⁇ L with a thawing medium, and static culture was performed.
  • Procedure 10) Place the 12-well plate of procedure 9) on an Orbital Shaker OS-762 manufactured by Optima (swirl along the horizontal plane with a swirl width (diameter) of 25 mm) and start culturing at a swirl speed of 100 rpm. did. (This point is defined as 0 hours after the start of culture.)
  • (Comparative Example 3) Cell thawing and seeding into culture vessels were performed according to the following procedure. Procedure 1) A thawing medium was prepared by adding Y-27632 to a seeding medium for CarmyA to a final concentration of 10 ⁇ M and warmed to 37°C.
  • Procedure 2 One vial containing cryopreserved human iPS cell-derived cardiomyocytes was warmed in a water bath at 37°C for 120 seconds. Step 3) Transfer the cell suspension from the vial warmed in step 2) into a 15 mL tube containing 10 mL of thawing medium from step 1). At this time, no pipettor was used to homogenize the cell suspension. Procedure 4) The vial of Procedure 3) was washed with 1 mL of the thawing medium in the tube of Procedure 3), and 1 mL of the medium after washing was returned to the tube. Procedure 5) After centrifuging the tube of Procedure 4) at 300 xg for 3 minutes, the supernatant was removed.
  • Step 6) The cells precipitated in step 5) were resuspended in 500 ⁇ L of thawing medium and counted using a Thermo Fisher Scientific Countess II FL automatic cell counter.
  • Procedure 7) Based on the cell count results, the cell suspension of Procedure 6) containing 1.5 ⁇ 10 5 viable cells was passed through a strainer with an opening of 35 ⁇ m, seeded in one well of a 12-well plate, and placed in a thawing medium. to make the total amount 1 mL.
  • Procedure 8) Based on the cell count results, the cell suspension of Procedure 6) containing 2.0 ⁇ 10 5 viable cells was seeded in 1 well of a 12-well plate, and the total volume was adjusted to 1 mL with thawing medium.
  • Procedure 9 Placed on an Orbital Shaker OS-762 manufactured by Optima (swirling in a circle along a horizontal plane with a swirling width (diameter) of 25 mm), and culture was started at a swirling speed of 100 rpm. (This point is defined as 0 hours after the start of culture.)
  • Example 1 Cell thawing and seeding into a 5 mL single-use reactor for stem cell culture (hereinafter, reactor) were performed according to the following procedure.
  • Procedure 1) A thawing medium was prepared by adding Y-27632 to a seeding medium for CarmyA to a final concentration of 10 ⁇ M and warmed to 37°C.
  • Procedure 2 One vial containing cryopreserved human iPS cell-derived cardiomyocytes was warmed in a water bath at 37°C for 120 seconds. Step 3) Transfer the cell suspension from the vial warmed in step 2) into a 15 mL tube containing 10 mL of thawing medium from step 1). At this time, no pipettor was used to homogenize the cell suspension. Procedure 4) The vial of Procedure 3) was washed with 1 mL of the thawing medium in the tube of Procedure 3), and 1 mL of the medium after washing was returned to the tube. Procedure 5) After centrifuging the tube of Procedure 4) at 300 xg for 3 minutes, the supernatant was removed.
  • Step 6) The cells precipitated in step 5) were resuspended in 500 ⁇ L of thawing medium and counted using a Thermo Fisher Scientific Countess II FL automatic cell counter.
  • Procedure 7) Based on the cell count results, the cell suspension of Procedure 6) containing 7.5 ⁇ 10 5 viable cells was passed through a strainer with an opening of 70 ⁇ m, and thawing medium was added to make the total volume 5 mL in the reactor. sown.
  • Procedure 9 After 24 hours from the start of the culture, confirm the presence of cardiomyocyte clusters close to the target size as observed in FIG. and the stirring culture was continued until 48 hours after the start of the culture.
  • Example 2 The following experiment was performed for the purpose of obtaining a smaller myocardial cell mass than in Example 1 by changing the timing of increasing the wing tip speed. Procedures 1) to 8) described in Example 1 were performed. After 14 hours of culturing, the presence of precursors with a particle size of 500 ⁇ m or more as observed in FIG. , the agitation culture was continued until 48 hours after the start of the culture.
  • Example 3 The following experiment was conducted for the purpose of obtaining a smaller myocardial cell mass than in Example 2 by changing the timing of increasing the wing tip speed. Procedures 1) to 8) described in Example 1 were performed. After 6 hours from the start of the culture, the presence of precursors with a particle size of 500 ⁇ m or more as observed in FIG. , the agitation culture was continued until 48 hours after the start of the culture. (Example 4) The following experiment was performed for the purpose of obtaining cardiomyocyte clusters smaller than those in Example 2 and with less variation in particle size by increasing the wing tip speed stepwise. Procedures 1) to 8) described in Example 1 were performed.
  • the blade tip speed was increased to 4.7 ⁇ 10 ⁇ 2 m/s (reactor stirring speed: 30 rpm), and two hours after the start of culture, the blade tip speed was increased to 5.5 ⁇ 10 ⁇ 2 m/s (reactor The stirring speed was increased to 35 rpm).
  • the blade tip speed was increased to 7.1 ⁇ 10 ⁇ 2 m/s (reactor stirring speed: 45 rpm), and stirring culture was continued until 48 hours after the start of culture.
  • Example 5 A single-use reactor for cell thawing and 5 mL stem cell culture (hereinafter, reactor) for the purpose of improving the productivity of cardiomyocyte clusters by changing the seeding density of human iPS cell-derived cardiomyocytes in suspension was sown according to the following procedure.
  • a thawing medium was prepared by adding Y-27632 to a seeding medium for CarmyA to a final concentration of 10 ⁇ M and warmed to 37°C.
  • Procedure 2 One vial containing cryopreserved human iPS cell-derived cardiomyocytes was warmed in a water bath at 37°C for 120 seconds.
  • Step 3) Transfer the cell suspension from the vial warmed in step 2) into a 15 mL tube containing 10 mL of thawing medium from step 1). At this time, no pipettor was used to homogenize the cell suspension.
  • Procedure 4) The vial of Procedure 3) was washed with 1 mL of the thawing medium in the tube of Procedure 3), and 1 mL of the medium after washing was returned to the tube.
  • Step 6) The cells precipitated in step 5) were resuspended in 500 ⁇ L of thawing medium and counted using a Thermo Fisher Scientific Countess II FL automatic cell counter.
  • Step 7) Based on the cell count results, pass the cell suspension of Step 6) containing 3.0 ⁇ 10 6 viable cells through a strainer with an opening of 70 ⁇ m, add thawing medium to make the total volume 5 mL, and put it into the reactor. sown.
  • Procedure 8) The culture was started at a blade tip speed of 5.5 ⁇ 10 ⁇ 2 m/s (reactor agitation speed of 35 rpm). (This point is defined as 0 hours after the start of culture.)
  • Procedure 9) After 3 hours from the start of the culture, the presence of precursors with a particle size of 500 ⁇ m or more as observed in FIG.
  • FIG. 3 shows the morphology of the cells in Comparative Examples 1 to 3 48 hours after the initiation of culture.
  • Comparative Example 1 formation of cardiomyocyte clusters and pulsation of cardiomyocyte clusters were not observed until 48 hours after the start of culture. Since the flow of cells is not sufficient in static culture, it is expected that it will take time to form cells.
  • Comparative Example 2 in which cardiomyocyte clusters were produced by spinning culture, formation of cardiomyocyte clusters was observed, but overaggregation occurred, and one large cardiomyocyte cluster (overaggregate) was formed. The occurrence of excessive aggregates is not desirable because the excessive aggregates may clog the transplant needle used for transplantation, and the cells inside the excessive aggregates die because they cannot supply nutrients and discharge waste products.
  • the morphology of the cells 48 hours after the start of culture in Examples 1 to 5 and the morphology of the cells 24 hours after the start of culture in Example 6 are shown in FIGS. 4 and 5, respectively.
  • Examples 1 to 5 formation of cardiomyocyte clusters was confirmed 24 hours after the start of culture.
  • Example 6 the formation of cardiomyocyte clusters could not be confirmed at 24 hours after the start of culture, and the cardiomyocytes remained single cells, but the formation of cardiomyocyte clusters was confirmed at 48 hours after the start of culture.
  • pulsating cardiomyocyte clusters were observed at 48 hours after the start of culture, and in Example 5 at 24 hours after the start of culture.
  • the cells were able to flow sufficiently, which increased the frequency of contact between the cells, and the rapid formation of intercellular bonds led to aggregation.
  • FIG. 6 shows changes in blade tip speed in Examples 1-6.
  • the size of the cardiomyocyte clusters obtained in Examples 1 to 5 was measured 48 hours after the start of the culture. Table 2 shows the results. Individual sizes of cells and cell clusters are obtained by using the measurement function of ZEN Lite (free software) to determine the minimum ferret diameter and maximum ferret diameter from images of cells and cell clusters taken with a routine inverted microscope Primovert manufactured by ZEISS. The average value of both was used. Also, the aspect ratio was defined as the ratio of the minimum ferret diameter to the maximum ferret diameter. Formation efficiency was determined by estimating the number of cells forming the cardiomyocyte cluster from the size of the cardiomyocyte cluster, and taking the ratio of the total number to the number of seeded viable cells.
  • the size of the cardiomyocyte mass can be freely controlled by changing the wing tip speed during the culture and by adjusting the timing of the change.
  • Example 4 by making the maximum value of the wing tip speed smaller than in Example 3, inhibition of adhesion between cells due to shear force can be suppressed, and cardiomyocyte clusters larger in size than in Example 3 can be produced. did it.
  • Example 4 by increasing the wing tip speed stepwise from the initial stage of culture, it is possible to prevent overaggregation of cardiomyocyte clusters and maintain a wing tip speed that does not inhibit the adhesion of cardiomyocytes. As compared with Example 3, cardiomyocyte clusters of uniform size could be obtained.
  • Example 5 cardiomyocyte clusters were prepared at a cell density four times that of Examples 1 to 4, and cardiomyocyte clusters could be obtained without problems such as overaggregation.
  • the cardiomyocyte clusters obtained in Example 4 were subjected to Live/Dead assay using Live/Dead Cell Staining Kit II (Promokine). Observation was performed using BZ-810X (KEYENCE) as a fluorescence microscope. In addition, the procedure of Live/Dead assay was performed according to the protocol included in the kit. Briefly, the cardiomyocyte mass obtained in Example 4 was dispersed in PBS containing 2 ⁇ M and 4 ⁇ M of calcein-AM and Ethidium homodimer III (EthD-III), respectively. , at room temperature and in the dark for 30 minutes.
  • EthD-III Ethidium homodimer III
  • Fig. 7 shows the results of the Live/Dead assay. ImageJ was used for image analysis. The area stained with dead cell marker EthD-III was 4.0% of the area stained with live cell marker Calcein-AM. This means that most of the cardiomyocyte clusters obtained in Example 4 are composed of viable cells, suggesting that the quality is very good.

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Abstract

本発明の課題は、単細胞化された心筋細胞から心筋細胞塊を大量かつ簡便に得ることである。本発明は、単細胞化された心筋細胞を、容器内で液体に懸濁した状態で撹拌しながら培養することによって、当該細胞同士を凝集させる工程を含む、心筋細胞塊の製造方法を提供する。

Description

心筋細胞塊の製造方法
　本発明は、心筋細胞塊を作製する方法に関する。
　重篤な心疾患の治療法として心筋細胞の移植が提唱されている。移植される心筋細胞の形態としてはシート状のものや心筋細胞塊状のものが挙げられ、なかでも心筋細胞塊は注射針で心臓に直接注入できることから、治療効果が高いとされている。このような移植には大量の心筋細胞塊が必要となるため、心筋細胞塊の大量製造技術の確立に期待が寄せられている。心筋細胞塊の作製方法として、精製後の単細胞化された心筋細胞から、心筋細胞塊を調製する方法が知られている。その具体的な方法として、培地に心筋細胞を懸濁させた液を、丸底の９６ウェルプレートに注入し静置培養する方法、もしくは底面に多数のマイクロウェルを有する培養プレートに注入し静置培養する方法が、それぞれ特許文献１、非特許文献１で報告されている。しかしながら、治療に必要な数の心筋細胞塊を得るための製法としては不向きである。
ＷＯ２００９／０１７２５４
Ｔａｂｅｉ　Ｒ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ　Ｈｅａｒｔ　Ｌｕｎｇ　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．　２０１９；３８（２）：２０３－２１４
　単細胞化された心筋細胞から、拍動する心筋細胞塊を大量且つ簡便に得ることが本発明の目的である。
　以下に示す本発明によって、上記課題を解決できた。
（１）単細胞化された心筋細胞を、容器内で液体に懸濁した状態で撹拌しながら培養することによって、当該細胞同士を凝集させる工程を含む、心筋細胞塊の製造方法。
（２）前記容器の内面が、細胞非接着性である、（１）に記載の心筋細胞塊の製造方法。
（３）前記容器の容積が５ｍＬ以上である、（１）または（２）に記載の心筋細胞塊の製造方法。
（４）前記撹拌の速度を、培養中に段階的または連続的に変更する、（１）～（３）のいずれかに記載の心筋細胞塊の製造方法。
（５）前記撹拌の速度を、培養中に段階的または連続的に増加させる、（１）～（４）のいずれかに記載の心筋細胞塊の製造方法。
（６）前記心筋細胞が多能性幹細胞由来である、（１）～（５）のいずれかに記載の心筋細胞塊の製造方法。
（７）前記心筋細胞の培養開始前に、前記心筋細胞に由来するデブリスをセルストレーナーを用いて予め除去する、（１）～（６）のいずれかに記載の心筋細胞塊の製造方法。
（８）前記液体中の前記心筋細胞の細胞濃度が、１．０×１０３ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上１．０×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下である、（１）～（７）のいずれかに記載の心筋細胞塊の製造方法。
（９）（１）～（８）のいずれかに記載の方法で製造された心筋細胞塊であって、アスペクト比の平均値が０．６０以上である心筋細胞塊。
（１０）（１）～（８）のいずれかに記載の方法で製造された心筋細胞塊であって、細胞塊のサイズの標準偏差が細胞塊のサイズの平均値の５０％以下である心筋細胞塊。
（１１）（１）～（８）のいずれかに記載の方法で製造された心筋細胞塊であって、細胞塊のサイズの平均値が３０μｍ以上２０００μｍ以下である心筋細胞塊。
（１２）（１）～（８）のいずれかに記載の方法で製造された心筋細胞塊であって、拍動している、心筋細胞塊。
（１３）（１）～（８）のいずれかに記載の方法で製造された心筋細胞塊であって、心筋細胞塊を構成する心筋細胞の総数が、前記容器に播種した生細胞数の１５％以上であることを特徴とする、心筋細胞塊。
（１４）（１）～（８）のいずれかに記載の方法で製造された心筋細胞塊であって、心筋細胞塊の重心を通る断面中の総細胞数に対して、同断面中のアポトーシスマーカーで染色される細胞数が５０％以下である、心筋細胞塊。
（１５）（１）～（８）のいずれかに記載の方法で製造された心筋細胞塊であって、Ｃａｌｃｅｉｎ－ＡＭおよびＥｔｈＤ－ＩＩＩで二重染色した場合において、ＥｔｈＤ－ＩＩＩで染色された領域の面積がＣａｌｃｅｉｎ－ＡＭで染色された領域の面積に対して３０％以下である、心筋細胞塊。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2021-059860号の開示内容を包含する。
　本発明の方法により、心筋細胞塊を大量且つ簡便に得ることができる。本発明は、心筋細胞移植の普及に貢献することができる。
図１は、実施例１～３における、翼先端速度を変更した時点での心筋細胞塊の状態を示す画像である。 図２は、実施例４および５における、培養開始３時間後時点での心筋細胞塊の状態を示す画像である。 図３は、比較例１～３における、培養開始４８時間後時点での心筋細胞塊の状態を示す画像である。 図４は、実施例１～５における、培養開始４８時間後時点での心筋細胞塊の状態を示す画像である。 図５は、実施例６における、培養開始２４時間後時点での心筋細胞塊の状態を示す画像である。 図６は、実施例１～６における培養中の翼先端速度推移を示す図である。 図７は、実施例４における、培養開始４８時間後時点での心筋細胞塊の、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ　ａｓｓａｙ結果を示す画像である。
　本発明は、単細胞化された心筋細胞を、容器内で液体に懸濁した状態で攪拌しながら培養することによって、当該細胞同士を凝集させる工程を含む、心筋細胞塊の製造方法を提供する。上記攪拌は、例えば、撹拌翼又は攪拌子（以下、「攪拌翼等」とも称する。）が装着された容器内で行うことができる。上記培養は、例えば、攪拌翼等により攪拌しながら行うことができる。これにより、心筋細胞塊を大量、簡便、短期間で得ることができ、心筋細胞移植の普及に貢献できることが期待できる。
（使用する心筋細胞について）
　ここで、本発明において使用する心筋細胞について説明する。本発明では、単細胞化された心筋細胞を心筋細胞塊の製造に使用する。本発明に使用する心筋細胞は、限定されないが、例えば、生体から採取した心筋細胞、あるいはそれを精製および／または増殖させたものであっても良く、また、幹細胞などから誘導した心筋細胞であっても良い。本発明に使用する心筋細胞は、好ましくは、後述するように、多能性幹細胞由来の心筋細胞、例えば、多能性幹細胞から分化誘導により得られた心筋細胞である。心筋細胞の単細胞化には、限定されないが、従来から公知の方法を用いることができる。
　単細胞化された心筋細胞は精製されたものであることが好ましい。心筋細胞の精製には、限定されないが、従来からよく知られた方法を用いることができる。例えば、心筋細胞の精製方法としては、心筋細胞のみが生存可能な組成の培地を用いたり、培養温度を高めたり、多能性幹細胞に特異的に作用する物質を添加する方法等が挙げられる。
　本発明に使用する心筋細胞の純度は、限定されないが、例えば、５０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上である。
　心筋細胞の純度の指標としては、例えば、心筋トロポニンＴ陽性細胞率を挙げることができる。本発明で用いる単細胞化された心筋細胞の心筋トロポニンＴ陽性細胞率が５０％以上であれば、品質の高い心筋細胞塊が得られることから、本発明で用いる単細胞化された心筋細胞の心筋トロポニンＴ陽性細胞率は、好ましくは５０％以上、より好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上である。心筋トロポニンＴ陽性細胞率は、例えば、蛍光標識によるフローサイトメトリー法、電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ法）等の従来より公知の免疫学的手法で求めることができる。幹細胞から分化誘導により得られた心筋細胞を本発明に用いる場合には、心筋細胞は、好ましくは分化誘導開始後１５日時点までに上記の心筋トロポニンＴ陽性細胞率を示す。
　本発明に使用する心筋細胞は心室筋細胞であればより好ましい。心室筋のマーカーとしてはＭＬＣ２ｖが挙げられる。
　心筋細胞移植治療には上記心筋細胞が大量に必要である。分化誘導を行って心筋細胞を得るためにも、原料となる細胞が大量に必要である。人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）や胚性幹細胞（ＥＳ細胞）のような多能性幹細胞は無限に増殖できる性質を有することから、本発明で用いる心筋細胞の原料に好適であり、ミューズ細胞のような非腫瘍性の多能性幹細胞も、安全性の観点から好ましい。また、ヒトへの治療に心筋細胞塊を用いる場合、心筋細胞はヒト多能性幹細胞由来であることが好ましい。また、用いる心筋細胞の準備を多能性幹細胞の増殖から開始すると、心筋細胞塊の移植を受けるまでに多大な期間を要する可能性があるため、予め単細胞化された心筋細胞を大量調製し、凍結保存しておくことが好ましい。したがって、本発明の方法では、凍結保存された心筋細胞を、本発明の方法に使用する直前に解凍して使用してもよい。
　心筋細胞の容器への播種時の細胞生存率が５０％以上であれば、懸濁液（心筋細胞を培養する液体）中に占める死細胞数の割合が低く、高品質な心筋細胞塊を作製できることから、本発明に用いる心筋細胞の容器への播種時の細胞生存率は、好ましくは５０％以上、より好ましくは５５％以上、さらに好ましくは６０％以上、特に好ましくは６５％以上、最も好ましくは７０％以上である。
　培養開始時の懸濁液中の細胞の７０％以上が単細胞であれば本発明により得られる心筋細胞塊のサイズが均一になることから、本発明において、培養開始時の懸濁液中の単細胞の割合は、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、特に好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上である。培養開始時の懸濁液には単細胞以外に、心筋細胞が２個、もしくは３個、もしく４個、またはそれ以上凝集したものが含まれていても良い。
（培養容器について）
　ここで、本発明において使用する培養容器について説明する。本発明の心筋細胞塊の製造は、撹拌翼等が装着（設置）された容器内で行われ得る。本明細書において、「撹拌翼等が装着された容器」には、攪拌翼が容器と一体になっている容器や、攪拌子が磁力等により固着している容器が包含される。容器および撹拌翼等の形状は、限定されないが、細胞を均一に分散可能なものが好ましい。例えば、容器の形状は、円柱型であり得る。攪拌翼は、限定されないが、例えば、タービン型、パドル型、プロペラ型等であり得る。攪拌子は、限定されないが、例えば、棒状、クロス十字型、プロペラ型等であり得る。攪拌翼等の装着位置は、限定されないが、例えば、容器の底面又は上部（蓋等）であり得る。本発明において使用することができる撹拌翼が装着された容器としては、例えば、パドル型の攪拌翼が底面に装着された容器が挙げられる。ここで、パドル型の攪拌翼は、例えば、回転軸に平板（例えば、長方形、正方形、三角形等の形状、底面に向かって広がる形状）が取り付けられたものであってもよい。具体的には、本発明において使用することができる撹拌翼が装着された容器としては、例えば、ＡＢＬＥ社の幹細胞培養用シングルユースリアクターやＣｏｒｎｉｎｇ社のディスポーザブルスピナーフラスコ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社のＢｉｏＢＬＵ　Ｓｉｎｇｌｅ　Ｕｓｅ　Ｖｅｓｓｅｌなどが挙げられる。
　使用する培地にタンパク成分が乏しい場合は、接着基質無添加であっても心筋細胞そのものの特性により培養容器内面に心筋細胞が付着する可能性があるため、本発明で用いる容器は内面が細胞非接着性であることが好ましい。容器内面を細胞非接着性に処理する方法としては、限定されないが、細胞非接着性の物質で容器内面をコーティングする方法があり、例えばポリメタクリル酸ヒドロキシエチル（Ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ；ｐ－ＨＥＭＡ）などの親水性ポリマーをエタノール中に溶解させ、容器内に添加し乾燥させることでコーティングする方法が挙げられる。ｐ－ＨＥＭＡ以外にも、日油社のＬｉｐｉｄｕｒｅなどのリン脂質ポリマーを用いることもできる。また、細胞非接着性の素材を用いて製造された培養容器を用いても良い。細胞非接着性の素材としては、限定されないが、ポリスチレンなどが挙げられる。
　本発明で用いる容器の容積は、例えば３ｍＬ以上であり得るが、５ｍＬ以上であることが好ましい。容器の容積が５ｍＬ以上であれば、大量に心筋細胞塊を作製することができるため、本発明で用いる容器の容積は、５ｍＬ以上であることが好ましく、１５ｍＬ以上であることがより好ましく、５０ｍＬ以上であることが更に好ましく、商業生産的には１００ｍＬ以上であることが特に好ましく、比較的小柄な患者への治療に用いる場合等には５００ｍＬ以上であることが好ましく、比較的大柄な患者への治療に用いる場合等には１０００ｍＬ以上であることが好ましい。また、容器の容積が７０Ｌ以下であれば良好なハンドリング性で細胞塊を作製できることから、本発明で用いる容器の体積は、７０Ｌ以下であることが好ましく、３０Ｌ以下であることがより好ましく、１５Ｌ以下であることが更に好ましく、１０Ｌ以下であることが特に好ましく、最も好ましくは７Ｌ以下である。
　本発明で用いる容器は滅菌されていることが好ましく、ディスポーザブルであれば尚好ましい。本発明で用いる容器はまた、心筋細胞塊を作製している間に（培養中に）無菌性を担保できる容器であることも好ましい。
（細胞懸濁用の液体について）
　本発明において、単細胞化された心筋細胞を、液体に懸濁した状態で撹拌しながら培養することによって、当該細胞同士を凝集させる工程に用いる細胞懸濁用の液体は、限定されないが、心筋細胞を安定して培養できる培地であることが好ましく、例えばｃａｒｍｙＡ（マイオリッジ社）、ＲＰＭＩ培地＋Ｂ２７（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＭＥＭ－α培地＋５％ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ）などが挙げられる。上記細胞懸濁用の液体は通常、当分野で培地交換と呼ばれる操作で交換を行うことができる。培地交換は、限定されないが、例えば、１時間毎、４時間毎、８時間毎、１２時間毎、２４時間毎、４８時間毎等、定期的に行っても良いし、不定期に行っても良い。また交換する量は、限定されないが、ほぼ全量であっても良いし、半量であっても良い。培地交換は、灌流にて常時所定量ずつ入れ替えることによって行っても良い。
　ＲＯＣＫ（Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｋｉｎａｓｅ）阻害剤には単細胞状態の心筋細胞の生存性を高く保ち、凝集を促進する効果があることから、ＲＯＣＫ阻害剤を培地に添加しておくことが好ましい。培地中のＲＯＣＫ阻害剤濃度は、上記効果が現れ、且つ細胞毒性が現れない範囲であればよい。培地中のＲＯＣＫ阻害剤濃度の下限値は、限定されないが、例えば１μＭ、または２μＭ、または３μＭなどが挙げられ、培地中のＲＯＣＫ阻害剤濃度の上限値は、限定されないが、例えば５０μＭ、または２５μＭ、または１０μＭなどが挙げられる。ＲＯＣＫ阻害剤は培養中添加し続けても良いが、培養途中に除去しても良い。ＲＯＣＫ阻害剤の例としては、限定されないが、Ｙ－２７６３２（Ｎ－（４－ピリジニル）－４β－［（Ｒ）－１－アミノエチル］シクロヘキサン－１α－カルボアミド）が挙げられる。
　本発明において、容器内の懸濁液の量は、流動時の液はね等を考慮し、容器メーカーの推奨容量であることが好ましい。本発明において、容器内の懸濁液の量は、例えば、３ｍＬ～７０Ｌ、３ｍＬ～３０Ｌ、３ｍＬ～１５Ｌ、３ｍＬ～１０Ｌ、３ｍＬ～７．５Ｌ、３ｍＬ～３Ｌ、３ｍＬ～１．５Ｌ、３ｍＬ～５００ｍＬ、３ｍＬ～１００ｍＬ、３ｍＬ～５０ｍＬ、３ｍＬ～３０ｍＬ、３ｍＬ～１０ｍＬ、３ｍＬ～７ｍＬ、５ｍＬ～７０Ｌ、５ｍＬ～３０Ｌ、５ｍＬ～１５Ｌ５ｍＬ～Ｌ、５ｍＬ～７．５Ｌ、５ｍＬ～３Ｌ、５ｍＬ～１．５Ｌ、５ｍＬ～５００ｍＬ、５ｍＬ～１００ｍＬ、５ｍＬ～５０ｍＬ、５ｍＬ～３０ｍＬ、５ｍＬ～１０ｍＬ、５ｍＬ～７ｍＬ、または５ｍＬであり得る。
（心筋細胞の播種方法について）
　ここで、本発明における心筋細胞の培養開始時の播種方法について説明する。本発明においては単細胞化された心筋細胞を播種することが好ましい。播種方法については、限定されないが、予め容器内に規定量の培地を加えておき、その後、液体に懸濁した心筋細胞を加える方法や、心筋細胞を所定の細胞密度となるよう液体に懸濁することにより得られた懸濁液を容器内に加える方法、所定の細胞数の心筋細胞を容器内に加えた後、所定の液量まで液体を加える方法が挙げられる。
　本発明の方法は、心筋細胞および／または形成中の心筋細胞塊が液体に懸濁した状態にあることを特徴とする。ここで、ある物質（細胞または細胞塊）が「液体に懸濁した状態」とは、培地等の液体にその物質が懸濁している状態を意味しており、その物質が容器の底に沈降しているが少しの刺激でその物質が容器の内面から離れることができる状態を含む。懸濁液中の心筋細胞の細胞濃度が１．０×１０３ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上であれば、培地等の液体成分のコストが少なく、細胞が凝集塊を形成しやすいことから、本発明の方法における懸濁液中の心筋細胞の細胞濃度は、限定されないが、１．０×１０３ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上であることが好ましく、１．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上であることがより好ましく、１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上であることが特に好ましく、１．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上であることが最も好ましい。また、懸濁液中の心筋細胞の細胞濃度が１．０×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下であれば、心筋細胞の過凝集を抑制しやすいことから、本発明の方法における懸濁液中の心筋細胞の細胞濃度は、限定されないが、１．０×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下であることが好ましく、１．０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下であることが更に好ましく、５．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下であることが特に好ましく、１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下であることが最も好ましい。本発明の方法における懸濁液中の心筋細胞の細胞濃度は、例えば、１．０×１０３ｃｅｌｌｓ／ｍＬ～１．０×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、１．０×１０３ｃｅｌｌｓ／ｍＬ～１．０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、１．０×１０３ｃｅｌｌｓ／ｍＬ～１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、１．０×１０３ｃｅｌｌｓ／ｍＬ～５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、１．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ～１．０×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、１．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ～１．０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、１．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ～１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、１．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ～５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ～１．０×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ～１．０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ～１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ～５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ～１．０×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ～１．０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ～１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬであり得る。
　例えば凍結保存された心筋細胞を解凍して本発明の方法に用いる場合、細胞の凍結方法、保存方法、および解凍方法によっては解凍後の心筋細胞に死細胞の連結体であるデブリスが含まれている場合があるが、その場合は解凍した心筋細胞を含む懸濁液をセルストレーナーに通し、デブリスを除去したうえで使用することが好ましい。したがって、本発明の方法では、心筋細胞の培養開始前に、前記心筋細胞に由来するデブリスをセルストレーナーを用いて予め除去することができる。セルストレーナーの目開きは、デブリスが十分除去できる大きさであればよい。セルストレーナーの目開きは、限定されないが、単細胞が通過可能であることが望ましく、例えば目開き３０μｍ、３５μｍ、７０μｍ、７５μｍのいずれか１種類以上のセルストレーナーを用いることが好ましい。
（心筋細胞の培養条件について）
　本発明において、単細胞化された心筋細胞を、液体に懸濁した状態で撹拌しながら培養することによって、当該細胞同士を凝集させる工程における培養温度は、限定されないが、３０～４５℃が好ましく、より好ましくは３６～３８℃、最も好ましくは３７℃である。
　上記培養時の環境中のガス組成および濃度には特に限定は無く、上記培養は、例えば、通常よく用いられる炭酸ガス雰囲気下のインキュベーター内で実施することもできる。上記培養時の炭酸ガス濃度は、限定されないが、例えば０～１０％、例えば４～６％、例えば約５％が好ましい。また、炭酸ガス濃度を自動制御可能な機器にて、限定されないが、例えば０～１０％の範囲内にて変動的に制御することも可能である。また、上記培養時の酸素濃度は、限定されないが、１％以上であれば細胞死が生じ難いことから、１％以上であることが好ましく、１０％以上であることがより好ましく、１５％以上であることが更に好ましく、１８％以上であることが特に好ましく、最も好ましくは２０％以上である。上記培養時の酸素濃度はまた、４０％以下であれば不要な細胞の酸化を抑制できることから、４０％以下であることが好ましく、３０％以下であることがより好ましく、２５％以下であることが更に好ましく、２２％以下であることが特に好ましく、２１％以下であることが最も好ましい。
　本発明において、単細胞化された心筋細胞を、液体に懸濁しながら培養することによって、当該細胞同士を凝集させる工程における心筋細胞の懸濁液の溶存酸素量は、限定されないが、懸濁液の液体成分に空気を充分量飽和させた時の溶存酸素量を１００とした場合、１０以上であれば細胞死を抑制しやすく、１００以下であれば余計な通気の必要が無いことから、１０以上１００以下であることが好ましく、２５以上１００以下であることがより好ましく、４０以上１００以下であることがさらに好ましく、５０以上１００以下であることが特に好ましく、８０以上１００以下が最も好ましい。
　本発明において、心筋細胞の培養時間は、限定されないが、例えば、２０時間～９６時間、２０～７２時間、２０～６０時間、２０～４８時間、２４時間～９６時間、２４～７２時間、２４～６０時間、２４～４８時間であり得る。
（撹拌培養中の翼先端速度について）
　ここで、撹拌培養中の翼先端速度について説明する。攪拌翼等の「翼先端速度」とは、回転軸又は回転中心から最も遠い攪拌翼等の部位（翼先端）の周速度を意味する。
　本発明の心筋細胞塊の製造方法は、前記容器内の撹拌翼等を回転させ、細胞を含む懸濁液を流動させながら実施することを特徴とする。例えば、マグネティックスターラー上に心筋細胞を含有する懸濁液が入った前記容器を載せ、下端に磁力体（永久磁石等）が固着された撹拌翼等で撹拌を続けることで、やがて細胞同士が凝集し、細胞塊が形成される。撹拌翼等の翼先端速度は、使用する細胞株や培地に合わせて調整することができ、限定されないが、７．９×１０－３ｍ／ｓ以上であれば細胞が流動することから、７．９×１０－３ｍ／ｓ以上であることが好ましく、１．６×１０－２ｍ／ｓ以上であることがより好ましく、２．４×１０－２ｍ／ｓ以上であれば更に好ましく、３．２×１０－２ｍ／ｓ以上であれば特に好ましく、最も好ましくは３．９×１０－２ｍ／ｓ以上である。また、攪拌翼等の翼先端速度は、限定されないが、心筋細胞塊の安定性の面から１．９×１０－１ｍ／ｓ以下であることが好ましく、１．７×１０－１ｍ／ｓ以下であることがより好ましく、１．３×１０－１ｍ／ｓ以下であれば更に好ましく、９．５×１０－２ｍ／ｓ以下であれば特に好ましく、最も好ましくは８．０×１０－２ｍ／ｓ以下である。本発明において、攪拌翼等の回転速度は、限定されないが、例えば１ｒｐｍ～１００ｒｐｍ、１ｒｐｍ～８０ｒｐｍ、１ｒｐｍ～６０ｒｐｍ、１ｒｐｍ～５５ｒｐｍ、５ｒｐｍ～１００ｒｐｍ、５ｒｐｍ～８０ｒｐｍ、５ｒｐｍ～６０ｒｐｍ、５ｒｐｍ～５５ｒｐｍ、１５ｒｐｍ～１００ｒｐｍ、１５ｒｐｍ～８０ｒｐｍ、１５ｒｐｍ～６０ｒｐｍ、１５ｒｐｍ～５５ｒｐｍ、２５ｒｐｍ～１００ｒｐｍ、２５ｒｐｍ～８０ｒｐｍ、２５ｒｐｍ～６０ｒｐｍ、または２５ｒｐｍ～５５ｒｐｍであり得る。
　上述の撹拌翼等を用いた撹拌培養では、翼先端速度を大きくすると細胞の流動性が向上し、細胞同士の接触頻度が増して、細胞同士の接着が促進される。一方で、翼先端速度を大きくすると剪断力も大きくなるため、翼先端速度を大きくし過ぎると逆に細胞同士の接着が阻害される。また、翼先端速度を上昇させると、形成した心筋細胞塊が容器底面部に滞留するのが抑制され、心筋細胞塊同士が凝集することが抑制される。本発明者らは、鋭意検討の結果、心筋細胞塊のサイズ調整を可能とする翼先端速度の調整方法を見い出した。
　本発明では、例えば、凝集を促進する翼先端速度と心筋細胞塊サイズを維持する翼先端速度を、目標とする心筋細胞塊のサイズに合わせて適切に選択することができる。本発明ではまた、培養中に翼先端速度（攪拌の速度）を変更することができ、これにより心筋細胞塊のサイズをより精密にコントロールすることが可能である。翼先端速度（攪拌の速度）は、限定されないが、例えば、培養中に段階的または連続的に変更する（例えば増加させる）ことができる。翼先端速度の変更は、限定されないが、例えば、粒径５００μｍ以上の前駆体が形成したタイミング、目標サイズに近しい心筋細胞塊が形成したタイミング、等で行うことができる。ここでいう前駆体とは、心筋細胞塊の前段階の細胞凝集塊であり、後に凝縮し、心筋細胞塊となるものである。
　本発明において、翼先端速度の初期速度（培養開始時の速度）は、限定されないが、例えば、７．９×１０－３ｍ／ｓ～６．０×１０－２ｍ／ｓ、１．６×１０－２ｍ／ｓ～６．０×１０－２ｍ／ｓ、３．２×１０－２ｍ／ｓ～６．０×１０－２ｍ／ｓ、３．９×１０－２ｍ／ｓ～６．０×１０－２ｍ／ｓ、４．５×１０－２ｍ／ｓ～６．０×１０－２ｍ／ｓ、５．５×１０－２ｍ／ｓ～６．０×１０－２ｍ／ｓ、７．９×１０－３ｍ／ｓ～５．５×１０－２ｍ／ｓ、１．６×１０－２ｍ／ｓ～５．５×１０－２ｍ／ｓ、３．２×１０－２ｍ／ｓ～５．５×１０－２ｍ／ｓ、３．９×１０－２ｍ／ｓ～５．５×１０－２ｍ／ｓ、７．９×１０－３ｍ／ｓ～４．５×１０－２ｍ／ｓ、１．６×１０－２ｍ／ｓ～４．５×１０－２ｍ／ｓ、３．２×１０－２ｍ／ｓ～４．５×１０－２ｍ／ｓ、または３．９×１０－２ｍ／ｓ～４．５×１０－２ｍ／ｓであり得る。
　本発明において、翼先端速度の最終速度（培養終了時の速度）は、限定されないが、例えば、６．５×１０－２ｍ／ｓ～１．９×１０－１ｍ／ｓ、７．０×１０－２ｍ／ｓ～１．９×１０－１ｍ／ｓ、７．５×１０－２ｍ／ｓ～１．９×１０－１ｍ／ｓ、８．０×１０－２ｍ／ｓ～１．９×１０－１ｍ／ｓ、８．５×１０－２ｍ／ｓ～１．９×１０－１ｍ／ｓ、６．５×１０－２ｍ／ｓ～９．５×１０－２ｍ／ｓ、７．０×１０－２ｍ／ｓ～９．５×１０－２ｍ／ｓ、７．５×１０－２ｍ／ｓ～９．５×１０－２ｍ／ｓ、８．０×１０－２ｍ／ｓ～９．５×１０－２ｍ／ｓ、８．５×１０－２ｍ／ｓ～９．５×１０－２ｍ／ｓ、６．５×１０－２ｍ／ｓ～８．５×１０－２ｍ／ｓ、７．０×１０－２ｍ／ｓ～８．５×１０－２ｍ／ｓ、７．５×１０－２ｍ／ｓ～８．５×１０－２ｍ／ｓ、８．０×１０－２ｍ／ｓ～８．５×１０－２ｍ／ｓ、６．５×１０－２ｍ／ｓ～７．５×１０－２ｍ／ｓ、または７．０×１０－２ｍ／ｓ～７．５×１０－２ｍ／ｓであり得る。
　一実施形態では、翼先端速度は、培養開始後１～４８時間後、１～３６時間後、１～２４時間後、１～１６時間後、１～１４時間後、１～１２時間後、１～１０時間後、１～８時間後、１～６時間後、３～４８時間後、３～３６時間後、３～２４時間後、３～１６時間後、３～１４時間後、３～１２時間後、３～１０時間後、３～８時間後、３～６時間後、６～４８時間後、６～３６時間後、６～２４時間後、６～１６時間後、６～１４時間後、６～１２時間後、６～１０時間後、６～８時間後、６時間後、１４時間後、または２４時間後に１回のみ増加させることができる。
　一実施形態では、翼先端速度は、培養中複数回（例えば、２回、３回、４回、５回等）増加させることができる。
（心筋細胞塊の回収工程について）
　ここで、本発明により得られた心筋細胞塊の回収方法について説明する。心筋細胞塊を含む懸濁液を回収する方法としては、限定されないが、懸濁液を十分に均一にしてから、もしくは心筋細胞塊を底面部に沈降させてから、ピペッターやシリンジ等を用いて回収する方法が挙げられる。回収する懸濁液量は、容器内の全量でも、一部でも良い。容器内の懸濁液全量を回収する場合、上記操作後に容器内に残留した心筋細胞塊を、培地による洗いこみで回収することも可能である。回収した心筋細胞塊は遠心操作等で培地成分を取り除き、移植時に使用する溶液等に置き換えても良い。
（心筋細胞塊を形成しなかった単細胞の除去方法について）
　心筋細胞塊の形成後に残存している単細胞は生存率が低いため、除去することが好ましい。単細胞の除去方法については、限定されないが、撹拌翼等の停止した培養容器内で心筋細胞塊を沈降させ、浮遊している単細胞のみを除去する方法や、懸濁液全量を単細胞のみが通過可能なセルストレーナーに通過させ除去する方法、遠心チューブに懸濁液全量を回収後、遠心操作により心筋細胞塊とシングルセルを分離し除去する方法、等が挙げられる。
（心筋細胞塊の品質について）
　ここで、本発明の心筋細胞塊の製造方法で製造された心筋細胞塊（「本発明の心筋細胞塊」と称する）の品質について説明する。
　本発明の製造方法によれば、拍動している心筋細胞塊を得ることができる。したがって、本発明の心筋細胞塊は、拍動しているものであってもよい。一般的に、移植治療には、全体が均一に拍動している心筋細胞塊を用いることが好ましい。そのため、本発明の心筋細胞塊は、好ましくは、全体が均一に拍動している心筋細胞塊であり得る。なお、ここで述べる「拍動」とは、心筋細胞塊が一定間隔、もしくはほぼ一定間隔で収縮と弛緩を繰り返し行うことを意味する。
　本発明の製造方法によれば、形状が良好で真球性の高い心筋細胞塊を得ることができる。形状の指標としては、例えばアスペクト比を挙げることができる。アスペクト比は、最小フェレット径（Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｆｅｒｅｔ　Ｄｉａｍｅｔｅｒ）と最大フェレット径（Ｍａｘｉｍｕｍ　Ｆｅｒｅｔ　Ｄｉａｍｅｔｅｒ）の比で求めることができる。本発明の製造方法により提供される本発明の心筋細胞塊は、好ましくは、アスペクト比の平均値が０．６０以上、より好ましくは０．６５以上、さらに好ましくは０．７０以上、特に好ましくは０．７５以上、最も好ましくは０．８０以上であり得る。
　また、本発明の製造方法によれば、サイズが比較的均質な心筋細胞塊集団を提供することができる。サイズの均質性の指標としては、例えば標準偏差を挙げることができる。本発明の製造方法により提供される本発明の心筋細胞塊は、好ましくは、細胞塊のサイズの標準偏差が細胞塊のサイズの平均値の５０％以下であり、さらに好ましくは４０％以下であり、特に好ましくは３０％以下であり、最も好ましくは２０％以下である。ここでいう「心筋細胞塊」とは、心筋細胞が２個以上接着している、３０μｍ以上のサイズの細胞塊である。本発明の心筋細胞塊のサイズの平均値は、限定されないが、心筋細胞としての機能（拍動等）の発現の点で３０μｍ以上であることが好ましく、より好ましくは７５μｍ以上、更に好ましくは１００μｍ以上、特に好ましくは１２５μｍ以上、最も好ましくは１５０μｍ以上である。また、本発明の心筋細胞塊のサイズの平均値は、２０００μｍ以下であれば移植時に注入しやすいことから、２０００μｍ以下であることが好ましく、より好ましくは１５００μｍ以下、更に好ましくは１０００μｍ以下、特に好ましくは５００μｍ以下、最も好ましくは２５０μｍ以下である。ここでいう「細胞塊のサイズ」は体積基準における平均粒径であり、最小フェレット径および最大フェレット径の平均で求められるものである。
　本発明の製造方法を用いた場合、播種した生細胞は高効率で心筋細胞塊を構成する。本発明では、心筋細胞塊を構成する心筋細胞の総数は、（培養開始時に）容器に播種した生細胞数の１５％以上であることが心筋細胞塊の作製効率の面から好ましく、より好ましくは３０％以上、さらに好ましくは４５％以上、特に好ましくは６０％以上、最も好ましくは７５％以上である。
　本発明の製造方法によれば、死細胞が少ない高品質の心筋細胞塊を提供することができる。心筋細胞塊中の生細胞と死細胞を確認する方法としては、限定されないが、例えばＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ　Ｃｅｌｌ　Ｓｔａｉｎｉｎｇ　Ｋｉｔ　ＩＩ（ＰｒｏｍｏＫｉｎｅ社）を用いる方法が挙げられる。この方法において、生細胞はＣａｌｃｅｉｎ－ＡＭ、死細胞はＥｔｈＤ－ＩＩＩによってそれぞれ染色される。心筋細胞塊の細胞生存性は、例えば、心筋細胞塊をＣａｌｃｅｉｎ－ＡＭおよびＥｔｈＤ－ＩＩＩで二重染色し、位相差顕微鏡などで蛍光撮影された染色画像から、Ｃａｌｃｅｉｎ－ＡＭで染色された領域の面積に対する、ＥｔｈＤ－ＩＩＩで染色された領域の割合を算出することによって、評価しても良い。この割合が３０％以下であれば高品質な心筋細胞塊であるといえる。したがって、本発明の心筋細胞塊は、Ｃａｌｃｅｉｎ－ＡＭおよびＥｔｈＤ－ＩＩＩで二重染色した場合において、ＥｔｈＤ－ＩＩＩで染色された領域の面積がＣａｌｃｅｉｎ－ＡＭで染色された領域の面積に対して、好ましくは３０％以下、より好ましくは２５％以下、さらに好ましくは２０％以下、特に好ましくは１５％以下、最も好ましくは１０％以下であるものである。
　心筋細胞塊中の生細胞と死細胞を確認するその他の方法として心筋細胞塊の凍結切片を作製し免疫染色を行う方法が挙げられる。染色に使用する凍結切片は、細胞塊内部の様子を最も正確に表すことから心筋細胞塊の重心を通る面から切り出された凍結切片であることが好ましい。凍結切片の死細胞のみを染色する方法として、例えばアポトーシスマーカーで染色する方法がある。アポトーシスマーカーとしては、Ｃｌｅａｖｅｄ　Ｃａｓｐａｓｅ－３、Ｃｌｅａｖｅｄ　Ｃａｓｐａｓｅ－７などが挙げられる。例えば、心筋細胞塊の重心を通るように心筋細胞塊を切断し、その断面の総細胞数に対する同断面中のアポトーシスマーカーで染色される細胞数の割合から心筋細胞塊の細胞生存性を評価しても良い。この割合が５０％以下であれば生細胞の割合が多く、高品質な心筋細胞塊であるといえることから、この割合は、５０％以下であることが好ましく、より好ましくは４０％以下、さらに好ましくは３０％以下、特に好ましくは３０％以下、最も好ましくは１０％以下である。
（得られた心筋細胞塊の使用方法について）
　本発明の心筋細胞塊は様々な手法により個体（生体）の心臓組織に移植することができる。例えば、本発明の心筋細胞塊は、注射やカテーテルを用いて心臓の心筋層内へ投与することができる。特殊な液体成分を用いずに本発明の方法により心筋細胞塊を製造した場合、懸濁液の液体成分を置換せず、そのまま移植に用いることもできるが、個体に適切な液体（例：生理食塩水）に置換したうえで移植することもできる。本発明の心筋細胞塊はサイズの分布が小さく、形状も良好であることから、注射針での詰まり等の不具合は発生し難いが、念のため移植時に用いる注射針の内径以下の内径または目開きを有する注射針、流路または篩等を通過できた心筋細胞塊のみを集めて使用することが好ましい。特に３０Ｇ以下の低侵襲性の注射針を用いたい場合に、注射針を通過しない心筋細胞塊を除去しておくことは効果的である。
　本発明のように大量に好適な心筋細胞塊を一度に簡便に得られる方法はこれまで知られておらず、本発明は非常に優れた画期的な発明であると言える。
　以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
　使用した材料、資材を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１中のＹ－２７６３２はＲＯＣＫ阻害剤である。
　ｐ－ＨＥＭＡをエタノール中に溶解させ、５ｍＬ幹細胞培養用シングルユースリアクター内に添加し乾燥させることにより、シングルユースリアクターをｐ－ＨＥＭＡでコーティングした。
（比較例１）
　細胞解凍および培養容器への播種を、以下の手順にて行った。
手順１）ＣａｒｍｙＡ用播種用培地に終濃度１０μＭとなるようにＹ－２７６３２を添加したものを解凍培地とし、３７℃に温めた。
手順２）凍結保存されたヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞（マイオリッジ社製ＣａｒｍｙＡ、純度＞９０％、以下同様）の入ったバイアル１本を３７℃のウォーターバスで１２０秒間温めた。
手順３）手順２）で温めたバイアルから、ピペッティングを行わずに細胞懸濁液をそれぞれ５０ｍＬ遠沈管に移した。
手順４）手順１）の解凍培地１ｍＬで手順３）のバイアルを洗い、その洗浄後の培地１ｍＬを１滴／５秒の速度で手順３）の細胞懸濁液に添加し、振り混ぜた。
手順５）手順１）の解凍培地１ｍＬを手順４）の細胞懸濁液に１滴／２秒で加え振り混ぜた。
手順６）手順１）の解凍培地８ｍＬを手順５）の細胞懸濁液に１滴／１秒で加え振り混ぜた。
手順７）手順６）の細胞懸濁液を３００ｘｇで３分間遠心後、上清を除去した。
手順８）手順７）で沈殿させた細胞を５００μＬの解凍培地に再懸濁し、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製Ｃｏｕｎｔｅｓｓ　ＩＩ　ＦＬ自動セルカウンターを用いて細胞数カウントを行った。
手順９）細胞数カウント結果を基に、１．０×１０３個の生細胞を含む手順８）の細胞懸濁液を丸底９６ｗｅｌｌプレート（Ｃｅｌｌ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｐｌａｔｅ　９６－ｗｅｌｌ，　Ｒｏｕｎｄ　Ｂｏｔｔｏｍ）の１ｗｅｌｌに播種し、解凍培地で全量を１００μＬとし、静置培養を行った。
　なお、培養は３７℃、５．０％ＣＯ２下で行った。（以下、すべての比較例および実施例について同様である。）
（比較例２）
　比較例１に記載の手順８）までは同様にして行い、その後の手順を以下の通りとした。
手順９）細胞数カウント結果を基に、２．０×１０５個の細胞を含む手順８）の細胞懸濁液を１２ｗｅｌｌプレート（１２－ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅ）の１ｗｅｌｌに播種し、解凍培地で全量を１ｍＬとした。
手順１０）手順９）の１２ｗｅｌｌプレートをオプティマ社製Ｏｒｂｉｔａｌ　Ｓｈａｋｅｒ　ＯＳ－７６２（旋回幅（直径）２５ｍｍで水平面に沿って円を描くように旋回する）上に載せ、旋回速度１００ｒｐｍにて培養を開始した。（この時点を培養開始０時間後とする。）
（比較例３）
　細胞解凍および培養容器への播種を、以下の手順にて行った。
手順１）ＣａｒｍｙＡ用播種用培地に終濃度１０μＭとなるようにＹ－２７６３２を添加したものを解凍培地とし、３７℃に温めた。
手順２）凍結保存されたヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞の入ったバイアル１本を３７℃のウォーターバスで１２０秒間温めた。
手順３）手順２）で温めたバイアルから、手順１）の解凍培地１０ｍＬの入った１５ｍＬチューブ内に、細胞懸濁液を移した。この時、ピペッターを用いて細胞懸濁液内を均一にする操作は行わなかった。
手順４）手順３）のチューブ内の解凍培地１ｍＬで手順３）のバイアルを洗い、その洗浄後の培地１ｍＬを上記チューブ内に戻した。
手順５）手順４）のチューブを３００ｘｇで３分間遠心後、上清を除去した。
手順６）手順５）で沈殿させた細胞を５００μＬの解凍培地に再懸濁し、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製Ｃｏｕｎｔｅｓｓ　ＩＩ　ＦＬ自動セルカウンターを用いて細胞数カウントを行った。
手順７）細胞数カウント結果を基に、１．５×１０５個の生細胞を含む手順６）の細胞懸濁液を目開き３５μｍのストレーナーに通し、１２ｗｅｌｌプレートの１ｗｅｌｌに播種し、解凍培地で全量を１ｍＬとした。
手順８）細胞数カウント結果を基に、２．０×１０５個の生細胞を含む手順６）の細胞懸濁液を１２ｗｅｌｌプレートの１ｗｅｌｌに播種し、解凍培地で全量を１ｍＬとした。
手順９）オプティマ社製Ｏｒｂｉｔａｌ　Ｓｈａｋｅｒ　ＯＳ－７６２（旋回幅（直径）２５ｍｍで水平面に沿って円を描くように旋回する）上に載せ、旋回速度１００ｒｐｍにて培養を開始した。（この時点を培養開始０時間後とする。）
（実施例１）
　細胞解凍および５ｍＬ幹細胞培養用シングルユースリアクター（以下、リアクター）への播種を、以下の手順にて行った。
手順１）ＣａｒｍｙＡ用播種用培地に終濃度１０μＭとなるようにＹ－２７６３２を添加したものを解凍培地とし、３７℃に温めた。
手順２）凍結保存されたヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞の入ったバイアル１本を３７℃のウォーターバスで１２０秒間温めた。
手順３）手順２）で温めたバイアルから、手順１）の解凍培地１０ｍＬの入った１５ｍＬチューブ内に、細胞懸濁液を移した。この時、ピペッターを用いて細胞懸濁液内を均一にする操作は行わなかった。
手順４）手順３）のチューブ内の解凍培地１ｍＬで手順３）のバイアルを洗い、その洗浄後の培地１ｍＬを上記チューブ内に戻した。
手順５）手順４）のチューブを３００ｘｇで３分間遠心後、上清を除去した。
手順６）手順５）で沈殿させた細胞を５００μＬの解凍培地に再懸濁し、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製Ｃｏｕｎｔｅｓｓ　ＩＩ　ＦＬ自動セルカウンターを用いて細胞数カウントを行った。
手順７）細胞数カウント結果を基に、７．５×１０５個の生細胞を含む手順６）の細胞懸濁液を目開き７０μｍのストレーナーに通し、解凍培地で全量を５ｍＬとしてリアクター内に播種した。
手順８）翼先端速度３．９×１０－２ｍ／ｓ（リアクター撹拌速度２５ｒｐｍ）にて培養を開始した。（この時点を培養開始０時間後とする。）
手順９）培養開始２４時間後に、図１に観察されるような目標サイズに近い心筋細胞塊の存在を確認し、翼先端速度を８．０×１０－２ｍ／ｓ（リアクター撹拌速度５１ｒｐｍ）に上昇させ、培養開始４８時間後まで撹拌培養を継続した。
（実施例２）
　翼先端速度を上昇させるタイミングを変更することにより、実施例１より小さい心筋細胞塊を得ることを目的に、以下の実験を行った。実施例１に記載の手順１）～８）までを行った。培養開始１４時間後に、図１に観察されるような粒径５００μｍ以上の前駆体の存在を確認し、翼先端速度を８．０×１０－２ｍ／ｓ（リアクター撹拌速度５１ｒｐｍ）に上昇させ、培養開始４８時間後まで撹拌培養を継続した。
（実施例３）
　翼先端速度を上昇させるタイミングを変更することにより、実施例２より小さい心筋細胞塊を得ることを目的に、以下の実験を行った。実施例１に記載の手順１）～８）までを行った。培養開始６時間後に、図１に観察されるような粒径５００μｍ以上の前駆体の存在を確認し、翼先端速度を８．０×１０－２ｍ／ｓ（リアクター撹拌速度５１ｒｐｍ）に上昇させ、培養開始４８時間後まで撹拌培養を継続した。
（実施例４）
　翼先端速度を段階的に上昇させることにより、実施例２より小さく、かつ粒径のばらつきが小さい心筋細胞塊を得ることを目的に、以下の実験を行った。実施例１に記載の手順１）～８）までを行った。培養開始１時間後に翼先端速度を４．７×１０－２ｍ／ｓ（リアクター撹拌速度３０ｒｐｍ）に上昇させ、培養開始２時間後に翼先端速度を５．５×１０－２ｍ／ｓ（リアクター撹拌速度３５ｒｐｍ）に上昇させた。培養開始３時間後に、図２に観察されるような粒径５００μｍ以上の前駆体の存在を確認し、翼先端速度を６．３×１０－２ｍ／ｓ（リアクター撹拌速度４０ｒｐｍ）に上昇させ、培養開始６時間後に翼先端速度を７．１×１０－２ｍ／ｓ（リアクター撹拌速度４５ｒｐｍ）に上昇させ、培養開始４８時間後まで撹拌培養を継続した。
（実施例５）
　ヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞の、懸濁液中の播種密度を変更することによって、心筋細胞塊の生産性を向上することを目的に、細胞解凍および５ｍＬ幹細胞培養用シングルユースリアクター（以下、リアクター）への播種を、以下の手順にて行った。
手順１）ＣａｒｍｙＡ用播種用培地に終濃度１０μＭとなるようにＹ－２７６３２を添加したものを解凍培地とし、３７℃に温めた。
手順２）凍結保存されたヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞の入ったバイアル１本を３７℃のウォーターバスで１２０秒間温めた。
手順３）手順２）で温めたバイアルから、手順１）の解凍培地１０ｍＬの入った１５ｍＬチューブ内に、細胞懸濁液を移した。この時、ピペッターを用いて細胞懸濁液内を均一にする操作は行わなかった。
手順４）手順３）のチューブ内の解凍培地１ｍＬで手順３）のバイアルを洗い、その洗浄後の培地１ｍＬを上記チューブ内に戻した。
手順５）手順４）のチューブを３００ｘｇで３分間遠心後、上清を除去した。
手順６）手順５）で沈殿させた細胞を５００μＬの解凍培地に再懸濁し、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製Ｃｏｕｎｔｅｓｓ　ＩＩ　ＦＬ自動セルカウンターを用いて細胞数カウントを行った。
手順７）細胞数カウント結果を基に、３．０×１０６個の生細胞を含む手順６）の細胞懸濁液を目開き７０μｍのストレーナーに通し、解凍培地で全量を５ｍＬとしてリアクター内に播種した。
手順８）翼先端速度５．５×１０－２ｍ／ｓ（リアクター撹拌速度３５ｒｐｍ）にて培養を開始した。（この時点を培養開始０時間後とする。）
手順９）培養開始３時間後に、図２に観察されるような粒径５００μｍ以上の前駆体の存在を確認し、翼先端速度を６．３×１０－２ｍ／ｓ（リアクター撹拌速度４０ｒｐｍ）に上昇させ、培養開始６時間後に翼先端速度を７．１×１０－２ｍ／ｓ（リアクター撹拌速度４５ｒｐｍ）に上昇させ、培養開始７時間後に翼先端速度を８．０×１０－２ｍ／ｓ（リアクター撹拌速度５１ｒｐｍ）に上昇させ、培養開始９時間後に翼先端速度を８．７×１０－２ｍ／ｓ（リアクター撹拌速度５５ｒｐｍ）に上昇させた。
（実施例６）
　実施例１に記載の手順１）～７）までを行い、翼先端速度７．９×１０－３ｍ／ｓ（リアクター撹拌速度５ｒｐｍ）にて培養を開始した。
（評価例１：心筋細胞塊の形態確認）
　比較例１～３による培養開始４８時間後での細胞の形態を図３に示す。
　比較例１では、培養開始４８時間後までの心筋細胞塊の作製および、心筋細胞塊の拍動は観察されなかった。静置培養では細胞の流動が十分でないため、形成までに時間を要すると予想される。一方旋回培養にて心筋細胞塊の作製を試みた比較例２では心筋細胞塊の形成が見られたものの過凝集を起こし、一つの大きな心筋細胞塊（過凝集塊）が形成している。過凝集塊は移植の際に用いる移植針を閉塞させてしまう恐れがあり、また過凝集内部の細胞は栄養供給および老廃物排出が行えず死滅するため、過凝集塊の発生は望ましくない。比較例３では、解凍時に存在するデブリスをセルストレーナーにより事前に除去したことで、播種直後は培養液中にデブリスは存在していなかったが、培養開始２４時間後に新たなデブリスが発生していることを確認した。この原因としてストレーナーを通過した死細胞が新たなデブリスを形成したと考えられる。培養開始４８時間後において、形成した心筋細胞塊はこれらデブリスに絡めとられるようにして過凝集している様子が観察された。旋回培養においては容器の中心に向けて液流が発生するため細胞が容器中心部に集積してしい、新たなデブリスを発生させたと考えられる。
　比較例２、３の結果より、浮遊旋回方式は心筋細胞塊を作製する手法に用いることが適切ではないことが分かった。
　実施例１～５による培養開始４８時間後での細胞の形態および、実施例６による培養開始２４時間後での細胞の形態を、それぞれ図４および図５に示す。
　実施例１～５では、培養開始２４時間後時点で心筋細胞塊が形成している様子を確認した。実施例６では培養開始２４時間後時点で心筋細胞塊の形成が確認できず、心筋細胞は単細胞のままであったが、培養開始４８時間で心筋細胞塊の形成を確認した。また、実施例１～４および６においては培養開始４８時間後時点で、実施例５においては培養開始２４時間後時点で拍動している心筋細胞塊を観察した。比較例１のような静置培養とは異なり、撹拌培養では細胞の流動が十分行われるようになったことで細胞同士の接触頻度が向上し、細胞間結合が素早く形成されたことにより凝集までの期間が短縮され、従来技術より拍動開始までの時間が大幅に縮まったと考えられる。また、比較例２、３の様な旋回培養とは異なり、撹拌培養では細胞が培養容器の中心部に集まることがないため、デブリスや過凝集塊の発生が抑制されたものと考える。
（評価例２：心筋細胞塊のサイズ測定）
　実施例１～６の翼先端速度推移を図６に示す。
　培養開始４８時間後時点で、実施例１～５により得られた心筋細胞塊のサイズを計測した。表２に結果を示す。細胞および細胞塊の個々のサイズは、ＺＥＩＳＳ社製ルーチン倒立顕微鏡　Ｐｒｉｍｏｖｅｒｔで撮影した細胞および細胞塊の画像から、ＺＥＮ　ｌｉｔｅ（フリーソフトウェア）の計測機能を用いて最小フェレット径と最大フェレット径を求め、両者の平均値とした。また、アスペクト比は最小フェレット径と最大フェレット径の比とした。形成効率は、心筋細胞塊のサイズから心筋細胞塊を構成する細胞数を予測し、その総数の播種した生細胞数に対する割合とした。表２の結果から、心筋細胞塊のサイズは、翼先端速度を培養途中に変更することにより、また、変更するタイミングを調整することにより自在に制御できることが分かる。例えば、実施例４では、翼先端速度の最大値を実施例３より小さくすることで剪断力による細胞同士の接着の阻害を抑制することができ、実施例３よりサイズの大きな心筋細胞塊を作製できた。実施例４ではさらに、翼先端速度を培養初期から段階的に上昇させることによって、心筋細胞塊同士の過凝集を防止しつつ、心筋細胞同士の接着を阻害しない翼先端速度を維持することができ、実施例３に比べて均一なサイズの心筋細胞塊を得ることができた。このことは、実施例４では細胞塊のサイズ平均に対する細胞塊のサイズの標準偏差の割合が実施例３よりも小さかったことにより示される（表２）。また、実施例５では、実施例１～４の４倍の細胞密度で心筋細胞塊作製を行ったが、過凝集等の問題なく心筋細胞塊を得ることができた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（評価例３）
　培養開始４８時間後時点で、実施例４により得られた心筋細胞塊に対して、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ　Ｃｅｌｌ　Ｓｔａｉｎｉｎｇ　Ｋｉｔ　ＩＩ（Ｐｒｏｍｏｋｉｎｅ社）を用いてＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ　ａｓｓａｙを行った。蛍光顕微鏡としてＢＺ－８１０Ｘ（ＫＥＹＥＮＣＥ社）を用いて観察した。また、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ　ａｓｓａｙの手順はキットに同梱されたプロトコルに従い行った。端的に述べると、カルセインＡＭ（Ｃａｌｃｅｉｎ－ＡＭ）とエチジウムホモダイマーＩＩＩ（Ｅｔｈｉｄｉｕｍ　ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ ＩＩＩ；ＥｔｈＤ－ＩＩＩ）の濃度をそれぞれ２μＭと４μＭとしたＰＢＳ中に実施例４により得られた心筋細胞塊を分散し、室温、遮光下にて３０分反応させた。
　Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ　ａｓｓａｙの結果を図７に示す。画像解析には、ＩｍａｇｅＪを使用した。死細胞マーカーであるＥｔｈＤ－ＩＩＩにより染色された面積は、生細胞マーカーであるＣａｌｃｅｉｎ－ＡＭにより染色された面積の４．０％であった。これは、実施例４により得られた心筋細胞塊の殆どが生細胞で構成されていることを意味しており、品質が非常に優れたものであることを示唆する。
　これらの実施例は、本発明の方法によって大量の心筋細胞塊を極めて簡便に短期間で作製できることを示している。よって、本発明は移植治療等に大きな貢献をもたらすことが期待される。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (14)

  1. 単細胞化された心筋細胞を、容器内で液体に懸濁した状態で撹拌しながら培養することによって、当該細胞同士を凝集させる工程を含む、心筋細胞塊の製造方法。
  2. 前記容器の内面が、細胞非接着性である、請求項１に記載の心筋細胞塊の製造方法。
  3. 前記容器の容積が５ｍＬ以上である、請求項１または２に記載の心筋細胞塊の製造方法。
  4. 前記撹拌の速度を、培養中に段階的または連続的に変更する、請求項１～３のいずれか一項に記載の心筋細胞塊の製造方法。
  5. 前記撹拌の速度を、培養中に段階的または連続的に増加させる、請求項１～４のいずれか一項に記載の心筋細胞塊の製造方法。
  6. 前記心筋細胞が多能性幹細胞由来である、請求項１～５のいずれか一項に記載の心筋細胞塊の製造方法。
  7. 前記心筋細胞の培養開始前に、前記心筋細胞に由来するデブリスをセルストレーナーを用いて予め除去する、請求項１～６のいずれか一項に記載の心筋細胞塊の製造方法。
  8. 前記液体中の前記心筋細胞の細胞濃度が、１．０×１０３ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上１．０×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下である、請求項１～７のいずれか一項に記載の心筋細胞塊の製造方法。
  9. 請求項１～８のいずれか一項に記載の方法で製造された心筋細胞塊であって、アスペクト比の平均値が０．６０以上である心筋細胞塊。
  10. 請求項１～８のいずれか一項に記載の方法で製造された心筋細胞塊であって、細胞塊のサイズの標準偏差が細胞塊のサイズの平均値の５０％以下である心筋細胞塊。
  11. 請求項１～８のいずれか一項に記載の方法で製造された心筋細胞塊であって、細胞塊のサイズの平均値が３０μｍ以上２０００μｍ以下である心筋細胞塊。
  12. 請求項１～８のいずれか一項に記載の方法で製造された心筋細胞塊であって、拍動している、心筋細胞塊。
  13. 請求項１～８のいずれか一項に記載の方法で製造された心筋細胞塊であって、心筋細胞塊を構成する心筋細胞の総数が、前記容器に播種した生細胞数の１５％以上であることを特徴とする、心筋細胞塊。
  14. 請求項１～８のいずれか一項に記載の方法で製造された心筋細胞塊であって、カルセインＡＭ（Ｃａｌｃｅｉｎ－ＡＭ）およびエチジウムホモダイマーＩＩＩ（ＥｔｈＤ－ＩＩＩ）で二重染色した場合において、ＥｔｈＤ－ＩＩＩで染色された領域の面積がＣａｌｃｅｉｎ－ＡＭで染色された領域の面積に対して３０％以下である、心筋細胞塊。
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