JPH07100029B2 - 付着依存性動物正常細胞の包埋培養法 - Google Patents
付着依存性動物正常細胞の包埋培養法Info
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- JPH07100029B2 JPH07100029B2 JP62041442A JP4144287A JPH07100029B2 JP H07100029 B2 JPH07100029 B2 JP H07100029B2 JP 62041442 A JP62041442 A JP 62041442A JP 4144287 A JP4144287 A JP 4144287A JP H07100029 B2 JPH07100029 B2 JP H07100029B2
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、付着性の動物正常細胞を大量培養するための
包埋培養法に関する。
包埋培養法に関する。
従来技術 従来、付着性で生育する培養細胞、すなわち、付着依存
性細胞を大量培養するには、細胞を表面積が大きい円筒
型の瓶の表面に付着させ、瓶を回転させて培養する回転
瓶培養又は微粒子担体の表面に細胞を付着させ、これを
撹拌しながら培養を行う、いわゆるマイクロキヤリアー
培養が有効であることが知られている。
性細胞を大量培養するには、細胞を表面積が大きい円筒
型の瓶の表面に付着させ、瓶を回転させて培養する回転
瓶培養又は微粒子担体の表面に細胞を付着させ、これを
撹拌しながら培養を行う、いわゆるマイクロキヤリアー
培養が有効であることが知られている。
しかし、動物正常細胞、例えばt−プラスミノーゲンア
クチベーター産生細胞であるヒト組織由来の正常2倍体
線維芽細胞では上記マイクロキヤリアー培養を行う場
合、細胞の増殖を伴なつて起るブリツジング現象並びに
撹拌による剪断作用のために細胞がマイクロキヤリアー
から剥離し易くなる。また、有用物質生産のための無血
清培地では特に撹拌による剪断力により細胞が担体から
剥離し易く、細胞は死滅して安定した物質生産ができな
くなるという問題がある。
クチベーター産生細胞であるヒト組織由来の正常2倍体
線維芽細胞では上記マイクロキヤリアー培養を行う場
合、細胞の増殖を伴なつて起るブリツジング現象並びに
撹拌による剪断作用のために細胞がマイクロキヤリアー
から剥離し易くなる。また、有用物質生産のための無血
清培地では特に撹拌による剪断力により細胞が担体から
剥離し易く、細胞は死滅して安定した物質生産ができな
くなるという問題がある。
また、遊離性或は付着性のガン細胞や形質転換細胞をア
ルギン酸カルシウム等のゲル体内に包埋して培養するこ
とにより、大量培養を行う方法も知られているが、この
包埋培養法を付着性の動物正常細胞に適用して培養を行
つても細胞の増殖はみられない。
ルギン酸カルシウム等のゲル体内に包埋して培養するこ
とにより、大量培養を行う方法も知られているが、この
包埋培養法を付着性の動物正常細胞に適用して培養を行
つても細胞の増殖はみられない。
しかして、近年、t−プロスミナーゲンアクチベーター
の生産にみられるごとく、動物正常細胞の培養を利用し
て有用な生理活性物質を生産する技術の開発に伴ない、
動物正常細胞大量培養の技術の確立が要望されている。
の生産にみられるごとく、動物正常細胞の培養を利用し
て有用な生理活性物質を生産する技術の開発に伴ない、
動物正常細胞大量培養の技術の確立が要望されている。
発明が解決しようとする課題 本発明は、叙上の状況に鑑みなされたものであつて、付
着性動物正常細胞を高密度で大量培養するための包埋培
養法を提供することを課題とする。
着性動物正常細胞を高密度で大量培養するための包埋培
養法を提供することを課題とする。
本発明者は、付着性動物正常細胞を、微粒子状の生体高
分子担体に付着させたものを、アルギン酸カルシウムの
ゲル体に包埋させることにより、上述したような細胞の
剥離現象を起すことなく高密度に大量培養し得ることに
成功し、本発明をなすに至つた。
分子担体に付着させたものを、アルギン酸カルシウムの
ゲル体に包埋させることにより、上述したような細胞の
剥離現象を起すことなく高密度に大量培養し得ることに
成功し、本発明をなすに至つた。
以下本発明を詳しく説明する。
発明の構成 本発明の特徴は、付着性動物正常細胞を微粒子状の生体
高分子担体に付着させたものを、生理的食塩水にアルギ
ン酸を溶解して除菌したアルギン酸溶液と混合してアル
ギン酸ゲルの最終濃度を0.3〜1.0%となし、次いで該混
合液を、非イオン性界面活性剤を含有させて滅菌処理し
た塩化カルシウム溶液中に滴下して上記正常細胞を包埋
したアルギン酸カルシウムから成る微粒子担体を作成
し、該微粒子担体を血清添加培地等で培養することにあ
る。
高分子担体に付着させたものを、生理的食塩水にアルギ
ン酸を溶解して除菌したアルギン酸溶液と混合してアル
ギン酸ゲルの最終濃度を0.3〜1.0%となし、次いで該混
合液を、非イオン性界面活性剤を含有させて滅菌処理し
た塩化カルシウム溶液中に滴下して上記正常細胞を包埋
したアルギン酸カルシウムから成る微粒子担体を作成
し、該微粒子担体を血清添加培地等で培養することにあ
る。
課題を解決するための手段 本発明では、付着性動物正常細胞を、ゼラチン、コラー
ゲン等のような生体高分子を微粒子状に形成した担体、
すなわち、マイクロキヤリアーに付着させたものを、ア
ルギン酸カルシウムのゲル体内に包埋させることが重要
である。
ゲン等のような生体高分子を微粒子状に形成した担体、
すなわち、マイクロキヤリアーに付着させたものを、ア
ルギン酸カルシウムのゲル体内に包埋させることが重要
である。
上記生体高分子から成るマイクロキヤリアーは、従来公
知の方法により形成することができる。このマイクロキ
ヤリアーに上記正常細胞を付着させるには、マイクロキ
ヤリアー1個当り5〜10個の細胞が付着するような細胞
密度で播種し、炭酸ガスの5%濃度雰囲気のフラン器内
で1〜3時間前培養を行うとよい。
知の方法により形成することができる。このマイクロキ
ヤリアーに上記正常細胞を付着させるには、マイクロキ
ヤリアー1個当り5〜10個の細胞が付着するような細胞
密度で播種し、炭酸ガスの5%濃度雰囲気のフラン器内
で1〜3時間前培養を行うとよい。
上述のようにしてマイクロキヤリアーに付着させた細胞
は、下記のようにして調整したアルギン酸溶液と混合す
る。
は、下記のようにして調整したアルギン酸溶液と混合す
る。
アルギン酸溶液の調製: 0.85%生理的食塩水にアルギン酸を1.6%濃度に溶解
し、この溶液をフイルター濾過により除菌する。この除
菌は当初0.8μmのフイルターを用い、次に0.45μmの
フイルターを用い、最後に0.22μmのフイルターを用い
て行うとよい。
し、この溶液をフイルター濾過により除菌する。この除
菌は当初0.8μmのフイルターを用い、次に0.45μmの
フイルターを用い、最後に0.22μmのフイルターを用い
て行うとよい。
このようにして調製したアルギン酸溶液を、上記細胞を
付着させたマイクロキヤリアーと混合し、その際、アル
ギン酸ゲルの最終濃度が0.3〜1.0%になるように混合を
行う。この場合、混合後のアルギン酸ゲルの最終濃度が
0.3%未満ではゲル強度が低くて撹拌に耐えられず、一
方、1.0%を超えると、ゲル内のマイクロキヤリアー上
での細胞の生育が抑制される。
付着させたマイクロキヤリアーと混合し、その際、アル
ギン酸ゲルの最終濃度が0.3〜1.0%になるように混合を
行う。この場合、混合後のアルギン酸ゲルの最終濃度が
0.3%未満ではゲル強度が低くて撹拌に耐えられず、一
方、1.0%を超えると、ゲル内のマイクロキヤリアー上
での細胞の生育が抑制される。
次いで、上記混合液を、下記のようにして調製した塩化
カルシウム溶液中に滴下してアルギン酸カルシウムから
成る微粒子包埋体担体(マクロキヤリアー)を作成す
る。
カルシウム溶液中に滴下してアルギン酸カルシウムから
成る微粒子包埋体担体(マクロキヤリアー)を作成す
る。
塩化カルシウム溶液の調製: 非イオン性界面活性剤、好ましくはソレビタンモノオレ
アートのエチレンオキシド縮合物(Tween80)の0.001%
〜0.01%添加した50〜100mM濃度の塩化カルシウム水溶
液をオートクレーブで滅菌した後、室温下に放冷する。
ここで用いる塩化カルシウム水溶液に添加した非イオン
性界面活性剤は、アルギン酸ナトリウム溶液の滴下時の
包埋ゲルの形成を容易にするために、塩化カルシウム溶
液の表面張力を下げるのに役立つ。
アートのエチレンオキシド縮合物(Tween80)の0.001%
〜0.01%添加した50〜100mM濃度の塩化カルシウム水溶
液をオートクレーブで滅菌した後、室温下に放冷する。
ここで用いる塩化カルシウム水溶液に添加した非イオン
性界面活性剤は、アルギン酸ナトリウム溶液の滴下時の
包埋ゲルの形成を容易にするために、塩化カルシウム溶
液の表面張力を下げるのに役立つ。
上記塩化カルシウム溶液への上述した混合液の滴下は、
従来、ガン細胞等の包埋培養に用いるマクロキヤリアー
の作成方法に従つて行うとよい。
従来、ガン細胞等の包埋培養に用いるマクロキヤリアー
の作成方法に従つて行うとよい。
すなわち、マクロキヤリアーの作成は、アルギン酸ナト
リウムと細胞付着マイクロキヤリアーとの上述の混合液
を、ノズル(又は滅菌ピペツト)から滅菌塩化カルシウ
ムに0.001〜0.01%のTween80を添加した溶液に滴下する
ことによつて作成される。マクロビースの大きさは、ノ
ズルの径を自由に変えることによつてコントロールする
ことができる。生成したマクロキヤリアー中に細胞の付
着したマイクロキヤリアーが包埋される。上記マイクロ
キィヤリアーにおける細胞濃度は、マイクロキヤリアー
1個当り細胞が5〜40ヶ包埋された程度となる。
リウムと細胞付着マイクロキヤリアーとの上述の混合液
を、ノズル(又は滅菌ピペツト)から滅菌塩化カルシウ
ムに0.001〜0.01%のTween80を添加した溶液に滴下する
ことによつて作成される。マクロビースの大きさは、ノ
ズルの径を自由に変えることによつてコントロールする
ことができる。生成したマクロキヤリアー中に細胞の付
着したマイクロキヤリアーが包埋される。上記マイクロ
キィヤリアーにおける細胞濃度は、マイクロキヤリアー
1個当り細胞が5〜40ヶ包埋された程度となる。
上述のようにして作成された細胞包埋のマクロキヤリヤ
ーは、細胞及びマイクロキヤリアーが、アルギン酸ゲル
に固定された状態にあるため、培養に際して、前述した
ようなマイクロキヤリアーに付着させた細胞のようにブ
リツジング現象や撹拌作用により剥離することがなく、
また、外的環境因子の影響を受けることも少ないので、
細胞自体のロンジビテイ(longevity)も長くなる。
ーは、細胞及びマイクロキヤリアーが、アルギン酸ゲル
に固定された状態にあるため、培養に際して、前述した
ようなマイクロキヤリアーに付着させた細胞のようにブ
リツジング現象や撹拌作用により剥離することがなく、
また、外的環境因子の影響を受けることも少ないので、
細胞自体のロンジビテイ(longevity)も長くなる。
したがつて、このマクロキヤリアーを例えば血清添加培
地で培養すると付着依存性の動物正常細胞を高密度に大
量培養することが可能となる。なお、マイクロキヤリア
ーへの細胞の付着は下記のようにして行い得る。
地で培養すると付着依存性の動物正常細胞を高密度に大
量培養することが可能となる。なお、マイクロキヤリア
ーへの細胞の付着は下記のようにして行い得る。
生体高分子(ゼラチン、コラーゲン等)から成るマイク
ロキヤリアーをPBSで膨潤させ、次いで121℃で10〜15分
間オートクレーブで滅菌する。オートクレーブで滅菌し
たマイクロキヤリアー懸濁液のPBSを、10%FCSを加えた
細胞培養用培地(DMEM又はMEM)で置換後、マイクロキ
ヤリアー培養用スピナフラスコ中で付着性正常細胞をマ
イクロキヤリアー1個当り細胞が5〜10個程度付着する
ように接種し、5%CO2雰囲気中に1〜4時間かんけつ
的に撹拌する(30分間静置、1分間撹拌、これを1〜4
時間繰返す)。細胞が完全にマイクロキヤリアーに付着
後、所定濃度のアルギン酸ナトリウム溶液と混合する
(混合液中のアルギン酸ナトリウムの最終濃度0.3〜1.0
%にし、細胞付着マイクロキヤリアーは所望の濃度に自
由に設定することができる)。
ロキヤリアーをPBSで膨潤させ、次いで121℃で10〜15分
間オートクレーブで滅菌する。オートクレーブで滅菌し
たマイクロキヤリアー懸濁液のPBSを、10%FCSを加えた
細胞培養用培地(DMEM又はMEM)で置換後、マイクロキ
ヤリアー培養用スピナフラスコ中で付着性正常細胞をマ
イクロキヤリアー1個当り細胞が5〜10個程度付着する
ように接種し、5%CO2雰囲気中に1〜4時間かんけつ
的に撹拌する(30分間静置、1分間撹拌、これを1〜4
時間繰返す)。細胞が完全にマイクロキヤリアーに付着
後、所定濃度のアルギン酸ナトリウム溶液と混合する
(混合液中のアルギン酸ナトリウムの最終濃度0.3〜1.0
%にし、細胞付着マイクロキヤリアーは所望の濃度に自
由に設定することができる)。
以上述べたごとく、本発明に従つて、付着依存性の動物
正常細胞を、生体高分子から成るマイクロキヤリアーに
付着させたものをアルギン酸カルシウムのゲル体内に包
埋させて作成したマクロキヤリアーとして培養すること
により、従来困難とされていた上記正常細胞の大量培養
が可能となるので、本発明は、正常細胞の培養により有
用な生理活性物質を生産する技術上非常に有益であると
いえる。
正常細胞を、生体高分子から成るマイクロキヤリアーに
付着させたものをアルギン酸カルシウムのゲル体内に包
埋させて作成したマクロキヤリアーとして培養すること
により、従来困難とされていた上記正常細胞の大量培養
が可能となるので、本発明は、正常細胞の培養により有
用な生理活性物質を生産する技術上非常に有益であると
いえる。
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明する。
実施例1 ヒト胎児肺由来正常2倍体線維芽細胞IMR−90(ATCC、C
CL−186)を、細胞培養フラスコ(T−175cm2)で80%
集密状態まで培養を行つた。得られた培養細胞を滅菌し
たPBSで洗浄し、倍地成分を除去した後、トリプシン処
理を行つて総細胞数5×106個を得た。得られた細胞を1
0%FCSを添加したDMEM(ダルベツコ変性イーグル培地、
Dulbecco's Modified Eagle Medium)1.5mlに懸濁し
た。
CL−186)を、細胞培養フラスコ(T−175cm2)で80%
集密状態まで培養を行つた。得られた培養細胞を滅菌し
たPBSで洗浄し、倍地成分を除去した後、トリプシン処
理を行つて総細胞数5×106個を得た。得られた細胞を1
0%FCSを添加したDMEM(ダルベツコ変性イーグル培地、
Dulbecco's Modified Eagle Medium)1.5mlに懸濁し
た。
一方、ゼラチンから形成されたマイクロキヤリアー(ゼ
リービース、KCバイオロジカル社製)をPBSで膨潤さ
せ、オートクレーブで滅菌後、PBSを10%FCSを添加した
DMEMで置換し、マイクロキヤリアー濃度を24μg/mlとな
るように調製した。50ml容マイクロキヤリアー培養スピ
ナボトルに上記の細胞懸濁液15ml(細胞数5×106)と
マイクロキヤリアー懸濁液5ml(マイクロキヤリアー量1
20mg)を入れ、ヘツドスペースを5%CO2で置換後、30
分間静置、1分間撹拌の操作をかんけつ的に2〜3時間
繰返し行つて撹拌培養した。細胞がマイクロキヤリアー
に完全に付着した後、低速遠心(500〜600rpm、5分
間)又は静置によりマイクロキヤリアーを沈下させ、上
清の培地を抜き取ることにより、細胞付着マイクロキヤ
リアーを収集した。
リービース、KCバイオロジカル社製)をPBSで膨潤さ
せ、オートクレーブで滅菌後、PBSを10%FCSを添加した
DMEMで置換し、マイクロキヤリアー濃度を24μg/mlとな
るように調製した。50ml容マイクロキヤリアー培養スピ
ナボトルに上記の細胞懸濁液15ml(細胞数5×106)と
マイクロキヤリアー懸濁液5ml(マイクロキヤリアー量1
20mg)を入れ、ヘツドスペースを5%CO2で置換後、30
分間静置、1分間撹拌の操作をかんけつ的に2〜3時間
繰返し行つて撹拌培養した。細胞がマイクロキヤリアー
に完全に付着した後、低速遠心(500〜600rpm、5分
間)又は静置によりマイクロキヤリアーを沈下させ、上
清の培地を抜き取ることにより、細胞付着マイクロキヤ
リアーを収集した。
この細胞付着マイクロキヤリアーを30%FCSを含むDMEM1
5mlに懸濁し、25mlの濾過滅菌を行つた0.48%のアルギ
ン酸ナトリウム溶液と混合した。
5mlに懸濁し、25mlの濾過滅菌を行つた0.48%のアルギ
ン酸ナトリウム溶液と混合した。
得られた混合液40mlを18ゲージの注射針のついた滅菌注
射筒に入れ、圧力を加えながら、滅菌した0.01%のTwee
n80を含む50mMの塩化カルシウム溶液に滴下して細胞付
着マイクロキヤリアーを包埋したアルギン酸ゲルマクロ
キヤリアーを作成した。最終アルギン酸ナトリウムの濃
度は0.3%であつた。
射筒に入れ、圧力を加えながら、滅菌した0.01%のTwee
n80を含む50mMの塩化カルシウム溶液に滴下して細胞付
着マイクロキヤリアーを包埋したアルギン酸ゲルマクロ
キヤリアーを作成した。最終アルギン酸ナトリウムの濃
度は0.3%であつた。
次に、上記細胞付着マイクロキヤリアーの懸濁液とアル
ギン酸ナトリウム溶液との混合液40mlを、各群5mlづつ
に等分しながら、計8群のマクロキヤリアーを形成し
た。各マクロキヤリアーを作成後、30〜60分以内に塩化
カルシウム溶液を生理的食塩水で置換洗浄し、次いで10
%FCSを添加し、DMEMで置洗浄した。
ギン酸ナトリウム溶液との混合液40mlを、各群5mlづつ
に等分しながら、計8群のマクロキヤリアーを形成し
た。各マクロキヤリアーを作成後、30〜60分以内に塩化
カルシウム溶液を生理的食塩水で置換洗浄し、次いで10
%FCSを添加し、DMEMで置洗浄した。
上述のようにして培地で洗浄したマクロキヤリアーを、
γ線で滅菌した250ml容ポリスチレンボトル(コーニン
グ社製)に移し、10%FCS添加DMEMを各群に50mlそれぞ
れ添加し、ヘツドスペースに5%CO2を吹き込み、細菌
培養用振とう培養機にセツトし、40rpmで振とうしなが
ら、37℃で10日間培養を行つた。
γ線で滅菌した250ml容ポリスチレンボトル(コーニン
グ社製)に移し、10%FCS添加DMEMを各群に50mlそれぞ
れ添加し、ヘツドスペースに5%CO2を吹き込み、細菌
培養用振とう培養機にセツトし、40rpmで振とうしなが
ら、37℃で10日間培養を行つた。
培養後、上記8群のうち4群は細胞数の測定に、他の4
群はt−プラスミノーゲンアクチベーターの生産に用い
た。t−プラスミノーゲンアクチベーターの生産は、マ
クロキヤリアー培養液(37℃で、10日間培養したもの)
からピペツトで培地だけ抜き取り、生理的食塩水又はPA
Sでマクロキヤリアーを洗浄して培地成分を除去した
後、1%プロテオースペプトン及び0.01%Tween80を添
加したDMEM100mlを加え、37℃で7日間40rpmで同様に振
とうしながら培養して行つた。ここで0.01%Tween80を
培地に添加するのは、t−プラスミノーゲンアクチベー
ターをマクロキヤリアー中で吸着させずに、マクロキヤ
リアーから培地に円滑に放出させるためである。
群はt−プラスミノーゲンアクチベーターの生産に用い
た。t−プラスミノーゲンアクチベーターの生産は、マ
クロキヤリアー培養液(37℃で、10日間培養したもの)
からピペツトで培地だけ抜き取り、生理的食塩水又はPA
Sでマクロキヤリアーを洗浄して培地成分を除去した
後、1%プロテオースペプトン及び0.01%Tween80を添
加したDMEM100mlを加え、37℃で7日間40rpmで同様に振
とうしながら培養して行つた。ここで0.01%Tween80を
培地に添加するのは、t−プラスミノーゲンアクチベー
ターをマクロキヤリアー中で吸着させずに、マクロキヤ
リアーから培地に円滑に放出させるためである。
また、上記培養後の細胞数の測定は、アルギン酸ゲルか
らなるマクロキヤリアーを100mMをEDTA(エチレンジア
ミンテトラ酢酸)で溶解した後、細胞付着マイクロキヤ
リアーを遠心分離(600〜900rpm、10分間)により収集
してトリプシン処理を行つて、マイクロキヤリアーから
細胞を剥離して計測した。
らなるマクロキヤリアーを100mMをEDTA(エチレンジア
ミンテトラ酢酸)で溶解した後、細胞付着マイクロキヤ
リアーを遠心分離(600〜900rpm、10分間)により収集
してトリプシン処理を行つて、マイクロキヤリアーから
細胞を剥離して計測した。
上記計測した結果、各ボトルの平均細胞数は、培養開始
時で5×105/ボトル(マイクロキヤリアー1個当り細胞
平均8個)のものが、37℃で10日間培養後、3.5×106/
ボトルであつた。
時で5×105/ボトル(マイクロキヤリアー1個当り細胞
平均8個)のものが、37℃で10日間培養後、3.5×106/
ボトルであつた。
また、一方、t−プラスミノーゲンアクチベーターの培
養日数による生産状況は表1のとおりであつた。
養日数による生産状況は表1のとおりであつた。
実施例2 ヒト胎児肺由来正常2倍体線維芽細胞IMR−90(ATCC、C
CL−186)を実施例1と同様にT−フラスコで培養して
種細胞4.5×106を得、マイクロキヤリアー(ゼリービー
ズ、KCバイオロジカル社製)120mgに付着させた。この
細胞付着マイクロキヤリアー(マイクロキヤリアー量12
0mg)の懸濁液15mlを、濾過滅菌した0.8/のアルギン酸
ナトリウム溶液25mlと混合し、混合液40mlを得た。
CL−186)を実施例1と同様にT−フラスコで培養して
種細胞4.5×106を得、マイクロキヤリアー(ゼリービー
ズ、KCバイオロジカル社製)120mgに付着させた。この
細胞付着マイクロキヤリアー(マイクロキヤリアー量12
0mg)の懸濁液15mlを、濾過滅菌した0.8/のアルギン酸
ナトリウム溶液25mlと混合し、混合液40mlを得た。
この混合液(40ml)を各5mlづつ8等分しながら、5ml用
ピペツトの尖端から0.01%Tween80を含む50mM CaCl2溶
液にそれぞれ滴下し、アルギン酸ビースマクロキヤリア
ーを作成した。このマクロキヤリアーのアルギン酸ナト
リウムの最終濃度は0.5%となり、細胞付着マイクロキ
ヤリアーはマクロキヤリアー内に包埋固定された。な
お、上記のように5ml用ピペツトの大端を滴下のためノ
ズルに用いた時には、形成したマクロキヤリアーの径は
約4〜5mmであつた。
ピペツトの尖端から0.01%Tween80を含む50mM CaCl2溶
液にそれぞれ滴下し、アルギン酸ビースマクロキヤリア
ーを作成した。このマクロキヤリアーのアルギン酸ナト
リウムの最終濃度は0.5%となり、細胞付着マイクロキ
ヤリアーはマクロキヤリアー内に包埋固定された。な
お、上記のように5ml用ピペツトの大端を滴下のためノ
ズルに用いた時には、形成したマクロキヤリアーの径は
約4〜5mmであつた。
次に、このようにして得られた各群(上記8等分した
群)のマクロキヤリアーを、実施例1と同様にして洗浄
後、10%FCS添加DMEM50mlに懸濁後、250ml容ポリスチレ
ンボトル(コーニング社製)に移し、細菌培養用振とう
培養器で回転数100rpmで振とうしながら、37℃で10日間
培養した。
群)のマクロキヤリアーを、実施例1と同様にして洗浄
後、10%FCS添加DMEM50mlに懸濁後、250ml容ポリスチレ
ンボトル(コーニング社製)に移し、細菌培養用振とう
培養器で回転数100rpmで振とうしながら、37℃で10日間
培養した。
培養後、8群のうちの4群は細胞数測定に用い、たの4
群はt−プラスミノーゲンアクチベーターの生産に用い
た。
群はt−プラスミノーゲンアクチベーターの生産に用い
た。
t−プラスミノーゲンアクチベーターの生産は、回転数
を100rpmとした以外は、実施例1に記載したと同様の手
順で行つた。
を100rpmとした以外は、実施例1に記載したと同様の手
順で行つた。
細胞数の測定並びにt−プラスミノーゲンアクチベータ
ーの生産の結果は表2並びに表3に示すとおりである。
ーの生産の結果は表2並びに表3に示すとおりである。
実施例3 ヒト胎児腎由来正常2倍体線維芽細胞Flow4000を、実施
例1と同様にしてT−フラスコで培養して種細胞7.1×1
06を得、マイクロキヤリアー(コラーゲンビーズ、フナ
イ薬品社製)168mgに付着させた。
例1と同様にしてT−フラスコで培養して種細胞7.1×1
06を得、マイクロキヤリアー(コラーゲンビーズ、フナ
イ薬品社製)168mgに付着させた。
この細胞付着マイクロキヤリアー(マイクロキヤリアー
量168mg)の懸濁液18.5mlと、濾過滅菌した1.6%のアル
ギン酸ナトリウム溶液31.5mlを混合し、計50mlの混合液
とした。
量168mg)の懸濁液18.5mlと、濾過滅菌した1.6%のアル
ギン酸ナトリウム溶液31.5mlを混合し、計50mlの混合液
とした。
この混合液(50ml)を各5mlづつ10等分しながら、5ml用
ピペツトの尖端から、0.01%Tween80を含む50mM CaCl2
溶液にそれぞれ滴下してアルギン酸ビーズマクロキヤリ
アーを作成した。このマクロキヤリアーのアルギン酸ナ
トリウムの最終濃度は1.0%となり、細胞付着マイクロ
キヤリアー(コラーゲンビーズ)は、上記マクロキヤリ
アー内に包埋固定加された。なお、マクロビーズの径は
約4mmであつた。
ピペツトの尖端から、0.01%Tween80を含む50mM CaCl2
溶液にそれぞれ滴下してアルギン酸ビーズマクロキヤリ
アーを作成した。このマクロキヤリアーのアルギン酸ナ
トリウムの最終濃度は1.0%となり、細胞付着マイクロ
キヤリアー(コラーゲンビーズ)は、上記マクロキヤリ
アー内に包埋固定加された。なお、マクロビーズの径は
約4mmであつた。
上述のようにして得られた各群(10群)のマクロキヤリ
アーを洗浄した後、10%FCS添加DMEM50mlに懸濁させた
後、250ml容ポリスチレンボトル(コーニング社製)に
移し、細菌培養用振とう培養機で回転数100rpmで振とう
しながら、37℃で10日間培養した。
アーを洗浄した後、10%FCS添加DMEM50mlに懸濁させた
後、250ml容ポリスチレンボトル(コーニング社製)に
移し、細菌培養用振とう培養機で回転数100rpmで振とう
しながら、37℃で10日間培養した。
培養後、10群のうちの5群は細胞数の測定に用い、他の
5群はt−プラスミノーゲンアクチベーターの生産に用
いた。
5群はt−プラスミノーゲンアクチベーターの生産に用
いた。
t−プラスミノーゲンアクチベーターの生産は、回転数
100rpmとした以外は、実施例1に記載したと同様の手順
で行つた。
100rpmとした以外は、実施例1に記載したと同様の手順
で行つた。
細胞数測定並びにt−プラスミノーゲンアクチベーター
生産の結果は表4並びに表5に示すとおりである。
生産の結果は表4並びに表5に示すとおりである。
Claims (4)
- 【請求項1】付着性動物正常細胞を微粒子状の生体高分
子担体に付着させたものを、生理的食塩水にアルギン酸
を溶解して除菌したアルギン酸溶液と混合してアルギン
酸ゲルの最終濃度を0.3〜1.0%となし、次いで該混合液
を、非イオン性界面活性剤を添加して含有させた滅菌処
理した塩化カルシウム溶液中に滴下して上記担体に付着
の正常細胞を包埋したアルギン酸カルシウムから成る微
粒子担体(マクロ キヤリアー)を作成し、該微粒子担
体を培地で培養することを特徴とする付着性動物正常細
胞の包埋培養法。 - 【請求項2】上記動物正常細胞を、生体高分子担体に1
×105/mlキヤリアー以上播種し、5%炭酸ガス雰囲気中
で1〜3時間前培養を行つて該担体に付着させる特許請
求の範囲第(1)項記載の包埋培養法。 - 【請求項3】アルギン酸溶液は、0.85%生理的食塩水に
アルギン酸を1.6%の濃度に溶解し、フイルター濾過に
より除菌したものである特許請求の範囲第(1)項記載
の包埋培養法。 - 【請求項4】塩化カルシウム溶液は、非イオン性界面活
性剤としてソルビタモンノオレアートのエチレンオキシ
ド縮合物を0.001〜0.01%を含有させた塩化カルシウム
濃度が50mMの溶液である特許請求の範囲第(1)項記載
の包埋培養法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP62041442A JPH07100029B2 (ja) | 1987-02-26 | 1987-02-26 | 付着依存性動物正常細胞の包埋培養法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP62041442A JPH07100029B2 (ja) | 1987-02-26 | 1987-02-26 | 付着依存性動物正常細胞の包埋培養法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS63209581A JPS63209581A (ja) | 1988-08-31 |
JPH07100029B2 true JPH07100029B2 (ja) | 1995-11-01 |
Family
ID=12608483
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP62041442A Expired - Lifetime JPH07100029B2 (ja) | 1987-02-26 | 1987-02-26 | 付着依存性動物正常細胞の包埋培養法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH07100029B2 (ja) |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1989010397A1 (en) * | 1988-04-18 | 1989-11-02 | Nitta Gelatin Inc. | Process for culturing animal cells on a large scale and process for preparing supporting substrate for that process |
US9664671B2 (en) | 2012-07-24 | 2017-05-30 | Nissan Chemical Industries, Ltd. | Culture medium composition and method of culturing cell or tissue using thereof |
CN108753679A (zh) | 2012-07-24 | 2018-11-06 | 日产化学工业株式会社 | 培养基组合物以及使用所述组合物培养细胞或组织的方法 |
US10017805B2 (en) | 2012-08-23 | 2018-07-10 | Nissan Chemical Industries, Ltd. | Enhancing ingredients for protein production from various cells |
CN106414707A (zh) | 2014-01-23 | 2017-02-15 | 日产化学工业株式会社 | 培养基组合物的制造方法 |
TWI719697B (zh) | 2014-01-23 | 2021-02-21 | 日商日產化學股份有限公司 | 液體組成物 |
JP7034467B2 (ja) * | 2017-10-20 | 2022-03-14 | 国立大学法人 東京大学 | 細胞の三次元培養方法、細胞構造体、細胞構造体の製造方法、細胞の運搬方法及び細胞の保存方法 |
-
1987
- 1987-02-26 JP JP62041442A patent/JPH07100029B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS63209581A (ja) | 1988-08-31 |
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