JPH07100029B2 - 付着依存性動物正常細胞の包埋培養法 - Google Patents
付着依存性動物正常細胞の包埋培養法Info
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- JPH07100029B2 JPH07100029B2 JP62041442A JP4144287A JPH07100029B2 JP H07100029 B2 JPH07100029 B2 JP H07100029B2 JP 62041442 A JP62041442 A JP 62041442A JP 4144287 A JP4144287 A JP 4144287A JP H07100029 B2 JPH07100029 B2 JP H07100029B2
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、付着性の動物正常細胞を大量培養するための
包埋培養法に関する。
包埋培養法に関する。
従来技術 従来、付着性で生育する培養細胞、すなわち、付着依存
性細胞を大量培養するには、細胞を表面積が大きい円筒
型の瓶の表面に付着させ、瓶を回転させて培養する回転
瓶培養又は微粒子担体の表面に細胞を付着させ、これを
撹拌しながら培養を行う、いわゆるマイクロキヤリアー
培養が有効であることが知られている。
性細胞を大量培養するには、細胞を表面積が大きい円筒
型の瓶の表面に付着させ、瓶を回転させて培養する回転
瓶培養又は微粒子担体の表面に細胞を付着させ、これを
撹拌しながら培養を行う、いわゆるマイクロキヤリアー
培養が有効であることが知られている。
しかし、動物正常細胞、例えばｔ−プラスミノーゲンア
クチベーター産生細胞であるヒト組織由来の正常２倍体
線維芽細胞では上記マイクロキヤリアー培養を行う場
合、細胞の増殖を伴なつて起るブリツジング現象並びに
撹拌による剪断作用のために細胞がマイクロキヤリアー
から剥離し易くなる。また、有用物質生産のための無血
清培地では特に撹拌による剪断力により細胞が担体から
剥離し易く、細胞は死滅して安定した物質生産ができな
くなるという問題がある。
クチベーター産生細胞であるヒト組織由来の正常２倍体
線維芽細胞では上記マイクロキヤリアー培養を行う場
合、細胞の増殖を伴なつて起るブリツジング現象並びに
撹拌による剪断作用のために細胞がマイクロキヤリアー
から剥離し易くなる。また、有用物質生産のための無血
清培地では特に撹拌による剪断力により細胞が担体から
剥離し易く、細胞は死滅して安定した物質生産ができな
くなるという問題がある。
また、遊離性或は付着性のガン細胞や形質転換細胞をア
ルギン酸カルシウム等のゲル体内に包埋して培養するこ
とにより、大量培養を行う方法も知られているが、この
包埋培養法を付着性の動物正常細胞に適用して培養を行
つても細胞の増殖はみられない。
ルギン酸カルシウム等のゲル体内に包埋して培養するこ
とにより、大量培養を行う方法も知られているが、この
包埋培養法を付着性の動物正常細胞に適用して培養を行
つても細胞の増殖はみられない。
しかして、近年、ｔ−プロスミナーゲンアクチベーター
の生産にみられるごとく、動物正常細胞の培養を利用し
て有用な生理活性物質を生産する技術の開発に伴ない、
動物正常細胞大量培養の技術の確立が要望されている。
の生産にみられるごとく、動物正常細胞の培養を利用し
て有用な生理活性物質を生産する技術の開発に伴ない、
動物正常細胞大量培養の技術の確立が要望されている。
発明が解決しようとする課題 本発明は、叙上の状況に鑑みなされたものであつて、付
着性動物正常細胞を高密度で大量培養するための包埋培
養法を提供することを課題とする。
着性動物正常細胞を高密度で大量培養するための包埋培
養法を提供することを課題とする。
本発明者は、付着性動物正常細胞を、微粒子状の生体高
分子担体に付着させたものを、アルギン酸カルシウムの
ゲル体に包埋させることにより、上述したような細胞の
剥離現象を起すことなく高密度に大量培養し得ることに
成功し、本発明をなすに至つた。
分子担体に付着させたものを、アルギン酸カルシウムの
ゲル体に包埋させることにより、上述したような細胞の
剥離現象を起すことなく高密度に大量培養し得ることに
成功し、本発明をなすに至つた。
以下本発明を詳しく説明する。
発明の構成 本発明の特徴は、付着性動物正常細胞を微粒子状の生体
高分子担体に付着させたものを、生理的食塩水にアルギ
ン酸を溶解して除菌したアルギン酸溶液と混合してアル
ギン酸ゲルの最終濃度を0.3〜1.0％となし、次いで該混
合液を、非イオン性界面活性剤を含有させて滅菌処理し
た塩化カルシウム溶液中に滴下して上記正常細胞を包埋
したアルギン酸カルシウムから成る微粒子担体を作成
し、該微粒子担体を血清添加培地等で培養することにあ
る。
高分子担体に付着させたものを、生理的食塩水にアルギ
ン酸を溶解して除菌したアルギン酸溶液と混合してアル
ギン酸ゲルの最終濃度を0.3〜1.0％となし、次いで該混
合液を、非イオン性界面活性剤を含有させて滅菌処理し
た塩化カルシウム溶液中に滴下して上記正常細胞を包埋
したアルギン酸カルシウムから成る微粒子担体を作成
し、該微粒子担体を血清添加培地等で培養することにあ
る。
課題を解決するための手段 本発明では、付着性動物正常細胞を、ゼラチン、コラー
ゲン等のような生体高分子を微粒子状に形成した担体、
すなわち、マイクロキヤリアーに付着させたものを、ア
ルギン酸カルシウムのゲル体内に包埋させることが重要
である。
ゲン等のような生体高分子を微粒子状に形成した担体、
すなわち、マイクロキヤリアーに付着させたものを、ア
ルギン酸カルシウムのゲル体内に包埋させることが重要
である。
上記生体高分子から成るマイクロキヤリアーは、従来公
知の方法により形成することができる。このマイクロキ
ヤリアーに上記正常細胞を付着させるには、マイクロキ
ヤリアー１個当り５〜10個の細胞が付着するような細胞
密度で播種し、炭酸ガスの５％濃度雰囲気のフラン器内
で１〜３時間前培養を行うとよい。
知の方法により形成することができる。このマイクロキ
ヤリアーに上記正常細胞を付着させるには、マイクロキ
ヤリアー１個当り５〜10個の細胞が付着するような細胞
密度で播種し、炭酸ガスの５％濃度雰囲気のフラン器内
で１〜３時間前培養を行うとよい。
上述のようにしてマイクロキヤリアーに付着させた細胞
は、下記のようにして調整したアルギン酸溶液と混合す
る。
は、下記のようにして調整したアルギン酸溶液と混合す
る。
アルギン酸溶液の調製： 0.85％生理的食塩水にアルギン酸を1.6％濃度に溶解
し、この溶液をフイルター濾過により除菌する。この除
菌は当初0.8μｍのフイルターを用い、次に0.45μｍの
フイルターを用い、最後に0.22μｍのフイルターを用い
て行うとよい。
し、この溶液をフイルター濾過により除菌する。この除
菌は当初0.8μｍのフイルターを用い、次に0.45μｍの
フイルターを用い、最後に0.22μｍのフイルターを用い
て行うとよい。
このようにして調製したアルギン酸溶液を、上記細胞を
付着させたマイクロキヤリアーと混合し、その際、アル
ギン酸ゲルの最終濃度が0.3〜1.0％になるように混合を
行う。この場合、混合後のアルギン酸ゲルの最終濃度が
0.3％未満ではゲル強度が低くて撹拌に耐えられず、一
方、1.0％を超えると、ゲル内のマイクロキヤリアー上
での細胞の生育が抑制される。
付着させたマイクロキヤリアーと混合し、その際、アル
ギン酸ゲルの最終濃度が0.3〜1.0％になるように混合を
行う。この場合、混合後のアルギン酸ゲルの最終濃度が
0.3％未満ではゲル強度が低くて撹拌に耐えられず、一
方、1.0％を超えると、ゲル内のマイクロキヤリアー上
での細胞の生育が抑制される。
次いで、上記混合液を、下記のようにして調製した塩化
カルシウム溶液中に滴下してアルギン酸カルシウムから
成る微粒子包埋体担体（マクロキヤリアー）を作成す
る。
カルシウム溶液中に滴下してアルギン酸カルシウムから
成る微粒子包埋体担体（マクロキヤリアー）を作成す
る。
塩化カルシウム溶液の調製： 非イオン性界面活性剤、好ましくはソレビタンモノオレ
アートのエチレンオキシド縮合物（Tween80）の0.001％
〜0.01％添加した50〜100mM濃度の塩化カルシウム水溶
液をオートクレーブで滅菌した後、室温下に放冷する。
ここで用いる塩化カルシウム水溶液に添加した非イオン
性界面活性剤は、アルギン酸ナトリウム溶液の滴下時の
包埋ゲルの形成を容易にするために、塩化カルシウム溶
液の表面張力を下げるのに役立つ。
アートのエチレンオキシド縮合物（Tween80）の0.001％
〜0.01％添加した50〜100mM濃度の塩化カルシウム水溶
液をオートクレーブで滅菌した後、室温下に放冷する。
ここで用いる塩化カルシウム水溶液に添加した非イオン
性界面活性剤は、アルギン酸ナトリウム溶液の滴下時の
包埋ゲルの形成を容易にするために、塩化カルシウム溶
液の表面張力を下げるのに役立つ。
上記塩化カルシウム溶液への上述した混合液の滴下は、
従来、ガン細胞等の包埋培養に用いるマクロキヤリアー
の作成方法に従つて行うとよい。
従来、ガン細胞等の包埋培養に用いるマクロキヤリアー
の作成方法に従つて行うとよい。
すなわち、マクロキヤリアーの作成は、アルギン酸ナト
リウムと細胞付着マイクロキヤリアーとの上述の混合液
を、ノズル（又は滅菌ピペツト）から滅菌塩化カルシウ
ムに0.001〜0.01％のTween80を添加した溶液に滴下する
ことによつて作成される。マクロビースの大きさは、ノ
ズルの径を自由に変えることによつてコントロールする
ことができる。生成したマクロキヤリアー中に細胞の付
着したマイクロキヤリアーが包埋される。上記マイクロ
キィヤリアーにおける細胞濃度は、マイクロキヤリアー
１個当り細胞が５〜40ヶ包埋された程度となる。
リウムと細胞付着マイクロキヤリアーとの上述の混合液
を、ノズル（又は滅菌ピペツト）から滅菌塩化カルシウ
ムに0.001〜0.01％のTween80を添加した溶液に滴下する
ことによつて作成される。マクロビースの大きさは、ノ
ズルの径を自由に変えることによつてコントロールする
ことができる。生成したマクロキヤリアー中に細胞の付
着したマイクロキヤリアーが包埋される。上記マイクロ
キィヤリアーにおける細胞濃度は、マイクロキヤリアー
１個当り細胞が５〜40ヶ包埋された程度となる。
上述のようにして作成された細胞包埋のマクロキヤリヤ
ーは、細胞及びマイクロキヤリアーが、アルギン酸ゲル
に固定された状態にあるため、培養に際して、前述した
ようなマイクロキヤリアーに付着させた細胞のようにブ
リツジング現象や撹拌作用により剥離することがなく、
また、外的環境因子の影響を受けることも少ないので、
細胞自体のロンジビテイ（longevity）も長くなる。
ーは、細胞及びマイクロキヤリアーが、アルギン酸ゲル
に固定された状態にあるため、培養に際して、前述した
ようなマイクロキヤリアーに付着させた細胞のようにブ
リツジング現象や撹拌作用により剥離することがなく、
また、外的環境因子の影響を受けることも少ないので、
細胞自体のロンジビテイ（longevity）も長くなる。
したがつて、このマクロキヤリアーを例えば血清添加培
地で培養すると付着依存性の動物正常細胞を高密度に大
量培養することが可能となる。なお、マイクロキヤリア
ーへの細胞の付着は下記のようにして行い得る。
地で培養すると付着依存性の動物正常細胞を高密度に大
量培養することが可能となる。なお、マイクロキヤリア
ーへの細胞の付着は下記のようにして行い得る。
生体高分子（ゼラチン、コラーゲン等）から成るマイク
ロキヤリアーをPBSで膨潤させ、次いで121℃で10〜15分
間オートクレーブで滅菌する。オートクレーブで滅菌し
たマイクロキヤリアー懸濁液のPBSを、10％FCSを加えた
細胞培養用培地（DMEM又はMEM）で置換後、マイクロキ
ヤリアー培養用スピナフラスコ中で付着性正常細胞をマ
イクロキヤリアー１個当り細胞が５〜10個程度付着する
ように接種し、５％CO2雰囲気中に１〜４時間かんけつ
的に撹拌する（30分間静置、１分間撹拌、これを１〜４
時間繰返す）。細胞が完全にマイクロキヤリアーに付着
後、所定濃度のアルギン酸ナトリウム溶液と混合する
（混合液中のアルギン酸ナトリウムの最終濃度0.3〜1.0
％にし、細胞付着マイクロキヤリアーは所望の濃度に自
由に設定することができる）。
ロキヤリアーをPBSで膨潤させ、次いで121℃で10〜15分
間オートクレーブで滅菌する。オートクレーブで滅菌し
たマイクロキヤリアー懸濁液のPBSを、10％FCSを加えた
細胞培養用培地（DMEM又はMEM）で置換後、マイクロキ
ヤリアー培養用スピナフラスコ中で付着性正常細胞をマ
イクロキヤリアー１個当り細胞が５〜10個程度付着する
ように接種し、５％CO2雰囲気中に１〜４時間かんけつ
的に撹拌する（30分間静置、１分間撹拌、これを１〜４
時間繰返す）。細胞が完全にマイクロキヤリアーに付着
後、所定濃度のアルギン酸ナトリウム溶液と混合する
（混合液中のアルギン酸ナトリウムの最終濃度0.3〜1.0
％にし、細胞付着マイクロキヤリアーは所望の濃度に自
由に設定することができる）。
以上述べたごとく、本発明に従つて、付着依存性の動物
正常細胞を、生体高分子から成るマイクロキヤリアーに
付着させたものをアルギン酸カルシウムのゲル体内に包
埋させて作成したマクロキヤリアーとして培養すること
により、従来困難とされていた上記正常細胞の大量培養
が可能となるので、本発明は、正常細胞の培養により有
用な生理活性物質を生産する技術上非常に有益であると
いえる。
正常細胞を、生体高分子から成るマイクロキヤリアーに
付着させたものをアルギン酸カルシウムのゲル体内に包
埋させて作成したマクロキヤリアーとして培養すること
により、従来困難とされていた上記正常細胞の大量培養
が可能となるので、本発明は、正常細胞の培養により有
用な生理活性物質を生産する技術上非常に有益であると
いえる。
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明する。
実施例１ ヒト胎児肺由来正常２倍体線維芽細胞IMR−90（ATCC、C
CL−186）を、細胞培養フラスコ（Ｔ−175cm2）で80％
集密状態まで培養を行つた。得られた培養細胞を滅菌し
たPBSで洗浄し、倍地成分を除去した後、トリプシン処
理を行つて総細胞数５×106個を得た。得られた細胞を1
0％FCSを添加したDMEM（ダルベツコ変性イーグル培地、
Dulbecco's Modified Eagle Medium）1.5mlに懸濁し
た。
CL−186）を、細胞培養フラスコ（Ｔ−175cm2）で80％
集密状態まで培養を行つた。得られた培養細胞を滅菌し
たPBSで洗浄し、倍地成分を除去した後、トリプシン処
理を行つて総細胞数５×106個を得た。得られた細胞を1
0％FCSを添加したDMEM（ダルベツコ変性イーグル培地、
Dulbecco's Modified Eagle Medium）1.5mlに懸濁し
た。
一方、ゼラチンから形成されたマイクロキヤリアー（ゼ
リービース、KCバイオロジカル社製）をPBSで膨潤さ
せ、オートクレーブで滅菌後、PBSを10％FCSを添加した
DMEMで置換し、マイクロキヤリアー濃度を24μg/mlとな
るように調製した。50ml容マイクロキヤリアー培養スピ
ナボトルに上記の細胞懸濁液15ml（細胞数５×106）と
マイクロキヤリアー懸濁液5ml（マイクロキヤリアー量1
20mg）を入れ、ヘツドスペースを５％CO2で置換後、30
分間静置、１分間撹拌の操作をかんけつ的に２〜３時間
繰返し行つて撹拌培養した。細胞がマイクロキヤリアー
に完全に付着した後、低速遠心（500〜600rpm、５分
間）又は静置によりマイクロキヤリアーを沈下させ、上
清の培地を抜き取ることにより、細胞付着マイクロキヤ
リアーを収集した。
リービース、KCバイオロジカル社製）をPBSで膨潤さ
せ、オートクレーブで滅菌後、PBSを10％FCSを添加した
DMEMで置換し、マイクロキヤリアー濃度を24μg/mlとな
るように調製した。50ml容マイクロキヤリアー培養スピ
ナボトルに上記の細胞懸濁液15ml（細胞数５×106）と
マイクロキヤリアー懸濁液5ml（マイクロキヤリアー量1
20mg）を入れ、ヘツドスペースを５％CO2で置換後、30
分間静置、１分間撹拌の操作をかんけつ的に２〜３時間
繰返し行つて撹拌培養した。細胞がマイクロキヤリアー
に完全に付着した後、低速遠心（500〜600rpm、５分
間）又は静置によりマイクロキヤリアーを沈下させ、上
清の培地を抜き取ることにより、細胞付着マイクロキヤ
リアーを収集した。
この細胞付着マイクロキヤリアーを30％FCSを含むDMEM1
5mlに懸濁し、25mlの濾過滅菌を行つた0.48％のアルギ
ン酸ナトリウム溶液と混合した。
5mlに懸濁し、25mlの濾過滅菌を行つた0.48％のアルギ
ン酸ナトリウム溶液と混合した。
得られた混合液40mlを18ゲージの注射針のついた滅菌注
射筒に入れ、圧力を加えながら、滅菌した0.01％のTwee
n80を含む50mMの塩化カルシウム溶液に滴下して細胞付
着マイクロキヤリアーを包埋したアルギン酸ゲルマクロ
キヤリアーを作成した。最終アルギン酸ナトリウムの濃
度は0.3％であつた。
射筒に入れ、圧力を加えながら、滅菌した0.01％のTwee
n80を含む50mMの塩化カルシウム溶液に滴下して細胞付
着マイクロキヤリアーを包埋したアルギン酸ゲルマクロ
キヤリアーを作成した。最終アルギン酸ナトリウムの濃
度は0.3％であつた。
次に、上記細胞付着マイクロキヤリアーの懸濁液とアル
ギン酸ナトリウム溶液との混合液40mlを、各群5mlづつ
に等分しながら、計８群のマクロキヤリアーを形成し
た。各マクロキヤリアーを作成後、30〜60分以内に塩化
カルシウム溶液を生理的食塩水で置換洗浄し、次いで10
％FCSを添加し、DMEMで置洗浄した。
ギン酸ナトリウム溶液との混合液40mlを、各群5mlづつ
に等分しながら、計８群のマクロキヤリアーを形成し
た。各マクロキヤリアーを作成後、30〜60分以内に塩化
カルシウム溶液を生理的食塩水で置換洗浄し、次いで10
％FCSを添加し、DMEMで置洗浄した。
上述のようにして培地で洗浄したマクロキヤリアーを、
γ線で滅菌した250ml容ポリスチレンボトル（コーニン
グ社製）に移し、10％FCS添加DMEMを各群に50mlそれぞ
れ添加し、ヘツドスペースに５％CO2を吹き込み、細菌
培養用振とう培養機にセツトし、40rpmで振とうしなが
ら、37℃で10日間培養を行つた。
γ線で滅菌した250ml容ポリスチレンボトル（コーニン
グ社製）に移し、10％FCS添加DMEMを各群に50mlそれぞ
れ添加し、ヘツドスペースに５％CO2を吹き込み、細菌
培養用振とう培養機にセツトし、40rpmで振とうしなが
ら、37℃で10日間培養を行つた。
培養後、上記８群のうち４群は細胞数の測定に、他の４
群はｔ−プラスミノーゲンアクチベーターの生産に用い
た。ｔ−プラスミノーゲンアクチベーターの生産は、マ
クロキヤリアー培養液（37℃で、10日間培養したもの）
からピペツトで培地だけ抜き取り、生理的食塩水又はPA
Sでマクロキヤリアーを洗浄して培地成分を除去した
後、１％プロテオースペプトン及び0.01％Tween80を添
加したDMEM100mlを加え、37℃で７日間40rpmで同様に振
とうしながら培養して行つた。ここで0.01％Tween80を
培地に添加するのは、ｔ−プラスミノーゲンアクチベー
ターをマクロキヤリアー中で吸着させずに、マクロキヤ
リアーから培地に円滑に放出させるためである。
群はｔ−プラスミノーゲンアクチベーターの生産に用い
た。ｔ−プラスミノーゲンアクチベーターの生産は、マ
クロキヤリアー培養液（37℃で、10日間培養したもの）
からピペツトで培地だけ抜き取り、生理的食塩水又はPA
Sでマクロキヤリアーを洗浄して培地成分を除去した
後、１％プロテオースペプトン及び0.01％Tween80を添
加したDMEM100mlを加え、37℃で７日間40rpmで同様に振
とうしながら培養して行つた。ここで0.01％Tween80を
培地に添加するのは、ｔ−プラスミノーゲンアクチベー
ターをマクロキヤリアー中で吸着させずに、マクロキヤ
リアーから培地に円滑に放出させるためである。
また、上記培養後の細胞数の測定は、アルギン酸ゲルか
らなるマクロキヤリアーを100mMをEDTA（エチレンジア
ミンテトラ酢酸）で溶解した後、細胞付着マイクロキヤ
リアーを遠心分離（600〜900rpm、10分間）により収集
してトリプシン処理を行つて、マイクロキヤリアーから
細胞を剥離して計測した。
らなるマクロキヤリアーを100mMをEDTA（エチレンジア
ミンテトラ酢酸）で溶解した後、細胞付着マイクロキヤ
リアーを遠心分離（600〜900rpm、10分間）により収集
してトリプシン処理を行つて、マイクロキヤリアーから
細胞を剥離して計測した。
上記計測した結果、各ボトルの平均細胞数は、培養開始
時で５×105/ボトル（マイクロキヤリアー１個当り細胞
平均８個）のものが、37℃で10日間培養後、3.5×106/
ボトルであつた。
時で５×105/ボトル（マイクロキヤリアー１個当り細胞
平均８個）のものが、37℃で10日間培養後、3.5×106/
ボトルであつた。
また、一方、ｔ−プラスミノーゲンアクチベーターの培
養日数による生産状況は表１のとおりであつた。
養日数による生産状況は表１のとおりであつた。
実施例２ ヒト胎児肺由来正常２倍体線維芽細胞IMR−90（ATCC、C
CL−186）を実施例１と同様にＴ−フラスコで培養して
種細胞4.5×106を得、マイクロキヤリアー（ゼリービー
ズ、KCバイオロジカル社製）120mgに付着させた。この
細胞付着マイクロキヤリアー（マイクロキヤリアー量12
0mg）の懸濁液15mlを、濾過滅菌した0.8/のアルギン酸
ナトリウム溶液25mlと混合し、混合液40mlを得た。
CL−186）を実施例１と同様にＴ−フラスコで培養して
種細胞4.5×106を得、マイクロキヤリアー（ゼリービー
ズ、KCバイオロジカル社製）120mgに付着させた。この
細胞付着マイクロキヤリアー（マイクロキヤリアー量12
0mg）の懸濁液15mlを、濾過滅菌した0.8/のアルギン酸
ナトリウム溶液25mlと混合し、混合液40mlを得た。
この混合液（40ml）を各5mlづつ８等分しながら、5ml用
ピペツトの尖端から0.01％Tween80を含む50mM CaCl2溶
液にそれぞれ滴下し、アルギン酸ビースマクロキヤリア
ーを作成した。このマクロキヤリアーのアルギン酸ナト
リウムの最終濃度は0.5％となり、細胞付着マイクロキ
ヤリアーはマクロキヤリアー内に包埋固定された。な
お、上記のように5ml用ピペツトの大端を滴下のためノ
ズルに用いた時には、形成したマクロキヤリアーの径は
約４〜5mmであつた。
ピペツトの尖端から0.01％Tween80を含む50mM CaCl2溶
液にそれぞれ滴下し、アルギン酸ビースマクロキヤリア
ーを作成した。このマクロキヤリアーのアルギン酸ナト
リウムの最終濃度は0.5％となり、細胞付着マイクロキ
ヤリアーはマクロキヤリアー内に包埋固定された。な
お、上記のように5ml用ピペツトの大端を滴下のためノ
ズルに用いた時には、形成したマクロキヤリアーの径は
約４〜5mmであつた。
次に、このようにして得られた各群（上記８等分した
群）のマクロキヤリアーを、実施例１と同様にして洗浄
後、10％FCS添加DMEM50mlに懸濁後、250ml容ポリスチレ
ンボトル（コーニング社製）に移し、細菌培養用振とう
培養器で回転数100rpmで振とうしながら、37℃で10日間
培養した。
群）のマクロキヤリアーを、実施例１と同様にして洗浄
後、10％FCS添加DMEM50mlに懸濁後、250ml容ポリスチレ
ンボトル（コーニング社製）に移し、細菌培養用振とう
培養器で回転数100rpmで振とうしながら、37℃で10日間
培養した。
培養後、８群のうちの４群は細胞数測定に用い、たの４
群はｔ−プラスミノーゲンアクチベーターの生産に用い
た。
群はｔ−プラスミノーゲンアクチベーターの生産に用い
た。
ｔ−プラスミノーゲンアクチベーターの生産は、回転数
を100rpmとした以外は、実施例１に記載したと同様の手
順で行つた。
を100rpmとした以外は、実施例１に記載したと同様の手
順で行つた。
細胞数の測定並びにｔ−プラスミノーゲンアクチベータ
ーの生産の結果は表２並びに表３に示すとおりである。
ーの生産の結果は表２並びに表３に示すとおりである。
実施例３ ヒト胎児腎由来正常２倍体線維芽細胞Flow4000を、実施
例１と同様にしてＴ−フラスコで培養して種細胞7.1×1
06を得、マイクロキヤリアー（コラーゲンビーズ、フナ
イ薬品社製）168mgに付着させた。
例１と同様にしてＴ−フラスコで培養して種細胞7.1×1
06を得、マイクロキヤリアー（コラーゲンビーズ、フナ
イ薬品社製）168mgに付着させた。
この細胞付着マイクロキヤリアー（マイクロキヤリアー
量168mg）の懸濁液18.5mlと、濾過滅菌した1.6％のアル
ギン酸ナトリウム溶液31.5mlを混合し、計50mlの混合液
とした。
量168mg）の懸濁液18.5mlと、濾過滅菌した1.6％のアル
ギン酸ナトリウム溶液31.5mlを混合し、計50mlの混合液
とした。
この混合液（50ml）を各5mlづつ10等分しながら、5ml用
ピペツトの尖端から、0.01％Tween80を含む50mM CaCl2
溶液にそれぞれ滴下してアルギン酸ビーズマクロキヤリ
アーを作成した。このマクロキヤリアーのアルギン酸ナ
トリウムの最終濃度は1.0％となり、細胞付着マイクロ
キヤリアー（コラーゲンビーズ）は、上記マクロキヤリ
アー内に包埋固定加された。なお、マクロビーズの径は
約4mmであつた。
ピペツトの尖端から、0.01％Tween80を含む50mM CaCl2
溶液にそれぞれ滴下してアルギン酸ビーズマクロキヤリ
アーを作成した。このマクロキヤリアーのアルギン酸ナ
トリウムの最終濃度は1.0％となり、細胞付着マイクロ
キヤリアー（コラーゲンビーズ）は、上記マクロキヤリ
アー内に包埋固定加された。なお、マクロビーズの径は
約4mmであつた。
上述のようにして得られた各群（10群）のマクロキヤリ
アーを洗浄した後、10％FCS添加DMEM50mlに懸濁させた
後、250ml容ポリスチレンボトル（コーニング社製）に
移し、細菌培養用振とう培養機で回転数100rpmで振とう
しながら、37℃で10日間培養した。
アーを洗浄した後、10％FCS添加DMEM50mlに懸濁させた
後、250ml容ポリスチレンボトル（コーニング社製）に
移し、細菌培養用振とう培養機で回転数100rpmで振とう
しながら、37℃で10日間培養した。
培養後、10群のうちの５群は細胞数の測定に用い、他の
５群はｔ−プラスミノーゲンアクチベーターの生産に用
いた。
５群はｔ−プラスミノーゲンアクチベーターの生産に用
いた。
ｔ−プラスミノーゲンアクチベーターの生産は、回転数
100rpmとした以外は、実施例１に記載したと同様の手順
で行つた。
100rpmとした以外は、実施例１に記載したと同様の手順
で行つた。
細胞数測定並びにｔ−プラスミノーゲンアクチベーター
生産の結果は表４並びに表５に示すとおりである。
生産の結果は表４並びに表５に示すとおりである。
Claims (4)
- 【請求項１】付着性動物正常細胞を微粒子状の生体高分
子担体に付着させたものを、生理的食塩水にアルギン酸
を溶解して除菌したアルギン酸溶液と混合してアルギン
酸ゲルの最終濃度を0.3〜1.0％となし、次いで該混合液
を、非イオン性界面活性剤を添加して含有させた滅菌処
理した塩化カルシウム溶液中に滴下して上記担体に付着
の正常細胞を包埋したアルギン酸カルシウムから成る微
粒子担体（マクロ キヤリアー）を作成し、該微粒子担
体を培地で培養することを特徴とする付着性動物正常細
胞の包埋培養法。 - 【請求項２】上記動物正常細胞を、生体高分子担体に１
×105/mlキヤリアー以上播種し、５％炭酸ガス雰囲気中
で１〜３時間前培養を行つて該担体に付着させる特許請
求の範囲第（１）項記載の包埋培養法。 - 【請求項３】アルギン酸溶液は、0.85％生理的食塩水に
アルギン酸を1.6％の濃度に溶解し、フイルター濾過に
より除菌したものである特許請求の範囲第（１）項記載
の包埋培養法。 - 【請求項４】塩化カルシウム溶液は、非イオン性界面活
性剤としてソルビタモンノオレアートのエチレンオキシ
ド縮合物を0.001〜0.01％を含有させた塩化カルシウム
濃度が50mMの溶液である特許請求の範囲第（１）項記載
の包埋培養法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62041442A JPH07100029B2 (ja) | 1987-02-26 | 1987-02-26 | 付着依存性動物正常細胞の包埋培養法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62041442A JPH07100029B2 (ja) | 1987-02-26 | 1987-02-26 | 付着依存性動物正常細胞の包埋培養法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63209581A JPS63209581A (ja) | 1988-08-31 |
| JPH07100029B2 true JPH07100029B2 (ja) | 1995-11-01 |
Family
ID=12608483
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62041442A Expired - Lifetime JPH07100029B2 (ja) | 1987-02-26 | 1987-02-26 | 付着依存性動物正常細胞の包埋培養法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07100029B2 (ja) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0364606B1 (en) * | 1988-04-18 | 1994-03-16 | Nitta Gelatin Inc. | Process for culturing animal cells on a large scale and process for preparing supporting substrate for that process |
| IL300460A (en) | 2012-07-24 | 2023-04-01 | Nissan Chemical Corp | A culture medium preparation, and a method for culturing cells or tissues by using the preparation |
| US9664671B2 (en) | 2012-07-24 | 2017-05-30 | Nissan Chemical Industries, Ltd. | Culture medium composition and method of culturing cell or tissue using thereof |
| US10017805B2 (en) | 2012-08-23 | 2018-07-10 | Nissan Chemical Industries, Ltd. | Enhancing ingredients for protein production from various cells |
| WO2015111685A1 (ja) | 2014-01-23 | 2015-07-30 | 日産化学工業株式会社 | 培地組成物の製造方法 |
| CA2937801C (en) | 2014-01-23 | 2023-04-04 | Nissan Chemical Industries, Ltd. | Liquid culture medium composition comprising dispersed chitin or chitosan nanofibers |
| JP7034467B2 (ja) * | 2017-10-20 | 2022-03-14 | 国立大学法人 東京大学 | 細胞の三次元培養方法、細胞構造体、細胞構造体の製造方法、細胞の運搬方法及び細胞の保存方法 |
-
1987
- 1987-02-26 JP JP62041442A patent/JPH07100029B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63209581A (ja) | 1988-08-31 |
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