CN107384857B - 自体脂肪间充质干细胞的培养方法和使用的培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及自体脂肪间充质干细胞的培养方法和使用的培养基。具体的说，本发明涉及的培养方法包括如下步骤培养预处理、贴壁培养、补液与换液、一次或任选的多次的细胞传代、以及任选的制备脂肪间充质干细胞的制剂和任选的对所得脂肪间充质干细胞进行细胞冻存、复苏。本发明的培养基中包括DMEM和FBS。使用本发明培养基培养所述自体脂肪间充质干细胞特别是眼部脂肪细胞的自体脂肪间充质干细胞时，能够呈现本发明所述优异技术效果。得到的这些自体脂肪间充质干细胞可以用于自体应用，例如由眼部脂肪得到的自体脂肪间充质干细胞可用于面部注射，例如于面部皱纹、太阳穴、泪沟等部位的注射填充。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种脂肪间充质干细胞的培养方法，特别是涉及一种自体脂肪间充质干细胞的培养方法，所述自体脂肪间充质干细胞特别是来源于眼部的自体脂肪间充质干细胞。本发明还涉及上述自体脂肪间充质干细胞培养中所用的培养基。使用本发明培养基培养所述自体脂肪间充质干细胞特别是眼部脂肪细胞的自体脂肪间充质干细胞时，能够呈现本发明所述优异技术效果。得到的这些自体脂肪间充质干细胞可以用于自体应用，例如由眼部脂肪得到的自体脂肪间充质干细胞可用于面部注射，例如于面部皱纹、太阳穴、泪沟等部位的注射填充。
背景技术
皮肤老化是内源性和外源性因素共同作用，从而导致的皮肤衰老现象，主要表现为皮肤变薄松弛、干燥粗糙、弹性变差、皱纹形成、局部色素过度沉着及毛细血管扩张等等。内源性因素包括遗传因素和不可抗力因素，而紫外线照射、风吹、吸烟、高糖饮食和接触有害化学物质等造成的皮肤显著变化，则属于外源性老化。
内源性皮肤老化表现为皮肤纹理细密，松弛和缺乏弹性；外源性皮肤老化表现为皱纹粗糙，质地不平整，肤色灰黄、伴色素沉着，弹性组织变性，以及毛细血管扩张等。
自体脂肪组织是目前临床常用的长效组织填充材料，不仅容易获得，而且填充效果持久，无排异反应，可用于治疗凹陷瘢痕和较深的皱纹，还可明显改善皮肤质地，但脂肪组织移植会导致皮下脂肪容积的扩增。研究发现，脂肪组织中的脂肪间充质干细胞(ADSCs)对于维持脂肪组织的存活更新起到至关重要的作用。因此，使用ADSCs的面部应用成为面部抗衰老的可行途径。
ADSCs是来源于脂肪的间充质干细胞，取材方便，其提取效率比骨髓间充质干细胞高40倍，并且体外培养条件下增殖速度更快；具有多向分化能力，可以向脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞，甚至神经细胞分化。目前临床Ⅰ期和Ⅱ期实验都证明，ADSCs在心脏、直肠、乳腺等多种器官损伤修复中的应用是安全、有效的，而且已有研究证实ADSCs具有促进皮肤再生修复的作用。
ADSCs在多个方面呈现出其固有的优势。ADSCs属于单核细胞家族，是成体干细胞中的一种。它来自处理过的脂肪组织，培养时在细胞培养皿中以贴壁、粘附方式生长，并具有多样分化的能力，不只分化为脂肪细胞，还可以分化为肌细胞、软骨细胞、神经细胞、血管内皮细胞、骨细胞等，因此它们也在组织工程中被广泛地应用。例如，ADSCs可通过自我复制分化为脂肪细胞，在组织再生中发挥作用；ADSCs可以分化成血管内皮细胞或周围细胞；ADSCs在缺氧或其他条件下，可以分泌血管生长因子；当ADSCs和脂肪细胞一起移植的时候，它能够分化成内皮细胞，阻止纤维化和脂肪坏死的发生，提高脂肪成活率；根据最近的许多具体研究结果表明，ADSCs能表达多种细胞因子VEGF、IGF、TGF-β1、bFGF、EGF等，还通过表达VEGF、IGF-1等血管生长因子，来阻止凋亡的发生，维持脂肪细胞的成活率。
现有技术公开了诸多有关脂肪间充质干细胞的培养方法。例如，CN106479970A(201611050980.1)公开了一种大规模培养人脂肪间充质干细胞的方法。本发明所述大规模培养人脂肪间充质干细胞的方法向玻璃培养瓶中加入脂肪间充质干细胞培养基，在湿度95％、5％CO2的培养箱中于35℃温育平衡30分钟；调整脂肪间充质干细胞培养基的温度到35℃，pH7.05，加入预处理的微载体和脂肪间充质干细胞，5RPM～20RPM搅拌2h；升温至37℃于15RPM-40RPM、5％CO2条件下培养96h，期间补加脂肪间充质干细胞培养基。与现有方法相比，据信该发明大规模培养人脂肪间充质干细胞的方法增殖后获得细胞更多，细胞活力和增殖能力强，且能很好保持脂肪间充质干细胞的形态和良好的干细胞特性。
CN104762260A(201510197879.8)涉及一种脂肪间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1：获得脂肪，预处理、酶解、离心，收集沉淀，获得脂肪间充质干细胞；步骤2：培养所述脂肪间充质干细胞，当所述脂肪间充质干细胞生长至80％融合时，弃培养液，加PBS清洗，再加EDTA～胰酶溶液消化，终止消化、离心，传代培养。据信该发明具有以下优势：1、培养得到的干细胞纯度高；2、回收脂肪间充质干细胞培养过程中分泌出的各类因子，可以显著促进表皮细胞的增殖，表明能加快表皮细胞的新生和更替，达到显著的抗衰老效果。
CN104974984A(申请号201510173453.9)公开了一种脂肪组织来源的间充质干细胞的扩增培养方法，包括如下步骤：将分离的脂肪组织来源的间充质干细胞用脂肪干细胞培养基进行重悬处理，得到含间充质干细胞的重悬液；将所述重悬液接种至干细胞培养器中进行扩增培养；扩增培养24小时后更换所述脂肪干细胞培养基，之后每两天更换所述脂肪干细胞培养基一次，待生长融合至80～90％时，用胰酶消化处理后进行传代培养；其中，所述脂肪干细胞培养基含有0.1～10v/v％胎牛血清、1～10v/v％庆大霉素和80～98.9v/v％高糖DMEM培养基；所述干细胞培养器为用纤维粘连蛋白包被处理的干细胞培养器。据信该发明脂肪组织来源的间充质干细胞的扩增培养方法采用纤维粘连蛋白包被脂肪间充质干细胞生长依附的固相支持物，利用低浓度胎牛血清和高浓度庆大霉素的协同增效筛选培养，使得脂肪组织来源的间充质干细胞在两周时间内能扩增400-500倍，且纯度高，能定向诱导分化为脂肪组织。
CN106520686A(申请号201610887111.8)提供了一种脂肪间充质干细胞的培养方法。本发明脂肪间充质干细胞培养方法包括如下培养步骤：将获取的原代脂肪间充质干细胞接种至干细胞培养基中进行培养处理，其中，所述干细胞培养基中含有干细胞因子和白介素3因子，且所述干细胞因子与白介素3因子的含量比为(5-20μmol/L):(5-20ug/ml)。本发明培养方法能够提高脂肪间充质干细胞的扩增能力，并获得较高的迁移能力。
CN101984049A(申请号201010580537.1)公开了一种从脂肪组织中分离间充质干细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)脂肪组织的获得：脂肪组织为专业的医院或者美容院通过肿胀法吸脂手术获得的废弃物，在无菌条件下，4-20℃储存小于48小时；(2)初步去除红细胞：脂肪抽取物静止放置待分层后，小心移除下层液体，用D-Hanks液洗涤多次至洗出液清亮；(3)消化脂肪抽取物：加入以D-Hanks液配制的一型胶原酶至0.01-2g/100ml，37℃下20-400转/min震荡消化15-120分钟；(4)脂肪干细胞的获得：将消化后产物在4℃、离心力450g条件下离心5min，脂肪干细胞培养基重悬，以100μm孔径滤膜过滤去除杂质最终获得脂肪干细胞；(5)再次去除红细胞，利用反复洗涤和红细胞裂解的方式再次去除红细胞；(6)脂肪干细胞计数、活性检测和培养：取100μl分离的细胞以细胞计数板进行细胞计数；同时取出100μl细胞通过苔盼蓝染色的方法进行活细胞计数，根据两个计数的结果按照3*104/cm2的密度接种于T-75培养瓶中，37℃、CO2浓度5％、湿度100％条件下进行培养。据信该发明方法能够利用小量的脂肪组织获得大量的状态良好、保持很好的多向分化能力的脂肪干细胞，并且操作方法简单易行、可重复性强。
尽管现有技术公开了一些诸如上述的有关脂肪间充质干细胞的培养方法，然而本发明人已经发现这些方法似乎并不适用于眼部脂肪例如有关眼袋/眼皮部位脂肪间充质干细胞，例如这些方法在用于从眼部脂肪获取脂肪间充质干细胞时，其细胞收率低和/或细胞活率低。
因此，本领域仍然期待有新的方法来制备脂肪间充质干细胞，特别是期待有适用于眼部脂肪特别是自体眼部脂肪间充质干细胞的简易培养方法，并且期待这种简易培养方法能够呈现出细胞收率高和/或细胞活率高等特性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的方法来制备脂肪间充质干细胞，特别是提供一种适用于眼部脂肪特别是自体眼部脂肪间充质干细胞的简易培养方法，并且期待这种简易培养方法能够呈现出细胞收率高和/或细胞活率高等特性和/或其它优异性能。本发明已经出人意料的发现使用本发明方法能够获得如本发明所述一个或多个方面的技术效果。本发明基于此发现而得以完成。
为此，本发明第一方面提供了脂肪间充质干细胞的培养方法，其包括如下步骤
(1)培养预处理：将采集的脂肪转移至生物安全柜，倒入装有含青链霉素的PBS的培养皿中，使用无菌手术剪和无菌镊子取出脂肪上的血管和结缔组织，使用PBS清洗脂肪组织；
(2)贴壁培养：将脂肪组织剪成4-5mm3大小的碎块，取干净的10cm培养皿，用镊子将脂肪碎块贴于培养皿内，一个培养皿贴10-15块，在生物安全柜中晾干30min左右，每个培养皿添加10ml完全培养基；
(3)补液与换液：每隔3天进行补液，添加约5ml完全培养基/皿，当有细胞爬出后，进行全换液，约10ml完全培养基/皿；当有成片细胞爬出后，将脂肪组织块去掉，并进行全换液；(当培养皿中有若干片生长较密，成旋涡状的梭形细胞(作为P0代细胞)时，进行传代培养；)
(4)细胞传代：
(4a)清洗：将培养皿中的培养基吸出并弃去，吸取PBS加入每个培养皿中，约为5ml/皿，轻轻晃动培养皿，使PBS能充分清洗细胞表面，吸出PBS并弃去；
(4b)消化：加入0.25％胰酶(通常的量为约3ml/皿)，使胰酶覆盖细胞表面，室温消化约2-5分钟，在倒置显微镜下观察细胞状态，当所有细胞均变圆并脱离培养皿时，轻拍培养皿，使所有细胞脱落并悬浮于培养皿中，显微镜下观察确保所有细胞均脱落后，将培养皿移至生物安全柜中；
(4c)中止：每皿加入2～5mL与胰酶等体积的完全培养基，混匀，中止胰酶消化；
(4d)收集：用移液管吸取培养皿中的细胞悬液，并收集至50ml离心管中，再用PBS冲洗培养皿，确保所有细胞均被收集；
(4e)离心：将离心管放入台式离心机中，配平，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；
(4f)重悬：离心结束后，取出离心管，放入生物安全柜中，吸出上清液并弃去，用完全培养基重悬细胞沉淀，将多管细胞悬液合并为一管，混匀后取样计数及检测细胞存活率；
(4g)传代：按5000-8000个细胞/cm2的密度将细胞接种至T75培养瓶中，放入细胞培养箱中培养3-4天，得到P1代脂肪间充质干细胞；
(4h)任选的，依照以上步骤(4a)至步骤(4g)的操作进行细胞传代，依次得到P2代至P5代脂肪间充质干细胞；
(4i)任选的，使得到的P1代至P5代的任一代或多代的脂肪间充质干细胞进行制剂的制备；
(4j)任选的，使得到的P1代至P5代的任一代或多代的脂肪间充质干细胞进行细胞冻存，任选的对所冻存的细胞进行复苏，以及任选的对复苏的细胞进行制剂的制备。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的培养方法，其中，当在细胞传代的过程中，在步骤(4g)的操作中，在融合率达到80-90％时，进行下一代的细胞传代或者进行制剂制备和/或细胞冻存。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的培养方法，其中，所述完全培养基组成为：10％FBS、0.2％丙二醇、0.05％果糖和DMEM。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的培养方法，其中，所述DMEM为低糖型DMEM。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的培养方法，其中，所述低糖型DMEM配方组成如下：无水氯化钙265mg、硝酸铁0.1mg、氯化钾400mg、无水硫酸镁97.67mg、氯化钠6400mg、无水磷酸二氢钠109mg、丁二酸75mg、丁二酸钠100mg、L-盐酸精氨酸84mg、L-盐酸胱氨酸63mg、甘氨酸30mg、L-盐酸组氨酸42mg、L-异亮氨酸105mg、L-亮氨酸105mg、L-盐酸赖氨酸146mg、L-甲硫氨酸30mg、L-苯丙氨酸66mg、L-丝氨酸42mg、L-苏氨酸95mg、L-色氨酸16mg、L-酪氨酸72mg、L-缬氨酸94mg、D-泛酸钙4mg、酒石酸胆碱7.2mg、叶酸4mg、肌醇7.2mg、烟酰胺4mg、核黄素0.4mg、盐酸硫胺4mg、盐酸吡哆辛4mg、葡萄糖1000mg、丙酮酸钠110mg、酚红9.3mg、水适量加至1000mL。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的培养方法，其中，所述完全培养基组成为：100mL的FBS、丙二醇2g、果糖500mg、无水氯化钙265mg、硝酸铁0.1mg、氯化钾400mg、无水硫酸镁97.67mg、氯化钠6400mg、无水磷酸二氢钠109mg、丁二酸75mg、丁二酸钠100mg、L-盐酸精氨酸84mg、L-盐酸胱氨酸63mg、甘氨酸30mg、L-盐酸组氨酸42mg、L-异亮氨酸105mg、L-亮氨酸105mg、L-盐酸赖氨酸146mg、L-甲硫氨酸30mg、L-苯丙氨酸66mg、L-丝氨酸42mg、L-苏氨酸95mg、L-色氨酸16mg、L-酪氨酸72mg、L-缬氨酸94mg、D-泛酸钙4mg、酒石酸胆碱7.2mg、叶酸4mg、肌醇7.2mg、烟酰胺4mg、核黄素0.4mg、盐酸硫胺4mg、盐酸吡哆辛4mg、葡萄糖1000mg、丙酮酸钠110mg、酚红9.3mg、水适量加至1000mL。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的培养方法，其中，所述脂肪是从眼袋和/或眼皮部位采集的眼部脂肪。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的培养方法，其中，所述细胞冻存使用的冻存液组成为：1份DMSO：2份人血清白蛋白：7份完全培养基。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的培养方法，其包括如下步骤：
(1)培养预处理：将采集的脂肪转移至生物安全柜，倒入装有含青链霉素的PBS的培养皿中，使用无菌手术剪和无菌镊子取出脂肪上的血管和结缔组织，使用PBS清洗脂肪组织；
(2)贴壁培养：将脂肪组织剪成4-5mm3大小的碎块，取干净的10cm培养皿，用镊子将脂肪碎块贴于培养皿内，一个培养皿贴10-15块，在生物安全柜中晾干30min左右，每个培养皿添加10ml完全培养基；
(3)补液与换液：每隔3天进行补液，添加约5ml完全培养基/皿，当有细胞爬出后，进行全换液，约10ml完全培养基/皿；当有成片细胞爬出后，将脂肪组织块去掉，并进行全换液；(当培养皿中有若干片生长较密，成旋涡状的梭形细胞(作为P0代细胞)时，进行传代培养；)
(4)P0代-P1代的细胞传代：
(4a)清洗：将培养皿中的培养基吸出并弃去，吸取PBS加入每个培养皿中，约为5ml/皿，轻轻晃动培养皿，使PBS能充分清洗细胞表面，吸出PBS并弃去；
(4b)消化：加入0.25％胰酶(通常的量为约3ml/皿)，使胰酶覆盖细胞表面，室温消化约2-5分钟，在倒置显微镜下观察细胞状态，当所有细胞均变圆并脱离培养皿时，轻拍培养皿，使所有细胞脱落并悬浮于培养皿中，显微镜下观察确保所有细胞均脱落后，将培养皿移至生物安全柜中；
(4c)中止：每皿加入2～5mL与胰酶等体积的完全培养基，混匀，中止胰酶消化；
(4d)收集：用移液管吸取培养皿中的细胞悬液，并收集至50ml离心管中，再用PBS冲洗培养皿，确保所有细胞均被收集；
(4e)离心：将离心管放入台式离心机中，配平，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；
(4f)重悬：离心结束后，取出离心管，放入生物安全柜中，吸出上清液并弃去，用完全培养基重悬细胞沉淀，将多管细胞悬液合并为一管，混匀后取样计数及检测细胞存活率；
(4g)传代：按5000-8000个细胞/cm2的密度将细胞接种至T75培养瓶中，放入细胞培养箱中培养3-4天；(当培养瓶中细胞融合率达到80-90％时，为P1代细胞，可进行传代培养；)
(5)P1-P2代的细胞传代：
(5a)清洗：将培养瓶中的培养基吸出并弃去，吸取PBS加入每个培养瓶中，约为10ml/T75培养瓶，将培养瓶横放并轻轻晃动，使PBS能充分清洗细胞表面，吸出PBS并弃去；
(5b)消化：加入0.25％胰酶(通常的量为约3ml/T75瓶)，盖上瓶盖，将培养瓶横放，使胰酶覆盖细胞表面，室温消化约2-5分钟，在倒置显微镜下观察细胞状态，当所有细胞均变圆并脱离培养瓶时，轻拍培养瓶壁，使所有细胞脱落并悬浮于培养瓶中，显微镜下观察确保所有细胞均脱落后，将培养瓶移至生物安全柜中；
(5c)中止：每瓶加入2～5mL与胰酶等体积的完全培养基，混匀，中止胰酶消化；
(5d)收集：用移液管吸取培养瓶中的细胞悬液，并收集至50ml离心管中，再用PBS冲洗培养瓶，确保所有细胞均被收集；
(5e)离心：将离心管放入台式离心机中，配平，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；
(5f)重悬：离心结束后，取出离心管，放入生物安全柜中，吸出上清液并弃去，用完全培养基重悬细胞沉淀，将多管细胞悬液合并为一管，混匀后取样计数及检测细胞存活率；
(5g)传代：按5000-8000个细胞/cm2的密度将细胞接种至T225培养瓶中，放入细胞培养箱中培养3-4天；(当培养瓶中细胞融合率达到80-90％时，为P2代细胞，进行传代培养；)
(6)P2-P3代的细胞传代：
(6a)清洗：将培养瓶中的培养基吸出并弃去，吸取PBS加入每个培养瓶中，约为15ml/T225培养瓶，将培养瓶横放并轻轻晃动，使PBS能充分清洗细胞表面，吸出PBS并弃去；
(6b)消化：加入0.25％胰酶(通常的量为约5ml/T225瓶)，盖上瓶盖，将培养瓶横放，使胰酶覆盖细胞表面，室温消化约2-5分钟，在倒置显微镜下观察细胞状态，当所有细胞均变圆并脱离培养瓶时，轻拍培养瓶壁，使所有细胞脱落并悬浮于培养瓶中，显微镜下观察确保所有细胞均脱落后，将培养瓶移至生物安全柜中；
(6c)中止：每瓶加入5mL与胰酶等体积的完全培养基，混匀，中止胰酶消化；
(6d)收集：用移液管吸取培养瓶中的细胞悬液，并收集至50ml离心管中，再用PBS冲洗培养瓶，确保所有细胞均被收集；
(6e)离心：将离心管放入台式离心机中，配平，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；
(6f)重悬：离心结束后，取出离心管，放入生物安全柜中，吸出上清液并弃去，用完全培养基重悬细胞沉淀，将多管细胞悬液合并为一管，混匀后取样计数及检测细胞存活率；
(6g)传代：按5000-8000个细胞/cm2的密度将细胞接种至T225培养瓶中，放入细胞培养箱中培养3-4天；(当培养瓶中细胞融合率达到80-90％时，为P3代细胞，进行冻存；)
(7)细胞冻存：
(7a)清洗：将培养瓶中的培养基吸出并弃去，吸取PBS加入每个培养瓶中，约为15ml/T225培养瓶，将培养瓶横放并轻轻晃动，使PBS能充分清洗细胞表面，吸出PBS并弃去；
(7b)消化：加入0.25％胰酶(通常的量为约5ml/T225瓶)，盖上瓶盖，将培养瓶横放，使胰酶覆盖细胞表面，室温消化约2-5分钟，在倒置显微镜下观察细胞状态，当所有细胞均变圆并脱离培养瓶时，轻拍培养瓶壁，使所有细胞脱落并悬浮于培养瓶中，显微镜下观察确保所有细胞均脱落后，将培养瓶移至生物安全柜中；
(7c)中止：每瓶加入5mL与胰酶等体积的完全培养基，混匀，中止胰酶消化；
(7d)收集：用移液管吸取培养瓶中的细胞悬液，并收集至50ml离心管中，再用PBS冲洗培养瓶，确保所有细胞均被收集；
(7e)离心：将离心管放入台式离心机中，配平，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；
(7f)重悬：离心结束后，取出离心管，放入生物安全柜中，吸出上清液并弃去，用完全培养基重悬细胞沉淀，将多管细胞悬液合并为一管，混匀后取样计数及检测细胞存活率；
(7g)离心：将待冻存细胞悬液离心，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；
(7hi)混合与分装：细胞离心后移至生物安全柜，吸取并弃去上清液，加入冻存液重悬细胞沉淀，混合均匀以后，按照固定的体积将细胞悬液分装至2ml冻存管中，放入冻存盒4度冰箱预冷30分钟；
(7i)程序降温：打开程序降温仪，设定好降温程序，输入细胞批号，连接液氮供给罐，启动程序，使程序降温仪腔体温度降至4度，将预冷好的冻存盒放入程序降温仪，开始降温，整个降温过程约为90分钟；
(7j)液氮储存：取出完成降温的冻存盒，放入冻存架中，放入MVE液氮储存罐中，进行冻存；
(8)复苏冻存的P3代细胞(即P4代)
(8a)解冻：将冻存的细胞放入37度水浴锅中，迅速晃动，使细胞在1分钟内解冻迅速将解冻好的细胞悬液转移至装有完全培养基的离心管中；
(8b)离心：将装有细胞悬液的离心管放入离心机，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；
(8d)接种：将完全培养基移至培养瓶中，将离心后的细胞上清液吸出并弃去，使用完全培养基重悬细胞沉淀，加入培养瓶中，混匀后贴标签，放入细胞培养箱中培养，融合率达到80-90％时(即P4代)，用于制备脂肪间充质干细胞制剂；
(9)制备脂肪间充质干细胞制剂：
待P4代细胞融合率达到80-90％时，按以下步骤收获，制备用于面部填充或修饰的脂肪间充质干细胞制剂：
(9a)清洗：将培养瓶中的培养基吸出并弃去，吸取PBS加入每个培养瓶中，约为15ml/T225培养瓶，将培养瓶横放并轻轻晃动，使PBS能充分清洗细胞表面，吸出PBS并弃去；
(9b)消化：加入0.25％胰酶(通常的量为约5ml/T225瓶)，盖上瓶盖，将培养瓶横放，使胰酶覆盖细胞表面，室温消化约2-5分钟，在倒置显微镜下观察细胞状态，当所有细胞均变圆并脱离培养瓶时，轻拍培养瓶壁，使所有细胞脱落并悬浮于培养瓶中，显微镜下观察确保所有细胞均脱落后，将培养瓶移至生物安全柜中；
(9c)中止：每瓶加入5mL与胰酶等体积的完全培养基，混匀，中止胰酶消化；
(9d)收集：用移液管吸取培养瓶中的细胞悬液，并收集至50ml离心管中，再用PBS冲洗培养瓶，确保所有细胞均被收集；
(9e)离心：将离心管放入台式离心机中，配平，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；
(9f)重悬：离心结束后，取出离心管，放入生物安全柜中，吸出上清液并弃去，用生理盐水重悬细胞沉淀；
(9g)清洗：将离心管放入台式离心机中，配平，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；离心结束后，取出离心管，放入生物安全柜中，吸出上清液并弃去，用生理盐水重悬细胞沉淀；任选的重复该清洗步骤以进行二次清洗；清洗后，用生理盐水将多管细胞合并为一管，取样计数及检测细胞存活率；
(9h)离心：将细胞悬液放入台式离心机中，配平，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；
(9i)脂肪间充质干细胞制剂：按照4×106/ml的密度，用生理盐水重悬，得到脂肪间充质干细胞制剂。
进一步的，本发明第二方面提供了一种脂肪间充质干细胞制剂，其是通过包括如下步骤的方法制备得到的：
(1)培养预处理：将采集的脂肪转移至生物安全柜，倒入装有含青链霉素的PBS的培养皿中，使用无菌手术剪和无菌镊子取出脂肪上的血管和结缔组织，使用PBS清洗脂肪组织；
(2)贴壁培养：将脂肪组织剪成4-5mm3大小的碎块，取干净的10cm培养皿，用镊子将脂肪碎块贴于培养皿内，一个培养皿贴10-15块，在生物安全柜中晾干30min左右，每个培养皿添加10ml完全培养基；
(3)补液与换液：每隔3天进行补液，添加约5ml完全培养基/皿，当有细胞爬出后，进行全换液，约10ml完全培养基/皿；当有成片细胞爬出后，将脂肪组织块去掉，并进行全换液；(当培养皿中有若干片生长较密，成旋涡状的梭形细胞(作为P0代细胞)时，进行传代培养；)
(4)细胞传代：
(4a)清洗：将培养皿中的培养基吸出并弃去，吸取PBS加入每个培养皿中，约为5ml/皿，轻轻晃动培养皿，使PBS能充分清洗细胞表面，吸出PBS并弃去；
(4b)消化：加入0.25％胰酶(通常的量为约3ml/皿)，使胰酶覆盖细胞表面，室温消化约2-5分钟，在倒置显微镜下观察细胞状态，当所有细胞均变圆并脱离培养皿时，轻拍培养皿，使所有细胞脱落并悬浮于培养皿中，显微镜下观察确保所有细胞均脱落后，将培养皿移至生物安全柜中；
(4c)中止：每皿加入2～5mL与胰酶等体积的完全培养基，混匀，中止胰酶消化；
(4d)收集：用移液管吸取培养皿中的细胞悬液，并收集至50ml离心管中，再用PBS冲洗培养皿，确保所有细胞均被收集；
(4e)离心：将离心管放入台式离心机中，配平，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；
(4f)重悬：离心结束后，取出离心管，放入生物安全柜中，吸出上清液并弃去，用完全培养基重悬细胞沉淀，将多管细胞悬液合并为一管，混匀后取样计数及检测细胞存活率；
(4g)传代：按5000-8000个细胞/cm2的密度将细胞接种至T75培养瓶中，放入细胞培养箱中培养3-4天，得到P1代脂肪间充质干细胞；
(4h)任选的，依照以上步骤(4a)至步骤(4g)的操作进行细胞传代，依次得到P2代至P5代脂肪间充质干细胞；
(5)制剂制备：使得到的P1代至P5代的任一代或多代的脂肪间充质干细胞制备成制剂；或者，使得到的P1代至P5代的任一代或多代的脂肪间充质干细胞进行细胞冻存、复苏、以及制备成制剂。
根据本发明第二方面任一实施方案所述的脂肪间充质干细胞制剂，其中，当在细胞传代的过程中，在步骤(4g)的操作中，在融合率达到80-90％时，进行下一代的细胞传代或者进行制剂制备和/或细胞冻存。
根据本发明第二方面任一实施方案所述的脂肪间充质干细胞制剂，其中，所述完全培养基组成为：10％FBS、0.2％丙二醇、0.05％果糖和DMEM。
根据本发明第二方面任一实施方案所述的脂肪间充质干细胞制剂，其中，所述DMEM为低糖型DMEM。
根据本发明第二方面任一实施方案所述的脂肪间充质干细胞制剂，其中，所述低糖型DMEM配方组成如下：无水氯化钙265mg、硝酸铁0.1mg、氯化钾400mg、无水硫酸镁97.67mg、氯化钠6400mg、无水磷酸二氢钠109mg、丁二酸75mg、丁二酸钠100mg、L-盐酸精氨酸84mg、L-盐酸胱氨酸63mg、甘氨酸30mg、L-盐酸组氨酸42mg、L-异亮氨酸105mg、L-亮氨酸105mg、L-盐酸赖氨酸146mg、L-甲硫氨酸30mg、L-苯丙氨酸66mg、L-丝氨酸42mg、L-苏氨酸95mg、L-色氨酸16mg、L-酪氨酸72mg、L-缬氨酸94mg、D-泛酸钙4mg、酒石酸胆碱7.2mg、叶酸4mg、肌醇7.2mg、烟酰胺4mg、核黄素0.4mg、盐酸硫胺4mg、盐酸吡哆辛4mg、葡萄糖1000mg、丙酮酸钠110mg、酚红9.3mg、水适量加至1000mL。
根据本发明第二方面任一实施方案所述的脂肪间充质干细胞制剂，其中，所述完全培养基组成为：100mL的FBS、丙二醇2g、果糖500mg、无水氯化钙265mg、硝酸铁0.1mg、氯化钾400mg、无水硫酸镁97.67mg、氯化钠6400mg、无水磷酸二氢钠109mg、丁二酸75mg、丁二酸钠100mg、L-盐酸精氨酸84mg、L-盐酸胱氨酸63mg、甘氨酸30mg、L-盐酸组氨酸42mg、L-异亮氨酸105mg、L-亮氨酸105mg、L-盐酸赖氨酸146mg、L-甲硫氨酸30mg、L-苯丙氨酸66mg、L-丝氨酸42mg、L-苏氨酸95mg、L-色氨酸16mg、L-酪氨酸72mg、L-缬氨酸94mg、D-泛酸钙4mg、酒石酸胆碱7.2mg、叶酸4mg、肌醇7.2mg、烟酰胺4mg、核黄素0.4mg、盐酸硫胺4mg、盐酸吡哆辛4mg、葡萄糖1000mg、丙酮酸钠110mg、酚红9.3mg、水适量加至1000mL。
根据本发明第二方面任一实施方案所述的脂肪间充质干细胞制剂，其中，所述脂肪是从眼袋和/或眼皮部位采集的眼部脂肪。
根据本发明第二方面任一实施方案所述的脂肪间充质干细胞制剂，其中，所述细胞冻存使用的冻存液组成为：1份DMSO：2份人血清白蛋白：7份完全培养基。
根据本发明第二方面任一实施方案所述的脂肪间充质干细胞制剂，其是照包括如下步骤的方法制备得到的：
(1)培养预处理：将采集的脂肪转移至生物安全柜，倒入装有含青链霉素的PBS的培养皿中，使用无菌手术剪和无菌镊子取出脂肪上的血管和结缔组织，使用PBS清洗脂肪组织；
(2)贴壁培养：将脂肪组织剪成4-5mm3大小的碎块，取干净的10cm培养皿，用镊子将脂肪碎块贴于培养皿内，一个培养皿贴10-15块，在生物安全柜中晾干30min左右，每个培养皿添加10ml完全培养基；
(3)补液与换液：每隔3天进行补液，添加约5ml完全培养基/皿，当有细胞爬出后，进行全换液，约10ml完全培养基/皿；当有成片细胞爬出后，将脂肪组织块去掉，并进行全换液；(当培养皿中有若干片生长较密，成旋涡状的梭形细胞(作为P0代细胞)时，进行传代培养；)
(4)P0代-P1代的细胞传代：
(4a)清洗：将培养皿中的培养基吸出并弃去，吸取PBS加入每个培养皿中，约为5ml/皿，轻轻晃动培养皿，使PBS能充分清洗细胞表面，吸出PBS并弃去；
(4b)消化：加入-0.25％胰酶(通常的量为约3ml/皿)，使胰酶覆盖细胞表面，室温消化约2-5分钟，在倒置显微镜下观察细胞状态，当所有细胞均变圆并脱离培养皿时，轻拍培养皿，使所有细胞脱落并悬浮于培养皿中，显微镜下观察确保所有细胞均脱落后，将培养皿移至生物安全柜中；
(4c)中止：每皿加入2～5mL与胰酶等体积的完全培养基，混匀，中止胰酶消化；
(4d)收集：用移液管吸取培养皿中的细胞悬液，并收集至50ml离心管中，再用PBS冲洗培养皿，确保所有细胞均被收集；
(4e)离心：将离心管放入台式离心机中，配平，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；
(4f)重悬：离心结束后，取出离心管，放入生物安全柜中，吸出上清液并弃去，用完全培养基重悬细胞沉淀，将多管细胞悬液合并为一管，混匀后取样计数及检测细胞存活率；
(4g)传代：按5000-8000个细胞/cm2的密度将细胞接种至T75培养瓶中，放入细胞培养箱中培养3-4天；(当培养瓶中细胞融合率达到80-90％时，为P1代细胞，可进行传代培养；)
(5)P1-P2代的细胞传代：
(5a)清洗：将培养瓶中的培养基吸出并弃去，吸取PBS加入每个培养瓶中，约为10ml/T75培养瓶，将培养瓶横放并轻轻晃动，使PBS能充分清洗细胞表面，吸出PBS并弃去；
(5b)消化：加入0.25％胰酶(通常的量为约3ml/T75瓶)，盖上瓶盖，将培养瓶横放，使胰酶覆盖细胞表面，室温消化约2-5分钟，在倒置显微镜下观察细胞状态，当所有细胞均变圆并脱离培养瓶时，轻拍培养瓶壁，使所有细胞脱落并悬浮于培养瓶中，显微镜下观察确保所有细胞均脱落后，将培养瓶移至生物安全柜中；
(5c)中止：每瓶加入2～5mL与胰酶等体积的完全培养基，混匀，中止胰酶消化；
(5d)收集：用移液管吸取培养瓶中的细胞悬液，并收集至50ml离心管中，再用PBS冲洗培养瓶，确保所有细胞均被收集；
(5e)离心：将离心管放入台式离心机中，配平，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；
(5f)重悬：离心结束后，取出离心管，放入生物安全柜中，吸出上清液并弃去，用完全培养基重悬细胞沉淀，将多管细胞悬液合并为一管，混匀后取样计数及检测细胞存活率；
(5g)传代：按5000-8000个细胞/cm2的密度将细胞接种至T225培养瓶中，放入细胞培养箱中培养3-4天；(当培养瓶中细胞融合率达到80-90％时，为P2代细胞，进行传代培养；)
(6)P2-P3代的细胞传代：
(6a)清洗：将培养瓶中的培养基吸出并弃去，吸取PBS加入每个培养瓶中，约为15ml/T225培养瓶，将培养瓶横放并轻轻晃动，使PBS能充分清洗细胞表面，吸出PBS并弃去；
(6b)消化：加入0.25％胰酶(通常的量为约5ml/T225瓶)，盖上瓶盖，将培养瓶横放，使胰酶覆盖细胞表面，室温消化约2-5分钟，在倒置显微镜下观察细胞状态，当所有细胞均变圆并脱离培养瓶时，轻拍培养瓶壁，使所有细胞脱落并悬浮于培养瓶中，显微镜下观察确保所有细胞均脱落后，将培养瓶移至生物安全柜中；
(6c)中止：每瓶加入5mL与胰酶等体积的完全培养基，混匀，中止胰酶消化；
(6d)收集：用移液管吸取培养瓶中的细胞悬液，并收集至50ml离心管中，再用PBS冲洗培养瓶，确保所有细胞均被收集；
(6e)离心：将离心管放入台式离心机中，配平，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；
(6f)重悬：离心结束后，取出离心管，放入生物安全柜中，吸出上清液并弃去，用完全培养基重悬细胞沉淀，将多管细胞悬液合并为一管，混匀后取样计数及检测细胞存活率；
(6g)传代：按5000-8000个细胞/cm2的密度将细胞接种至T225培养瓶中，放入细胞培养箱中培养3-4天；(当培养瓶中细胞融合率达到80-90％时，为P3代细胞，进行冻存；)
(7)细胞冻存：
(7a)清洗：将培养瓶中的培养基吸出并弃去，吸取PBS加入每个培养瓶中，约为15ml/T225培养瓶，将培养瓶横放并轻轻晃动，使PBS能充分清洗细胞表面，吸出PBS并弃去；
(7b)消化：加入0.25％胰酶(通常的量为约5ml/T225瓶)，盖上瓶盖，将培养瓶横放，使胰酶覆盖细胞表面，室温消化约2-5分钟，在倒置显微镜下观察细胞状态，当所有细胞均变圆并脱离培养瓶时，轻拍培养瓶壁，使所有细胞脱落并悬浮于培养瓶中，显微镜下观察确保所有细胞均脱落后，将培养瓶移至生物安全柜中；
(7c)中止：每瓶加入5mL与胰酶等体积的完全培养基，混匀，中止胰酶消化；
(7d)收集：用移液管吸取培养瓶中的细胞悬液，并收集至50ml离心管中，再用PBS冲洗培养瓶，确保所有细胞均被收集；
(7e)离心：将离心管放入台式离心机中，配平，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；
(7f)重悬：离心结束后，取出离心管，放入生物安全柜中，吸出上清液并弃去，用完全培养基重悬细胞沉淀，将多管细胞悬液合并为一管，混匀后取样计数及检测细胞存活率；
(7g)离心：将待冻存细胞悬液离心，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；
(7hi)混合与分装：细胞离心后移至生物安全柜，吸取并弃去上清液，加入冻存液重悬细胞沉淀，混合均匀以后，按照固定的体积将细胞悬液分装至2ml冻存管中，放入冻存盒4度冰箱预冷30分钟；
(7i)程序降温：打开程序降温仪，设定好降温程序，输入细胞批号，连接液氮供给罐，启动程序，使程序降温仪腔体温度降至4度，将预冷好的冻存盒放入程序降温仪，开始降温，整个降温过程约为90分钟；
(7j)液氮储存：取出完成降温的冻存盒，放入冻存架中，放入MVE液氮储存罐中，进行冻存；
(8)复苏冻存的P3代细胞(即P4代)
(8a)解冻：将冻存的细胞放入37度水浴锅中，迅速晃动，使细胞在1分钟内解冻迅速将解冻好的细胞悬液转移至装有完全培养基的离心管中；
(8b)离心：将装有细胞悬液的离心管放入离心机，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；
(8d)接种：将完全培养基移至培养瓶中，将离心后的细胞上清液吸出并弃去，使用完全培养基重悬细胞沉淀，加入培养瓶中，混匀后贴标签，放入细胞培养箱中培养，融合率达到80-90％时(即P4代)，用于制备脂肪间充质干细胞制剂；
(9)制备脂肪间充质干细胞制剂：
待P4代细胞融合率达到80-90％时，按以下步骤收获，制备用于面部填充或修饰的脂肪间充质干细胞制剂：
(9a)清洗：将培养瓶中的培养基吸出并弃去，吸取PBS加入每个培养瓶中，约为15ml/T225培养瓶，将培养瓶横放并轻轻晃动，使PBS能充分清洗细胞表面，吸出PBS并弃去；
(9b)消化：加入0.25％胰酶(通常的量为约5ml/T225瓶)，盖上瓶盖，将培养瓶横放，使胰酶覆盖细胞表面，室温消化约2-5分钟，在倒置显微镜下观察细胞状态，当所有细胞均变圆并脱离培养瓶时，轻拍培养瓶壁，使所有细胞脱落并悬浮于培养瓶中，显微镜下观察确保所有细胞均脱落后，将培养瓶移至生物安全柜中；
(9c)中止：每瓶加入5mL与胰酶等体积的完全培养基，混匀，中止胰酶消化；
(9d)收集：用移液管吸取培养瓶中的细胞悬液，并收集至50ml离心管中，再用PBS冲洗培养瓶，确保所有细胞均被收集；
(9e)离心：将离心管放入台式离心机中，配平，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；
(9f)重悬：离心结束后，取出离心管，放入生物安全柜中，吸出上清液并弃去，用生理盐水重悬细胞沉淀；
(9g)清洗：将离心管放入台式离心机中，配平，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；离心结束后，取出离心管，放入生物安全柜中，吸出上清液并弃去，用生理盐水重悬细胞沉淀；任选的重复该清洗步骤以进行二次清洗；清洗后，用生理盐水将多管细胞合并为一管，取样计数及检测细胞存活率；
(9h)离心：将细胞悬液放入台式离心机中，配平，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；
(9i)脂肪间充质干细胞制剂：按照4×106/ml的密度，用生理盐水重悬，得到脂肪间充质干细胞制剂。
进一步的，本发明第三方面提供了一种用于培养脂肪间充质干细胞的培养基，其为完全培养基，其中包括10％FBS和DMEM。
根据本发明第三方面任一实施方案所述的培养基，其中，所述DMEM为低糖型DMEM。
根据本发明第三方面任一实施方案所述的培养基，其中，所述脂肪间充质干细胞的培养方法包括如下步骤：
(1)培养预处理：将采集的脂肪转移至生物安全柜，倒入装有含青链霉素的PBS的培养皿中，使用无菌手术剪和无菌镊子取出脂肪上的血管和结缔组织，使用PBS清洗脂肪组织；
(2)贴壁培养：将脂肪组织剪成4-5mm3大小的碎块，取干净的10cm培养皿，用镊子将脂肪碎块贴于培养皿内，一个培养皿贴10-15块，在生物安全柜中晾干30min左右，每个培养皿添加10ml完全培养基；
(3)补液与换液：每隔3天进行补液，添加约5ml完全培养基/皿，当有细胞爬出后，进行全换液，约10ml完全培养基/皿；当有成片细胞爬出后，将脂肪组织块去掉，并进行全换液；(当培养皿中有若干片生长较密，成旋涡状的梭形细胞(作为P0代细胞)时，进行传代培养；)
(4)细胞传代：
(4a)清洗：将培养皿中的培养基吸出并弃去，吸取PBS加入每个培养皿中，约为5ml/皿，轻轻晃动培养皿，使PBS能充分清洗细胞表面，吸出PBS并弃去；
(4b)消化：加入0.25％胰酶(通常的量为约3ml/皿)，使胰酶覆盖细胞表面，室温消化约2-5分钟，在倒置显微镜下观察细胞状态，当所有细胞均变圆并脱离培养皿时，轻拍培养皿，使所有细胞脱落并悬浮于培养皿中，显微镜下观察确保所有细胞均脱落后，将培养皿移至生物安全柜中；
(4c)中止：每皿加入2～5mL与胰酶等体积的完全培养基，混匀，中止胰酶消化；
(4d)收集：用移液管吸取培养皿中的细胞悬液，并收集至50ml离心管中，再用PBS冲洗培养皿，确保所有细胞均被收集；
(4e)离心：将离心管放入台式离心机中，配平，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；
(4f)重悬：离心结束后，取出离心管，放入生物安全柜中，吸出上清液并弃去，用完全培养基重悬细胞沉淀，将多管细胞悬液合并为一管，混匀后取样计数及检测细胞存活率；
(4g)传代：按5000-8000个细胞/cm2的密度将细胞接种至T75培养瓶中，放入细胞培养箱中培养3-4天，得到P1代脂肪间充质干细胞；
(4h)任选的，依照以上步骤(4a)至步骤(4g)的操作进行细胞传代，依次得到P2代至P5代脂肪间充质干细胞；
(4i)任选的，使得到的P1代至P5代的任一代或多代的脂肪间充质干细胞进行制剂的制备；
(4j)任选的，使得到的P1代至P5代的任一代或多代的脂肪间充质干细胞进行细胞冻存，任选的对所冻存的细胞进行复苏，以及任选的对复苏的细胞进行制剂的制备。
根据本发明第三方面任一实施方案所述的培养基，其中，当在细胞传代的过程中，在步骤(4g)的操作中，在融合率达到80-90％时，进行下一代的细胞传代或者进行制剂制备和/或细胞冻存。
根据本发明第三方面任一实施方案所述的培养基，其中，所述完全培养基组成为：10％FBS、0.2％丙二醇、0.05％果糖和DMEM。
根据本发明第三方面任一实施方案所述的培养基，其中，所述低糖型DMEM配方组成如下：无水氯化钙265mg、硝酸铁0.1mg、氯化钾400mg、无水硫酸镁97.67mg、氯化钠6400mg、无水磷酸二氢钠109mg、丁二酸75mg、丁二酸钠100mg、L-盐酸精氨酸84mg、L-盐酸胱氨酸63mg、甘氨酸30mg、L-盐酸组氨酸42mg、L-异亮氨酸105mg、L-亮氨酸105mg、L-盐酸赖氨酸146mg、L-甲硫氨酸30mg、L-苯丙氨酸66mg、L-丝氨酸42mg、L-苏氨酸95mg、L-色氨酸16mg、L-酪氨酸72mg、L-缬氨酸94mg、D-泛酸钙4mg、酒石酸胆碱7.2mg、叶酸4mg、肌醇7.2mg、烟酰胺4mg、核黄素0.4mg、盐酸硫胺4mg、盐酸吡哆辛4mg、葡萄糖1000mg、丙酮酸钠110mg、酚红9.3mg、水适量加至1000mL。
根据本发明第三方面任一实施方案所述的培养基，其中，所述完全培养基组成为：100mL的FBS、丙二醇2g、果糖500mg、无水氯化钙265mg、硝酸铁0.1mg、氯化钾400mg、无水硫酸镁97.67mg、氯化钠6400mg、无水磷酸二氢钠109mg、丁二酸75mg、丁二酸钠100mg、L-盐酸精氨酸84mg、L-盐酸胱氨酸63mg、甘氨酸30mg、L-盐酸组氨酸42mg、L-异亮氨酸105mg、L-亮氨酸105mg、L-盐酸赖氨酸146mg、L-甲硫氨酸30mg、L-苯丙氨酸66mg、L-丝氨酸42mg、L-苏氨酸95mg、L-色氨酸16mg、L-酪氨酸72mg、L-缬氨酸94mg、D-泛酸钙4mg、酒石酸胆碱7.2mg、叶酸4mg、肌醇7.2mg、烟酰胺4mg、核黄素0.4mg、盐酸硫胺4mg、盐酸吡哆辛4mg、葡萄糖1000mg、丙酮酸钠110mg、酚红9.3mg、水适量加至1000mL。
根据本发明第三方面任一实施方案所述的培养基，其中，所述脂肪是从眼袋和/或眼皮部位采集的眼部脂肪。
根据本发明第三方面任一实施方案所述的培养基，其中，所述细胞冻存使用的冻存液组成为：1份DMSO：2份人血清白蛋白：7份完全培养基。
根据本发明第三方面任一实施方案所述的培养基，其包括如下步骤：
(1)培养预处理：将采集的脂肪转移至生物安全柜，倒入装有含青链霉素的PBS的培养皿中，使用无菌手术剪和无菌镊子取出脂肪上的血管和结缔组织，使用PBS清洗脂肪组织；
(2)贴壁培养：将脂肪组织剪成4-5mm3大小的碎块，取干净的10cm培养皿，用镊子将脂肪碎块贴于培养皿内，一个培养皿贴10-15块，在生物安全柜中晾干30min左右，每个培养皿添加10ml完全培养基；
(3)补液与换液：每隔3天进行补液，添加约5ml完全培养基/皿，当有细胞爬出后，进行全换液，约10ml完全培养基/皿；当有成片细胞爬出后，将脂肪组织块去掉，并进行全换液；(当培养皿中有若干片生长较密，成旋涡状的梭形细胞(作为P0代细胞)时，进行传代培养；)
(4)P0代-P1代的细胞传代：
(4a)清洗：将培养皿中的培养基吸出并弃去，吸取PBS加入每个培养皿中，约为5ml/皿，轻轻晃动培养皿，使PBS能充分清洗细胞表面，吸出PBS并弃去；
(4b)消化：加入0.25％胰酶(通常的量为约3ml/皿)，使胰酶覆盖细胞表面，室温消化约2-5分钟，在倒置显微镜下观察细胞状态，当所有细胞均变圆并脱离培养皿时，轻拍培养皿，使所有细胞脱落并悬浮于培养皿中，显微镜下观察确保所有细胞均脱落后，将培养皿移至生物安全柜中；
(4c)中止：每皿加入2～5mL与胰酶等体积的完全培养基，混匀，中止胰酶消化；
(4d)收集：用移液管吸取培养皿中的细胞悬液，并收集至50ml离心管中，再用PBS冲洗培养皿，确保所有细胞均被收集；
(4e)离心：将离心管放入台式离心机中，配平，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；
(4f)重悬：离心结束后，取出离心管，放入生物安全柜中，吸出上清液并弃去，用完全培养基重悬细胞沉淀，将多管细胞悬液合并为一管，混匀后取样计数及检测细胞存活率；
(4g)传代：按5000-8000个细胞/cm2的密度将细胞接种至T75培养瓶中，放入细胞培养箱中培养3-4天；(当培养瓶中细胞融合率达到80-90％时，为P1代细胞，可进行传代培养；)
(5)P1-P2代的细胞传代：
(5a)清洗：将培养瓶中的培养基吸出并弃去，吸取PBS加入每个培养瓶中，约为10ml/T75培养瓶，将培养瓶横放并轻轻晃动，使PBS能充分清洗细胞表面，吸出PBS并弃去；
(5b)消化：加入0.25％胰酶(通常的量为约3ml/T75瓶)，盖上瓶盖，将培养瓶横放，使胰酶覆盖细胞表面，室温消化约2-5分钟，在倒置显微镜下观察细胞状态，当所有细胞均变圆并脱离培养瓶时，轻拍培养瓶壁，使所有细胞脱落并悬浮于培养瓶中，显微镜下观察确保所有细胞均脱落后，将培养瓶移至生物安全柜中；
(5c)中止：每瓶加入2～5mL与胰酶等体积的完全培养基，混匀，中止胰酶消化；
(5d)收集：用移液管吸取培养瓶中的细胞悬液，并收集至50ml离心管中，再用PBS冲洗培养瓶，确保所有细胞均被收集；
(5e)离心：将离心管放入台式离心机中，配平，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；
(5f)重悬：离心结束后，取出离心管，放入生物安全柜中，吸出上清液并弃去，用完全培养基重悬细胞沉淀，将多管细胞悬液合并为一管，混匀后取样计数及检测细胞存活率；
(5g)传代：按5000-8000个细胞/cm2的密度将细胞接种至T225培养瓶中，放入细胞培养箱中培养3-4天；(当培养瓶中细胞融合率达到80-90％时，为P2代细胞，进行传代培养；)
(6)P2-P3代的细胞传代：
(6a)清洗：将培养瓶中的培养基吸出并弃去，吸取PBS加入每个培养瓶中，约为15ml/T225培养瓶，将培养瓶横放并轻轻晃动，使PBS能充分清洗细胞表面，吸出PBS并弃去；
(6b)消化：加入0.25％胰酶(通常的量为约5ml/T225瓶)，盖上瓶盖，将培养瓶横放，使胰酶覆盖细胞表面，室温消化约2-5分钟，在倒置显微镜下观察细胞状态，当所有细胞均变圆并脱离培养瓶时，轻拍培养瓶壁，使所有细胞脱落并悬浮于培养瓶中，显微镜下观察确保所有细胞均脱落后，将培养瓶移至生物安全柜中；
(6c)中止：每瓶加入5mL与胰酶等体积的完全培养基，混匀，中止胰酶消化；
(6d)收集：用移液管吸取培养瓶中的细胞悬液，并收集至50ml离心管中，再用PBS冲洗培养瓶，确保所有细胞均被收集；
(6e)离心：将离心管放入台式离心机中，配平，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；
(6f)重悬：离心结束后，取出离心管，放入生物安全柜中，吸出上清液并弃去，用完全培养基重悬细胞沉淀，将多管细胞悬液合并为一管，混匀后取样计数及检测细胞存活率；
(6g)传代：按5000-8000个细胞/cm2的密度将细胞接种至T225培养瓶中，放入细胞培养箱中培养3-4天；(当培养瓶中细胞融合率达到80-90％时，为P3代细胞，进行冻存；)
(7)细胞冻存：
(7a)清洗：将培养瓶中的培养基吸出并弃去，吸取PBS加入每个培养瓶中，约为15ml/T225培养瓶，将培养瓶横放并轻轻晃动，使PBS能充分清洗细胞表面，吸出PBS并弃去；
(7b)消化：加入0.25％胰酶(通常的量为约5ml/T225瓶)，盖上瓶盖，将培养瓶横放，使胰酶覆盖细胞表面，室温消化约2-5分钟，在倒置显微镜下观察细胞状态，当所有细胞均变圆并脱离培养瓶时，轻拍培养瓶壁，使所有细胞脱落并悬浮于培养瓶中，显微镜下观察确保所有细胞均脱落后，将培养瓶移至生物安全柜中；
(7c)中止：每瓶加入5mL与胰酶等体积的完全培养基，混匀，中止胰酶消化；
(7d)收集：用移液管吸取培养瓶中的细胞悬液，并收集至50ml离心管中，再用PBS冲洗培养瓶，确保所有细胞均被收集；
(7e)离心：将离心管放入台式离心机中，配平，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；
(7f)重悬：离心结束后，取出离心管，放入生物安全柜中，吸出上清液并弃去，用完全培养基重悬细胞沉淀，将多管细胞悬液合并为一管，混匀后取样计数及检测细胞存活率；
(7g)离心：将待冻存细胞悬液离心，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；
(7hi)混合与分装：细胞离心后移至生物安全柜，吸取并弃去上清液，加入冻存液重悬细胞沉淀，混合均匀以后，按照固定的体积将细胞悬液分装至2ml冻存管中，放入冻存盒4度冰箱预冷30分钟；
(7i)程序降温：打开程序降温仪，设定好降温程序，输入细胞批号，连接液氮供给罐，启动程序，使程序降温仪腔体温度降至4度，将预冷好的冻存盒放入程序降温仪，开始降温，整个降温过程约为90分钟；
(7j)液氮储存：取出完成降温的冻存盒，放入冻存架中，放入MVE液氮储存罐中，进行冻存；
(8)复苏冻存的P3代细胞(即P4代)
(8a)解冻：将冻存的细胞放入37度水浴锅中，迅速晃动，使细胞在1分钟内解冻迅速将解冻好的细胞悬液转移至装有完全培养基的离心管中；
(8b)离心：将装有细胞悬液的离心管放入离心机，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；
(8d)接种：将完全培养基移至培养瓶中，将离心后的细胞上清液吸出并弃去，使用完全培养基重悬细胞沉淀，加入培养瓶中，混匀后贴标签，放入细胞培养箱中培养，融合率达到80-90％时(即P4代)，用于制备脂肪间充质干细胞制剂；
(9)制备脂肪间充质干细胞制剂：
待P4代细胞融合率达到80-90％时，按以下步骤收获，制备用于面部填充或修饰的脂肪间充质干细胞制剂：
(9a)清洗：将培养瓶中的培养基吸出并弃去，吸取PBS加入每个培养瓶中，约为15ml/T225培养瓶，将培养瓶横放并轻轻晃动，使PBS能充分清洗细胞表面，吸出PBS并弃去；
(9b)消化：加入0.25％胰酶(通常的量为约5ml/T225瓶)，盖上瓶盖，将培养瓶横放，使胰酶覆盖细胞表面，室温消化约2-5分钟，在倒置显微镜下观察细胞状态，当所有细胞均变圆并脱离培养瓶时，轻拍培养瓶壁，使所有细胞脱落并悬浮于培养瓶中，显微镜下观察确保所有细胞均脱落后，将培养瓶移至生物安全柜中；
(9c)中止：每瓶加入5mL与胰酶等体积的完全培养基，混匀，中止胰酶消化；
(9d)收集：用移液管吸取培养瓶中的细胞悬液，并收集至50ml离心管中，再用PBS冲洗培养瓶，确保所有细胞均被收集；
(9e)离心：将离心管放入台式离心机中，配平，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；
(9f)重悬：离心结束后，取出离心管，放入生物安全柜中，吸出上清液并弃去，用生理盐水重悬细胞沉淀；
(9g)清洗：将离心管放入台式离心机中，配平，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；离心结束后，取出离心管，放入生物安全柜中，吸出上清液并弃去，用生理盐水重悬细胞沉淀；任选的重复该清洗步骤以进行二次清洗；清洗后，用生理盐水将多管细胞合并为一管，取样计数及检测细胞存活率；
(9h)离心：将细胞悬液放入台式离心机中，配平，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；
(9i)脂肪间充质干细胞制剂：按照4×106/ml的密度，用生理盐水重悬，得到脂肪间充质干细胞制剂。
在本发明上述各种操作步骤中，虽然其描述的具体步骤在某些细节上或者语言描述上与下文具体实施方式部分的制备例中所描述的步骤有所区别，然而，本领域技术人员根据本发明全文的详细公开完全可以概括出以上所述方法步骤。
本发明的任一方面的任一实施方案，可以与其它实施方案进行组合，只要它们不会出现矛盾。此外，在本发明任一方面的任一实施方案中，任一技术特征可以适用于其它实施方案中的该技术特征，只要它们不会出现矛盾。下面对本发明作进一步的描述。
本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。
在本发明中，术语“脂肪间充质干细胞”是指来源于脂肪的间充质干细胞。因此在本发明中，特别是涉及本发明的语境中，术语“脂肪间充质干细胞”可以与“脂肪干细胞”、“干细胞”、“间充质干细胞”互换使用，除非另有明确指明。
在本发明中，术语“PBS缓冲液”或者“PBS”是指磷酸盐缓冲液。本领域技术人员熟知在本发明情形下使用的PBS的一般性配方和配制方法以及它们的一般性质例如pH值或pH范围，并且这些PBS缓冲液通常是可以通过商业途径获得的预配液(或预配粉)，例如用于本发明领域的PBS通常是pH7.4(±0.1)的商品化缓冲液，例如HyClone品牌的PBS缓冲液；本领域经典的应用时的PBS缓冲液组成中包括137mM氯化钠、2.7nM氯化钾和10mM磷酸根，在本发明中如未另外特别说明，所用PBS使用时的组成均为该组成。
本发明方法培养眼部脂肪间充质干细胞，所得眼部脂肪间充质干细胞具有非常高的纯度且具有非常高的收率。例如，本发明实施例1所得原代眼部脂肪间充质干细胞，经统计，每10万个细胞中脂滴数约3000～3500个，经检查，以后每代脂肪间充质干细胞中的脂滴数约为上一代的7～10％，至P4代时已经检查不到脂滴的存在。在一个补充的试验中，参照本文实施例1，不同的仅是针对眼皮部位的脂肪组织进行间充质干细胞的培养，各方面的结果显示均与本文实施例1中针对眼袋脂肪组织所得结果一致。在一个补充的试验中，参照本文实施例1，不同的仅是在所用的完全培养基中未添加果糖，结果显示，原代眼部脂肪间充质干细胞经统计每10万个细胞中脂滴数约6000～7000个，以后每代脂肪间充质干细胞中的脂滴数约为上一代的44～62％，至P5代时仍然明显存在有脂滴。在一个补充的试验中，参照本文实施例1，不同的仅是针对腹部抽脂所得脂肪组织进行脂肪间充质干细胞的培养而不是针对实施例1所述眼部脂肪组织，结果显示，原代眼部脂肪间充质干细胞经统计每10万个细胞中脂滴数约5500～6000个，以后每代脂肪间充质干细胞中的脂滴数约为上一代的32～41％，至P5代时仍然明显存在有脂滴。在一个补充的试验中，照CN 102586180 A之[0041]至[0075]的方法，经观测，结果显示，原代眼部脂肪间充质干细胞经统计每10万个细胞中脂滴数约5300～5700个，在进行传代培养时，以后每代脂肪间充质干细胞中的脂滴数约为上一代的38～44％，至P5代时仍然明显存在有脂滴。这些结果表明本发明方法所得脂肪间充质干细胞具有非常高的纯度。
再例如，本发明实施例1中，经折算，以每一克的眼部脂肪计培养传代得到P3代的脂肪间充质干细胞数可以达到7.5～8.5×106个细胞的产量。在一个补充的试验中，参照本文实施例1，不同的仅是在所用的完全培养基中未添加丙二醇，结果显示以每一克的眼部脂肪计培养传代得到P3代的脂肪间充质干细胞数仅能达到0.7～1.1×106个细胞的产量。在一个补充的试验中，照CN 102586180 A之[0041]至[0075]的方法并进行多次传代培养，结果显示以每一克的眼部脂肪计培养传代得到P3代的脂肪间充质干细胞数仅能达到0.4～0.6×106个细胞的产量。这些结果表明本发明方法所得脂肪间充质干细胞具有d的非常高的收率。
特别地，本发明的脂肪间充质干细胞是采用来源于眼部脂肪经培养获得的脂肪间充质干细胞。本发明包括眼部脂肪间充质干细胞贴壁培养法及应用脂肪间充质干细胞(ADSCs)进行面部修饰/填充的方法。本发明在培养脂肪间充质干细胞时采用脂肪贴壁培养方法简便，省去了离心清洗和酶消化的步骤，避免了对脂肪组织的损伤，节约了处理时间和成本。从自体眼部脂肪培养得到ADSCs，再进行面部应用，省去了免疫排斥和伦理方面的问题，有较高的安全性。
附图说明
图1：原代贴壁培养的眼部脂肪间充质干细胞，放大40倍(A)和放大100倍(B)的形态，呈长梭形，旋涡状生长，具备典型的间充质干细胞形态。图中较大的圆形为眼部脂肪间充质干细胞上附着的脂滴，可通过反复传代去除。
具体实施方式
通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细的描述。
在本发明下文，所用的脂肪细胞是从临床上手术抽取眼袋/眼皮部位的脂肪获得的，将所得眼部脂肪放入事先配制好的脂肪保护液中(PBS+青链霉素)中，密封放于4度冰箱，24小时内完成下面的培养步骤。
实施例1：培养眼部脂肪间充质干细胞并制备眼部脂肪间充质干细胞制剂
(1)培养预处理：将从眼袋采集的眼部脂肪转移至生物安全柜，倒入装有含青链霉素的PBS的培养皿中，使用无菌手术剪和无菌镊子取出脂肪上的血管和结缔组织，使用PBS清洗脂肪组织。
(2)贴壁培养：将脂肪组织成4-5mm3大小的碎块，取干净的10cm培养皿，用镊子将脂肪碎块贴于培养皿内，一个培养皿贴10-15块，在生物安全柜中晾干30min左右，每个培养皿添加10ml完全培养基(添加时应避免脂肪组织漂起。如有脂肪组织漂起，则可在其上方覆盖无菌的盖玻片，帮助其贴壁)。
(3)补液与换液：每隔3天进行补液，添加约5ml完全培养基/皿，当有细胞爬出后，可进行全换液，约10ml完全培养基/皿；当有成片细胞爬出后，可将脂肪组织块去掉，并进行全换液。
(4)细胞传代(P0代-P1代)：当培养皿中有若干片生长较密，成旋涡状的梭形细胞时可以进行传代培养。
(4a)清洗：将培养皿中的培养基吸出并弃去，吸取PBS加入每个培养皿中，约为5ml/皿，轻轻晃动培养皿，使PBS能充分清洗细胞表面，吸出PBS并弃去；
(4b)消化：每瓶加入一定量的0.25％胰酶(通常的量为约3ml/皿)，使胰酶覆盖细胞表面，室温消化约2-5分钟，在倒置显微镜下观察细胞状态，当所有细胞均变圆并脱离培养皿时，轻拍培养皿，使所有细胞脱落并悬浮于培养皿中，显微镜下观察确保所有细胞均脱落后，将培养皿移至生物安全柜中；
(4c)中止：每皿加入2～5mL与胰酶等体积的完全培养基，混匀，中止胰酶消化；
(4d)收集：用移液管吸取培养皿中的细胞悬液，并收集至50ml离心管中，再用PBS冲洗培养皿，确保所有细胞均被收集；
(4e)离心：将离心管放入台式离心机中，配平，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；
(4f)重悬：离心结束后，取出离心管，放入生物安全柜中，吸出上清液并弃去，用完全培养基重悬细胞沉淀，将多管细胞悬液合并为一管，混匀后取样计数及检测细胞存活率(>90％)；
(4g)传代：按5000-8000个细胞/cm2的密度将细胞接种至T75培养瓶中，放入细胞培养箱中培养3-4天。
在前面步骤中，当培养瓶中细胞融合率达到80-90％时，可进行下一代的传代培养。
(5)细胞传代(P1-P2代)：
(5a)清洗：将培养瓶中的培养基吸出并弃去，吸取PBS加入每个培养瓶中，约为10ml/T75培养瓶，将培养瓶横放并轻轻晃动，使PBS能充分清洗细胞表面，吸出PBS并弃去；
(5b)消化：每瓶加入一定量的0.25％胰酶(通常的量为约3ml/T75瓶)，盖上瓶盖，将培养瓶横放，使胰酶覆盖细胞表面，室温消化约2-5分钟，在倒置显微镜下观察细胞状态，当所有细胞均变圆并脱离培养瓶时，轻拍培养瓶壁，使所有细胞脱落并悬浮于培养瓶中，显微镜下观察确保所有细胞均脱落后，将培养瓶移至生物安全柜中；
(5c)中止：每瓶加入2～5mL与胰酶等体积的完全培养基，混匀，中止胰酶消化；
(5d)收集：用移液管吸取培养瓶中的细胞悬液，并收集至50ml离心管中，再用PBS冲洗培养瓶，确保所有细胞均被收集；
(5e)离心：将离心管放入台式离心机中，配平，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；
(5f)重悬：离心结束后，取出离心管，放入生物安全柜中，吸出上清液并弃去，用完全培养基重悬细胞沉淀，将多管细胞悬液合并为一管，混匀后取样计数及检测细胞存活率(>90％)；
(5g)传代：按5000-8000个细胞/cm2的密度将细胞接种至T225培养瓶中，放入细胞培养箱中培养3-4天。
在前面步骤中，当培养瓶中细胞融合率达到80-90％时，可进行下一代的传代培养。
(6)细胞传代(P2-P3代)：
(6a)清洗：将培养瓶中的培养基吸出并弃去，吸取PBS加入每个培养瓶中，约为15ml/T225培养瓶，将培养瓶横放并轻轻晃动，使PBS能充分清洗细胞表面，吸出PBS并弃去；
(6b)消化：每瓶加入一定量的0.25％胰酶(通常的量为约5ml/T225瓶)，盖上瓶盖，将培养瓶横放，使胰酶覆盖细胞表面，室温消化约2-5分钟，在倒置显微镜下观察细胞状态，当所有细胞均变圆并脱离培养瓶时，轻拍培养瓶壁，使所有细胞脱落并悬浮于培养瓶中，显微镜下观察确保所有细胞均脱落后，将培养瓶移至生物安全柜中；
(6c)中止：每瓶加入5mL与胰酶等体积的完全培养基，混匀，中止胰酶消化；
(6d)收集：用移液管吸取培养瓶中的细胞悬液，并收集至50ml离心管中，再用PBS冲洗培养瓶，确保所有细胞均被收集；
(6e)离心：将离心管放入台式离心机中，配平，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；
(6f)重悬：离心结束后，取出离心管，放入生物安全柜中，吸出上清液并弃去，用完全培养基重悬细胞沉淀，将多管细胞悬液合并为一管，混匀后取样计数及检测细胞存活率；
(6g)传代：按5000-8000个细胞/cm2的密度将细胞接种至T225培养瓶中，放入细胞培养箱中培养3-4天。
(7)细胞冻存：当脂肪间充质干细胞培养至P3代后，融合率达到80-90％可进行冻存。
(7a)清洗：将培养瓶中的培养基吸出并弃去，吸取PBS加入每个培养瓶中，约为15ml/T225培养瓶，将培养瓶横放并轻轻晃动，使PBS能充分清洗细胞表面，吸出PBS并弃去；
(7b)消化：每瓶加入一定量的0.25％胰酶(通常的量为约5ml/T225瓶)，盖上瓶盖，将培养瓶横放，使胰酶覆盖细胞表面，室温消化约2-5分钟，在倒置显微镜下观察细胞状态，当所有细胞均变圆并脱离培养瓶时，轻拍培养瓶壁，使所有细胞脱落并悬浮于培养瓶中，显微镜下观察确保所有细胞均脱落后，将培养瓶移至生物安全柜中；
(7c)中止：每瓶加入5mL与胰酶等体积的完全培养基，混匀，中止胰酶消化；
(7d)收集：用移液管吸取培养瓶中的细胞悬液，并收集至50ml离心管中，再用PBS冲洗培养瓶，确保所有细胞均被收集；
(7e)离心：将离心管放入台式离心机中，配平，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；
(7f)重悬：离心结束后，取出离心管，放入生物安全柜中，吸出上清液并弃去，用完全培养基重悬细胞沉淀，将多管细胞悬液合并为一管，混匀后取样计数及检测细胞存活率；
(7g)配制冻存液：按1份DMSO：2份人血清白蛋白：7份完全培养基比例配制，根据计数结果和冻存密度计算冻存液体积，冻存液需多配制10ml左右用于无菌检测，将配好的冻存液放入4度冰箱预冷；
(7h)离心：将待冻存细胞悬液离心，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；
(7i)混合与分装：细胞离心后移至生物安全柜，吸取并弃去上清液，加入一定体积的冻存液重悬细胞沉淀，混合均匀以后，按照固定的体积将细胞悬液分装至2ml冻存管中，放入冻存盒4度冰箱预冷30分钟；
(7j)程序降温：打开程序降温仪，设定好降温程序，输入细胞批号，连接液氮供给罐，启动程序，使程序降温仪腔体温度降至4度，将预冷好的冻存盒放入程序降温仪，开始降温，整个降温过程约为90分钟；
(7k)液氮储存：取出完成降温的冻存盒，放入冻存架中，放入MVE液氮储存罐中，填写完成储存位置表；
(8)复苏冻存的P3代细胞(即P4代)
(8a)解冻：准备工作：打开水浴锅，配制完全培养基；根据所需细胞数量计算取出细胞管数，在细胞库存管理台账中记录取出时间和取出管数，并在储存位置表中相应位置进行标记；打开液氮储存罐，找到相应冻存架和冻存盒位置，取出细胞；将冻存的细胞放入37度水浴锅中，迅速晃动，使细胞在1分钟内解冻；去冻存液：由于冻存液中的DMSO在常温下对细胞有伤害作用，因此需迅速将解冻好的细胞悬液转移至装有完全培养基的离心管中；
(8b)离心：将装有细胞悬液的离心管放入离心机，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；
(8d)接种：将完全培养基移至培养瓶中，将离心后的细胞上清液吸出并弃去，使用完全培养基重悬细胞沉淀，加入培养瓶中，混匀后贴标签，放入细胞培养箱中培养，融合率达到80-90％时(即P4代)，可用于制备脂肪间充质干细胞制剂，用于面部填充或修饰。
(9)制备脂肪间充质干细胞制剂：
待P4代细胞融合率达到80-90％时，可按以下步骤收获，制备可用于面部填充或修饰的脂肪间充质干细胞制剂。
(9a)清洗：将培养瓶中的培养基吸出并弃去，吸取PBS加入每个培养瓶中，约为15ml/T225培养瓶，将培养瓶横放并轻轻晃动，使PBS能充分清洗细胞表面，吸出PBS并弃去；
(9b)消化：每瓶加入一定量的0.25％胰酶(通常的量为约5ml/T225瓶)，盖上瓶盖，将培养瓶横放，使胰酶覆盖细胞表面，室温消化约2-5分钟，在倒置显微镜下观察细胞状态，当所有细胞均变圆并脱离培养瓶时，轻拍培养瓶壁，使所有细胞脱落并悬浮于培养瓶中，显微镜下观察确保所有细胞均脱落后，将培养瓶移至生物安全柜中；
(9c)中止：每瓶加入5mL与胰酶等体积的完全培养基，混匀，中止胰酶消化；
(9d)收集：用移液管吸取培养瓶中的细胞悬液，并收集至50ml离心管中，再用PBS冲洗培养瓶，确保所有细胞均被收集；
(9e)离心：将离心管放入台式离心机中，配平，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；
(9f)重悬：离心结束后，取出离心管，放入生物安全柜中，吸出上清液并弃去，用生理盐水重悬细胞沉淀；
(9g)清洗：将离心管放入台式离心机中，配平，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；离心结束后，取出离心管，放入生物安全柜中，吸出上清液并弃去，用生理盐水重悬细胞沉淀；二次清洗：重复以上步骤；计数：用生理盐水将多管细胞合并为一管，取样计数及检测细胞存活率(>90％)；
(9h)离心：将细胞悬液放入台式离心机中，配平，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；
(9i)脂肪间充质干细胞制剂：按照4×106/ml的密度，用生理盐水重悬。取样做微生物检测、流式检测和支原体检测。
本发明制得的脂肪间充质干细胞(ADSCs)可以自体应用于面部，示例性的应用方法为：在所得脂肪间充质干细胞制剂所有检测均符合标准后，可将ADSCs制剂直接进行面部注射。例如，可以使用1ml医用注射器，使用30GA(外径0.3mm左右)的针头，每个部位建议用量为0.5-1ml，可用于面部皱纹、太阳穴、泪沟等部位的填充。
在本发明上述实施例1中，从原代即P0代开始，所得各代脂肪间充质干细胞中均含有一定量的脂滴，例如对于原代贴壁培养的眼部脂肪间充质干细胞，如图1所示，放大40倍(A)和放大100倍(B)的形态，脂肪间充质干细胞呈长梭形，旋涡状生长，具备典型的间充质干细胞形态。图中较大的圆形为眼部脂肪间充质干细胞上附着的脂滴，可通过反复传代去除。
以上所述实施例仅是为充分说明本申请而所举的较佳的实施例，本申请的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本申请基础上所作的等同替代或变换，均在本申请的保护范围之内。本申请的保护范围以权利要求书为准。
Claims (5)
1.脂肪间充质干细胞的培养方法，其包括如下步骤：
(1)培养预处理：将采集的脂肪转移至生物安全柜，倒入装有含青链霉素的PBS的培养皿中，使用无菌手术剪和无菌镊子取出脂肪上的血管和结缔组织，使用PBS清洗脂肪组织；
(2)贴壁培养：将脂肪组织剪成4-5mm3大小的碎块，取干净的10cm培养皿，用镊子将脂肪碎块贴于培养皿内，一个培养皿贴10-15块，在生物安全柜中晾干30min左右，每个培养皿添加10ml完全培养基；
(3)补液与换液：每隔3天进行补液，添加5ml完全培养基/皿，当有细胞爬出后，进行全换液，10ml完全培养基/皿；当有成片细胞爬出后，将脂肪组织块去掉，并进行全换液；
(4)细胞传代：
(4a)清洗：将培养皿中的培养基吸出并弃去，吸取PBS加入每个培养皿中，5ml/皿，轻轻晃动培养皿，使PBS能充分清洗细胞表面，吸出PBS并弃去；
(4b)消化：加入0.25%胰酶，使胰酶覆盖细胞表面，室温消化2-5分钟，在倒置显微镜下观察细胞状态，当所有细胞均变圆并脱离培养皿时，轻拍培养皿，使所有细胞脱落并悬浮于培养皿中，显微镜下观察确保所有细胞均脱落后，将培养皿移至生物安全柜中；
(4c)中止：每皿加入2~5mL与胰酶等体积的完全培养基，混匀，中止胰酶消化；
(4d)收集：用移液管吸取培养皿中的细胞悬液，并收集至50ml离心管中，再用PBS冲洗培养皿，确保所有细胞均被收集；
(4e)离心：将离心管放入台式离心机中，配平，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；
(4f)重悬：离心结束后，取出离心管，放入生物安全柜中，吸出上清液并弃去，用完全培养基重悬细胞沉淀，将多管细胞悬液合并为一管，混匀后取样计数及检测细胞存活率；
(4g)传代：按5000-8000个细胞/cm2的密度将细胞接种至T75培养瓶中，放入细胞培养箱中培养3-4天，得到P1代脂肪间充质干细胞；
(4h)任选的，依照以上步骤(4a)至步骤(4g)的操作进行细胞传代，依次得到P2代至P5代脂肪间充质干细胞；
(4i)任选的，使得到的P1代至P5代的任一代或多代的脂肪间充质干细胞进行制剂的制备；
(4j)任选的，使得到的P1代至P5代的任一代或多代的脂肪间充质干细胞进行细胞冻存，任选的对所冻存的细胞进行复苏，以及任选的对复苏的细胞进行制剂的制备，
其中，所述完全培养基组成为：100mL的FBS、丙二醇2g、果糖500mg、无水氯化钙265mg、硝酸铁0.1mg、氯化钾400mg、无水硫酸镁97.67mg、氯化钠6400mg、无水磷酸二氢钠109mg、丁二酸75mg、丁二酸钠100mg、L-盐酸精氨酸84mg、L-盐酸胱氨酸63mg、甘氨酸30mg、L-盐酸组氨酸42mg、L-异亮氨酸105mg、L-亮氨酸105mg、L-盐酸赖氨酸146mg、L-甲硫氨酸30mg、L-苯丙氨酸66mg、L-丝氨酸42mg、L-苏氨酸95mg、L-色氨酸16mg、L-酪氨酸72mg、L-缬氨酸94mg、D-泛酸钙4mg、酒石酸胆碱7.2mg、叶酸4mg、肌醇7.2mg、烟酰胺4mg、核黄素0.4mg、盐酸硫胺4mg、盐酸吡哆辛4mg、葡萄糖1000mg、丙酮酸钠110mg、酚红9.3mg、水适量加至1000mL。
2.根据权利要求1的培养方法，其中，当在细胞传代的过程中，在步骤(4g)的操作中，在融合率达到80-90%时，进行下一代的细胞传代或者进行制剂制备和/或细胞冻存。
3.根据权利要求1的培养方法，其中，所述脂肪是从眼袋和/或眼皮部位采集的眼部脂肪。
4.根据权利要求1的培养方法，其中，所述细胞冻存使用的冻存液组成为：1份DMSO：2份人血清白蛋白：7份完全培养基。
5.根据权利要求1的培养方法，其包括如下步骤：
(1)培养预处理：将采集的脂肪转移至生物安全柜，倒入装有含青链霉素的PBS的培养皿中，使用无菌手术剪和无菌镊子取出脂肪上的血管和结缔组织，使用PBS清洗脂肪组织；
(2)贴壁培养：将脂肪组织剪成4-5mm3大小的碎块，取干净的10cm培养皿，用镊子将脂肪碎块贴于培养皿内，一个培养皿贴10-15块，在生物安全柜中晾干30min左右，每个培养皿添加10ml完全培养基；
(3)补液与换液：每隔3天进行补液，添加5ml完全培养基/皿，当有细胞爬出后，进行全换液，10ml完全培养基/皿；当有成片细胞爬出后，将脂肪组织块去掉，并进行全换液；
(4) P0代-P1代的细胞传代：
(4a)清洗：将培养皿中的培养基吸出并弃去，吸取PBS加入每个培养皿中，5ml/皿，轻轻晃动培养皿，使PBS能充分清洗细胞表面，吸出PBS并弃去；
(4b)消化：加入0.25%胰酶，使胰酶覆盖细胞表面，室温消化2-5分钟，在倒置显微镜下观察细胞状态，当所有细胞均变圆并脱离培养皿时，轻拍培养皿，使所有细胞脱落并悬浮于培养皿中，显微镜下观察确保所有细胞均脱落后，将培养皿移至生物安全柜中；
(4c)中止：每皿加入2~5mL与胰酶等体积的完全培养基，混匀，中止胰酶消化；
(4d)收集：用移液管吸取培养皿中的细胞悬液，并收集至50ml离心管中，再用PBS冲洗培养皿，确保所有细胞均被收集；
(4e)离心：将离心管放入台式离心机中，配平，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；
(4f)重悬：离心结束后，取出离心管，放入生物安全柜中，吸出上清液并弃去，用完全培养基重悬细胞沉淀，将多管细胞悬液合并为一管，混匀后取样计数及检测细胞存活率；
(4g)传代：按5000-8000个细胞/cm2的密度将细胞接种至T75培养瓶中，放入细胞培养箱中培养3-4天；
(5) P1-P2代的细胞传代：
(5a)清洗：将培养瓶中的培养基吸出并弃去，吸取PBS加入每个培养瓶中，10ml/T75培养瓶，将培养瓶横放并轻轻晃动，使PBS能充分清洗细胞表面，吸出PBS并弃去；
(5b)消化：加入0.25%胰酶，3ml/T75瓶，盖上瓶盖，将培养瓶横放，使胰酶覆盖细胞表面，室温消化2-5分钟，在倒置显微镜下观察细胞状态，当所有细胞均变圆并脱离培养瓶时，轻拍培养瓶壁，使所有细胞脱落并悬浮于培养瓶中，显微镜下观察确保所有细胞均脱落后，将培养瓶移至生物安全柜中；
(5c)中止：每瓶加入2~5mL与胰酶等体积的完全培养基，混匀，中止胰酶消化；
(5d)收集：用移液管吸取培养瓶中的细胞悬液，并收集至50ml离心管中，再用PBS冲洗培养瓶，确保所有细胞均被收集；
(5e)离心：将离心管放入台式离心机中，配平，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；
(5f)重悬：离心结束后，取出离心管，放入生物安全柜中，吸出上清液并弃去，用完全培养基重悬细胞沉淀，将多管细胞悬液合并为一管，混匀后取样计数及检测细胞存活率；
(5g)传代：按5000-8000个细胞/cm2的密度将细胞接种至T225培养瓶中，放入细胞培养箱中培养3-4天；
(6) P2-P3代的细胞传代：
(6a)清洗：将培养瓶中的培养基吸出并弃去，吸取PBS加入每个培养瓶中，15ml/T225培养瓶，将培养瓶横放并轻轻晃动，使PBS能充分清洗细胞表面，吸出PBS并弃去；
(6b)消化：加入0.25%胰酶，5ml/T225瓶，盖上瓶盖，将培养瓶横放，使胰酶覆盖细胞表面，室温消化2-5分钟，在倒置显微镜下观察细胞状态，当所有细胞均变圆并脱离培养瓶时，轻拍培养瓶壁，使所有细胞脱落并悬浮于培养瓶中，显微镜下观察确保所有细胞均脱落后，将培养瓶移至生物安全柜中；
(6c)中止：每瓶加入5mL与胰酶等体积的完全培养基，混匀，中止胰酶消化；
(6d)收集：用移液管吸取培养瓶中的细胞悬液，并收集至50ml离心管中，再用PBS冲洗培养瓶，确保所有细胞均被收集；
(6e)离心：将离心管放入台式离心机中，配平，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；
(6f)重悬：离心结束后，取出离心管，放入生物安全柜中，吸出上清液并弃去，用完全培养基重悬细胞沉淀，将多管细胞悬液合并为一管，混匀后取样计数及检测细胞存活率；
(6g)传代：按5000-8000个细胞/cm2的密度将细胞接种至T225培养瓶中，放入细胞培养箱中培养3-4天；
(7)细胞冻存：
(7a)清洗：将培养瓶中的培养基吸出并弃去，吸取PBS加入每个培养瓶中，15ml/T225培养瓶，将培养瓶横放并轻轻晃动，使PBS能充分清洗细胞表面，吸出PBS并弃去；
(7b)消化：加入0.25%胰酶，5ml/T225瓶，盖上瓶盖，将培养瓶横放，使胰酶覆盖细胞表面，室温消化2-5分钟，在倒置显微镜下观察细胞状态，当所有细胞均变圆并脱离培养瓶时，轻拍培养瓶壁，使所有细胞脱落并悬浮于培养瓶中，显微镜下观察确保所有细胞均脱落后，将培养瓶移至生物安全柜中；
(7c)中止：每瓶加入5mL与胰酶等体积的完全培养基，混匀，中止胰酶消化；
(7d)收集：用移液管吸取培养瓶中的细胞悬液，并收集至50ml离心管中，再用PBS冲洗培养瓶，确保所有细胞均被收集；
(7e)离心：将离心管放入台式离心机中，配平，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；
(7f)重悬：离心结束后，取出离心管，放入生物安全柜中，吸出上清液并弃去，用完全培养基重悬细胞沉淀，将多管细胞悬液合并为一管，混匀后取样计数及检测细胞存活率；
(7g)离心：将待冻存细胞悬液离心，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；
(7hi)混合与分装：细胞离心后移至生物安全柜，吸取并弃去上清液，加入冻存液重悬细胞沉淀，混合均匀以后，按照固定的体积将细胞悬液分装至2ml冻存管中，放入冻存盒4度冰箱预冷30分钟；
(7i)程序降温：打开程序降温仪，设定好降温程序，输入细胞批号，连接液氮供给罐，启动程序，使程序降温仪腔体温度降至4度，将预冷好的冻存盒放入程序降温仪，开始降温，整个降温过程为90分钟；
(7j)液氮储存：取出完成降温的冻存盒，放入冻存架中，放入MVE液氮储存罐中，进行冻存；
(8)复苏冻存的P3代细胞
(8a)解冻：将冻存的细胞放入37度水浴锅中，迅速晃动，使细胞在1分钟内解冻迅速将解冻好的细胞悬液转移至装有完全培养基的离心管中；
(8b)离心：将装有细胞悬液的离心管放入离心机，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；
(8d)接种：将完全培养基移至培养瓶中，将离心后的细胞上清液吸出并弃去，使用完全培养基重悬细胞沉淀，加入培养瓶中，混匀后贴标签，放入细胞培养箱中培养，融合率达到80-90%时，用于制备脂肪间充质干细胞制剂；
(9)制备脂肪间充质干细胞制剂：
待P4代细胞融合率达到80-90%时，按以下步骤收获，制备用于面部填充或修饰的脂肪间充质干细胞制剂：
(9a)清洗：将培养瓶中的培养基吸出并弃去，吸取PBS加入每个培养瓶中，15ml/T225培养瓶，将培养瓶横放并轻轻晃动，使PBS能充分清洗细胞表面，吸出PBS并弃去；
(9b)消化：加入0.25%胰酶，5ml/T225瓶，盖上瓶盖，将培养瓶横放，使胰酶覆盖细胞表面，室温消化2-5分钟，在倒置显微镜下观察细胞状态，当所有细胞均变圆并脱离培养瓶时，轻拍培养瓶壁，使所有细胞脱落并悬浮于培养瓶中，显微镜下观察确保所有细胞均脱落后，将培养瓶移至生物安全柜中；
(9c)中止：每瓶加入5mL与胰酶等体积的完全培养基，混匀，中止胰酶消化；
(9d)收集：用移液管吸取培养瓶中的细胞悬液，并收集至50ml离心管中，再用PBS冲洗培养瓶，确保所有细胞均被收集；
(9e)离心：将离心管放入台式离心机中，配平，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；
(9f)重悬：离心结束后，取出离心管，放入生物安全柜中，吸出上清液并弃去，用生理盐水重悬细胞沉淀；
(9g)清洗：将离心管放入台式离心机中，配平，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；离心结束后，取出离心管，放入生物安全柜中，吸出上清液并弃去，用生理盐水重悬细胞沉淀；任选的重复该清洗步骤以进行二次清洗；清洗后，用生理盐水将多管细胞合并为一管，取样计数及检测细胞存活率；
(9h)离心：将细胞悬液放入台式离心机中，配平，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；
(9i)脂肪间充质干细胞制剂：按照4×106/ml的密度，用生理盐水重悬，得到脂肪间充质干细胞制剂。
2 ．一种用于培养脂肪间充质干细胞的培养基，其为完全培养基，其组成为：100mL的FBS、丙二醇2g、果糖500mg、无水氯化钙265mg、硝酸铁0.1mg、氯化钾400mg、无水硫酸镁97.67mg、氯化钠6400mg、无水磷酸二氢钠109mg、丁二酸75mg、丁二酸钠100mg、L-盐酸精氨酸84mg、L-盐酸胱氨酸63mg、甘氨酸30mg、L-盐酸组氨酸42mg、L-异亮氨酸105mg、L-亮氨酸105mg、L-盐酸赖氨酸146mg、L-甲硫氨酸30mg、L-苯丙氨酸66mg、L-丝氨酸42mg、L-苏氨酸95mg、L-色氨酸16mg、L-酪氨酸72mg、L-缬氨酸94mg、D-泛酸钙4mg、酒石酸胆碱7.2mg、叶酸4mg、肌醇7.2mg、烟酰胺4mg、核黄素0.4mg、盐酸硫胺4mg、盐酸吡哆辛4mg、葡萄糖1000mg、丙酮酸钠110mg、酚红9.3mg、水适量加至1000mL。
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