BR112013015215B1

BR112013015215B1 - Método para recuperação facilitada de células regenerativas a partir de uma amostra de tecido do corpo

Info

Publication number: BR112013015215B1
Application number: BR112013015215-0A
Authority: BR
Inventors: Eckhard U. Alt; Michael E. Coleman; Ron Stubbers
Original assignee: InGeneron, Inc
Priority date: 2010-12-16
Filing date: 2011-12-16
Publication date: 2020-09-29
Also published as: US20150093809A1; AU2011343513B2; JP2014505675A; CN103402646A; WO2012083260A2; US20120195863A1; US8951513B2; EP2651565A4; US20150299643A1; KR101951055B1; EP2651565B1; US20150307845A1; KR20140038354A; EP2651565A2; WO2012083260A3; JP6014045B2; CN103402646B; WO2012083260A9; BR112013015215A2; US20150314041A1

Abstract

métodos para recuperação e para a dissociação de células regenerativas a partir de um tecido do corpo, unidade de processamento de tecido automatizada para o isolamento das referidas células e aparelho para a recuperação das mesmas. este pedido de patente descreve métodos e um aparelho para a recuperação de matriz enriquecida por célula e células (por exemplo, células regenerativas) a partir de uma amostra de tecido. em algumas concretizações, pelo menos, dois ciclos de aceleração e desaceleração são realizados.

Description

Referência Cruzada a Pedidos Relacionados

[0001] Este pedido de patente reivindica prioridade deste ao Pedido de Patente U.S. Provisório N2 61/424 012, depositado em 16 de dezembro de 2010, e ao Pedido de Patente U.S. Provisório N2 61/555 305, depositado em 03 de novembro de 2011. Os conteúdos dos pedidos de patente anteriores são considerados parte (e são aqui incorporados por referência neste pedido de patente) do conteúdo deste pedido de patente.

Campo Técnico

[0002] Esta invenção diz respeito a métodos e a um aparelho para a recuperação de uma matriz enriquecida por células e a recuperação de células, e mais especialmente à recuperação de células a partir de uma amostra de tecido usando duas ou mais etapas de aceleração e desaceleração sob a ação de força centrífuga, e suas combinações.

Antecedentes da Invenção

[0003] As estratégias atuais na medicina regenerativa têm como objetivo a reposição de tecido no qual a taxa de apoptose está aumentada. Isso significa que, dentro do órgão, há uma perda final de células funcionais, pois um número maior de células está morrendo do que sendo substituído. Por conseguinte, a transferência de células regenerativas, por exemplo, células-tronco e células progenitoras, de um local para o sítio de renovação, é uma abordagem terapêutica para restaurar o órgão de volta a um equilíbrio. A pesquisa empreendida nos laboratórios dos inventores demonstrou que células-tronco e células regenerativas estão presentes em todos os órgãos, situadas primariamente no espaço vascular e perivascular com as células progenitoras iniciais na parede do vaso presas à lâmina interna elástica. Uma população destas células é capaz de repor o estroma de um órgão e a outra parte destas é capaz de se diferenciar para o respectivo parênquima do órgão específico. Cada órgão pode ser comparado a uma casa, onde o estroma, composto por fibroblastos e consistindo em matriz extracelular, pode ser comparado a paredes de tijolos e argamassa em uma causa, a tubulação em uma casa corresponde aos vasos sanguíneos do órgão e os nervos representam a fiação elétrica nas paredes. Dentro destas casas, em cada órgão, há um determinado tipo de habitantes, como células hepáticas, células cardíacas, células ósseas, células cartilaginosas ou adiposas, também denominadas o parênquima de um órgão.

[0004] Para restaurar a função de um órgão disfuncional, é importante fornecer tanto o estroma, que significa o suporte que forma as paredes do órgão, como os habitantes, que são as células parenquimatosas específicas.

[0005] Um meio simples para recuperar as células regenerativas capazes de restaurar a função do órgão é dissociar as células do tecido adiposo subcutâneo, pois este é rico em vasos sanguíneos e o tecido adiposo removível não é essencial para a vida. A maioria das pessoas é capaz, e mesmo se sentem felizes, de doar algumas gramas destes tecidos adiposos.

[0006] O implante de enxertos autólogos de tecido colhido por lipoaspiração é um procedimento comum na cirurgia estética para aplicações de preenchimento de pequeno (por exemplo, dobras nasolabiais) e grandes volumes (nádegas ou mamas). Os benefícios primários deste procedimento denominado "enxerto de gordura autóloga" são custos mais baixos em comparação a preenchedores sintéticos e ausência de rejeição imune, uma vez que é usado o tecido do próprio paciente. Atualmente, múltiplos métodos de coleta e processamento de lipoaspirados são empregados para obter tecido para o enxerto. Os fatores que determinam os resultados clínicos, que se seguem ao enxerto de gordura autóloga, não foram ainda completamente elucidados. No entanto, é amplamente reconhecido que melhorar a persistência do enxerto é uma área de necessidade signifi cante.

Sumário da Invenção

[0007] O metabolismo de tecido adiposo ou células adiposas transferidas, recuperados de um local no corpo e transferidos para outro, continua a ser anaeróbico. Sem o suprimento sanguíneo adequado, estas células sofrem necrose, apoptose e autofagia dentro de 24 a 48 horas e morrem. O problema com os enxertos tradicionais de gordura, em que a gordura é retirada por lipoaspiração de um local no corpo e novamente injetada em outro, é que uma grande fração de células transferidas não sobrevive, e as células em vias de morrer podem causar inflamação local considerável. O potencial de persistência e regenerativo do enxerto de gordura não está correlacionado com o teor de adipócitos cheios de lipídios no enxerto, mas sim com o teor de células regenerativas como células-tronco e com a matriz extracelular administrada. A perda após o enxerto de adipócitos maduros é alta, que se deve ao trauma sofrido na colheita e na readministração e à natureza isquêmica no ambiente do enxerto. Por outro lado, células-tronco e as regenerativas são mais resistentes a esses fatores e assim contribuem substancialmente para a viabilidade e o potencial regenerativo do enxerto em longo prazo.

[0008] O presente documento é fundamentado em um método melhorado para o preenchimento de volume do tecido subcutâneo ou de outras estruturas do tecido conjuntivo que necessitam aumentar de volume. O método inclui a transferência de uma matriz enriquecida por células com teor reduzido de lipídios, mas com concentração aumentada de células regenerativas. É sabido que o tecido conjuntivo possui uma tolerância consideravelmente longa à isquemia, pois seu metabolismo é significativamente mais baixo em comparação ao de células do tipo adipócito. Por conseguinte, a presente invenção tem como objetivo prover um método e um aparelho para o preenchimento de volume, estável e duradouro, com células de matriz enriquecida por células. Isso resulta em sobrevida maior do tecido quando a matriz é transferida para um novo local. Nesse contexto, conforme descrito neste documento, a neovascularização a partir das células-tronco residentes no tecido proporciona maior viabilidade do enxerto transplantado. Uma melhora adicional a este método é reaplicar uma mistura da matriz enriquecida por células juntamente com células regenerativas dissociadas recuperadas pelo método aqui descrito que inclui a dissociação enzimática do lipoaspirado em uma centrífuga aquecida por aceleração e desaceleração em um rotor invertido.

[0009] Desse modo, o presente documento provê novos métodos para o preparo e a recuperação de uma matriz enriquecida por células, recuperação melhorada de células regenerativas a partir de sua localização subcutânea por meio do mesmo aparelho que o usado para a recuperação da matriz, e a combinação de matriz enriquecida por células e células regenerativas para reforçar a neovascularização e melhorar a sobrevida do tecido enxertado transplantado para o preenchimento de volume.

[00010] O presente documento também provê meios com custo compensador para a recuperação de células regenerativas, as quais são definidas como células mesenquimais em estágio precoce e mais toda a gama de células progenitoras, a partir do local onde estão situadas no tecido adiposo subcutâneo. O processamento prévio e a redução do teor de células cheias de lipídios do lipoaspirado inicial é um método eficaz para poupar enzimas custosas tais como colagenase e protease neutra. Os métodos incluem uma abordagem em duas etapas, nas quais a quantidade de células cheias de lipídios no lipoaspirado é reduzida e uma matriz enriquecida por células é recuperada e, em seguida, submeter a matriz enriquecida por células com teor reduzido de lipídios a um processo enzimático e mecânico, empregando aumento de temperatura proveniente de uma centrífuga aquecida com rotor reconfigurável e ciclos repetidos de aceleração e desaceleração para recuperar um preparado celular regenerativo a custo otimizado.

[00011] Atualmente, os métodos conhecidos para processar gordura subcutânea com o objetivo de obter um lipoaspirado processado aplicam apenas a centrifugação. Como mostrado neste documento, o processamento por centrifugação apenas pode incrementar o rendimento celular do tecido processado. Contudo, a extrusão do tecido adiposo antes da etapa de centrifugação aumentar o teor celular do material lipoaspirado processado, designado a matriz enriquecida por células.

[00012] O processamento de tecido subcutâneo pode ser realizado conforme descrito neste documento para produzir uma matriz enriquecida por células, a qual é composta primariamente por colágeno, laminina, elastina e outros proteoglicanos da matriz extracelular e de células residentes de tecidos, incluindo células-tronco e progenitoras, coletivamente "células regenerativas" ou "plataforma regenerativa", que ainda estão ligadas no tecido. Tipicamente, uma matriz enriquecida por células contém 90% ou mais das células regenerativas ligadas em seu local no tecido.

[00013] Em uma concretização, o present documento provê métodos e um aparelho para preparar e recuperar uma matriz enriquecida por células.

[00014] Em uma concretização, o presente documento provê QIAS métodos e um aparelho para preparar e recuperar células regenerativas a partir da matriz enriquecida por células.

[00015] Em uma concretização, são providas composições celulares que incluem células regenerativas isoladas, conforme aqui descritas, ou composições celulares contendo uma matriz enriquecida por células e células regenerativas. A matriz enriquecida por células preparada conforme aqui descrito possui teor reduzido de lipídios, mas concentração aumentada de células regenerativas. É sabido que a tolerância à isquemia do tecido conjuntivo é consideravelmente, já que seu metabolismo é significativamente mais baixo quando comparado ao de células tipo adipócito. As composições celulares aqui descritas podem intensificar a neovascularização de enxertos e aumentar a sobrevida em longo prazo do enxerto. Composições celulares contendo uma combinação da matriz enriquecida por células e células regenerativas são especialmente úteis para intensificar a neovascularização de enxertos e aumentar a sobrevida em longo prazo do enxerto.

[00016] Em uma concretização, este documento apresenta um método para recuperar matriz enriquecida por células a partir de tecido. O método inclui extrusar uma amostra de tecido que contém uma suspensão de pedaços de tecido adiposo em líquido aquoso através de um óstio e centrifugar a amostra de tecido extrudada para isolar uma matriz enriquecida por células. O diâmetro do óstio pode ter de 1 a 5 mm. A amostra de tecido extrudada é centrifugada por pelo menos cinco minutos no mínimo a 400 x g, de preferência em força g mais alta de até 1200 x g (por exemplo, 400 x g a 1200 x g). Células podem ser recuperadas a partir da matriz enriquecida por células conforme aqui descrita.

[00017] Em outro aspecto, este documento apresenta um método para recuperar células a partir de tecido. O método inclui fornecer uma amostra de tecido extrudada armazenada em um recipiente adaptado para uma centrífuga, a amostra de tecido compreendendo uma suspensão de pedaços de tecido em líquido aquoso; submeter a amostra a pelo menos uma etapa de aceleração e desaceleração, usando força centrífuga aplicada através de um elemento rotativo, em que o elemento rotativo compreende um eixo e um ou mais braços que se estendem a partir do eixo, em que (i) o um ou mais braços estão apoiados a partir do eixo em tal maneira que, quando o eixo gira, o um ou mais braços se movem para cima e para fora em relação ao eixo ou (ii) o um ou mais braços estão apoiados a um ângulo fixo, em que os recipientes ligados aos referidos braços são mantidos em uma posição tal que a força gravitacional sobre o material é oposta à força centrífuga aplicada, em que a referida força centrífuga aplicada varia de cerca de 50 g a cerca de 4000 g. A temperatura da amostra pode ser mantida entre 32° e 42 °C. Uma ou mais enzimas (por exemplo, proteases como colagenases ou proteases neutras, ou outras enzimas conforme aqui descritas) também podem ser incluídas.

[00018] Em uma concretização, este documento apresenta um método para recuperar uma plataforma regenerativa a partir de uma amostra de tecido (por exemplo, lipoaspirado, tecido adiposo, e suas combinações). O método inclui fornecer uma amostra de tecido, armazenada em um primeiro recipiente de coleta de tecido, para uma unidade de processamento de tecido automatizada, em que a unidade de processamento de tecido automatizada compreende um aparelho rotativo removível contendo pelo menos duas cavidades, em que cada cavidade está configurada para inserção amovível de um recipiente de coleta de tecido no interior da cavidade, em que a amostra de tecido compreende uma suspensão de pedaços de tecido em líquido aquoso; e submeter a amostra de tecido à centrifugação a pelo menos uma rotação de pelo menos 400 x g por pelo menos aproximadamente 5 minutos, usando a unidade de processamento de tecido automatizada, pelo qual separando uma matriz enriquecida por células da amostra de tecido, em que a matriz enriquecida por células compreende uma plataforma regenerativa. O método pode incluir ainda extrusar a amostra de tecido através de um orifício antes de colocar a amostra de tecido na unidade de processamento de tecido automatizada. A matriz enriquecida por células pode ter uma concentração mais alta da plataforma regenerativa, em comparação a outro método de contrário correspondente sem a extrusão da amostra através de um orifício. O método pode incluir ainda transferir o concentrado de amostra de tecido do primeiro recipiente de coleta de tecido para um segundo recipiente de coleta por um método de sistema fechado. Em algumas concretizações, pelo menos uma protease pode ser adicionada ao segundo recipiente de coleta. A matriz enriquecida por células pode ser submetida pelo menos a dois ciclos de aceleração, em que cada ciclo de aceleração é seguido por um ciclo de desaceleração, pelo qual a matriz enriquecida por células é desagregada. Em algumas concretizações, a matriz enriquecida por células pode ser filtrada para obter uma plataforma regenerativa injetável.

[00019] Em qualquer um dos métodos descritos neste documento, o método pode incluir ainda administrar pelo menos uma parte da plataforma regenerativa injetável a um indivíduo em um local de injeção, pelo qual a injeção altera uma área ou próximo do local da injeção.

[00020] Este documento também apresenta um método para desagregar uma matriz enriquecida por células na qual está contida uma plataforma regenerativa, em que o método compreende fornecer uma matriz enriquecida por células armazenada em um segundo recipiente de coleta de tecido adaptado para uma unidade de processamento de tecido automatizada, em que o recipiente de coleta de tecido compreende pelo menos uma protease; e submeter a matriz enriquecida por células a pelo menos dois ciclos de aceleração, em que cada ciclo de aceleração é seguido por um ciclo de desaceleração, e em que pelo menos dois ciclos de aceleração e desaceleração são realizados a uma taxa de pelo menos 10 x g, pelo qual a matriz enriquecida por células é desagregada. O método pode incluir ainda filtrar, ou filtrar e concentrar, a matriz enriquecida por células desagregada para obter uma plataforma regenerativa injetável.

[00021] Este documento também apresenta um aparelho rotativo removível compreendendo pelo menos duas cavidades, em que cada cavidade está configurada para inserção amovível de um recipiente de coleta de tecido no interior da cavidade, em que o aparelho rotativo removível está configurado para girar no interior de uma unidade de processamento de tecido automatizada para a separação de uma matriz enriquecida por células a partir de uma amostra de tecido. O aparelho rotativo removível pode incluir uma etiqueta de identificação de radiofrequência (RFID) fixada ao aparelho que permita a identificação do aparelho rotativo removível pela unidade de processamento de tecido automatizada. Alternativamente, o tipo de aparelho rotativo removível pode ser identificado com base na quantidade de corrente elétrica necessária para acelerar o aparelho durante a fase de aceleração. O aparelho rotativo removível pode incluir materiais que podem ser submetidos à autoclave.

[00022] Em outro aspecto, este documento apresenta uma unidade de processamento de tecido automatizada para isolar uma matriz enriquecida por células a partir de uma amostra de tecido. A unidade de processamento de tecido automatizada pode incluir um aparelho rotativo removível compreendendo pelo menos duas cavidades, em que cada cavidade está configurada para inserção amovível de um recipiente de coleta de tecido no interior da cavidade. A unidade de processamento de tecido automatizada pode incluir um dispositivo de controle de temperatura. A unidade de processamento de tecido automatizada pode estar configurada para ter pelo menos dois intervalos de parada-início de aceleração. O aparelho rotativo removível pode ter pelo menos uma especificação predeterminada que permita a identificação do aparelho rotativo removível pela unidade de processamento de tecido automatizada.

[00023] Em outro aspecto, é provida uma centrífuga modificada que pode ser usada para realizar pelo menos duas séries de etapas rápidas de aceleração e desaceleração sob uma força centrífuga. Tais etapas podem ser realizadas em ambiente termicamente regulado (por exemplo, 35-42 °C) na presença de uma ou mais enzimas (por exemplo, colagenase e protease neutra) para intensificar a degradação da matriz extracelular e a liberação de células. A centrifugação pode ser usada para recuperar células liberadas a partir da matriz extracelular. Os métodos e o aparelho descritos neste documento podem ser usados para processar qualquer tecido humano ou de animal que contenha vasos sanguíneos. Os métodos e o aparelho são especialmente úteis para recuperar células a partir de tecido adiposo (por exemplo, tecido adiposo subcutâneo ou intra- abdominal), o qual é rico em vascularização e fácil de recuperar de um indivíduo.

[00024] Este documento também provê um método para recuperar células a partir de tecido. O método inclui fornecer uma amostra de tecido armazenada em um recipiente adaptado para uma centrífuga, a amostra de tecido incluindo uma suspensão de pedaços de tecido em líquido aquoso; e submeter a amostra de tecido a uma pluralidade de etapas de aceleração e desaceleração usando força centrífuga. A amostra de tecido pode incluir tecido humano ou tecido de animal, e pode conter vasos sanguíneos. A amostra de tecido pode ser de tecido adiposo tal como lipoaspirado. O método pode incluir manter uma temperatura de 26 °C a 42 °C dentro do recipiente, enquanto a amostra de tecido é submetida à pluralidade de etapas de aceleração e desaceleração. A amostra de tecido pode ser submetida à pluralidade de etapas de aceleração e desaceleração na presença de uma ou mais enzimas (por exemplo, uma colagenase, outra protease, ou uma mistura destas).

[00025] Em algumas concretizações, cada uma das etapas de aceleração pode ser realizada por 5 a 20 segundos e cada uma das etapas de desaceleração pode ser realizada por 3 a 20 segundos. A amostra de tecido pode ser submetida à pluralidade de etapas de aceleração e desaceleração por 5 minutos a 180 minutos (por exemplo, 20 minutos a 60 minutos). Em uma concretização, a amostra de tecido é submetida ao menos a três ciclos de aceleração a 200 x g e desaceleração a 1 x g por minuto durante 30 minutos.

[00026] Em outro aspecto, este documento apresenta um método para recuperar células a partir de tecido. O método incluir fornecer uma amostra de tecido armazenada em um recipiente adaptado para uma centrífuga, a amostra de tecido incluindo uma suspensão de pedaços de tecido em líquido aquoso; submeter a amostra a uma pluralidade de etapas de aceleração e desaceleração usando força centrífuga aplicada através de um elemento rotativo, em que o elemento rotativo compreende um eixo e um ou mais braços que se estendem a partir do eixo, em que (i) o um ou mais braços são apoiados a partir do eixo em tal maneira que, quando o eixo gira, o um ou mais braços se movem para cima e para fora em relação ao eixo ou (ii) o um ou mais braços são apoiados a um ângulo fixo, em que os recipientes ligados aos braços são mantidos em uma posição tal que a força gravitacional sobre o material é oposta à força centrífuga aplicada, em que a força centrífuga aplicada varia de cerca de 50 g a cerca de 4000 g. Cada uma das etapas de aceleração pode ser realizada por 5 a 20 segundos. Cada uma das etapas de desaceleração pode ser realizada por 3 a 20 segundos. A amostra de tecido pode ser submetida à pluralidade de etapas de aceleração e desaceleração por 5 minutos a 180 minutos (por exemplo, 20 minutos a 60 minutos). Em uma concretização, a amostra de tecido é submetida pelo menos a três ciclos de aceleração a 200 x g e desaceleração a 1 x g por minuto durante 30 minutos.

[00027] Este documento também apresenta um método para recuperar células regenerativas a partir de tecido. O método inclui fornecer uma amostra de tecido armazenada em um recipiente adaptado para uma centrífuga, a amostra de tecido compreendendo uma suspensão de pedaços de tecido em líquido aquoso; submeter a amostra a uma pluralidade de etapas de aceleração e desaceleração usando força centrífuga; e centrifugar a amostra entre 400 e 4000 x g para isolar componentes celulares. A amostra, quando submetida à centrifugação entre 400 e 4000 x g, pode estar armazenada dentro de um recipiente que inclui uma parte central cilíndrica; uma primeira parte de extremidade integralmente formada com a parte central; e uma segunda parte de extremidade aberta integralmente formada com a parte central, em que a primeira parte de extremidade se afunila em direção a uma abertura estreita, e compreende uma parte de coleta que se projeta a partir da parte de extremidade na abertura estreita, em que a parte de coleta é capaz de receber e armazenar um líquido e compreende um tampão removível que fecha a primeira parte de extremidade a partir da parte de coleta.

[00028] Em qualquer um dos métodos aqui descritos, o recipiente inclui uma inserção porosa, em que a inserção porosa é composta por material biocompatível e possui tamanho de poros variando de 0,5 a 5 mm, em que a inserção porosa intensifica a dissociação de células da matriz extracelular da amostra de tecido quando a amostra de tecido é submetida à referida pluralidade de etapas de aceleração e desaceleração. A inserção porosa pode ser de forma substancialmente cilíndrica, forma cônica substancialmente invertida ou pode dividir o recipiente em parte superior e inferior.

[00029] Em qualquer um dos métodos aqui descritos, o recipiente pode incluir uma pluralidade de partículas, em que as partículas possuem pelo menos 100 micrômetros de diâmetro e são compostas por um ou mais materiais biocompatíveis, em que as partículas intensificam a dissociação de células da matriz extracelular da amostra de tecido quando a amostra de tecido é submetida à pluralidade de etapas de aceleração e desaceleração. A pluralidade de partículas pode incluir partículas de diferentes gravidades específicas ou formas.

[00030] Em qualquer um dos métodos aqui descritos, o recipiente pode incluir um eixo disposto verticalmente no lúmen interno do recipiente, o eixo incluindo ainda uma pluralidade de braços dispostos ao longo de um comprimento do eixo e se estendendo substancialmente em sentido radial do eixo no lúmen do recipiente, em que os braços intensificam a dissociação de células da matriz extracelular da amostra de tecido quando a amostra de tecido é submetida à pluralidade de etapas de aceleração e desaceleração. Os braços podem ser de diferentes formas ou tamanhos. O recipiente pode incluir uma cobertura removível, em que o eixo está fixado à cobertura removível. O eixo pode estar fixado ao recipiente de modo que possa girar. O eixo pode ser móvel no interior do recipiente.

[00031] Em outro aspecto, este documento apresenta um recipiente ou conjunto de recipientes que inclui uma parte central cilíndrica alongada; uma primeira parte de extremidade integralmente formada com a parte central; uma segunda parte de extremidade aberta integralmente formada com a parte central; e uma porta que se estende radialmente para fora da parte cilíndrica alongada, em que a primeira parte de extremidade se afunila em direção a uma abertura estreita, e inclui uma parte de coleta que se projeta a partir da parte de extremidade na abertura estreita, em que a parte de coleta é capaz de receber e armazenar um líquido e compreende um tampão removível que fecha a primeira parte de extremidade a partir da parte de coleta. O tampão removível pode permitir o fluxo de líquido da parte de extremidade para a parte de coleta mediante força centrífuga, pressão, dissociação com uma enzima ou remoção física. A parte de coleta pode ser destacável da primeira parte de extremidade. A parte de coleta pode incluir um líquido aquoso. A segunda extremidade aberta inclui uma parte de engate.

[00032] Este documento também apresenta um conjunto de recipientes que inclui um primeiro recipiente; um segundo recipiente; e um dispositivo de acoplamento adaptado para acoplar o primeiro recipiente ao segundo recipiente. O primeiro recipiente está descrito acima. O segundo recipiente inclui uma parte central cilíndrica alongada, uma parte de extremidade fechada integralmente formada com a parte central, e uma parte de extremidade aberta integralmente formada com a parte central, em que a parte de extremidade aberta do segundo recipiente compreende uma parte de engate; e o dispositivo de acoplamento compreendendo uma parte central tubular com uma primeira e uma segunda extremidade aberta e uma inserção porosa estendendo-se horizontalmente através do dispositivo de acoplamento, em que cada extremidade aberta do dispositivo de acoplamento compreende uma parte de engate, em que a inserção porosa possui tamanho de poros de 40 a 500 pm. O dispositivo de acoplamento inclui ainda uma porta estendendo-se radialmente para fora da parte central tubular, em que uma parte de engate do dispositivo de acoplamento está presa à parte de engate do primeiro recipiente e a outra parte de engate do dispositivo de acoplamento está presa à parte de engate do segundo recipiente. A porta pode incluir uma inserção porosa.

[00033] O primeiro e o segundo recipiente podem ser montados previamente, em que o espaço interior definido pelo primeiro recipiente e o segundo recipiente está pelo menos parcialmente sob o vácuo.

[00034] Este documento também apresenta um recipiente que inclui uma parte central cilíndrica alongada definindo um lúmen interno; uma primeira parte de extremidade formada integralmente com a parte central; uma segunda parte de extremidade aberta integralmente formada com a parte central; um eixo disposto verticalmente no lúmen interno; e uma pluralidade de braços dispostos ao longo de um comprimento do eixo e estendendo-se em direção substancialmente radial a partir do eixo para o lúmen interno. A pluralidade de braços pode ser de diferentes formas ou tamanhos. O recipiente pode incluir ainda uma cobertura removível que se prende à segunda parte de extremidade aberta, em que o eixo está fixado à cobertura removível. O eixo pode estar fixado ao recipiente de modo girável. O eixo pode ser móvel dentro do lúmen do recipiente.

[00035] Em outro aspecto, este documento apresenta um kit que inclui qualquer um dos recipientes ou conjuntos de recipientes aqui descritos. O kit pode ainda incluir um ou mais reagentes para separação de células.

[00036] Em outro aspecto, este documento apresenta um método para aumentar o teor celular em um lipoaspirado processado com o objetivo de recuperar uma matriz celular enriquecida para reaplicação a um paciente, o método inclui extrusar o lipoaspirado através de um orifício de diâmetro definido na faixa de 1-5 mm, e depois submeter um lipoaspirado extrudado a uma etapa de centrifugação contínua de pelo menos cinco minutos e força g de no mínimo 400 x g. A etapa de centrifugação pode incluir força centrífuga de até 2000 x g. A etapa de centrifugação pode incluir força centrífuga de aproximadamente 1200 x g. A amostra de tecido pode incluir lipoaspirado, tecido adiposo, e suas combinações. A centrifugação pode ser realizada usando um rotor horizontal de ângulo fixo.

[00037] Em outro aspecto, este documento apresenta um método para recuperação facilitada de células regenerativas a partir de tecido adiposo, compreendendo acelerar e desacelerar o tecido na presença de enzima proteolítica no interior de uma centrífuga, segundo o qual o recipiente para o tecido está invertido. O interior da centrífuga pode ser com temperatura controlada. Um ou mais ciclos por minuto de aceleração e desaceleração podem ser aplicados ao tecido. A enzima proteolítica pode ser colagenase, protease neutra ou ser ambas. Uma combinação de colagenase com protease neutra pode ser empregada juntamente com temperatura e agitação aumentada por centrífuga de aceleração e desaceleração centrífuga em rotor invertido para facilitar a recuperação de células regenerativas a partir de tecido adiposo.

[00038] Este documento também apresenta um método de recuperação de células regenerativas a partir de tecido adiposo de custo compensador, compreendendo fornecer uma matriz celular enriquecida; acelerar e desacelerar a matriz enriquecida por células na presença de enzima proteolítica dentro de uma centrífuga, segundo o qual o recipiente para o tecido está invertido. O interior da centrífuga pode ser com temperatura controlada. Um ou mais ciclos por minuto de aceleração e desaceleração podem ser aplicados à matriz enriquecida por células. Uma combinação de colagenase com protease neutra pode ser empregada juntamente com temperatura e agitação aumentada por centrífuga de aceleração e desaceleração centrífuga em rotor invertido para facilitar a recuperação de células regenerativas a partir de matriz enriquecida por células.

[00039] Este documento também apresenta uma composição contendo uma matriz enriquecida por células, preparada conforme aqui descrito, juntamente com um preparado de células regenerativas, preparado conforme aqui descrito, para injeção em um paciente.

[00040] Em outro aspecto, este documento apresenta um aparelho rotativo removível compreendendo pelo menos duas cavidades, em que cada cavidade está configurada para inserção amovível de um recipiente de coleta de tecido no interior da cavidade, em que o aparelho rotativo removível está configurado para girar dentro de uma unidade de processamento de tecido automatizada para a separação de uma matriz celular enriquecida a partir de uma amostra de tecido. O aparelho rotativo removível compreende uma etiqueta de identificação de radiofrequência (RFID) fixada ao aparelho que permite a identificação do aparelho rotativo removível pela unidade de processamento de tecido automatizada. O aparelho rotativo removível pode incluir materiais que podem ser submetidos à autoclave.

[00041] Este documento também apresenta uma unidade de processamento de tecido automatizada para isolar uma matriz celular enriquecida a partir de uma amostra de tecido, em que a unidade de processamento de tecido automatizada compreende um aparelho rotativo removível incluindo pelo menos duas cavidades, em que cada cavidade está configurada para inserção amovível de um recipiente de coleta de tecido no interior da cavidade. A unidade de processamento de tecido automatizada compreende um dispositivo de controle de temperatura.

[00042] O aparelho rotativo removível possui pelo menos uma especificação predeterminada que permite que a unidade de processamento de tecido automatizada identifique o aparelho rotativo removível.

[00043] Em outro aspecto, este documento apresenta um método para recuperar células a partir de tecido adiposo. O método inclui extrusar um lipoaspirado através de um óstio; centrifugar o lipoaspirado extrudado para produzir uma matriz celular enriquecida; e submeter a matriz celular enriquecida a uma pluralidade de etapas de aceleração e desaceleração usando força centrífuga para recuperar células regenerativas a partir da matriz celular enriquecida. O método pode incluir ainda manter uma temperatura de 26 °C a 42 °C no interior do recipiente enquanto a amostra de tecido é submetida à pluralidade de etapas de aceleração e desaceleração. A amostra de tecido pode ser submetida à pluralidade de etapas de aceleração e desaceleração na presença de uma ou mais enzimas (por exemplo, colagenase, outra protease, ou uma mistura destas).

[00044] Em outro aspecto, este documento apresenta um método para recuperar células a partir de tecido. O método inclui fornecer uma amostra de tecido armazenada em um recipiente adaptado para uma centrífuga, a amostra de tecido compreendendo uma suspensão de pedaços de tecido em líquido aquoso; submeter a amostra a pelo menos uma etapa de aceleração e desaceleração usando força centrífuga aplicada através de um elemento rotativo, em que o elemento rotativo compreende um eixo e um ou mais braços que se estendem a partir do eixo, em que (i) o um ou mais braços estão apoiados a partir do eixo em tal maneira que, quando o eixo gira, o um ou mais braços se movem para cima e para fora em relação ao eixo ou (ii) o um ou mais braços estão apoiados a um ângulo fixo, em que os recipientes presos aos referidos braços são mantidos em uma posição tal que a força gravitacional sobre o material é oposta à força centrífuga aplicada, em que a referida força centrífuga aplicada varia de cerca de 50 g a cerca de 4000 g. A temperatura da amostra pode ser mantida entre 32° e 42 °C. A amostra de tecido pode incluir ainda uma ou mais proteases.

[00045] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos neste relatório descritivo possuem o mesmo significado conforme comumente entendido pelo técnico no assunto ao qual esta invenção pertence. Embora métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos neste documento possam ser utilizados na prática ou para testar a presente invenção, métodos e materiais exemplares estão descritos abaixo. Todas as publicações, pedidos de patente, patentes, Nos de acesso do Genbank® e outras referências citados no presente são aqui incorporados, em sua totalidade, por referência neste pedido de patente. Em caso de conflito, o presente pedido de patente, incluindo as definições, prevalecerá. Os materiais, métodos e exemplos são somente ilustrativos e não destinados a servir como limitação.

[00046] Outras características e vantagens da invenção serão evidentes a partir da descrição detalhada a seguir e a partir das reivindicações.

Breve Descrição dos Desenhos

[00047] A Figura 1 é uma visão em perspectiva de um aparelho para a dissociação, a separação e a recuperação de células a partir de uma amostra de tecido de acordo com uma concretização descrita neste documento.

[00048] A Figura 2 é um gráfico de diferentes ciclos de tempo e energia durante a fase de dissociação e de suas combinações.

[00049] As Figuras 3A-3E são visões em perspectiva de diferentes recipientes adaptados para uma centrífuga.

[00050] A Figura 4 é uma visão em perspectiva de um conjunto de recipientes de acordo com uma concretização descrita neste documento.

[00051] A Figura 5 é uma visão lateral em corte transversal de uma concretização do aparelho da Figura 1.

[00052] A Figura 6 é um gráfico em barras do número de células aderentes obtidas depois do processamento utilizando uma concretização do aparelho da Figura 1 ou depois do processamento em uma incubadora com agitação.

[00053] A Figura 7 é um gráfico em barras do número de células aderentes obtidas depois do processamento utilizando uma concretização do aparelho da Figura 1 e dos recipientes da Figura 3 A, 3D ou 3E, ou depois do processamento utilizando uma incubadora com agitação.

[00054] A Figura 8 é uma visão de cima de um aparelho rotativo removível que pode ser inserido em uma unidade de processamento de tecido automatizada.

[00055] A Figura 9 é uma visão lateral de um aparelho rotativo removível que pode ser inserido em uma unidade de processamento de tecido automatizada.

[00056] A Figura 10 é um gráfico do número de células aderentes/g de tecido obtidas a partir de tecido adiposo que foi tratado como segue: não centrifugado, centrifugado ou extrudado e depois centrifugado.

[00057] A Figura 11 é um gráfico do número de células aderentes/g de tecido obtidas a partir de tecido adiposo que não foi extrudado, foi extrudado através de agulha em emulsão (extrudado SS) ou extrudado através de Luer e depois não centrifugado ou centrifugado a 1200 x g. Para a extrusão, o tecido foi passado 5 x através do dispositivo de extrusão usando seringas.

[00058] A Figura 12 é um gráfico do número de células aderentes/g de tecido obtidas a partir de tecido adiposo depois de 5, 10 ou 20 minutos de centrifugação.

[00059] A Figura 13 é um gráfico do número de células aderentes/g de tecido obtidas a partir de tecido adiposo depois de nenhuma centrifugação, centrifugação a 400 x g por 30 minutos ou a 1200 x g por 30 minutos.

[00060] A Figura 14 é uma apresentação esquemática de um método para aumentar a concentração de células regenerativas derivadas de tecido adiposo (ADRC) em um preparado de tecido para implante de enxerto. O tecido é primeiramente processado para concentrar as ADRC na matriz enriquecida por células (CEM). A metade da CEM é processada para produzir ADRC isoladas, as quais são depois combinadas com a restante CEM para aumentar mais ainda a concentração de ADRC no enxerto.

[00061] A Figura 15 é uma apresentação esquemática de um método para aumentar a eficiência de enzimas e utilização descartável no processamento de tecido adiposo ou lipoaspirado para obter ADRC. O tecido é primeiramente processado para concentrar ADRC em CEM, que é depois combinada e processada para produzir ADRC.

[00062] Símbolos iguais de referência nos vários desenhos indicam elementos semelhantes.

Descrição Detalhada da Invenção

[00063] Em geral, este documento tem como base métodos e um aparelho para recuperação de células a partir de tecidos, incluindo tecidos humanos e de animais, tais como tecidos caninos, felinos, equinos, bovinos, ovinos ou suínos. Os métodos e o aparelho aqui descritos são especialmente úteis para a recuperação de células de tecido adiposo obtido a partir de, por exemplo, lipoaspiração (ou seja, lipoaspirado), incluindo aspiração assistida, lipoaspiração assistida por vapor ou assistira por ultrassom, e suas combinações. Por exemplo, os métodos e o aparelho aqui descritos podem ser utilizados para isolar células-tronco, células progenitoras, células hematopoiéticas ou células totalmente diferenciadas de tecido adiposo.

[00064] Os métodos e o aparelho aqui descritos podem ser utilizados no local para preparar composições celulares para a administração a um paciente (por exemplo, administração autóloga). Por exemplo, os métodos e o aparelho aqui descritos podem ser utilizados para recuperar células regenerativas de um paciente, designadas neste documento uma plataforma regenerativa, que podem ser preparadas para a administração e depois administradas (por exemplo, injetadas ou implantadas cirurgicamente) de volta ao paciente a partir de quem as células foram recuperadas. Em algumas concretizações, as células podem ser carregadas em um dispositivo de liberação, tal como uma seringa, para injeção no receptor, por exemplo, por técnicas subcutâneas, intravenosas, intramusculares ou intraperitoneais. Por exemplo, as células regenerativas podem ser injetadas em vasos sanguíneos para liberação sistêmica ou local, em tecido (por exemplo, muscular cardíaco ou de músculo esquelético), na derme (subcutânea), em espaço tecidual (por exemplo, pericárdio ou peritônio), ou em outro local. A injeção da plataforma regenerativa pode ter como resultado uma área próxima ao local da injeção ter seu volume aumentado, ser reparada, ter a inflamação reduzida, a dor reduzida, e suas combinações. Em algumas concretizações, um ou mais aditivos são acrescentados às células antes da administração. Por exemplo, as células podem ser misturadas com outras células, com compostos biologicamente ativos, compostos biologicamente inertes, osso desmineralizado, uma matriz ou outro arcabouço reabsorvível, um ou mais fatores de crescimento ou com outro ativo que possa reforçar a liberação, a eficácia, a tolerabilidade ou a função da população de células.

[00065] Os métodos e o aparelho também podem ser utilizados para preparar composições celulares para estudos de crescimento, estudos da expressão de genes, estudos de diferenciação ou para outras finalidades de pesquisa. Adicionalmente, os métodos e o aparelho aqui descritos podem ser utilizados para recuperar populações de células regenerativas (por exemplo, células-tronco) de tal modo que as células possam ser incluídas em bancos, por exemplo, por criopreservação das células com um meio apropriado. Para referência adicional, ver a Publicação do Pedido de Patente U.S. N220100285588-A1.

[00066] Em uma concretização, os métodos aqui descritos fazem uso de uma pluralidade, ou seja, de duas ou mais etapas de aceleração e desaceleração sob uma força centrífuga para intensificar a dissociação das células (por exemplo, células regenerativas tais como células-tronco ou progenitoras) da matriz extracelular do tecido. Uma etapa de aceleração e desaceleração sob a ação de força centrífuga pode ser designada um ciclo de centrifugação. Em algumas concretizações, um ou mais dos seguintes também podem ser empregados para intensificar a recuperação das células: ruptura mecânica, agitação mecânica, manutenção da temperatura acima da temperatura ambiente (>26 °C) e a ou abaixo de 42 °C (por exemplo, de aproximadamente 37 °C a 40 °C), uso de enzimas para degradar o tecido e separação dos diferentes componentes do tecido com base em características físicas, tais como densidade, peso específico e solubilidade. Em algumas concretizações, o tecido é rompido mecanicamente (por exemplo, por extrusão) antes de submeter um tecido a duas etapas de aceleração e desaceleração sob a ação de força centrífuga. Em algumas concretizações, depois da ruptura mecânica do tecido, uma primeira etapa de aceleração e desaceleração é realizada sob a ação de força centrífuga para separar o tecido em três camadas gerais (ou seja, camada aquosa, matriz enriquecida por células contendo a plataforma regenerativa e camada lipídica). A matriz enriquecida por células pode ser removida e submetida a uma segunda etapa de aceleração e desaceleração sob a ação de força centrífuga. Em algumas concretizações, uma ou mais enzimas (por exemplo, proteases) são adicionadas à matriz enriquecida por células antes que a matriz enriquecida por células seja submetida à segunda etapa de aceleração e desaceleração. Tal processo reduz o volume da amostra de tal modo que uma quantidade menor de enzimas é necessária para processar o tecido. Em algumas concretizações, uma parte da matriz enriquecida por células é submetida a uma segunda etapa de aceleração e desaceleração sob a ação de força centrífuga, e as células regenerativas são isoladas do granulado celular. A célula isolada da parte da matriz enriquecida por células pode depois ser combinada com a matriz enriquecida por células que não foi submetida à centrifugação adicional.

[00067] O uso de um rotor reconfigurável de centrífuga, que possa ser configurado em posição invertida ou em uma configuração de cesto giratório, conforme descrito abaixo, é especialmente útil nos métodos descritos neste documento. Quando na configuração invertida, as forças centrífugas direcionam o conteúdo para a parte mais externa, mais alta de um recipiente de amostras, e em repouso este conteúdo retorna para a parte mais interna, mais baixa do recipiente de amostras. Desse modo, por ciclos repetidos de aceleração e desaceleração, um rotor invertido proporciona um meio para agitação de uma amostra em uma maneira que, em repouso com a gravidade e sem as forças de aceleração, o conteúdo de um recipiente ocupa e se move em direção ao centro e o eixo de uma centrífuga, enquanto com a aceleração, o conteúdo segue as forças centrífugas e se dirigem para fora. Quando o tecido é combinado com uma solução contendo enzimas proteolíticas, conforme aqui descrito, e colocado em um recipiente no rotor reconfigurável em posição invertida, ciclos repetidos de aceleração e desaceleração facilitam a dissociação enzimática do tecido. Quando o rotor reconfigurável está configurado em uma configuração típica de rotor de cesto giratório, contudo, o conteúdo do recipiente de amostras concentra-se no fundo e a agitação, por conseguinte, é reduzida.

[00068] Com a finalidade de melhorar significativamente a recuperação de células regenerativas e encurtar a aplicação local dos métodos aqui descritos na projeção operacional, elevar a temperatura ambiente no interior da câmara de centrifugação durante ciclos repetidos de aceleração e desaceleração para 35 a 42 °C (por exemplo, 40 °C) aumenta a velocidade da dissociação enzimática em várias vezes, em comparação à temperatura ambiente.

[00069] Os métodos e o aparelho aqui descritos aumentam o rendimento de células recuperadas a partir da amostra de tecido em relação a outros métodos nos quais uma pluralidade de etapas de aceleração e desaceleração sob a ação de força centrífuga não é utilizada. O rendimento aumentado de células recuperadas utilizando os métodos e o aparelho aqui descritos é surpreendente em vista dos achados por Kurita et al, Plast. Reconst. Surg., 121:1033-1041 (2008), nos quais a centrifugação apenas à velocidade constante não é suficiente para liberar números aumentados de células-tronco viáveis a partir da matriz extracelular.

[00070] A Figura 1 é uma visão em perspectiva de uma concretização de centrífuga 1 com câmara interna separada por uma parede 2 (por exemplo, parede metálica) assim criando um recipiente interno 4. Tipicamente, o diâmetro do recipiente interno 4 é de 20-40 cm, dependendo do tamanho dos recipientes utilizados para o preparado celular. Dentro do recipiente interno 4 há um eixo 6 impulsionado por um motor 8 para girar o eixo 6. O motor 8 está tipicamente situado abaixo do recipiente interno 4. Um controlador 10 pode ligar e desligar o motor 8, e pode servir também para regular a temperatura dentro do recipiente interno 4 conforme descrito abaixo. O motor 8 através do eixo 6 gira o rotor 12, o qual possui dois (como retratado) ou mais braços, cada um destes capaz de receber e segurar o recipiente 16 criando um elo estável com o braço do rotor 14. Em uma concretização, o braço do rotor 14 pode mover-se para cima e para baixo de acordo com as forças centrífugas exercidas através do motor 8 via o eixo 6 e, dependendo de sua velocidade, mudam sua posição de vertical para outra totalmente de 90 graus quando certa força g (por exemplo, 20-30 g) é exercida por rotações por minuto do eixo 6. Em outra concretização, como a retratada na Figura 5, o braço do rotor 14 está definido em um ângulo fixo 9 (por exemplo, um ângulo variando de 1 grau a menos de 90 graus). Por exemplo, o ângulo 9 pode ser fixado em 12 graus. Em tal concretização, o recipiente 16 pode estar preso ao braço do rotor 14 em orientação invertida na qual o topo do recipiente 16, contendo uma cobertura removível, é orientado para próximo do centro pelo eixo 6.

[00071] Em algumas concretizações, a temperatura do recipiente interno 4 pode ser regulada de tal modo que a temperatura do recipiente interno varie, por exemplo, de 26 a 42 °C, 30 a 42 °C, 35 a 42 °C, 35 a 40 °C, 37 a 40 °C ou aproximadamente 37 °C. A temperatura pode ser regulada por qualquer método conhecido, por exemplo, regulação por sistema fechado de retroalimentação térmica. Em uma concretização, fios de resistência elétrica (não mostrados na Figura 1) podem envolver ou estar incorporados em torno do recipiente interno 4 para aquecer o recipiente interno 4 através de conexão para o sistema de eletricidade, por exemplo, através de um cabo. Tais fios podem ser parte de uma placa de aquecimento ou estarem incorporados em um polímero flexível. Para manter a temperatura constante, uma sonda de temperatura 18, que está operacionalmente ligada ao controlador 10, pode ser utilizada para detectar a temperatura no recipiente interno 4 e, através do controlador 10, regular a temperatura no interior do recipiente interno 4. Manter a temperatura de 35 a 42 °C é especialmente útil quando uma ou mais enzimas são utilizadas, pois temperaturas abaixo dessa faixa podem tornar o processo de dissociação mais lento e temperaturas acima de 42 °C podem danificar as células.

[00072] O controlador 10 pode ser programado para, por exemplo, controlar as etapas de aceleração e desaceleração, iniciar e parar o motor 8 e regular a temperatura. O controlador 10 conecta-se a uma fonte de energia (por exemplo, através de uma tomada ou cabo).

[00073] O controlador 10 pode ser programado para acelerar o recipiente 16 e ser atingida uma força g entre 50 x g e 4.000 x g inclusive, para manter esta força g por um período curto de tempo e para desacelerar o recipiente 16 para 1 x g dentro de um período curto de tempo. Ciclos repetitivos das etapas de aceleração / desaceleração podem ser aplicados durante um período de tempo de 5 a 180 minutos (por exemplo, 5 a 120 minutos, 10 a 100 minutos, 20 a 60 minutos, 25 a 50 minutos, 30 a 45 minutos, aproximadamente 30 minutos ou aproximadamente 45 minutos). Por exemplo, cada etapa de aceleração pode ser realizada por 5 a 20 segundos e cada etapa de desaceleração pode ser realizada por 3 a 20 segundos. Em uma concretização, pelo menos três ciclos de aceleração para 200 x g e desaceleração para 1 x g por minuto podem ser realizados durante 30 minutos.

[00074] A Figura 2 retrata exemplos de vários ciclos de tempo que podem ser usados para intensificar a dissociação de células da matriz extracelular na amostra de tecido contida no recipiente 8 mostrado na Figura 1. Diferentes padrões conforme retratados na Figura 2 podem ser combinados tais como de liga e desliga intermitente e de certas acelerações nas quais uma determinada força g é mantida sobre um período mais longo de tempo.

[00075] As Figuras 3A-3E retratam recipientes, cada um destes uma concretização exemplar do recipiente 16 mostrado nas Figuras 1 e 6. Os recipientes nas Figuras 3A-3E estão adaptados para uso em uma centrífuga (por exemplo, uma centrífuga retratada na Figura 1 ou Figura 6). Os recipientes possuem uma inserção que pode auxiliar a dissociação das células da matriz extracelular do tecido quando os recipientes são submetidos a uma pluralidade de etapas de aceleração e desaceleração sob a ação de força centrífuga, tais como as forças centrífugas transmitidas pela centrífuga 1 da Figura 1. Em cada uma das Figuras 3A-3E, o recipiente 300 inclui uma parte central cilíndrica alongada 302, uma parte de extremidade fechada 304 integralmente formada com a parte central e uma parte de extremidade aberta 306 integralmente formada com a parte central definindo um lúmen interior 308. A parte de extremidade fechada 304 pode ser substancialmente plana, arredondada, hemisférica, cônica ou com qualquer outra forma apropriada. Em algumas concretizações, o recipiente 300 pode ter um comprimento de aproximadamente 10-12 cm. Em algumas concretizações, o recipiente 300 pode ter um volume de aproximadamente 50-60 ml.

[00076] A parte de extremidade aberta 306 inclui uma parte de engate 310 (por exemplo, uma parte rosqueada) que é formada para aceitar uma tampa removível 312. A tampa removível 312, quando presa sobre a parte de engate 310, substancialmente circunda e fecha o lúmen interior 308 do recipiente 300. Em algumas implementações, a tampa 312 pode ser presa à extremidade aberta por roscas, fricção (por exemplo, uma tampa de encaixe), por travamento, por atração magnética, por selo para fechamento a vácuo ou por qualquer outro mecanismo apropriado pelo qual um vaso pode ser reversivelmente fechado.

[00077] Na Figura 3A, o recipiente 300 inclui uma inserção invertida substancialmente cônica 320. A inserção cônica 320 é formada como um cone oco invertido dentro do lúmen interior 308. A inserção invertida substancialmente cônica 320 está em orientação substancialmente coaxial com a parte central cilíndrica alongada 302, com uma parede lateral cônica 322 que se estende a partir de um vértice 324 proximal até a porção de extremidade anexa 304 a uma base 326 proximal da porção de extremidade aberta 308.

[00078] A inserção invertida substancialmente cônica 320 é composta por um material biocompatível e é porosa. Exemplos não limitantes de materiais biocompatíveis incluem polialimidas (por exemplo, Nylon); poliésteres tais como policaprolactona; poliestireno; polipropileno; poliacrilatos; compostos de polivinila; policarbonato; policetonas tais como poliéter-éter cetona (PEEK); politetrafluoroetileno (PTFE, Teflon); termanox; nitrocelulose; poli(orto ésteres); poliuretano; aço inoxidável; titânio; ou titânia (dióxido de titânio). O tamanho dos poros da inserção pode variar de 0,5 mm a 5 mm (por exemplo, 0,7 a 1,5 mm, 0,7 a 1,2 mm, 0,9 a 1,1 mm, 0,9 a 1,5 mm, 0,9 mm a 2,0 mm, 1 a 3 mm, 2 a 4 mm, 3 a 5 mm). Em algumas concretizações, a parede lateral invertida substancialmente crônica 322 pode ser uma tela, grade, malha, rede, folha perfurada ou outro substrato poroso biocompatível adequado. Em algumas concretizações, a inserção invertida substancialmente cônica pode ser uma malha com poros de 1 mm.

[00079] A base 322 da inserção cônica 230 possui um diâmetro substancialmente igual ao diâmetro da parte cilíndrica alongada 302 na extremidade aberta 308. Sendo assim, a inserção cônica 320 é inserida no volume interior 302 através da extremidade aberta 308 até que a base entre em contato com a borda da extremidade aberta 306. A tampa 312 está afixada de modo removível sobre a extremidade aberta 306, pelo qual substancialmente centrando e afixando a inserção cônica 320 dentro do lúmen interior 308. Em algumas concretizações, a base 326 contém um flange que pode ser utilizado para prender-se à extremidade aberta 308. A base 326 pode também estar presa diretamente à superfície inferior da tampa 312. A base 326 pode também estar presa diretamente à extremidade 304.

[00080] Em uso, a inserção invertida substancialmente cônica 320 pode ser inserida no recipiente 300. A inserção invertida substancialmente cônica 320 pode ser preenchida com uma amostra de tecido que inclui uma suspensão de pedaços de tecido em líquido aquoso, de tal modo que líquidos e componentes do tecido menores do que os poros possam passar através da inserção cônica 320 e serem capturados pela parede lateral cilíndrica 304 e a extremidade fechada 306.

[00081] Em algumas concretizações, uma ou mais proteases (por exemplo, uma ou mais colagenases tais como colagenases tipo I e/ou tipo II, uma protease neutra tal como termolisina, tripsina, ou suas misturas) podem ser adicionadas a um recipiente 300 para intensificar a dissociação das células da matriz extracelular da amostra de tecido. Por exemplo, uma colagenase tipo I, uma colagenase tipo II e uma dispase podem ser utilizadas para intensificar a dissociação das células da matriz extracelular.

[00082] A tampa 312, uma vez aplicada, fecha o lúmen interior 308 e substancialmente afixa a inserção cônica 320 em posição. Os líquidos e os tecidos são impelidos através dos poros da inserção substancialmente cônica 320 pela pluralidade de etapas de aceleração e desaceleração. Por exemplo, o recipiente 300, com uma amostra de tecido carregada dentro da inserção substancialmente cônica 320, pode estar preso sobre o braço do rotor 14 da centrífuga 1 da Figura 1. O recipiente 300 pode ser então acelerado e desacelerado conforme discutido na descrição das Figuras 1 e 2. Sob os ciclos repetidos de aceleração e desaceleração, a amostra de tecido é impelida em várias direções através dos poros da inserção. Esse processo rompe mecanicamente o tecido para intensificar a liberação das células da matriz extracelular.

[00083] Na Figura 3B, o recipiente 300 inclui uma inserção substancialmente cilíndrica 340. A inserção substancialmente cilíndrica 340 é formada como um cilindro dentro do lúmen interior 308. A inserção cilíndrica 340 está substancialmente em orientação coaxial com a parte central cilíndrica alongada 302, com uma parede lateral 344 que se estende da parte de extremidade fechada 304 à parte de extremidade aberta 306. A inserção substancialmente cilíndrica 340 é composta por um material biocompatível e é porosa. Exemplos de materiais biocompatíveis e tamanhos de poros adequados são discutidos acima.

[00084] Em uso, a inserção substancialmente cilíndrica 340 pode ser inserida no recipiente 300. A inserção substancialmente cilíndrica 340 pode ser preenchida com uma amostra de tecido contendo uma suspensão de pedaços de tecido em líquido aquoso de tal modo que os líquidos e componentes do tecido menores do que os poros sejam capazes de passar através da inserção cilíndrica 340 para serem capturados pela parte central cilíndrica alongada 302 e a extremidade fechada 304. Uma ou mais enzimas podem também ser adicionadas ao recipiente como discutido acima. A tampa 312, uma vez aplicada, fecha o volume interior 308 e substancialmente afixa a inserção cilíndrica 340 em posição. O recipiente 300 pode ser então acelerado e desacelerado como discutido na descrição das Figuras 1 e 2. Sob os ciclos repetidos de aceleração e desaceleração, a amostra de tecido é pressionada em várias direções através dos poros da inserção. Esse processo rompe mecanicamente o tecido para intensificar a liberação das células da matriz extracelular.

[00085] Na Figura 3E, o recipiente 300 contém uma inserção 345 que divide o recipiente em parte superior e inferior. A inserção é composta por um material biocompatível e é porosa. Exemplos de materiais biocompatíveis e de tamanhos de poros adequados são discutidos acima. A inserção pode ser mantida em posição usando, por exemplo, um anel feito de borracha. Em uso, a amostra de tecido contendo a suspensão de pedaços de tecido em líquido aquoso é carregada na parte superior ou na inferior do recipiente e submetida à pluralidade de etapas de aceleração e desaceleração para intensificar a dissociação das células da matriz extracelular. Uma ou mais enzimas também podem ser adicionadas com a amostra de tecido.

[00086] Em referência agora à Figura 3C, um recipiente 300 inclui uma pluralidade de partículas 350 dentro do lúmen interior 308. Os grânulos possuem diâmetro de pelo menos 100 micrômetros e são compostos por um ou mais materiais biocompatíveis ou são revestidos com um ou mais materiais biocompatíveis. Exemplos não limitantes de materiais biocompatíveis incluem poliamidas (por exemplo, Nylon); poliésteres tais como policaprolactona; poliestireno; polipropileno; poliacrilatos; compostos de polivinila; policarbonato; policetonas tais como PEEK; PTFE; termanox; nitrocelulose; poli(orto ésteres); poliuretano; aço inoxidável; titânio; titânia (dióxido de titânio); e vidro. Em algumas concretizações, a pluralidade de partículas 350 pode incluir partículas de diferentes gravidades específicas, formas ou características de superfície. Em uma concretização, a pluralidade de partículas 350 pode incluir esferas lisas de poliestireno e partículas com revestimento de ferro.

[00087] Em uso, uma amostra de tecido contendo uma suspensão de pedaços de tecido em líquido aquoso e as partículas 350 são carregadas no recipiente 300 e fechadas com a tampa 312. Em algumas concretizações, uma ou mais enzimas também são adicionadas ao recipiente antes de fechar com a tampa. O recipiente é então carregado na centrífuga 1 da Figura 1 e submetido à pluralidade de etapas de aceleração e desaceleração, as quais provocam a agitação das partículas 350 e intensificam a liberação das células da matriz extracelular.

[00088] A Figura 3D mostra outro exemplo de um recipiente 300 contendo uma inserção na qual um eixo 370 está disposto verticalmente no lúmen interno 308 do recipiente. O eixo 370 inclui uma pluralidade de braços 372 dispostos ao longo de um comprimento do eixo 370 e que se estendem substancialmente em orientação radial a partir do eixo 370 para o lúmen 308. Os braços 372 podem ser de diferentes formas e/ou tamanhos conforme retratado na Figura 3D.

[00089] Em algumas concretizações, o eixo 370 pode ser afixado à cobertura removível 312. O eixo 370 pode ser afixado de modo girável ao recipiente ou à cobertura removível 312. Por exemplo, o eixo 370 pode estar afixado de modo girável e se estender até a tampa 312, de tal modo que o eixo 370 possa ser encaixado e girado a partir de fora do recipiente para agitar a amostra de tecido. Em algumas concretizações, o eixo 370 pode estar afixado à tampa 312 de modo girável, e pode ser excentricamente pesado de modo tal que o eixo 370 possa girar sob a força da gravidade ou de centrifugação. Em algumas concretizações, o eixo 370 pode estar afixado à tampa 312 de modo girável, e um ou mais dos braços 372 podem incluir um imã de modo tal que o eixo 370 possa ser magneticamente acoplado a um campo magnético externo ao recipiente. Girando o campo magnético em relação ao recipiente, o eixo 370 pode ser impelido a girar dentro do lúmen interior 308 para agitar a amostra de tecido. Em algumas concretizações, o eixo 370 pode se mover verticalmente dentro do lúmen 308 de modo que os braços 372 possam passar para cima e para baixo através da amostra de tecido. Em algumas concretizações, os braços são lâminas afiadas.

[00090] Em uma concretização, uma amostra de tecido contendo uma suspensão de pedaços de tecido em líquido aquoso pode ser carregada no recipiente 300 e a tampa 312 com o eixo 370 anexado é afixada para fechar a extremidade aberta de modo que os braços 372 dispostos ao longo de um comprimento do eixo 370 sejam inseridos para o lúmen interior 308 e a amostra de tecido. Uma ou mais enzimas também podem ser adicionadas com a amostra de tecido. O recipiente 300 pode então ser submetido a uma pluralidade de etapas de aceleração e desaceleração conforme discutido neste documento. O eixo 370 e os braços associados 372 podem intensificar a dissociação de células da matriz extracelular da amostra de tecido quando submetida à pluralidade de etapas de aceleração e desaceleração.

[00091] A Figura 4 mostra um exemplo de um conjunto de recipientes 400, formado por um primeiro recipiente 300, um segundo recipiente 404 e um dispositivo de acoplamento 406. Na concretização retratada na Figura 4, o conjunto 400 inclui o recipiente 300 da Figura 3 A e um recipiente 404. Em algumas concretizações, o recipiente 300 pode ser qualquer um dos recipientes retratados nas Figuras 3B-3E. O recipiente 404 inclui uma parte central cilíndrica alongada 408; uma primeira parte de extremidade 410 integralmente formada com a parte central 408; e uma segunda parte de extremidade aberta 412 integralmente formada com a parte central 408, definindo um lúmen interno 414.

[00092] Em algumas concretizações, uma porta 432 pode estender- se radialmente para fora a partir da parte cilíndrica alongada 408 e fornecer uma passagem fluida que se estende a partir do lúmen interior 414 para o lado de fora. Tal porta pode incluir também uma inserção porosa 434. Em algumas concretizações, a inserção porosa pode ter poros de aproximadamente 0,2 micra, os quais permitem a passagem de ar, mas impedem a entrada de contaminantes para o lúmen interior 414.

[00093] A primeira parte de extremidade 410 afunila-se para uma abertura estreita 416 e contém uma parte de coleta 418 que se projeta a partir da porção de extremidade 410 na abertura estreita 416. A parte de coleta 418 é capaz de receber e armazenar um líquido e inclui um tampão removível 420 para fechar a passagem da primeira parte de extremidade 410 a partir da parte de coleta 418. O tampão removível 420 permite o fluxo de líquido da parte de extremidade 410 para a parte de coleta 418 mediante força centrífuga, pressão, dissociação com enzima ou remoção física. Em algumas concretizações, o tampão removível é uma válvula que pode ser ativada para permitir o acesso à parte de coleta. Em algumas concretizações, a parte de coleta é destacável da primeira parte de extremidade.

[00094] Em algumas concretizações, a parte de coleta 418 compreende um líquido aquoso que é separado do lúmen interior 414 através do tampão removível 420. Por exemplo, a parte de coleta 418 pode incluir solução salina estéril, tampão, meio de cultura celular, um ou mais compostos biologicamente ativos, um ou mais compostos biologicamente inertes, osso desmineralizado, uma matriz ou outro arcabouço reabsorvível, um ou mais fatores de crescimento ou outro aditivo que possa intensificar a liberação, a eficácia, a tolerabilidade ou a função da população de células.

[00095] A segunda parte de extremidade pode conter uma parte de engate (por exemplo, uma parte rosqueada) de modo tal que uma tampa possa ser presa para substancialmente fechar o recipiente.

[00096] O recipiente 404 pode ser conectado ao recipiente 300 de modo removível, usando o dispositivo de acoplamento 406, o qual inclui uma parte central tubular 422 com uma primeira e uma segunda extremidade aberta 424 e uma inserção porosa 426 que se estende horizontalmente através do dispositivo de acoplamento 406. Cada extremidade aberta 424 inclui uma parte de engate (por exemplo, uma parte rosqueada). A inserção porosa possui um tamanho de poros de 40 a 500 micrômetros e se estende horizontalmente através do dispositivo de acoplamento 406 de modo que a inserção porosa 426 separe substancialmente o volume interior 308 do volume interior 414. Em algumas concretizações, duas ou mais inserções porosas podem ser dispostas em cima uma da outra. Por exemplo, uma inserção porosa com tamanhos de poros relativamente maiores pode ser disposta mais proximamente ao recipiente 300, enquanto as inserções porosas com tamanhos de poros relativamente menores podem ser dispostas mais proximamente ao recipiente 404. Sendo assim, o fluxo de líquidos e partículas do recipiente 300 para o recipiente 404 pode atravessar poros progressivamente menores à medida que passa através da inserção porosa 426.

[00097] O dispositivo de acoplamento 406 pode incluir ainda uma porta 428 que se estende radialmente para fora a partir da parte central tubular 422 para fornecer uma passagem fluida a partir do interior do dispositivo de acoplamento. A porta pode incluir uma inserção porosa 430 com tamanho de poros de 0,2 a 500 micrômetros. Em algumas concretizações, a inserção porosa 430 pode ter poros de aproximadamente 0,2 micra, os quais permitem a entrada de ar para o interior do dispositivo de acoplamento 406, mas filtram e deixam de fora bactérias e matéria particulada que poderiam contaminar os recipientes 300, 404 ou a amostra de tecido.

[00098] Uma parte de engate do dispositivo de acoplamento pode estar presa à parte de engate do recipiente 300 e a outra parte de engate do dispositivo de acoplamento pode estar presa à parte de engate do recipiente 404. Em concretizações nas quais as partes de extremidade aberta dos recipientes 300 e 404 são rosqueadas, o dispositivo de acoplamento 406 é rosqueado em cada extremidade para permitir que os recipientes 300 e 404 sejam rosqueados no dispositivo de acoplamento 406 por suas partes rosqueadas. Em algumas concretizações, os recipientes 300 e 404 são previamente montados de modo que um espaço interior definido pelo primeiro recipiente e o segundo recipiente esta pelo menos parcialmente sob a ação de vácuo.

[00099] Em uso, o recipiente 300 pode ser desacoplado do dispositivo de acoplamento 406 e carregado com uma amostra de tecido, tampão (por exemplo, solução de Ringer com lactato) e enzima opcional. Uma tampa (por exemplo, a tampa 312) é aplicada de modo removível para fechar o recipiente 300. O recipiente 300 e a amostra de tecido no interior podem ser processados na centrífuga 1 conforme discutido acima. Depois de submeter uma amostra contida dentro do recipiente 300 à pluralidade de etapas de aceleração e desaceleração conforme discutido acima, a tampa 312 pode ser removida e o dispositivo de acoplamento 406 pode ser preso ao recipiente 300 e ao recipiente 404. Os componentes líquidos dentro do recipiente 300 podem ser forçados para o recipiente 404 pela inversão do conjunto de recipientes e aplicando pressão negativa à porta 432. Por exemplo, um pequeno pedaço de tubo pode ser preso à porta 432 e ser aplicada sucção usando uma seringa (por exemplo, com conexão Luer) para criar uma pressão negativa no recipiente 404 de modo que líquido e células dentro do líquido no recipiente 300 sejam forçados através da inserção porosa 426 e para o lúmen interior 414 do recipiente 404.

[000100] Depois da transferência para o recipiente 404, o recipiente 300 pode ser destacado do dispositivo de acoplamento e o dispositivo de acoplamento pode ser destacado do recipiente 404. Uma tampa pode estar presa de modo removível à parte de engate 420 para substancialmente fechar o recipiente 404. Células dissociadas da matriz extracelular podem então ser recuperadas a partir de outros componentes celulares pela centrifugação do recipiente de 400 a 4000 x g. Em algumas concretizações, as células são coletadas na parte de coleta 418 do recipiente 404.

[000101] Em algumas concretizações, a centrifugação de 400 a 4.000 x g pode ser realizada como um segundo programa executado usando a centrífuga 1. Por exemplo, o segundo programa pode ser programado no controlador 10. O recipiente 404 pode ser inserido no braço do rotor 14 em uma concretização de ângulo fixo na qual a tampa está orientada em direção ao centro do rotor e a parte de coleta 418 está orientada para fora. O recipiente 404 pode ser centrifugado por aproximadamente 5 a 10 minutos com uma força g de cerca de 400 x g a 4.000 x g (por exemplo, 400 a 1.000 x g). A centrifugação em ais forças g permite a separação e a coleta de células na parte de coleta 418.

[000102] Em algumas concretizações, um ou mais reagentes de separação celular, incluindo esferas magnéticas ou anticorpos ou seus fragmentos de ligação a antígeno podem ser utilizados em conjunto com os métodos e o aparelho aqui descritos. Por exemplo, anticorpos com afinidade de ligação por um determinado tipo de células podem ser utilizados para recuperar células deste tipo a partir de células coletadas dentro da parte de coleta. Em algumas concretizações, tais reagentes de separação celular estão incluídos dentro do recipiente 300. Em algumas concretizações, ais reagentes de separação celular estão incluídos dentro do recipiente 404.

[000103] Em algumas concretizações, uma amostra de tecido é submetida a uma etapa de aceleração e desaceleração sob a ação de força centrífuga para preparar uma matriz enriquecida por células, a qual é então submetida a uma ou mais etapas de aceleração e desaceleração. Por exemplo, uma amostra de tecido armazenada em um recipiente de coleta de tecido pode ser centrifugada para produzir uma matriz enriquecida por células, na qual está incluída uma plataforma regenerativa. Plataforma regenerativa refere-se a células regenerativas tais como células-tronco, células progenitoras e/ou células hematopoiéticas dentro do concentrado. Um exemplo de tal preparado celular é fornecido em US 2010/0124563 A1. Uma amostra de tecido pode conter uma plataforma regenerativa por toda a amostra de tecido; contudo, a centrifugação faz com que a amostra de tecido forme uma matriz enriquecida por células na qual a plataforma regenerativa está em quantidade concentrada. Por exemplo, quando da centrifugação de uma amostra de tecido dentro de um recipiente de coleta de tecido, três camadas gerais se formam (por exemplo, camada aquosa, matriz enriquecida por células contendo a plataforma regenerativa e camada lipídica). A matriz enriquecida por células está em geral situada entre a camada lipídica e a camada aquosa. Depois da extração da camada aquosa, a matriz enriquecida por células pode ser facilmente extraída do recipiente de coleta de tecido (por exemplo, usando um sistema fechado) para uso futuro da matriz enriquecida por células.

[000104] Uma unidade de processamento de tecido automatizada pode ser usada para centrifugar a amostra de tecido. Por exemplo, uma unidade de processamento de tecido automatizada contendo um aparelho rotativo removível, em que o aparelho rotativo removível está configurado para girar dentro da unidade de processamento de tecido automatizada, pode ser utilizada para gerar a força centrífuga. A unidade de processamento de tecido automatizada pode incluir um dispositivo de controle de temperatura para controlar a temperatura dentro da unidade.

[000105] A Figura 8 é uma visão de cima de um aparelho rotativo removível 500 que pode ser inserido em uma unidade de processamento de tecido automatizada (não mostrada). Um recipiente de coleta de tecido 502 pode ser inserido de modo destacável no aparelho rotativo removível 500 e mantido no lugar por um mecanismo de travamento 504 (por exemplo, mecanismo encaixável de travamento). Nesse caso, o recipiente de coleta de tecido 502 encaixa- se na cavidade 506. Em uma concretização não limitante, o recipiente de coleta de tecido 502 pode ser definido de modo a se ajustar de modo encaixável dentro da cavidade 506 e mantido no lugar pelo mecanismo encaixável de travamento 504. O recipiente de coleta de tecido 502 está orientado de modo que a abertura 512 do recipiente de coleta de tecido 502 esteja à maior distância do centro. Uma matriz enriquecida por células pode formar-se próxima à abertura 512, e a matriz enriquecida por células pode ser facilmente extraída do recipiente de coleta de tecido 502 através da abertura sem contaminação adicional à matriz enriquecida por células.

[000106] O aparelho rotativo removível 500 pode dispor de pelo menos duas cavidades (mostradas nesse caso como 506, 508) ou pode dispor de até aproximadamente cavidades em outra concretização não limitante.

[000107] Cada cavidade 506, 508 pode estar em orientação horizontal e conter um mecanismo destacável para inserção de um recipiente de coleta de tecido 502 dentro da cavidade 506, 508. O mecanismo destacável pode ser, por exemplo, entre outros, mecanismo de encaixe, Velcro, e os semelhantes, e suas combinações. Em outra concretização não limitante, o aparelho rotativo removível 500 pode conter ou incluir materiais que possam ser submetidos à autoclave, de modo tal que o aparelho rotativo removível 500 está configurado para poder ser submetido à autoclave.

[000108] A Figura 9 é uma visão lateral de um aparelho rotativo removível 500 que pode ser inserido em uma unidade de processamento de tecido automatizada (não mostrada). O recipiente de coleta de tecido 502 é mostrado dentro da cavidade 506 e mantido no lugar pelo mecanismo de travamento 504. Será reconhecido que o aparelho rotativo removível ilustrado nas Figuras 8-9 não está em escala ou proporção e que certas de suas características podem estar exageradas ou distorcidas para fins ilustrativos.

[000109] A unidade de processamento de tecido automatizada pode conter também um mecanismo para identificar um específico aparelho rotativo removível por ao menos uma especificação predeterminada do aparelho rotativo removível. Em uma concretização, o aparelho rotativo removível pode incluir uma etiqueta RFID anexada. A etiqueta RFID pode ser verificada quando do posicionamento do aparelho rotativo removível na unidade de processamento de tecido automatizada para a identificação pela unidade de processamento de tecido automatizada. Em outra concretização, uma especificação do aparelho rotativo removível dentro da unidade de processamento de tecido automatizada pode ser medida e registrada, tal como, entre outros, a demanda de energia associada com aceleração, peso, resistência ao vento e suas combinações. A especificação medida pode ser armazenada como parte de um programa de software e/ou pacote de software da unidade de processamento de tecido automatizada que possibilita à unidade automatizada de processamento de tecido identificar o aparelho rotativo removível por tais dados de especificação.

[000110] A amostra de tecido pode estar armazenada em um primeiro recipiente de coleta de tecido adaptado para a unidade de processamento de tecido automatizada. A amostra de tecido pode conter ou incluir uma suspensão de pedaços de tecido em líquido aquoso. Em outra concretização não limitante, a amostra de tecido pode ser extrudada antes que a amostra de tecido seja colocada no primeiro recipiente de coleta de tecido. A amostra de tecido pode ser extrudada entre uma e vinte vezes ou, alternativamente, de aproximadamente duas a aproximadamente dez vezes através de um orifício cujo diâmetro varia em torno de 1 mm independentemente a em torno de 4 mm ou, alternativamente, em torno de 1,5 independentemente a em torno de 3 mm. Extrusar a amostra de tecido antes de submetê-la a um ciclo de aceleração produz uma matriz enriquecida por células com concentração mais alta da plataforma regenerativa, em comparação a um método de contrário idêntico sem a extrusão da amostra de tecido. Neste relatório descritivo com respeito a uma variação, "independentemente" significa que qualquer limiar mais baixo pode ser utilizado junto com qualquer limiar mais alto para fornecer uma variação alternativa adequada.

[000111] A amostra de tecido pode ser submetida à centrifugação que alcance uma força g variando de cerca de 200 x g independentemente a cerca de 2000 x g, ou alternativamente pelo menos 400 x g, usando a unidade de processamento de tecido automatizada. A centrifugação pode ocorrer por um período de tempo variando em torno de 3 minutos independentemente a em torno de 60 minutos, ou pelo menos em torno de 5 minutos. Depois da centrifugação, uma matriz enriquecida por células pode formar-se.

[000112] A matriz enriquecida por células pode ser transferida do primeiro recipiente de coleta de tecido para um segundo recipiente de coleta de tecido por um método de sistema fechado. Tal método de sistema fechado pode incluir, entre outros, um mecanismo como um conector Leur entre o primeiro recipiente de coleta de tecido e o segundo recipiente de coleta de tecido, uma porta em ponta, uma agulha, ou suas combinações. O método de sistema fechado de transferência previne a contaminação da matriz enriquecida por células, que inclui uma plataforma regenerativa, por quaisquer patógenos adicionais externos à amostra de tecido e/ou os recipientes de coleta de tecido, por exemplo, entre outros, a entrada de bactérias, vírus e os semelhantes nos recipientes de coleta de tecido ou na matriz enriquecida por células. O sistema fechado diminui a necessidade de realizar etapas adicionais na matriz enriquecida por células antes da administração da amostra de tecido de volta a um indivíduo conforme descrito acima. Neste relatório descritivo, a anotação numérica de "primeiro recipiente de amostra de tecido" e "segundo recipiente de amostra de tecido" indica a ordem de utilização dos recipientes. Os recipientes podem ser dos mesmos tipos de recipientes ou de diferentes tipos de recipientes, por exemplo, uma ampola ou tubo de centrífuga.

[000113] O segundo recipiente de coleta de tecido pode ser então submetido a pelo menos uma ou mais etapas de aceleração e desaceleração, conforme descrito acima. Cada ciclo de aceleração e desaceleração pode ocorrer até que uma taxa de pelo menos aproximadamente 10 x g seja obtida. Alternativamente, a taxa de aceleração e desaceleração pode ocorrer a uma taxa que varie de cerca de 10 x g a independentemente cerca de 400 x g, ou de cerca de 20 x g independentemente a cerca de 40 x g em outra concretização não limitante. Em uma concretização não limitante, o número de ciclos por minuto de aceleração e desaceleração pode variar de em torno de 1 ciclo por minuto a em torno de um ciclo por cinco minutos ou, alternativamente, pelo menos em torno de três ciclos por minuto. Em outra concretização não limitante, a matriz enriquecida por células pode ser desagregada depois de um número de ciclos de aceleração e desaceleração ou, alternativamente, pelo menos dois ciclos de aceleração e desaceleração.

[000114] Em algumas concretizações, uma ou mais proteases (por exemplo, uma ou mais colagenases como colagenases tipos I e/ou tipo II, uma protease neutra como termolisina, tripsina, ou suas misturas) podem ser adicionadas ao segundo recipiente de tecido. Uma ou mais das proteases podem ser produzidas por recombinação. Por exemplo, uma ou mais colagenases podem ser adicionadas ao segundo recipiente de coleta de tecido em uma quantidade que varie em torno de 0,5 unidades Wunsch de colagenase por ml independentemente a em torno de 4,0 unidades Wunsch de colagenase por ml ou, alternativamente, em torno de 1,0 unidades Wunsch de colagenase por independentemente a em torno de 3,0 unidades 3.0 Wunsch de colagenase por ml. Os ciclos intermitentes de aceleração seguida por desaceleração na presença de uma protease pode desagregar a plataforma regenerativa da matriz enriquecida por células.

[000115] Depois das etapas de aceleração e desaceleração, a matriz enriquecida por células pode ser filtrada e lavada para obter uma plataforma regenerativa que possa ser administrada de volta a um indivíduo por implante ou injeção conforme descrito acima. Por exemplo, a matriz enriquecida por células pode ser filtrada para obter uma plataforma regenerativa injetável, em que poucas etapas ou nenhuma adicional precisam ser realizadas para a plataforma regenerativa ser injetada em um indivíduo.

[000116] A invenção será descrita mais detalhadamente com respeito ao Exemplo seguinte, o qual não se destina a limitar a invenção, mas sim a ilustrar mais ainda as várias concretizações.

Exemplos Exemplo 1

[000117] Tecido adiposo omental canino fresco foi obtido a partir de tecido descartado depois de cirurgia Spay. O tecido foi picado com tesouras estéreis e depois igualmente dividido (aproximadamente 5 2 g/tubo) em tubos estéreis de centrífuga de 50 ml_. Solução estéril de Ringer com lactato, contendo uma mistura de colagenases I e II bacterianas juntamente com dispase, foi adicionada e os tubos foram então aleatoriamente designados para incubação em incubadora com agitação (60 rpm) ou aparelho de processamento de tecido com aquecimento em rotor fixo (TPA, 3 ciclos por minuto de 1 x g a 200 x g a 1 x g). A temperatura foi mantida entre 37-40 °C, e a incubação ou o processamento foram conduzidos por 30 minutos.

[000118] Depois do processamento, a pasta com tecido dissociado foi passada através de um filtro de 100 pm, e a fração celular foi recuperada do filtrado por centrifugação a 400 x g por 10 minutos no TPA. As frações celulares foram semeadas em frascos de cultura de tecido de 25 cm2 e cultivadas por dois dias a 37 °C em DMEMZ soro bovino fetal (FBS) 20% (v/v) (FBS) contendo antibiótico e antimicótico. Depois da cultura por dois dias, as células aderentes foram contadas usando um hemacitômetro. A Figura 6 é um gráfico em barras do número de células aderentes obtidas depois do processamento usando o TPA e usando a incubadora com agitação. O processamento do tecido com o TPA resultou em número 2,6 vezes mais alto do que quando a dissociação foi realizada em incubadora com agitação.

Exemplo 2

[000119] Lipoaspirado adiposo humano fresco foi obtido com consentimento livre e esclarecido do paciente que se submeteu à lipoplastia eletiva. O tecido foi drenado usando um coador estéril de aço inoxidável e depois igualmente dividido (aproximadamente 10 g/tubo) em tubos estéreis de centrífuga de 50 ml_ com (ver as Figuras 3A, 3D e 3E) ou sem inserções fabricadas a partir de malha de nylon com tamanho de poros de 1 mm. Solução estéril de Ringer com lactato, contendo uma mistura de colagenases I e II bacterianas juntamente com dispase, foi adicionada e os tubos foram então aleatoriamente designados para incubação em incubadora com agitação (60 rpm) ou aparelho de processamento de tecido com aquecimento em rotor fixo (TPA, 3 ciclos por minuto de 1 x g a 200 x g a 1 x g). A temperatura foi mantida entre 37-40 °C, e a incubação ou o processamento foram conduzidos por 30 minutos.

[000120] Depois do processamento, a pasta com tecido dissociado foi passada através de um filtro de 100 pm, e a fração celular foi recuperada do filtrado por centrifugação a 400 x g por 10 minutos no TPA. As frações celulares foram semeadas em frascos de cultura de tecido de 25 cm2 e cultivadas por dois dias a 37 °C em DMEMZ soro bovino fetal (FBS) 20% (v/v) (FBS) contendo antibiótico e antimicótico. Depois da cultura por dois dias, as células aderentes foram contadas usando um hemacitômetro. A Figura 7 é um gráfico em barras do número de células aderentes obtidas depois do processamento usando o TPA e três diferentes inserções, ou depois do processamento usando a incubadora com agitação. Os resultados indicam que o rendimento de células obtido pelo processamento no TPA e usando a inserção em cone (por exemplo, Figura 3A) é semelhante ao rendimento de células obtido pelo processamento na incubadora.

Exemplo 3

[000121] Uma amostra de lipoaspirado foi obtida de um paciente humano submetido à lipoplastia eletiva. O lipoaspirado foi transferido para uma pluralidade de recipientes de coleta de tecido com volume de 20 cc. O conteúdo de lipoaspirado de cada recipiente de coleta de tecido foi extrudado cinco vezes através de uma agulha de microemulsão. O lipoaspirado extrudado de cada um dos recipientes de coleta de tecido foi então transferido para um recipiente separado de coleta de tecido. Os recipientes de coleta de tecido foram depois colocados nas cavidades de um aparelho rotativo removível dentro de uma unidade de processamento de tecido automatizada. O aparelho rotativo removível permitia que os recipientes de coleta de tecido se mantivessem em posição horizontal, enquanto a unidade de processamento de tecido automatizada aplicava aceleração e força centrífuga aos conteúdos dos recipientes de coleta de tecido. A força centrífuga foi aplicada por 30 minutos a uma taxa de cerca de 400 x g, cerca de 700 x g, cerca de 1200 x g ou cerca de 2000 x g por 30 minutos. Os conteúdos de dois recipientes de coleta de tecido foram usados para cada taxa de força centrífuga.

[000122] Depois da centrifugação, uma matriz enriquecida por células contendo uma plataforma regenerativa foi separada do restante da amostra de tecido dentro de cada recipiente de coleta de amostra de tecido. O volume da camada de óleo, de uma fração de lipoaspirado e de uma fração aquosa foi removido e medido para cada amostra. A camada do lipoaspirado foi colocada em um tubo separado cônico de centrífuga de 50 cc.

[000123] Como amostra de controle, aproximadamente 5 g de lipoaspirado não processado, ou seja, nem extrudado nem centrifugado, foi transferido para cada um de 2 recipientes de coleta de tecido. Os recipientes foram pesados e o peso do lipoaspirado transferido foi registrado.

[000124] Solução de Ringer com lactato, que inclui uma enzima colagenase e uma enzima dispase, foi adicionada ao lipoaspirado não processado em uma quantidade de 5 ml_ para cada recipiente de coleta de tecido. Os recipientes de coleta de tecido foram depois colocados em uma incubadora com agitação a aproximadamente 37 °C e cerca de 60 rpm por cerca de 30 minutos para desagregar o lipoaspirado não processado. A amostra de tecido desagregado foi depois passada através de um filtro do tipo steriflip de 100 pm. O tecido filtrado foi depois centrifugado a uma taxa de cerca de 600 x g por aproximadamente 10 minutos para recuperar células regenerativas. As células recuperadas foram colocadas em cultura em meio essencial mínimo (MEM) com soro bovino fetal 20% (v/v) por 24 horas. As células aderentes foram contadas por um hemacitômetro.

[000125] Como ilustrado na Figura 10, extrusar a amostra de tecido antes da centrifugação produz um número maior de células por grama de tecido. A Figura 11 ilustra que a centrifugação a 1200 x g possui um efeito aditivo em termos de aumentar a concentração de células dentro da matriz enriquecida por células independentemente se o tecido tenha sido extrudado antes da centrifugação. A Figura 12 ilustra que uma quantidade mais longa de tempo para a centrifugação da amostra de tecido produz um número mais alto de células por grama de matriz enriquecida por células. A Figura 13 ilustra que uma taxa de 1200 x g de aceleração produz uma concentração mais alta de células por matriz enriquecida por células quando comparada a uma taxa de 400 x g de aceleração ou a nenhuma centrifugação.

Exemplo 4

[000126] Lipoaspirado humano fresco foi dividido em duas alíquotas. A Alíquota 1 ("método de controle") foi processada usando condições semelhantes às comumente empregadas na cirurgia estética para preparar enxerto de gordura derivado de lipoaspirado. O lipoaspirado foi centrifugado por 2 minutos a 200 x g. A Alíquota 2 (método de "matriz enriquecida por células" (CEM)) foi processada primeiramente pela extrusão do lipoaspirado através de um acoplamento Luer entre duas seringas, cinco vezes, e depois pela centrifugação do lipoaspirado extrudado durante 30 minutos a 1200 x g. Depois da centrifugação, ambos os métodos resultaram no fracionamento em uma camada oleosa superior, uma camada intermédia de tecido e uma camada aquosa inferior. A fração da camada intermediária de tecido de cada alíquota foi coletada. Uma parte da fração de camada intermediária de tecido proveniente de cada método foi carregada em seringas individuais de 1 cc e administrada por via subcutânea na área da nuca de camundongos fêmeas NU/NU imunodeficientes (n=3 camundongos/preparado).

[000127] Uma parte adicional da fração de camada de tecido proveniente de cada método foi processada a 37 °C com uma mistura de colagenases I e II e dispase, filtrada através de um filtro de 100 pm e depois centrifugada a 600 x g para obter as células regenerativas. O número de células regenerativas viáveis nos preparados celulares frescos e o número de células aderentes plásticas em cultura de 24 horas foram determinados. Em 1 mês da implantação, os camundongos foram sacrificados e os enxertos foram avaliados.

[000128] O processamento pelo método CEM resultou em concentração 2,2 vezes mais alta de células viáveis no preparado fresco e concentração 5,5 vezes mais alta de células aderentes plásticas em comparação ao método de controle. Ver a Tabela 1. Esse enriquecimento de células traduziu-se por viabilidade mais alta do enxerto em 1 mês, conforme evidenciado por vascularização e ausência de bolsões oleosos em camundongos injetados com os preparados de células obtidos usando o método CEM. Tabela 1

Outras Modalidades

[000129] Embora a invenção tenha sido descrita em conjunto com sua descrição detalhada, a descrição precedente destina-se a ilustrar e não a limitar o âmbito da invenção, a qual é definida pelo âmbito das reivindicações anexadas. Outros aspectos, vantagens e modificações são abrangidos pelo âmbito das reivindicações que se seguem.

Claims

1. Método para recuperação facilitada de células regenerativas a partir de uma amostra de tecido do corpo, caracterizado pelo fato de que compreende acelerar e desacelerar o tecido na presença de enzima proteolítica em uma centrífuga, em que o recipiente para o tecido é fixado em um rotor invertido, que é orientado em um ângulo fixo entre 1 grau e menos de 90 graus, e em que ciclos repetidos de aceleração e desaceleração são aplicados ao tecido para que forças centrífugas conduzam a amostra em direção à parte mais externa, mais alta do recipiente, e em repouso retorne a amostra para a parte mais interna, mais baixa do recipiente.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o tecido do corpo é o tecido adiposo ou lipoaspirado.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o interior da centrífuga está a uma temperatura controlada.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a enzima proteolítica é uma colagenase, uma protease neutra ou ambas.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que uma combinação de colagenase e uma protease neutra, juntamente com o aumento da temperatura e agitação por aceleração e desaceleração centrífuga, são usadas para facilitar a recuperação de células regenerativas do tecido adiposo.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 5, caracterizado pelo fato de que a temperatura é controlada de 26° C a 42°C, preferencialmente entre 32° C e 42° C.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a referida aplicação de força centrífuga varia de 50 g a 4.000 g para aceleração.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a referida aplicação de força centrífuga está entre 50 g e 200 g para aceleração e em que em repouso com a gravidade a força centrífuga é zero.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que os ciclos repetitivos compreendem um ou mais ciclos por minuto de aceleração e desaceleração aplicados no tecido.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a amostra de tecido tem ou inclui uma suspensão de pedaços de tecido em um fluido aquoso, que são extrusados antes de colocar a amostra de tecido no recipiente da centrífuga.

11. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a amostra de tecido é extrusada entre uma e vinte vezes, ou entre duas vezes e 10 vezes através de um orifício variando em diâmetro de 1 mm a 4 mm.

12. Método de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que a extrusão é seguida por uma amostra de tecido para centrifugação por um período de pelo menos 5 minutos a uma força centrífuga variando de 200 g a 2.000 g.