BR112021011482A2

BR112021011482A2 - Aparelho de separação de células e métodos de uso

Info

Publication number: BR112021011482A2
Application number: BR112021011482-3A
Authority: BR
Inventors: Rolf Wolters; Jules VALENTI; Tom GURSKI
Original assignee: Koligo Therapeutics, Inc.
Priority date: 2018-12-13
Filing date: 2018-12-13
Publication date: 2021-08-31
Also published as: AU2018452704A1; CA3123386A1; MX2021007080A; WO2020122916A1; CN113660961A; EP3893949A4; ZA202104197B; IL283930A; KR20210092324A; EP3893949A1; JP2022522323A

Abstract

aparelho de separação de células e métodos de uso. sistemas e métodos de separação de células de células de separação são descritos. em uma forma de realização, o sistema de separação de células compreende um dispositivo de armazenamento não transitório que compreende uma pluralidade de lógica associada com programas de centrifugação, em que a execução de um programa de centrifugação separa um volume celular de um volume de material biológico; um mecanismo de aquecimento acoplado eletricamente a um suprimento de energia; um mecanismo de contenção; um conjunto acoplado de forma removível ao mecanismo de contençãoem que o conjunto compreende: um vaso de parede única compreendendo um reservatório de produto, pluralidade de áreas de concentração de células contidas no reservatório de produto, uma área de digestão, um reservatório de resíduos, e uma coluna central compreendendo um tubo de acesso acoplado de forma removível ao reservatório de produto, uma placa de montagem, e um mecanismo de alinhamento acoplado à bacia para restringir o movimento da placa de montagem quando o primeiro conjunto é acoplado ao mecanismo de contenção.

Description

APARELHO DE SEPARAÇÃO DE CÉLULAS E MÉTODOS DE USO INFORMAÇÕES RELACIONADAS AO PEDIDO

[001] Nenhuma.

ANTECEDENTES

[002] A terapia celular e a engenharia de tecidos estão se desenvolvendo em direção a aplicações clínicas para a reparação e restauração de tecidos e órgãos danificados ou doentes. Em particular, o desenvolvimento de enxertos de tecido promove o desenvolvimento de cirurgias, incluindo cirurgia cardíaca e vascular periférica, reparo de tecidos de membros, aplicações odontológicas, bem como cirurgias veterinárias. Os enxertos e outros produtos com base em células podem ser formados isolando e/ou cultivando células de tecido humano ou animal.

[003] Uma fonte potencial para a semeadura de células endoteliais são as células endoteliais microvasculares (MVEC). Williams e outros foram pioneiros em células endoteliais humanas, caninas, coelhos, ratos, bovinos e suínos recém-isoladas e cultivadas, especificamente MVEC, em seu laboratório para estudar a função celular. A fonte de MVEC humano era tecido aspirado de lipoaspiração cosmética. Dois protocolos separados para o isolamento de MVEC de gordura humana foram usados dependendo do emprego final da população de células. Os protocolos diferiam na complexidade do isolamento de um procedimento simples compatível com a sala de operação para enxerto imediato de enxertos humanos ou animais até um procedimento mais elaborado se o MVEC for subsequentemente cultivado. As células endoteliais são de importância crítica no estabelecimento de um revestimento celular não trombogênico. Ainda existe a necessidade de um método eficiente e confiável para a produção de revestimentos de células endoteliais em um enxerto sintético em uma configuração de sala de cirurgia. É desejável alcançar rápida adesão celular em ou sobre uma matriz permeável, arcabouço ou outro material de substrato celular permeável em questão de minutos ou horas com um instrumento que se presta ao ambiente da sala de cirurgia, mantém uma barreira estéril, é fácil de usar, produz resultados consistentes e é barato.

LISTAGEM DAS FIGURAS

[004] A Figura 1 é uma vista isométrica parcial de um sistema de separação de células 100, de acordo com determinadas modalidades da presente revelação.

[005] A Figura 2 é uma vista explodida parcial de uma tigela de parede única, de acordo com determinadas modalidades da presente revelação.

[006] A Figura 3A é uma vista superior parcial de uma tigela de parede única de acordo com determinadas modalidades da presente revelação.

[007] A Figura 3B é uma vista frontal de uma tigela de parede única de acordo com determinadas modalidades da presente revelação.

[008] A Figura 3C é uma vista lateral parcial de uma tigela de parede única de acordo com determinadas modalidades da presente revelação.

[009] A Figura 4A é uma vista em seção transversal parcial de uma tigela de parede única tomada através da tigela através das áreas de concentração de grânulos de acordo com determinadas modalidades da presente revelação.

[0010] A Figura 4B é uma vista em corte transversal parcial de uma tigela de parede única tomada através da tigela perpendicular através das áreas de concentração de grânulos de acordo com determinadas modalidades da presente revelação.

[0011] A Figura 5A é uma vista explodida parcial de um conjunto de tigela de parede única 102 de acordo com determinadas modalidades da presente revelação.

[0012] A Figura 5B é uma vista isométrica parcial de um conjunto de tigela de parede única 102 de acordo com determinadas modalidades da presente revelação.

[0013] A Figura 6 é uma vista explodida parcial de uma placa de montagem 504 e um conjunto de centrífuga 132 de acordo com determinadas modalidades da presente revelação.

[0014] A Figura 7 é um método de separação de células endoteliais de material biológico, como tecido adiposo, de acordo com determinadas modalidades da presente revelação.

SUMÁRIO

[0015] Uma modalidade da presente revelação descreve um método de separação de células, compreendendo: agitar, em uma área de digestão de um sistema de separação de células, um volume de material biológico e um volume de meio de digestão para formar um volume digerido de material biológico; centrifugar o volume digerido de material biológico a uma força de cerca de 500 G a cerca de 1.000 G de cerca de 5 minutos a cerca de 10 minutos para separar o volume digerido em uma pluralidade de volumes de células concentrados e uma pluralidade de resíduos; coletar a pluralidade de volumes de células concentradas em um reservatório de produto em que o volume de células concentradas compreende material com um diâmetro menor do que os poros de um filtro, de modo que o material pode passar através do filtro para uma área de concentração de célula; isolar a pluralidade de resíduos em um reservatório de resíduos, em que o reservatório de resíduos é dividido na tigela da área de digestão e em que a pluralidade de resíduos compreende resíduos com um diâmetro maior do que os poros do filtro e não está em contato com os volumes de células concentrados; e remover os volumes de células concentrados do reservatório de produto.

[0016] Uma modalidade da presente revelação descreve um sistema de separação de células, compreendendo: um dispositivo de armazenamento não transitório que compreende uma pluralidade de lógicas associadas aos programas de centrifugação, em que a execução de um programa de centrifugação separa um volume de célula de um volume de material biológico; um mecanismo de aquecimento eletricamente acoplado a uma fonte de alimentação; um mecanismo de contenção próximo ao mecanismo de aquecimento; um conjunto removivelmente acoplado ao mecanismo de contenção, em que o conjunto compreende: uma tigela de parede única compreendendo um reservatório de produto, pluralidade de áreas de concentração de células contidas dentro do reservatório de produto, uma área de digestão, um reservatório de resíduos e uma coluna central compreendendo um tubo de acesso acoplado removivelmente ao reservatório de produto, uma placa de montagem, em que a tigela de parede única é removivelmente acoplada à placa de montagem, um mecanismo de alinhamento acoplado à coluna central para restringir o movimento, em que, em um primeiro estado de um programa de centrifugação, o conjunto é configurado para girar em torno de um eixo central em uma primeira direção e em uma segunda direção de forma alternada e o mecanismo de aquecimento é ativado, e em que, em um segundo estado de um programa de centrifugação, o mecanismo de aquecimento é desativado e a única tigela com paredes é configurada para girar, em uma única direção, em torno do eixo central para separar uma pluralidade de resíduos de uma pluralidade de células.

[0017] Uma modalidade da presente revelação descreve um sistema de separação de células que compreende: um dispositivo de armazenamento não transitório que compreende uma pluralidade de lógicas associadas a uma pluralidade de diferentes programas de centrifugação, em que, quando executado por um processador; agita em uma área de digestão um volume de material biológico e um volume de meio de digestão para formar um volume digerido de material biológico; separa, por meio de centrifugação, o volume digerido de material biológico a uma força de cerca de 500 G a cerca de 1.000 G de cerca de 5 minutos a cerca de 10 minutos para separar o volume digerido em uma pluralidade de volumes de células concentradas e uma pluralidade de resíduos; coleta a pluralidade de volumes de células concentradas em um reservatório de produto em que o volume de células concentradas compreende material com um diâmetro menor do que os poros de um filtro, de modo que o material pode passar através do filtro para uma área de concentração de célula; isola a pluralidade de resíduos em um reservatório de resíduos em que o reservatório de resíduos é dividido na tigela da área de digestão e em que a pluralidade de resíduos compreende resíduos com um diâmetro maior do que os poros do filtro e não está em contato com os volumes de células concentrados; e remove os volumes de células concentrados do reservatório de produto.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0018] As células endoteliais são usadas para estabelecer o revestimento celular não trombogênico em enxertos sintéticos. Assim, é desejável atingir rápida adesão celular em ou sobre uma matriz permeável, plataforma ou outro material de substrato celular permeável, em questão de minutos ou horas com um instrumento que se presta ao ambiente da sala de operação, mantém uma barreira estéril, é fácil de usar e produz resultados de enxerto consistentes.

[0019] Atualmente, existem várias abordagens para atender a esses requisitos, mas com sucesso limitado: (i) o uso de materiais de tecido descelularizados; (ii) o uso de um mecanismo de automontagem, em que as células são cultivadas em plástico de cultura de tecidos em um meio que induz a síntese de matriz extracelular (ECM); (iii) o uso de polímeros sintéticos biodegradáveis, sobre os quais as células são posteriormente semeadas e cultivadas em um ambiente fisiológico simulado; e (iv) o uso de biopolímeros, como um gel de colágeno tipo I reconstituído, que é formado e compactado com células de tecido pela aplicação de forças mecânicas para simular um ambiente fisiológico.

[0020] As modalidades desta revelação descrevem sistemas e métodos que permitem o isolamento de grandes quantidades de células endoteliais do tecido adiposo e o rápido enxerto de células de enxertos sintéticos, e que permitem a automação e adesão de células em um instrumento pronto para uso na sala de operação para o rápido acúmulo do enxerto. As modalidades desta revelação provavelmente têm outras aplicações além do revestimento de enxertos para implantação.

[0021] Os sistemas e métodos revelados no presente documento são de um sistema de separação de células que compreende uma tigela de parede única que pode ser formada como uma única peça (sem costuras ou soldas) ou que pode ser formada como uma pluralidade de peças. A tigela de parede única ("tigela") pode compreender várias áreas, incluindo uma coluna central que abriga um único tubo de acesso conectado a um reservatório de produto, permitindo acesso direto às áreas de concentração de células contendo o produto final desejado. A tigela compreende ainda uma área de digestão e um reservatório de resíduos separados por uma pluralidade de paredes internas que podem ser formadas integralmente com a tigela ou que são componentes separáveis. As paredes internas permitem a separação da área de digestão e da área de resíduos, de forma que, quando a tigela é centrifugada, o processo de separação das células ocorre mais rapidamente e resulta em um produto final mais puro. A separação física da área de digestão e área de resíduos permite ainda que a área de digestão seja diretamente aquecida, auxiliando ainda mais no processo de separação das células. A tigela de parede única compreende, ainda, uma pluralidade de áreas de concentração de células dispostas circunferencialmente em torno de um eixo central da tigela, de modo que, durante a centrifugação, as forças gravitacionais separem as células de um volume de material biológico. Os resíduos são coletados no reservatório de resíduos e as células são coletadas nas áreas de concentração de células. A tigela compreende, ainda, um ou mais filtros ou telas conectadas a um reservatório de produto que se estende de uma extremidade da tigela à outra extremidade, de uma área de concentração de célula para outra. O reservatório do produto é conectado ao tubo de acesso na coluna central, proporcionando acesso às células concentradas. O reservatório de produto compreende ainda um ou mais suportes de tela que alojam telas ou filtros que evitam que produtos residuais contaminem o produto celular concentrado. A tigela se acopla a uma placa de montagem que se acopla a um mecanismo de contenção por meio de um mecanismo de travamento de mola. Um mecanismo de alinhamento é acoplado à tigela, de modo que engate na placa de montagem, na qual o conjunto da tigela está disposto.

[0022] Em um exemplo de separação de células usando o sistema de separação de células revelado no presente documento, uma pluralidade de lógica é armazenada em um dispositivo de armazenamento não transitório (memória) e compreende uma pluralidade de programas de centrifugação. Cada programa da pluralidade de programas compreende instruções que podem ter como base uma pluralidade de fatores, incluindo tipo de mídia e volume de material biológico e/ou volume de célula alvo ou concentração de célula alvo. Quando executado por um processador, cada programa inicia a separação de células através de uma pluralidade de estados, conforme discutido neste documento,

resultando na remoção automatizada das células separadas e na captura e/ou remoção de resíduos. Os programas podem diferir e/ou se sobrepor em vários aspectos, incluindo temperaturas, tempos, forças e duração geral do programa (tempo) desde o descarte do volume do material biológico e da mídia até a remoção do volume de células separado.

[0023] Em um exemplo do sistema de separação de células, uma pluralidade de meios de digestão e uma pluralidade de material biológico (um volume) são dispostos na tigela, em particular em uma área de mistura e digestão da tigela. A tigela é então agitada, girada em cada direção ao redor do eixo central para romper o volume do material biológico e permitir a separação durante a centrifugação. A tigela pode ser aquecida antes e/ou durante a agitação por meio de um mecanismo de aquecimento, o calor gerado pelo mecanismo de aquecimento faz com que o ar em uma lacuna entre a tigela e a placa de montagem e/ou o mecanismo de contenção aqueça e circule. A tigela pode ser aquecida a partir de cerca de 25ºC a cerca de 45ºC, e o mecanismo de aquecimento pode ser desligado após a conclusão da agitação, de modo que o restante da separação de células ocorra à temperatura ambiente (de cerca de 20°C a cerca de 25°C).

[0024] Após a agitação, a centrifugação é realizada. Durante a centrifugação, a tigela gira livremente em relação ao mecanismo de contenção, um mecanismo de alinhamento acoplado à tigela e à placa de montagem e, em algumas modalidades, ainda acoplado ao mecanismo de contenção, evita que uma parte da tigela gire.

[0025] A centrifugação pode ser realizada a uma força de cerca de 500 G a cerca de 1.000 G durante 5 minutos a 20 minutos, ou 1 minuto a 10 minutos, ou outros intervalos de tempo em várias modalidades. As células são separadas da mistura na área de mistura e digestão e são forçadas gravitacionalmente para uma pluralidade de áreas de concentração de células da tigela. Após a centrifugação, a velocidade da tigela é reduzida e os resíduos são coletados no reservatório de resíduos. Conforme a velocidade da tigela é reduzida, um vácuo é criado no reservatório do produto através do tubo de acesso e as células separadas são coletadas durante a operação. Células e meios de comunicação que têm um diâmetro menor do que os orifícios nos filtros/telas passam pelas telas e para as áreas de concentração de células, enquanto resíduos e outros materiais com um diâmetro maior do que os orifícios do filtro/tela são impedidos de passar pelas telas. Esses resíduos são mantidos no reservatório de resíduos e não entram em contato com o volume da célula separada.

[0026] Em uma modalidade, após a centrifugação, a rotação pode ser interrompida e as células coletadas permanecem no reservatório do produto. As células são removidas através do tubo de acesso usando um vácuo. Usando uma tigela de parede única, a transferência de calor pode ser mais eficaz, aumentando assim a eficiência do sistema. Um sistema de tigela de parede única reduz o custo associado à separação de células. O acesso direto às áreas de concentração celular permite a captura de um produto celular mais puro e concentrado. O acesso ao reservatório de produto permite ainda que o produto celular seja capturado enquanto a montagem ainda está girando.

[0027] A Figura 1 é uma vista isométrica parcial de um sistema de separação de células 100 de acordo com determinadas modalidades da presente revelação. O sistema de separação de células 100 compreende um conjunto de centrífuga 132 e um conjunto 102 de uma tigela de parede única 104 acoplado a uma placa de montagem 106, por meio de um mecanismo de travamento de mola. A placa de montagem 106 é acoplada ao eixo de acionamento de uma centrífuga (não mostrada). O conjunto 102 gira livremente, enquanto a haste de alinhamento 110 (e o tubo de acesso único 108) permanecem estacionários. Durante a agitação e centrifugação, o conjunto 102 gira em qualquer direção 130A ou 130B em torno de um eixo central 124, mostrado em um sistema de coordenadas na Figura 1 e referido por todo o mesmo. O sistema de coordenadas compreende, ainda, um segundo eixo 126 que é perpendicular ao eixo central 124 e um terceiro eixo 128 perpendicular a ambos 124 e 128.

[0028] Em uma modalidade, o conjunto 102 é agitado girando menos de 360 graus em cada direção 130A e 130B em torno do eixo central 124. A tigela 104 pode ser aquecida durante a agitação e/ou durante a centrifugação. Durante a agitação e centrifugação, o material biológico é separado e as células são concentradas no reservatório do produto 206 e os resíduos são coletados no reservatório de resíduos

202.

[0029] Em uma modalidade, a placa de montagem 106 é assentada e removivelmente acoplada a um mecanismo de contenção 112, que atua para direcionar o calor e o ar quente gerados pela ativação da unidade de aquecimento 114. O mecanismo de contenção 112 também é removivelmente acoplado a uma centrífuga que opera para girar o conjunto

102. O acoplamento do mecanismo de contenção 112 ao conjunto 102 cria um espaço de ar entre os dois, através do qual o ar quente pode ser circulado através de uma pluralidade de aberturas (não mostradas) na parte inferior da placa de montagem 106. Em uma modalidade, o conjunto de tigela de parede única 102 e a tubulação associada são descartáveis.

[0030] Em uma modalidade, a unidade de aquecimento 114 é empregada para elevar a temperatura do sistema 100 durante pelo menos a agitação. A unidade de aquecimento 114 é acoplada a uma base 118 que compreende uma pluralidade de pés 116 configurados para proibir o movimento da base 118 e do sistema 100 durante a execução de uma pluralidade de programas de centrifugação. A unidade de aquecimento 114 pode ser alimentada por uma conexão com fio direta via 122 ou pode compreender uma fonte de energia portátil, como uma bateria recarregável (ou baterias). A unidade de aquecimento 114 compreende ainda uma pluralidade de elementos de aquecimento configurados para elevar uma temperatura do mecanismo de contenção 112 e, assim, o conjunto 102 acoplado ao mecanismo 112. O mecanismo de contenção 112 também pode ser acoplado ou removivelmente acoplado à base 118.

[0031] Em uma modalidade, o conjunto de separação de células 102 é capaz de girar em relação ao mecanismo de contenção 112 porque a haste de alinhamento 110 está acoplada à coluna central 402, e a tigela 104 é fixada à placa de montagem 106, por um mecanismo de travamento de mola. O conjunto é removivelmente acoplado ao mecanismo de contenção 112, permitindo a rotação livre do conjunto 102.

[0032] Em uma modalidade, o sistema 100 pode compreender, pelo menos, um dispositivo de armazenamento (não mostrado) compreendendo uma pluralidade de programas de centrifugação e um processador, bem como uma pluralidade de controles (não mostrados) ativados por execução de um programa de centrifugação por meio do processador. O dispositivo de armazenamento e/ou a pluralidade de controles que podem estar localizados no sistema 100 ou localizados remotamente e acessados através de um tablet, telefone celular, tecnologia vestível, quiosque, laptop ou computador desktop. Cada programa de centrifugação pode compreender uma pluralidade de parâmetros empregados no ciclo de centrifugação e pode ser selecionado manual ou dinamicamente e de uma forma automatizada, com base nas entradas, tais como, o volume do material biológico usado e/ou o volume e/ou tipo de enzima de digestão (s) empregado.

[0033] A Figura 2 é uma vista explodida parcial 200 de uma tigela de parede única 104, de acordo com determinadas modalidades da presente revelação. A tigela de parede única 104 pode ser fabricada como uma única peça sem costura ou como várias peças montadas na tigela 104. A “parede única” da tigela está em contraste em relação a uma tigela que tem pelo menos duas paredes aninhadas.

[0034] Em uma modalidade, a tigela 104 compreende uma ou mais áreas de concentração de células 212 removivelmente acopladas a um reservatório de produto 206. As áreas de concentração de células 212 compreendem geometrias internas suaves e atuam para isolar e concentrar, por meio da remoção de fluido e sólidos, as células separadas durante a centrifugação. Uma porção central da tigela 104 aloja a haste de alinhamento 110 e um único tubo de acesso 108. A haste de alinhamento 110 é acoplada à tigela 104 e, posteriormente, ao reservatório de produto 206 por meio de vedações rotativas 214. A tigela 104 compreende, ainda, um reservatório de resíduos 202 que é separado de uma área de mistura e digestão 204 por uma pluralidade de paredes internas que podem ser formadas integralmente com a tigela 104 ou que são componentes separáveis.

[0035] Em uma modalidade, a tigela 104 compreende, ainda, um ou mais suportes de filtro 208 acoplados de forma removível ao reservatório de produto 206 e que retêm um ou mais filtros 210. Os referidos um ou mais filtros 210 evitam que produto residual, incluindo material não digerido, entre no reservatório do produto 206 e contamine o produto celular concentrado. Os referidos um ou mais filtros 210 podem ser tão grandes quanto um tamanho de filtro de 500 micra. Os referidos um ou mais filtros podem ter um tamanho entre 250 micra e 500 micra. Os referidos um ou mais filtros podem ter um tamanho entre 100 micra e 250 micra. Os referidos um ou mais filtros 201 podem ter menos de 100 micra de tamanho. Os referidos um ou mais filtros 201 podem ser configurados em um conjunto, em série, com uma variedade de tamanhos de filtro maiores a tamanhos de filtro menores.

[0036] Em uma modalidade, a tigela 104 compreende, ainda, um ou mais pés 216 que se acoplam a um mecanismo de travamento com mola (não mostrado) e atuam para fixar a tigela 104 na placa de montagem 106 durante a operação. Uma vez fixada, a tigela 104 pode girar livremente em relação ao mecanismo de contenção 112, que não gira e atua, pelo menos em parte, para posicionar e circular o ar aquecido em direção à tigela 104 durante a agitação (e quebra) do volume do material biológico.

[0037] As figuras 3A-C são várias vistas de uma tigela de parede única 104, de acordo com determinadas modalidades da revelação. A Figura 3A é uma vista superior parcial 300 de uma tigela de parede única 104. A tigela 104 pode compreender, pelo menos uma costura 306, ao longo de uma linha de centro da tigela 104. As áreas de concentração de células 212 e o tubo de acesso único 108 também são mostrados. A Figura 3B é uma vista frontal, parcial, 302 de uma tigela de parede única 104 de acordo com determinadas modalidades da revelação. A costura 306, as áreas de concentração de células 212, o tubo de acesso único 108 e a haste de alinhamento 110 também são mostradas. A Figura 3C é uma vista lateral, parcial, 304 de uma tigela de parede única de acordo com determinadas modalidades da revelação. As áreas de concentração de células 212, tubo de acesso único 108 e pés 216 são mostrados. A Figura 4A é uma vista em seção transversal, parcial, 400 de uma tigela de parede única de acordo com determinadas modalidades da presente revelação. A vista 400 da tigela 104 é obtida através da tigela através das áreas de concentração de granulado 212. O reservatório de produto 206 se estende através da tigela 104 de uma área de concentração de granulado 212 para uma área de concentração de granulado diametralmente oposta

212. Filtros 210 nos suportes de filtro 208 são mostrados acoplados de forma removível ao reservatório de produto

206.

[0038] A Figura 4A revela ainda uma coluna central ou cavidade 402 que contém tubo de acesso único 108. O tubo de acesso único 108 é configurado para permitir a introdução de meio estéril, para permitir o acesso ao produto celular concentrado e para permitir a remoção do produto celular concentrado, incluindo durante a operação. O tubo único 108 permanece estacionário durante a rotação, permitindo assim o acesso ao produto celular concentrado durante a rotação do conjunto 102. Esta configuração também reduz a contaminação do produto de célula separada. A Figura 4A compreende ainda uma porta de acesso 404 que está configurada para permitir o acesso apenas ao interior da tigela e permite a introdução de matéria-prima na área de mistura e digestão 204, da tigela 104, enquanto estacionária. O material pode ser material biológico, meio, enzimas de digestão ou outro material necessário para auxiliar na separação das células.

[0039] A Figura 4B uma vista em seção transversal, parcial 406, de uma tigela de parede única 104, de acordo com determinadas modalidades da presente revelação. A vista 406 é obtida através da tigela 104, perpendicular às áreas de concentração de células 212. A Figura 4B mostra características ilustradas nas figuras 2-3, incluindo o reservatório de resíduos 202 e a área de mistura e digestão

204. Também são mostradas na Figura 4B as paredes internas 408 que formam uma barreira parcial, entre a área de mistura e digestão 204 e o reservatório de resíduos 202. Durante o processo de digestão e mistura, o conjunto 102 gira em cada direção 130A e 130B, em torno do eixo central

124. Durante a centrifugação, o conjunto 102 gira em qualquer direção 130A ou 130B em torno de um eixo central

124. As células são separadas e coletadas no reservatório de produto 206. Conforme a tigela é agitada ou centrifugada, o material residual é girado sobre as paredes internas 408 e coletado no reservatório de resíduos 202.

[0040] Em uma modalidade, o reservatório de resíduos 202 é configurado para reter e isolar sólidos grandes e indesejados, bem como meios usados e outros líquidos. Quando da coleta no reservatório de resíduos, essas partículas são proibidas de obstruir o sistema. Uma medida adicional para evitar o entupimento são os filtros 210 (mantidos em suportes de filtro 208) que são acoplados de forma removível às bordas externas do reservatório de produto 206 (visto na Figura 4A). A Figura 5A é uma vista explodida parcial de um conjunto de tigela de parede única 102, de acordo com determinadas modalidades da presente revelação. A Figura 5A mostra que a tigela de parede única 104 se encaixa no mecanismo de travamento com mola da placa de montagem 504, por meio dos pés 216, sendo inseridos nas aberturas 506 e travados no lugar. A Figura 5B representa o conjunto 508 quando o mecanismo de travamento está engatado e a tigela 104 é acoplada à placa de montagem 504.

[0041] A Figura 6 é uma vista explodida, parcial 600, da placa de montagem 504 e conjunto de centrífuga 132 de acordo com determinadas modalidades da presente revelação. A Figura 6 mostra onde a placa de montagem 504 está localizada no interior e, acoplada de forma removível, ao mecanismo de contenção 112 do conjunto de centrífuga 132.

[0042] A Figura 7 é um método de separação de células endoteliais de material biológico, de acordo com determinadas modalidades da presente revelação. O método 700 é um mecanismo automatizado para a lavagem, separação, concentração e remoção/coleta de células viáveis. As células colhidas podem ser empregadas para enxertos ou de outra forma empregadas para uso em saúde (por exemplo, implantação aprovada pela FDA ou processamento adicional) e/ou pesquisa em saúde (ensaios para aprovar métodos de separação de células e produtos derivados de células para uso). Em uma modalidade, no bloco 702 do método 700, um volume de material biológico é disposto em uma área de mistura e digestão 204 (Figura 2), de uma tigela de parede única 104 de um sistema de separação de células, como o sistema 100 na Figura 1. No bloco 704, uma pluralidade de meios e uma enzima ou enzimas colagenase podem ser introduzidas na tigela 104, em particular na área de mistura e digestão 204, através da porta de acesso 404. Exemplos de meios podem ser Lactato de Ringer (LR), Hartmans, Água para injeção (WFI) ou qualquer outro meio semelhante. Em alguns exemplos, a área de mistura e digestão 204 pode ser pré-aquecida de cerca de 30°C a cerca de 40°C antes da eliminação do volume do material biológico e/ou meio na área. Em alguns exemplos, o bloco 702 pode ocorrer antes do bloco 704 e, em outros exemplos, o bloco 704 pode ocorrer antes do bloco 702. Ainda em outros exemplos, os blocos 702 e 704 podem ocorrer quase simultaneamente, de modo que o volume do material biológico e a mídia sejam dispostos na área de mistura e digestão 204 aproximadamente ao mesmo tempo.

[0043] Em um exemplo em que a área de mistura e digestão 204 é aquecida, ela pode ser aquecida e mantida a uma temperatura de cerca de 30ºC a cerca de 40ºC antes do bloco 702, bloco 704, ou após um ou ambos do volume de material biológico e/ou meio sendo dispostos na área de mistura e digestão 204. Este aquecimento pode ser referido como um pré-aquecimento, que pode durar cerca de 10 minutos a cerca de 45 minutos, ou menos de 10 minutos dependendo de uma temperatura alvo ou faixa de temperatura.

[0044] Além disso, no método 700 no bloco 706, o volume do material biológico disposto no bloco 702 é completa ou parcialmente digerido através do meio de enzima disposto no bloco 704. A digestão no bloco 706 do volume de material biológico disposto no bloco 702 pode ocorrer via aquecimento da área de mistura e digestão 204, ou via agitação da tigela de parede única 104, ou por uma combinação de ambos. Esta digestão pode ocorrer ao longo de vários períodos de tempo de 5 minutos á 1 hora, de 15 minutos á 45 minutos, ou outros períodos de tempo dependendo do tipo de enzima (s) usado (s), o número de enzima (s) usadas, e/ou um volume de cada enzima usada no bloco 704 e o volume de material biológico disposto no bloco 702a.

[0045] Além disso, no método 700 no bloco 706, a agitação no bloco 706 pode ocorrer por rotação parcial ou completa da tigela em direções alternadas, em torno de um eixo central, e não é a mesma, nem gera a força da centrifugação discutida no presente documento. A agitação empregada para promover a digestão no bloco 706 pode compreender rotações totais ou parciais em diferentes direções em torno de um eixo central 124 (Figura 1) e pode ocorrer por um período de tempo predeterminado. A digestão no bloco 706 pode ser referida como um primeiro estado do aparelho, em que as forças centrífugas não são aplicadas e a mídia e o volume do material biológico são agitados na câmara por um período de tempo predeterminado ou por um número predeterminado de ciclos de agitação. Em um exemplo, a temperatura da área de mistura e digestão 204 é mantida a cerca de 37ºC durante a digestão no bloco 706, este primeiro estado é mantido por um período de tempo predeterminado, com base em um tipo de enzima (s) usada (s), um número de enzima (s) usada (s) e/ou um volume de cada enzima usada no bloco 704 e o volume de material biológico disposto no bloco 702. Os sistemas discutidos neste documento podem compreender uma pluralidade de programas armazenados compreendendo parâmetros para a digestão no bloco 706, bem como para outros estados, blocos e fases revelados neste documento.

[0046] Além disso, no método 700, no bloco 708, em resposta e após a conclusão da digestão no bloco 706, ocorre a centrifugação. Conforme discutido neste documento, a "conclusão" da digestão no bloco 706 se refere a quando a digestão progrediu até um ponto onde as células ainda são viáveis, mas o volume biológico foi quebrado de modo que seja capaz de centrifugação no bloco 708. Esta centrifugação no bloco 708 pode ser caracterizada pela separação de células do volume digerido formado no bloco

606. Em uma modalidade, a configuração no bloco 708 compreende uma força-g de 600 G a 1.000 G por um período de tempo de cerca de 5 minutos a cerca de 10 minutos. As forças g ou "G" referidas no presente documento são a força da gravidade aplicada a um corpo, neste caso, a força aplicada às células coletadas nas áreas de concentração de células que continuam a ter fluido removido (tornando-se assim um volume de célula mais concentrado com o fluido/resíduo reduzido) e permanecem isoladas da área de mistura e digestão 204, durante pelo menos a centrifugação no bloco 708.

[0047] A centrifugação no bloco 708 pode ser referida como um segundo estado do sistema de separação de células. A centrifugação no bloco 708 pode compreender programas de várias velocidades RPM e tempos para ciclos. Esses ciclos podem aumentar em RPM e/ou em duração até a cessação no bloco 712, conforme discutido abaixo. Em uma modalidade, um único ciclo de centrifugação pode ser empregado de 500 G a

1.000 G por um período de tempo de cerca de 5 minutos a cerca de 10 minutos e, ainda, em outros exemplos, múltiplos ciclos de centrifugação podem ser empregados, de modo que o primeiro aumento aplicado na força G e, em seguida, diminuindo a força aplicada, conduzem à rotação retardada discutida em detalhes no bloco 710 abaixo.

[0048] Em uma modalidade, a digestão no bloco 706 separa uma pluralidade de células do tecido adiposo e fluidos, o (s) ciclo (s) de centrifugação no bloco 708 atua (m) para forçar a separação das células e o movimento dessas células separadas para as áreas de concentração celular 212.

[0049] Em uma modalidade, o mecanismo de aquecimento usado para pré-aquecer a área de mistura e digestão 204 durante a digestão no bloco 706 é desligado subsequentemente ao bloco 706 e, antes do início do bloco

708, de modo que a centrifugação no bloco 708 possa prosseguir entre a temperatura ambiente (de cerca de 20ºC a cerca de 25ºC) e a temperatura empregada no bloco 706. Além disso, no bloco 708, durante a separação das células no reservatório de produto 206 e nas áreas de concentração de células 212, após um período de tempo predeterminado de centrifugação no bloco 708, meios limpos podem ser introduzidos na câmara da tigela de parede única 104, via tubo de acesso único 108 (bloco 716). Estes meios deslocam, ainda, uma pluralidade de materiais, incluindo gordura e outros tecidos e líquidos da área de mistura e digestão 204, de modo que esses materiais sejam removidos da área de mistura e digestão 204, conforme o volume aumenta e capturados no reservatório de resíduos 202.

[0050] Em alguns exemplos, uma velocidade de 500 G a 800 G pode ser usada no bloco 708, a fim de separar o volume da célula nas áreas de concentração 212 e, em outros exemplos, uma velocidade de 700 G a 900 G pode ser usada para centrifugação em bloco 708. Os meios limpos do bloco 716 podem ser adicionados ao bloco 708 para aumentar o volume total dentro da tigela 104, de modo a promover a expulsão do produto residual para o reservatório de resíduos 202. A introdução dos meios no bloco 716 pode ocorrer dependendo das velocidades de rotação, programas de centrifugação (ciclos) e geometria do sistema e regiões de coleta. Em uma modalidade em que o meio de lavagem é introduzido no bloco 716, a quantidade empregada pode dobrar ou triplicar o volume total de todos os fluidos até agora introduzidos na tigela 102.

[0051] O bloco 710 é uma fase de rotação retardada e também pode ser referido como o terceiro estado do aparelho de separação de células. Durante esta fase, que pode ser de 3 minutos a 45 minutos, uma força centrífuga mais baixa é aplicada no bloco 710. Em um exemplo no bloco 710, a rotação da tigela de parede única 104 é desacelerada para uma velocidade predeterminada ou faixa de velocidades e uma temperatura da tigela pode ser da temperatura ambiente à temperatura máxima empregada no bloco 706. Os parâmetros como velocidade (força gerada) e temperatura podem ser empregados no bloco 710 para permitir que o volume de célula separado permaneça nas áreas de concentração de células 212, enquanto o fluido restante dos meios e o volume biológico drenam pelas paredes internas da tigela para o reservatório de resíduos 202.

[0052] Os resíduos podem ser coletados no reservatório de resíduos 202 no todo ou em parte, enquanto os volumes de células são retidos nas áreas de concentração de células 212 pela força centrífuga aplicada no bloco 710. Alguns resíduos podem permanecer presos na área de mistura e digestão 204, onde são isolados das células separadas. Em alguns exemplos, a rotação retardada do bloco 710 pode ser iterativa, por exemplo, uma primeira rotação retardada no bloco 710 pode estar a 90% de uma velocidade média do bloco 708, uma segunda rotação retardada subsequente no bloco 710 pode estar a 80% de uma velocidade média do bloco 708 e rotações desaceleradas subsequentes podem estar em velocidades cada vez menores, até que um período predeterminado tenha expirado ou até que uma quantidade predeterminada de fluido e/ou sólidos tenha sido removida para o reservatório de resíduos 202, conforme determinado pelo volume e/ou sensores ópticos. Durante o bloco 710, o material que é muito grande para passar pelos filtros 210 é retido e isolado no reservatório de resíduos 202, de modo que o volume de célula separado não seja contatado por este material.

[0053] Um vácuo é empregado para arrastar as células da área de concentração de células 212 para o centro do reservatório de produto 206. Assim, as células coletadas em 212 se movem dessas áreas de coleta para uma área do reservatório de produto 206 em que, no bloco 714, as células concentradas (volume de célula separado) podem ser removidas usando vácuo e através do tubo de acesso único

108. Em algumas modalidades, esta remoção é automatizada e ocorre em resposta à conclusão dos blocos 710 e 712. Em algumas modalidades, esta remoção é automatizada e ocorre antes do bloco 712. Os blocos 712 e 714 podem ser referidos coletivamente como um quarto estado do aparelho de separação de células quando a tigela não está mais girando em relação ao mecanismo de contenção 112.

[0054] Os blocos discutidos no método 700 estão associados a um método automatizado e dinâmico de separação e coleta de células, de modo que o carregamento da tigela 104 nos blocos 702 e 704 prossiga através da remoção e coleta no bloco 712 sem intervenção manual. Em um exemplo, uma memória não transitória armazenada em um dispositivo de armazenamento e acoplada ao aparelho de separação de células compreende uma pluralidade de códigos executáveis por um processador. Esta pluralidade de códigos compreende programas de centrifugação para amostras de propriedades variáveis, cada programa pode compreender uma taxa de fluxo para os blocos 702 e/ou 704, bem como o volume da célula e/ou alvos de concentração, taxas de fluxo, tempos e intervalos para as forças geradas (taxa de rotação/RPM) nos blocos 706, 708, 710, 714 e 716 conforme apropriado para as ações que ocorrem em cada bloco. Cada programa pode ser associado ao tempo geral de conclusão, desde a deposição dos meios e do volume do material biológico até a remoção das células separadas.

[0055] Em outro exemplo, a pluralidade de códigos contém programas que detectam, automaticamente, quando o sistema está obstruído e interrompem o processo de separação. O programa então inicia o fluxo dos meios do sistema ou agita o conjunto 102, de modo que o entupimento seja disperso e o procedimento de separação seja reiniciado.

[0056] Embora modalidades preferidas tenham sido mostradas e descritas, modificações das mesmas podem ser feitas por um técnico no assunto sem se afastar do escopo ou dos ensinamentos do presente documento. As modalidades descritas no presente documento são apenas exemplificativas e não são limitativas. Muitas variações e modificações dos sistemas, aparelhos e processos descritos neste documento são possíveis e estão dentro do escopo da invenção. Por exemplo, as dimensões relativas de várias peças, os materiais dos quais as várias peças são feitas e outros parâmetros podem ser variados. Por conseguinte, o escopo de proteção não está limitado às modalidades aqui descritas, mas é apenas limitado pelas reivindicações que se seguem, o escopo das quais deve incluir todos os equivalentes do objeto das reivindicações. A menos que expressamente declarado de outra forma, as etapas em uma reivindicação de método podem ser realizadas em qualquer ordem.

A citação de identificadores como (a), (b), (c) ou (1), (2), (3) antes das etapas em uma reivindicação de método não se destina a e não especifica a uma ordem particular para as etapas, porém, em vez disso, são usados para simplificar a referência subsequente a tais etapas.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método de separação de células, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) agitar em uma área de digestão de um sistema de separação de células, um volume de material biológico e meios de digestão de volume para formar um volume digerido de material biológico; (b) centrifugar o volume digerido de material biológico a uma força de cerca de 500 G a cerca de 1.000 G de cerca de 5 minutos a cerca de 10 minutos para separar o volume digerido em uma pluralidade de volumes de células concentradas e uma pluralidade de resíduos; (c) coletar a pluralidade de volumes de células concentradas em um reservatório de produto, em que o volume de células concentradas compreende material com um diâmetro menor do que os poros de um filtro, de modo que o material pode passar através do filtro para uma área de concentração de célula; (d) isolar a pluralidade de resíduos em um reservatório de resíduos, em que o reservatório de resíduos é dividido na tigela da área de digestão e, em que a pluralidade de resíduos compreende resíduos com um diâmetro maior, do que os poros do filtro e não está em contato com os volumes de células concentradas; (e) remover os volumes de células concentradas do reservatório de produto.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que (a) compreende girar a tigela de parede única em cada direção, em torno de um eixo central de uma forma alternada, por um período de tempo predeterminado.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que compreende, ainda, o aquecimento da tigela de parede única de cerca de 30ºC a cerca de 40ºC antes de (a) o volume de material biológico e a pluralidade de meios de digestão no interior do reservatório.

4. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que compreende ainda o aquecimento da tigela de parede única de cerca de 30°C a cerca de 40ºC durante (a).

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que (b), (c), (d) e (e) ocorrem em cerca de 20ºC a cerca de 25ºC.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda iniciar (a) pela execução de um programa de centrifugação por meio de um processador.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o programa de centrifugação está completo após (e).

8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que uma pluralidade de programas de centrifugação é armazenado em um dispositivo de armazenamento não transitório, do sistema de separação de células.

9. Sistema de separação de células, caracterizado pelo fato de que compreende: um dispositivo de armazenamento não transitório que compreende uma pluralidade de lógicas associadas aos programas de centrifugação, em que a execução de um programa de centrifugação separa um volume de célula de um volume de material biológico; um mecanismo de aquecimento eletricamente acoplado a uma fonte de alimentação; um mecanismo de contenção próximo ao mecanismo de aquecimento; um conjunto acoplado, de modo removível, ao mecanismo de contenção, em que o conjunto compreende: uma tigela de parede única que compreende um reservatório de produto, pluralidade de áreas de concentração de células, uma área de digestão, um reservatório de resíduos e uma coluna central que compreende um tubo de acesso removivelmente acoplado ao reservatório de produto, uma placa de montagem, em que a tigela de parede única é removivelmente acoplada à placa de montagem, um mecanismo de alinhamento acoplado à coluna central para restringir o movimento do tubo de acesso quando acoplado ao mecanismo de contenção, em que, em um primeiro estado de um programa de centrifugação, o conjunto é configurado para girar em torno de um eixo central, em uma primeira direção e em uma segunda direção de uma forma alternada e, o mecanismo de aquecimento é ativado, e em que, em um segundo estado de um programa de centrifugação, o mecanismo de aquecimento é desativado e a tigela de parede única é configurada para girar em uma única direção, em torno do eixo central para separar uma pluralidade de resíduos de uma pluralidade de células.

10. Sistema, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que as células separadas são separadas no segundo estado de um programa de centrifugação em uma pluralidade de áreas de concentração de células, no reservatório de produto da tigela de parede única.

11. Sistema, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que compreende, ainda, um terceiro estado, em que, quando o sistema é configurado no terceiro estado, o sistema é configurado para coletar resíduos em um reservatório de resíduos formado na tigela de parede única.

12. Sistema, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o reservatório de produto compreende um ou mais filtros que permitem, apenas, a passagem de material com menos de 200 micra de diâmetro, em direção as áreas de concentração de células.

13. Sistema, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que, quando configurada em um quarto estado, a tigela de parede única é estacionária.

14. Sistema, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o tubo de acesso permite a remoção do produto celular concentrado do reservatório de produto durante a centrifugação.

15. Sistema de separação de células, caracterizado pelo fato de que compreende: um dispositivo de armazenamento não transitório que compreende uma pluralidade de lógicas associadas a uma pluralidade de diferentes programas de centrifugação, em que, quando executado por um processador; agita um volume de material biológico, em uma área de digestão para formar um volume digerido de material biológico; separa, por meio de centrifugação, o volume digerido de material biológico a uma força de cerca de 500 G a cerca de 1.000 G, a partir de cerca de 5 minutos a cerca de 10 minutos para separar o volume digerido em uma pluralidade de volumes de células concentradas e uma pluralidade de resíduos; coleta a pluralidade de volumes de células concentradas em um reservatório de produto, em que o volume de células concentradas compreende material com um diâmetro menor do que os poros de um filtro, de modo que o material pode passar através do filtro para uma área de concentração de célula; isola a pluralidade de resíduos em um reservatório de resíduos, em que o reservatório de resíduos é dividido na tigela da área de digestão e em que a pluralidade de resíduos compreende resíduos com um diâmetro maior, do que os poros do filtro e não está em contato com os volumes de células concentrados; e remove, do reservatório de produto, os volumes de células concentradas.

16. Sistema, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o sistema compreende, ainda, um primeiro conjunto compreendendo uma tigela de parede única removivelmente acoplada a uma placa de montagem, para permitir que o conjunto gire em relação a um mecanismo de contenção, durante pelo menos, a agitação e a centrifugação.

17. Sistema, de acordo com a reivindicação 16,

caracterizado pelo fato de que o primeiro conjunto é acoplado de forma removível, a um mecanismo de contenção e, em que, um mecanismo de aquecimento está localizado próximo ao mecanismo de contenção.

18. Sistema, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que, pelo menos alguns programas de centrifugação, da pluralidade de programas de centrifugação são ainda configurados para, quando da execução pelo processador, aquecer a tigela pelo menos um, dentre antes ou durante, a agitação de cerca de 30ºC a cerca de 40ºC.

19. Sistema, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o produto celular é coletado por transferência do produto celular, da pluralidade de volumes de células concentradas, na pluralidade de áreas de concentração de células da tigela de parede única, para o reservatório de produto.

20. Sistema, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o primeiro conjunto é descartável.