KR101951055B1 - 조직 검체로부터 세포 및 세포가 풍부한 기질의 강화된 회수를 위한 방법 및 기구 - Google Patents

조직 검체로부터 세포 및 세포가 풍부한 기질의 강화된 회수를 위한 방법 및 기구 Download PDF

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Abstract

본 문헌은 조직 검체로부터 세포가 풍부한 기질 및 세포 (예컨대, 재생 세포) 를 회수하기 위한 방법 및 장치를 기술한다. 몇몇의 실시형태에서, 적어도 2 차례의 가속 및 감속이 행해진다.

Description

조직 검체로부터 세포 및 세포가 풍부한 기질의 강화된 회수를 위한 방법 및 기구{METHODS AND APPARATUS FOR ENHANCED RECOVERY OF CELLS AND OF CELL-ENRICHED MATRIX FROM TISSUE SAMPLES}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2010년 12월 16일에 제출된 미국 가출원 번호 61/424,012 및 2011년 11월 3일 제출된 미국 가출원 번호 61/555,305에 대해 우선권을 주장한다. 이전 출원의 공개는 본 출원의 공개의 일부로 간주 (또한 참고자료로 통합) 되고 있다.
기술분야
본 발명은 세포가 풍부한 기질 (matrix) 의 회수 및 세포의 회수를 위한, 보다 구체적으로는 원심력 하에서의 2개 이상의 가속 및 감속 단계 및 그들의 조합을 통해서 조직 검체로부터 세포를 회수하기 위한 방법과 기구에 관련되어 있다.
재생의학에 있어서 현재의 전략은 증가된 아포프토시스율을 경험하는 조직을 대체하는 데에 목표를 두고 있다. 이는 대체되는 세포보다 사멸하는 세포가 보다 많기 때문에 조직 내에 기능성 세포의 순손실이 존재한다는 것을 의미한다. 따라서, 하나의 위치로부터 갱신위치로의 재생 세포, 특히, 줄기세포 및 간세포의 전이는 조직을 평형상태로 복원하는 치료적 접근법이다. 우리 실험실에서의 연구를 통해, 줄기세포와 재생 세포는 혈관 내 조기 간세포가 내탄력판에 부착된 상태에서 현재 모든 조직, 특히 주로 혈관 및 혈관 주위 공간에 있음을 밝혀냈다. 이들 세포의 한 집단은 조직의 스트로마 (stroma) 를 대체할 수 있으며, 이들 세포들의 다른 부분은 특정 장기의 각각의 유조직으로 분화될 수 있다. 각 조직은 주택에 비유될 수 있으며, 반면에 섬유아세포에서 만들어지고 세포외 기질을 구성하고 있는 스트로마는 주택 내 벽돌벽과 모르타르에, 그리고 주택 내 배관은 장기의 혈관에 비유할 수 있고 신경은 벽체 내 전기배선을 나타낸다. 이들 주택 내부에는, 각 장기 내에 사람들이 장기의 유조직으로도 불리는 간 세포, 심장 세포, 골 세포, 연골 또는 지방 세포와 같은 주민의 특정 유형을 가지고 있다.
결손 장기에 대한 기능을 복원하려면, 양 스트로마를 제공하는 것이 중요하며 이는 특정 유세포들인 장기의 벽과 주민을 형성하고 있는 하우징을 의미한다.
조직 기능을 복원할 수 있는 재생 세포를 복원하기 위한 단순한 수단은 피하 지방조직으로부터 이들 세포를 분리하는 것이며, 이는 이 조직이 혈관 내에 풍부하며 탈착식 지방 조직이 생명에 필수적인 항목이 아니기 때문이다. 대부분의 사람들은 이러한 조직들을 상당부분 기꺼이 기증할 의사를 가지고 있다.
지방흡입술에 의해 수확되는 조직의 자가 식피술은 소규모 (예컨대, 팔자주름) 및 대규모 (보톡스 또는 유방) 확대술 적용을 위한 미용 성형수술에 있어서의 공통 절차이다. "자가 지방식피술"이라고 불리는 본 절차의 장점은 환자 자신의 조직이 사용되므로 비용이 저렴하고 합성 충진재의 사용이나 면역거부가 적다는 것이다. 현재, 지질흡인물 채취와 처리를 위한 복수의 방법들이 식피술에 대한 조직을 얻기 위하여 도입되고 있다. 자가 지방식피술에 뒤이은 임상결과를 측정하기 위한 인자들은 완전히 밝혀지지 않았다. 그러나, 지속적인 이식이 중요한 수요범위라는 것은 널리 알려져 있는 사실이다.
체내의 한 위치로부터 회수되고 다른 위치로 이전된 지방조직이나 지방세포는 호기성 신진대사를 계속한다. 적절한 혈액 공급이 없을 경우, 이들 세포는 24 ~ 48 시간 사이에 괴사, 고사, 자식하며 사멸한다. 지방이 지방흡입술에 의해 신체 내 한 위치로부터 분리되고 또 다른 위치로 재주입되는 경우의 전통적인 지방 식피술에 따른 문제점은 전이된 세포의 큰 부분이 생존하지 않으며 죽어가는 세포들이 상당한 국소 염증을 유발할 수 있다는 것이다. 지방이식의 지속성과 재생 잠재력은 이식에 있어서 지방질로 가득찬 지방세포의 내용물과는 관련이 없지만 대신에 줄기세포와 투여된 세포외 기질과 같은 재생 세포의 내용물과는 연관이 있다. 성숙한 지방세포의 식피술 후 손실은 채취 및 재투여에 따른 외상과 이식 환경에 다른 허혈의 본질에 의해 높아진다. 이와는 대조적으로, 줄기 및 재생 세포는 이들 인자에 더욱 강한 내성을 가지며 따라서 실질적으로 장기 이식 생존능력과 재생 잠재력에 기여한다.
본 문헌은 체적 증강을 필요로 하는 피하 조직이나 다른 결합 조직 구조의 확대술을 위한 개선된 방법에 기반하고 있다. 본 방법에는 지방질 내용물을 감소시켰던 세포가 풍부한 기질의 전이가 포함되지만 재생세포의 농도증가는 포함되지 않다. 결합 조직은 지방세포에 비해 신진대사가 현저하게 낮으므로 국소빈혈에 상당히 긴 내성을 가지고 있다고 알려져 있다. 따라서, 세포-세포가 풍부한 기질을 가진 장기간의 안정화된 확대술을 위한 방법과 기구를 제공하는 것이 현재 발명의 목표이다. 이는 새로운 위치로 이식될 경우 조직의 생존율이 현저히 개선된다. 따라서 여기서 기술한 바와 같이, 조직 내의 줄기세포로부터의 신혈관 형성은 이식된 접목부의 생존능력을 대폭 개선해 강화해 준다. 본 방법을 더욱 개선하려면, 반전된 회전자 내에서의 가속 및 감속에 의한 가열된 원심분리에서의 지질 흡인물의 효소분리를 포함하는, 여기에서 언급한 방법에 의해 회수되는 분리된 재생 세포와 함께 세포가 풍부한 기질의 혼합물을 재적용하면 된다.
따라서, 본 문헌은 세포가 풍부한 기질의 준비와 회수, 기질회수에 사용된 것과 동일한 기구의 장치에 의한 피하위치로부터의 재생 세포의 개선된 회수, 그리고 확장된 신혈관 형성과 이식된 확대술 이식 조직의 개선된 생존율을 위한 세포가 풍부한 기질과 재생 세포의 조합을 위한 새로운 방법을 제공하고 있다.
본 문헌은 또한 피하 지방 조직 내에서의 자신의 위치로부터의 전체 간세포 범위로 정의되는 재생 세포의 회수를 위한 비용효과적인 장치를 제공한다. 최초 지질흡인물로부터 지방질로 가득찬 세포의 내용물을 전처리 및 절감하는 것은 교원질 분해 효소와 중성 단백질 분해 효소와 같은 값비싼 효소를 절약하는 효과적인 방법이다. 본 방법에는 지질흡인물 내 지방질로 가득찬 세포량이 감소하고 세포가 풍부한 기질이 회수되는 2단계 접근법이 포함되며, 이후 가변구조형 회전자를 가진 가열된 원심분리 및 가속 및 감속의 반복 사이클로부터 증가된 온도도 사용해서 감소된 지방질 내용물을 가진 세포가 풍부한 기질을 지방질 내용물을 효소 및 역학적 과정에 가져가는 과정도 포함된다.
처리된 지질흡인물을 얻기 위한 목표에 의해 피하지방을 처리하기 위한 현재 알려진 방법들은 원심분리만 적용하고 있다. 여기에 보이는 것처럼, 원심분리 단독에 의한 처리는 처리된 조직의 세포 생산량을 늘릴 수 있다. 그러나, 원심분리 단계 이전의 압출 지방 조직은 세포가 풍부한 기질로 알려져 있는 처리된 지질흡인물 물질의 세포 내용물을 현저하게 증가시킨다.
여전히 조직 내에 구속되어 있는 집합적으로 "재생 세포" 또는 "재생 플랫폼"인 줄기와 간세포를 포함하여 주로 세포외 기질과 조직 내의 세포의 교원질, 라미닌, 엘라스틴, 다른 프로테오글리칸으로 구성되는 생산량 세포가 풍부한 기질을 생산하기 위하여 여기에 기술된 바와 같이 피하 조직을 처리할 수 있다. 전형적으로, 세포가 풍부한 기질에는 해당 조직 위치에 구속되어 있는 90% 이상의 재생 세포가 포함되어 있다.
일 실시형태에서, 본 문헌은 세포가 풍부한 기질의 준비와 회수를 위한 방법과 기구를 제공한다.
일 실시형태에서, 본 문헌은 세포가 풍부한 기질로부터 재생 세포를 준비하고 회수하기 위한 방법과 기구를 제공한다.
일 실시형태에서, 여기에 기술된 고립된 재생세포를 포함하거나 세포가 풍부한 기질 및 재생 세포를 모두 포함하는 세포구성을 포함하는 세포구성이 제공된다. 여기에 언급된 대로 준비된 세포가 풍부한 기질에는 감소된 지방질 내용물이 들어 있지만 재생 세포의 증가된 농도는 포함되지 않는다. 결합 조직이 지방세포에 비해서 현저히 낮은 신진대사율을 보이므로 이는 국소빈혈에 매우 긴 내성을 가지고 있다고 알려져 있다. 여기에서 기술된 세포 구성은 이식의 신혈관 형성을 넓혀주고 이식의 장기 생존율을 높여 준다. 세포가 풍부한 기질과 재생 세포의 조합이 들어 있는 세포구성은 이식의 신혈관 형성을 확장과 이식의 장기 생존율 증가에 특별히 유용하다.
일 실시형태에서, 본 문서는 조직으로부터 세포가 풍부한 기질을 회수하는 방법이다. 본 방법에는 세포가 풍부한 기질을 격리하기 위해 소공과 원심분리하기 압출된 조직 검체를 통해 수성 유체 내의 지방 조직 조각들의 현탁액을 함유하고 있는 압출 조직 검체를 사용하는 것이 특징이다. 소공들은 직경 1 ~ 5 ㎜ 의 것을 사용할 수 있다. 압출된 조직 검체는 400xg 이상, 바람직하게는 최대 1200xg (예컨대, 400xg ~ 1200xg) 의 관성력에서 적어도 5 분간 원심분리된다. 세포는 여기에 기술한 바와 같이 세포가 풍부한 기질로부터 회수할 수 있다.
또 다른 국면에서 볼 때, 본 문서는 조직으로부터 세포를 회수하는 방법이다. 본 방법에는 원심분리에 적용되는 용기 내에 담긴 압출된 조직 검체, 수성 유체 내의 조직 조각들의 현탁액을 구성하고 있는 조직 검체를 공급하는 과정이 포함된다; 더불어 검체들이 회전요소를 통하여 적용된 원심력을 사용해서 복수의 가속 및 감속 단계에 놓이는 여기에서, 회전요소는 축 및 그 축으로부터 연장되는 하나 이상의 암을 포함하고, (i) 하나 이상의 암은 축이 회전할 때 하나 이상의 암이 축에 대해 위쪽으로 그리고 바깥쪽으로 흔들리도록 축으로부터 지지되거나, 또는 (ⅱ) 하나 이상의 암은 고정각 (fixed angle) 으로 지지되고, 상기 암에 부착된 용기가 물질에 대한 중력이 적용된 원심력에 반대되게 하는 위치에 유지되며, 상기 적용된 원심력이 약 50 g ~ 약 4000 g 이다. 검체온도는 32 ~ 42 ℃ 에서 유지된다. 하나 이상의 효소 (예컨대, 교원질 분해 효소나 중성 단백질 분해 효소 또는 여기에 기술된 다른 효소들과 같은 단백질 분해 효소) 도 포함될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 문서는 조직 검체(예컨대, 지질흡인물, 지방 조직, 조합)로부터 재생 플랫폼을 회수하는 방법이 특징이다. 본 방법에는 자동화된 조직 처리 장치에 적용되는 1차 조직채취 용기 내에 수용되는 조직 검체의 공급과정이 포함되는 여기에서, 자동화된 조직 처리 장치는 2개 이상의 공동으로 구성되는 제거가능한 회전 기구로 구성되고 각 공동은 공동 내에 조직채취 용기를 삽입하여 분리될 수 있도록 구성되며 조직 검체는 수성 유체 내의 조직 조각들의 현탁액으로 구성되고, 조직 검체를 자동화된 조직 처리 장치를 사용하여 대략 5분 이상 400xg 이상의 관성력으로 최소 1차례 원심분리하며, 따라서 조직 검체로부터 세포가 풍부한 기질을 분리하며, 반면에 세포가 풍부한 기질은 재생 플랫폼으로 구성된다. 본 방법에는 더욱이 조직 검체를 자동화된 조직 처리 장치에 놓기 전에 오리피스를 통해 압출 조직 검체가 포함될 수 있다. 세포가 풍부한 기질은 오리피스를 통해 압출 조직 검체가 없는 다른 상당 방법에 비해서 보다 높은 재생 플랫폼 농도를 가질 수 있다. 본 방법은 폐쇄된 시스템 방법을 통해서 차 조직채취 용기로부터 2차 채취 용기로 조직 검체 농축물을 전달할 수 있다. 일 실시형태에서, 하나 이상의 단백질 분해 효소를 2차 채취 용기에 추가할 수 있다. 세포가 풍부한 기질은 최소 2차례 가속할 수 있는 여기에서, 각 차례의 가속이 끝나면 감속단계에 들어가며 따라서 세포가 풍부한 기질이 구성요소로 분해된다. 일 실시형태에서, 주사가능한 재생 플랫폼을 얻기 위해 세포가 풍부한 기질을 여과할 수 있다.
여기에 기술된 모든 방법에서는 주사가능한 재생 플랫폼의 최소 부분을 주사부위를 통해 대상물에 투여할 수 있는 반면에 주사를 통해 주사부위 및 인근 부위를 변화시킬 수 있다.
본 문서는 재생 플랫폼을 가지는 세포가 풍부한 기질을 구성요소로 분해하기 위한 방법이 특징인 여기에서, 본 방법에는 자동화된 조직 처리 장치에 적용되는 2차 조직채취 용기 내에 수용되는 세포가 풍부한 기질의 공급과정이 포함되고 조직채취 용기는 1개 이상의 단백질 분해 효소로 구성되며; 세포가 풍부한 기질을 최소 2차례 가속하고, 각 가속이 끝나면 감속과정이 뒤따르며, 최소 10xg의 비율로 가속 및 감속이 2차례 이상 이루어지며, 따라서 세포가 풍부한 기질이 구성요소로 분해된다. 나아가, 본 방법에는 주사가능한 재생 플랫폼을 얻기 위하여 세포가 풍부한 기질을 여과 또는 여과 및 농축하는 과정이 포함될 수 있다.
본 문서는 또한 2개 이상의 공동으로 구성되는 제거가능한 회전 기구가 특징인 여기에서, 각 공동은 공동 내에 조직채취 용기를 삽입하여 분리가능하도록 구성되고 제거가능한 회전 기구는 세포가 풍부한 기질을 조직 검체로부터 분리하기 위한 자동화된 조직 처리 장치 내에서 회전하도록 구성된다. 제거가능한 회전 기구에는 몸체에 부착되는 무선 주파수 식별(RFID) 태그가 포함될 수 있으며 이는 제거가능한 회전 기구를 자동화된 조직 처리 장치로 식별할 수 있게 해 준다. 아니면, 제거가능한 회전 기구의 유형은 가속 단계 중에 기구를 가속하는 데 필요한 전류량에 기초하여 식별할 수 있다. 제거가능한 회전 기구에는 가압멸균처리할 수 있는 물질이 들어 있을 수 있다.
또 다른 국면에서 볼 때, 본 문서는 조직 검체로부터 세포가 풍부한 기질을 고립시키기 위한 자동화된 조직 처리 장치가 특징이다. 자동화된 조직 처리 장치에는 2개 이상의 공동으로 구성되어 있는 제거가능한 회전 기구가 들어 있는 여기에서, 각 공동은 공동 내 조직채취 용기를 삽입하여 분리될 수 있도록 구성된다. 자동화된 조직 처리 장치에는 온도조절장치가 포함될 수 있다. 자동화된 조직 처리 장치는 가속 관련하여 2개 이상의 중단-개시 간격을 갖도록 구성할 수 있다. 제거가능한 회전 기구는 자동화된 조직 처리 장치가 제거가능한 회전 기구를 식별할 수 있도록 해 주는 1개 이상의 사전결정된 사양 (specification) 을 가질 수 있다.
또 다른 국면에서 볼 때, 원심력 하에서 2개 이상의 연속된 신속한 가속 및 감속 단계를 수행하기 위해 사용하기 위하여 개조된 원심분리가 제공된다. 그러한 단계는 세포외 기질의 악화와 세포방출을 강화하기 위하여 하나 이상의 효소 (예컨대, 교원질 분해 효소 및 중성 단백질 분해 효소) 가 존재하는 상황에서 열적으로 규제된 환경 (예컨대, 35 ~ 42 ℃) 에서 수행할 수 있다. 세포외 기질로부터 방출된 세포를 회수하기 위하여 원심분리를 사용할 수 있다. 혈관을 가지고 있는 인간이나 동물조직을 처리하기 위하여 여기서 설명된 방법과 기구를 사용할 수 있다. 방법과 기구는 특히 혈관이 풍부하고 대상으로부터 회수가 용이한 지방 조직 (예컨대, 피하 또는 복강 내의 지방 조직) 으로부터의 세포회수에 유용하다.
본 문서는 조직으로부터의 세포회수를 위한 방법도 제공한다. 본 방법에는 원심분리에 적합한 용기에 들어 있는 조직 검체, 수성 유체 내의 조직 조각들의 현탁액을 포함한 조직 검체를 제공하고; 원심력을 사용하여 조직 검체를 복수의 가속 및 감속 단계에 놓는 과정이 포함된다. 조직 검체에는 인간 또는 동물 조직이 포함되며 혈관이 들어 있을 수 있다. 조직 검체는 지질흡인물과 같은 지방 조직일 수 있다. 본 방법에는 용기 내에 26 ~ 42 ℃ 의 온도를 유지하면서 조직 검체를 복수의 가속 및 감속 단계에 놓는 과정이 포함된다. 조직 검체는 하나 이상의 효소 (예컨대, 교원질 분해 효소, 다른 단백질 분해 효소, 또는 그 혼합물) 의 존재 하에서 복수의 가속 및 감속 단계에 놓일 수 있다.
일 실시형태에서, 각각의 가속 단계는 5 ~ 20 초간 수행되고, 각각의 감속 단계는 3 ~ 20 초간 수행될 수 있다. 조직 검체는 5 ~ 180 분 (예컨대, 20 ~ 60 분) 간 여러 차례의 가속 및 감속 단계에 놓일 수 있다. 일 실시형태에서, 조직 검체는 30 분간 분당 200xg의 가속 및 1xg의 감속 사이클을 3회 이상 거치게 된다.
또 다른 국면에서 볼 때, 본 문서는 조직으로부터의 세포회수방법이 특징이다. 본 방법에는 원심분리에 적합한 용기에 들어 있는 조직 검체, 수성 유체 내의 조직 조각들의 현탁액을 포함한 조직 검체를 제공하고; 회전요소를 통하여 적용되는 원심력을 사용하여 조직 검체를 복수의 가속 및 감속 단계에 놓는 과정이 포함되는 여기에서, 회전요소는 축 및 그 축으로부터 연장되는 하나 이상의 암을 포함하며, (i) 하나 이상의 암은 축이 회전할 때 하나 이상의 암이 축에 대해 위쪽으로 그리고 바깥쪽으로 흔들리도록 축으로부터 지지되거나, 또는 (ⅱ) 하나 이상의 암이 고정각으로 지지되고, 암에 부착된 용기는 물질에 대한 중력이 적용된 원심력에 반대되게 하는 위치에 유지되고, 적용된 원심력은 대략 50 g ~ 대략 4000 g 이다. 각 가속단계는 5 ~ 20 초간 수행된다. 각 감속단계는 3 ~ 20 초간 수행된다. 조직 검체는 5 ~ 180 분 (예컨대, 20 ~ 60 분) 간 복수의 가속 및 감속 단계에 놓일 수 있다. 일 실시형태에서, 조직 검체는 30 분간 분당 200xg의 가속 및 1xg의 감속 사이클을 3회 이상 거치게 된다.
본 문서는 조직으로부터의 재생 세포의 회수를 위한 방법이라는 특징도 가지고 있다. 본 방법에는 원심분리에 적합한 용기에 들어 있는 조직 검체, 수성 유체 내의 조직 조각들의 현탁액을 포함한 조직 검체를 제공하고; 원심력을 사용하여 검체를 복수의 가속 및 감속 단계에 놓으며 세포 요소를 격리하기 위해 400 ~ 4000xg 에서 검체를 원심분리하는 과정이 포함된다. 400 ~ 4000xg 에서 원심분리할 경우, 검체는 가늘고 긴 원통형 중앙부; 중앙부와 일체로 형성되는 제 1 단부; 그리고 중앙부와 일체로 형성되는 제 2 개방 단부를 포함하는 용기 내에 담길 수 있는 여기에서, 제 1 단부는 좁은 개구부로 좁혀지고, 좁은 개구부 끝으로부터 돌출된 채취부로 구성되며 채취부는 액체를 접수 및 보관할 수 있고 채취부로부터 제 1 단부를 밀봉하기 위한 탈착식 플러그를 포함한다.
여기서 기술된 모든 방법들에서는, 용기에 다공성 삽입물이 들어 있을 수 있는 여기에서, 다공성 삽입물은 생체에 적합한 물질로 구성되고 0.5 ~ 5 ㎜ 의 범위의 기공 규격을 가지며, 다공성 삽입물은 조직 검체가 전술한 복수의 가속 및 감속 단계에 놓일 경우 조직 검체의 세포외 기질로부터 세포의 분리를 강화한다. 다공성 삽입물은 형태에 있어서 실질적인 원통형, 반전된 실질적인 원뿔형일 수 있으며 또는 용기를 상하부로 양분할 수 있다.
여기서 기술된 모든 방법들에서는, 용기에 복수의 입자가 포함되는 여기에서, 입자들은 최소 100㎛의 직경을 가지고 복수의 생체에 적합한 물질들로 구성되며, 입자들은 조직 검체가 전술한 복수의 가속 및 감속 단계에 놓일 경우 조직 검체의 세포외 기질로부터 세포의 분리를 강화한다. 복수의 입자에는 다양한 비중이나 형태를 가진 입자들이 포함될 수 있다.
여기서 기술된 모든 방법들에서는, 용기 내부에 용기의 체내 루멘 내에 수직으로 배치되는 축, 축의 길이방향을 따라 배치되고 축으로부터 용기의 루멘 내부로 실질적인 방사상으로 확장하는 하나 이상의 암을 포함하는 축이 포함될 수 있는 여기에서, 조직 검체가 전술한 복수의 가속 및 감속 단계에 놓일 경우 암은 조직 검체의 세포외 기질로부터 세포의 분리를 강화한다. 암은 다양한 형태나 규격을 가질 수 있다. 용기에는 탈착식 뚜껑이 포함될 수 있는 여기에서, 축은 탈착식 뚜껑에 부착된다. 축은 용기에 부착되어 회전할 수 있다. 축은 용기의 루멘 내에서 이동가능하다.
또 다른 국면에서 볼 때, 본 문서는 가늘고 긴 원통형 중앙부; 중앙부와 일체로 형성되는 제 1 단부; 중앙부와 일체로 형성되는 제 2 개방 단부; 그리고 가늘고 긴 원통형 부분으로부터 방사상으로 외부로 확장되는 포트를 포함하는 용기나 용기 조립품이 특징인 여기에서, 제 1 단부는 좁은 개구부로 좁혀지고, 좁은 개구부에 있는 끝 부분으로부터 돌출된 채취부가 포함되며, 채취부는 유체를 받아들이고 저장할 수 있으며 채취부로부터 제 1 단부를 밀봉하기 위한 탈착식 플러그로 구성된다. 탈착식 플러그는 원심력, 압력, 효소나 물리적 제거에 의한 분리를 통해서 단부에서 채취부 쪽으로 유체가 흘러가도록 해 준다. 채취부는 제 1 단부로부터 분리할 수 있다. 채취부에는 수성 유체가 포함될 수 있다. 제 2 개방 단부에는 켤레부 (mating portion) 가 포함된다.
본 문서는 1차 용기를 2차 용기에 물리기 위해 적용되는 1차 용기; 2차 용기; 연결장치를 포함하는 용기 조립품이 특징이다. 1차 용기는 상기에 언급되어 있다. 2차 용기에는 가늘고 긴 원통형 중앙부, 중앙부와 함께 일체로 형성된 폐쇄 단부, 중앙부와 함께 일체로 형성된 개방 단부가 포함되는 여기에서, 2차 용기의 개방단 부분은 켤레부; 제 1 및 제 2 개방 단부와 함께 튜브형 중앙부를 구성하는 연결장치, 그리고 연결장치를 건너서 수평으로 확장되는 다공성 삽입물로 구성되고, 연결장치의 각 개방단은 켤레부로 구성되며, 다공성 삽입물은 40 ~ 500 ㎛ 규격의 기공을 가지고 있다. 나아가, 연결장치에는 튜브형 중앙부의 외부로 방사상으로 확장하는 포트가 들어 있는 여기에서, 연결장치의 한 켤례부는 1차 용기의 켤레부에 부착되며 연결장치의 다른 켤레부는 2차 용기의 켤레부에 부착된다. 포트에는 다공성 삽입물이 포함될 수 있다.
1차 및 2차 용기는 사전조립될 수 있고, 1차 및 2차 용기에 의해 정의되는 내부 공간은 적어도 부분적으로 진공상태이다.
본 문서는 체내 루멘을 정의하는 가늘고 긴 원통형 중앙부를 포함하는 용기; 중앙부와 일체로 형성되는 제 1 단부; 중앙부와 일체로 형성되는 제 2 개방 단부; 체내 루멘에 수직으로 배치되는 축; 축의 길이방향을 따라서 배치되고 축으로부터 실질적인 방사방향으로 체내 루멘 내부로 확장되는 하나 이상의 암이 특징이다. 하나 이상의 암은 다양한 형태나 규격을 가질 수 있다. 나아가, 용기에는 제 2 개방 단부에 부착되는 탈착식 뚜껑이 포함될 수 있는 여기에서, 축은 탈착식 뚜껑에 고정된다. 축은 용기에 고정되어 회전가능하다. 축은 용기의 루멘 내에서 이동가능하다.
또 다른 국면에서 볼 때, 본 문서는 여기서 서술한 모든 용기나 용기 조립품을 포함하는 키트가 특징이다. 나아가 키트에는 하나 이상의 세포 분리시약이 들어 있다.
또 다른 국면에서 볼 때, 본 문서는 환자에 대한 재적용을 위한 세포가 풍부한 기질을 회수하기 위한 목표에 의해 처리된 지질흡인물 내의 세포 내용물을 증가시키기 위한 방법이 특징이며, 본 방법에는 1 ~ 5 ㎜ 의 범위 내에 있는 정의된 직경을 가진 오리피스를 통한 지질흡인물 압출과 뒤이어 압출된 지질흡인물을 최소 5 분간의 연속적인 원심분리 단계 및 최소 400xg 의 관성력을 적용하는 과정이 포함되어 있다. 원심분리 단계에는 최대 2000xg의 원심력을 포함할 수 있다. 원심분리 단계에는 약 1200xg의 원심력을 적용할 수 있다. 조직 검체에는 지질흡인물, 지방 조직 및 이들의 조합이 포함될 수 있다. 원심분리는 고정각의 수평 회전자를 이용해서 행해질 수 있다.
또 다른 국면에서 볼 때, 본 문서는 원심분리기 내부의 단백질 분해 효소의 존재에 있어서 가속 및 감속 조직을 구성하고 있는 지방조직으로부터 재생 세포를 용이하고 회수해서 조직용 용기를 반전시키는 방법이 특징이다. 원심분리기 내부의 온도는 제어할 수 있다. 가속 및 감속의 분당 1 이상의 사이클이 조직에 적용될 수 있다. 단백질 분해 효소는 교원질 분해 효소, 중성 단백질 분해 효소 또는 양자 모두가 될 수 있다. 교원질 분해 효소와 중성 단백질 분해 효소의 조합은 지방 조직으로부터 재생 세포의 용이한 회수를 위한 반전된 회전자 내부의 온도증가와 원심 가속 및 감속에 의한 교반과 함께 사용할 수 있다.
본 문서는 또한 세포가 풍부한 기질을 공급; 원심분리기 내의 단백질 분해 효소의 존재에 있어서 세포가 풍부한 기질을 가속 및 감속해서 구성되는 지방 조직으로부터 재생 세포를 비용효과적으로 회수하고, 그에 따라 조직용 용기를 반전시키는 방법이 특징이다. 원심분리기 내부의 온도는 제어할 수 있다. 가속 및 감속의 분당 1 이상의 사이클을 세포가 풍부한 기질에 적용할 수 있다. 교원질 분해 효소와 중성 단백질 분해 효소의 조합은 세포가 풍부한 기질로부터 재생 세포의 용이한 회수를 위한 반전된 회전자 내의 원심 가속 및 감속에 의한 증가된 온도와 교반을 통해 함께 사용할 수 있다.
본 문서는 또한 재생 세포 준비와 함께 여기에 기술된 대로 준비고 환자에 대한 주사를 위해 여기에 기술된 바와 같이 함께 준비된 세포가 풍부한 기질을 포함하는 구성이 특징이다.
또 다른 국면에서 볼 때, 본 문서는 2개 이상의 공동으로 구성되는 제거가능한 회전 기구로 구성되고 각 공동은 공동 내에 조직채취 용기를 삽입하여 분리될 수 있도록 구성되는 여기에서, 제거가능한 회전 기구는 세포가 풍부한 기질을 조직 검체로부터 분리하기 위한 자동화된 조직 처리 장치 내에서 회전하도록 구성되어 있는 점이 특징이다. 제거가능한 회전 기구는 몸체에 부착된 무선 주파수 식별(RFID) 태그로 구성되어 제거가능한 회전 기구가 자동화된 조직 처리 장치에 의해 식별될 수 있도록 해 준다. 제거가능한 회전 기구에는 가압멸균처리할 수 있는 물질이 들어 있을 수 있다.
본 문서는 또한 세포가 풍부한 기질을 조직 검체로부터 분리하기 위한 자동화된 조직 처리 장치가 특징이고, 자동화된 조직 처리 장치는 2개 이상의 공동으로 구성되는 제거가능한 회전 기구로 구성되며 각 공동은 공동 내에 조직채취 용기를 삽입하도록 구성된다. 자동화된 조직 처리 장치는 온도조절장치로 구성된다. 제거가능한 회전 기구는 자동화된 조직 처리 장치가 제거가능한 회전 기구를 식별하도록 적어도 하나의 사전결정된 사양을 가진다.
또 다른 국면에서 볼 때, 본 문서는 지방 조직으로부터 세포를 회수하기 위한 방법이 특징이다. 본 방법에는 소공을 통한 압출 지질흡인물; 세포가 풍부한 기질을 생산하기 위한 압출된 지질흡인물의 원심분리; 그리고 세포가 풍부한 기질로부터 재생 세포를 회수하기 위해 원심력을 사용하여 세포가 풍부한 기질을 복수의 가속 및 감속 단계에 놓이게 하는 과정들이 포함된다. 나아가, 본 방법에는 용기 내부에 26 ~ 42 ℃ 의 온도를 유지하는 여기에서, 조직 검체를 복수의 가속 및 감속 단계에 놓는 과정들이 포함된다. 조직 검체는 하나 이상의 효소 (예컨대, 교원질 분해 효소, 다른 단백질 분해 효소 또는 그 혼합물) 의 존재에 있어서 복수의 가속 및 감속 단계에 놓일 수 있다.
또 다른 국면에서 볼 때, 본 문서는 조직으로부터 세포를 회수하기 위한 방법이 특징이다. 본 방법에는 원심분리에 적용되는 용기 내에 담긴 조직 검체, 수성 유체 내의 조직 조각들의 현탁액을 구성하고 있는 조직 검체를 공급하고; 검체들이 회전요소를 통하여 적용된 원심력을 사용해서 복수의 가속 및 감속 단계에 놓이는 과정이 포함되고, 회전요소는 축 및 그 축으로부터 연장되는 하나 이상의 암을 포함하고, (i) 하나 이상의 암은 축이 회전할 때 하나 이상의 암이 축에 대해 위쪽으로 그리고 바깥쪽으로 흔들리도록 축으로부터 지지되거나, 또는 (ⅱ) 하나 이상의 암은 고정각으로 지지되고, 상기 암에 부착된 용기가 물질에 대한 중력이 적용된 원심력에 반대되게 하는 위치에 유지되며, 적용된 원심력은 약 50g ~ 약 4000 g 이다. 검체온도는 32 ~ 42 ℃ 에서 유지된다. 나아가 조직 검체에는 하나 이상의 단백질 분해 효소가 포함될 수 있다.
별도의 정의가 없는 한, 여기서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 예술에 있어서의 통상적인 기술들 중의 하나에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 비록 여기에 기술된 것과 유사하거나 동일한 방법과 물질들을 현실에 사용하고 현재 발명을 시험할 수 있다 하더라도, 예외적인 방법과 물질들이 아래와 같이 나와 있다. 모든 공보, 특허 출원, 특허, Genbank® Accession Nos 및 여기에 언급된 다른 기준들은 그 전체로써 인용된다. 분쟁시에는, 정의를 포함하여 본 출원이 우선한다. 물질, 방법 및 실시예들은 예시일 뿐이며 해석을 제한하려는 의도가 없다.
본 발명의 다른 특징들과 장점들은 다음의 상세한 설명과 청구항에서 자세히 다루고 있다.
도 1 은 여기에 언급된 구조에 따라서 조직 검체로부터 세포의 해리, 분리, 회수를 위한 기구의 투시도이다.
도 2 는 분리 단계와 그 조합 중의 다양한 시간과 에너지 사이클의 그래프이다.
도 3a ~ 3e 는 다양한 원심분리용 용기의 투시도이다.
도 4 는 여기에 서술된 하나의 구조에 따른 용기 조립품의 투시도이다.
도 5 는 도 1 의 기구에 대한 1가지 구조의 측면 단면도이다.
도 6 은 도 1 의 기구구조를 사용해서 처리 또는 진탕 배양기에 의한 처리 후에 얻어지는 수많은 부착 세포에 대한 막대 그래프이다.
도 7 은 도 1 의 기구구조와 도 3a, 3d 또는 3e 의 용기를 사용해서 처리 또는 진탕 배양기에 의한 처리 후에 얻어지는 수많은 부착 세포에 대한 막대 그래프이다.
도 8 은 자동화된 조직 처리 장치에 삽입가능한 제거가능한 회전 기구의 평면도이다.
도 9 는 자동화된 조직 처리 장치에 삽입가능한 제거가능한 회전 기구의 측면도이다.
도 10 은 다음과 같이 처리된 지방 조직으로부터 얻어지는 수많은 인접 조직의 g당 세포수에 대한 그래프이다.
도 11 은 압출되지 않은, 유화제 바늘(SS 압출된)에 의해 압출된 또는 Luer 압출되고 이후 원심분리되지 않거나 1200xg의 힘으로 원심분리된 지방 조직으로부터 얻어지는 수많은 조직의 g당 세포수에 대한 그래프이다. 압출의 경우, 조직은 주사기를 사용한 압출 장치에 대해 5 x의 속도로 조직이 통과되었다.
도 12 는 5, 10 또는 20 분간의 원심분리 후에 지방 조직으로부터 수많은 인접 조직의 g당 세포수에 대한 그래프이다.
도 13 은 무원심분리 또는 400xg에서 30 분간 또는 1200xg에서 30 분간 원심분리한 후에 지방 조직으로부터 얻어지는 수많은 인접 조직의 g당 세포수에 대한 그래프이다.
도 14 는 식피술을 위한 조직 준비에 있어서 지방에 의해 만들어진 재생 세포 (ADRC) 의 농도를 증가시키기 위한 방법을 보여주고 있다. 조직은 세포가 풍부한 기질 (CEM) 내의 ADRC를 농축하기 위해 1차 처리된다. CEM의 절반은 처리되어 고립된 ADRC를 생산한 다음 잔여 CEM과 결합하여 이식에 있어서의 ADRC의 농도를 높여준다.
도 15 는 ADRC를 얻기 위하여 지방 조직이나 지질흡인물의 처리에 효소와 1회용 활용의 효율성을 증대시키기 위한 방법을 보여주고 있다. 조직은 CEM내의 ADRC를 농축하기 위해 1차 처리된 후에 결합 및 처리되어 ADRC를 생산한다.
다양한 도면에서의 유사 참조부호는 유사 요소를 가리킨다.
일반적으로, 본 문서는 개, 고양이, 말, 소, 양 또는 돼지 조직과 같은 인간 및 동물 조직을 포함하여 조직으로부터 세포를 회수하기 위한 방법과 기구에 기초한다. 여기에 기술된 방법과 기구는 흡입식, 증기식 또는 초음파식 지방흡입술 및 이들의 조합을 포함하여 예를 들면, 지방흡입술 (즉, 지질흡인물) 로부터 얻어진 지방 조직으로부터 세포를 회수하는 데에 특히 유용하다. 예를 들면, 여기에 기술된 방법과 기구들은 줄기세포, 간세포, 조혈 세포를 격리하거나 세포를 지방 조직과 완전히 분리하는 데에 사용할 수 있다.
여기에서 기술한 방법과 기구들은 환자에 대한 투여 (예컨대, 자가 투여) 를 위한 세포 구성을 준비하기 위하여 현장에서 사용할 수 있다. 예를 들면, 여기에서 기술한 방법과 기구들은 환자로부터 재생 세포를 회수하기 위해 사용될 수 있는데, 이는 투여를 위해 준비하고 세포가 회수된 환자에게 재투여 (예컨대, 주사 또는 수술에 의해 이식) 될 수 있는 재생 플랫폼으로 여기에서 명명되어 있다. 일부 실시형태에서, 세포는 예를 들면, 피하, 정맥내, 근육내 또는 복강내 기술에 의해 수혈자에게 주사하기 위한 주사기와 같은 전달장치에 적재할 수 있다. 예를 들면, 재생 세포는 침투성 또는 국소 전달을 위해 혈관, 조직 (예컨대, 심근 또는 골격근), 피부(피하), 조직 공간 (예컨대, 심막이나 복막) 또는 다른 위치로 주사될 수 있다. 재생 플랫폼을 주사할 경우 주사부위 인근의 혈관들이 증대, 수리, 염증감소, 통증감소 및 그 조합현상들이 발생할 수 있다. 일부 실시형태에서, 복수의 첨가물들이 투여 전에 세포에 첨가된다. 예를 들면, 세포는 다른 세포, 생물학적으로 활성화된 화합물, 생물학적으로 불활성인 화합물, 탈염된 골, 기질 또는 다른 재흡수성 비계, 복수의 성장 인자 또는 세포 인구의 전달, 효험, 내성 또는 기능을 개선할 수 있는 다른 첨가물과 혼합될 수 있다.
본 방법과 기구들은 성장 연구, 유전자표현 연구, 구별 연구 또는 다른 연구 목적를 위한 세포 구성을 준비하는 데에도 사용할 수 있다. 또한, 여기에서 기술한 방법과 기구들은 예를 들면, 적정 매체로 세포를 저온보존함으로써 세포를 적재할 수 있는 바와 마찬가지로 재생 세포 인구 (예컨대, 줄기세포) 를 회수하는 데에 사용할 수 있다. 보다 자세한 사항은, 미국 특허 출원 공보 20100285588-A1 참조.
일 실시형태에서, 여기에서 기술한 방법들은 조직의 세포외 기질로부터 세포 (예컨대, 줄기나 간세포와 같은 재생 세포들) 들을 보다 많이 분리하기 위해 원심력 하에서 복수의, 즉, 2개 이상의, 가속 및 감속 단계를 사용한다. 원심력 하에서의 하나의 가속 및 감속 단계는 원심분리의 1가지 차례로서 언급할 수 있다. 일부 실시형태에서는, 다음 여러 가지 항목들도 세포회수를 강화하기 위해 사용할 수 있습니다: 기계적 분출, 기계적 교반, 실온 (>26 ℃) 이상 및 42 ℃ (예컨대, 약 37 ℃ ~ 40 ℃) 이하로 온도 유지하기, 조직을 분해하기 위하여 효소를 사용 밀도, 비중, 용해도와 같은 물리적 특성들에 기초하여 조직의 다양한 요소를 분리하기. 일부 실시형태에서, 조직은 원심력 하에서 2가지 가속 및 감속 단계에 놓이기 전에 기계적으로 분출 (예컨대, 압출에 의해) 된다. 일부 실시형태에서, 조직의 기계적 분출 후에, 3가지 일반 층 (즉, 수성 층, 재생 플랫폼이 들어 있는 세포가 풍부한 기질 및 지방질 층) 으로 조직을 분리하기 위해 원심력 하에서 1차 가속 및 감속 단계가 수행된다. 세포가 풍부한 기질은 제거 및 원심력 하에서 2차 가속 및 감속 단계에 놓일 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포가 풍부한 기질이 2차 가속 및 감속 단계에 놓이기 전에 복수의 효소 (예컨대, 단백질 분해 효소) 들이 세포가 풍부한 기질에 첨가된다. 그러한 과정은 소량의 효소가 조직처리에 필요한 것과 마찬가지로 검체 체적을 줄여 준다. 일부 실시형태에서, 세포가 풍부한 기질 부분은 원심력 하에서 2차 가속 및 감속 단계에 놓이게 되며, 재생 세포들이 세포 펠릿으로부터 분리된다. 이제 세포가 풍부한 기질로부터 분리된 세포는 추가 원심분리의 대상이 아니었던 세포가 풍부한 기질과 결합될 수 있다.
하기와 같이 반전된 위치에서 또는 회전하는 버킷 구성으로 구성될 수 있는 가변구조형 원심분리 회전자를 사용하면 여기에서 기술한 방법에 특히 유용하다. 반전된 구성에 있어서, 원심력은 내용물을 외측, 즉 검체 용기의 상부로 몰아내며, 이후 이들 내용물은 내부, 즉 검체 용기의 하부로 복귀하여 안정화된다. 따라서, 가속 및 감속 반복 사이클에 의해, 반전된 회전자는 중력은 있지만 가속력은 없는 상태로 안정화되며, 용기 내용물은 고정되고 원심분리기의 중심과 축을 향해서 이동하는 반면에 가속력에 의해, 내용물이 원심력을 따라서 외부로 향하는 방식으로 검체의 교반장치를 제공한다. 여기에서 기술한 대로, 조직이 단백질 분해 효소 용액과 결합하고 반전된 위치에서 가변구조형 회전자 내의 용기에 놓일 경우, 가속 및 감속의 반복 사이클은 조직의 효소분리를 용이하게 해 준다. 가변구조형 회전자가 전형적인 회전식 버킷 회전자 구성으로 구성되지만 바닥에 있는 검체 용기의 내용물은 농축되고 따라서 감소된다.
재생 세포의 회수를 현저하게 개선하고 작동중인 극장에서 여기에서 기술한 방법의 현장 적용기간을 단축하기 위해, 35 ~ 42 ℃ (예컨대, 40 ℃) 로 가속 및 감속의 반복 사이클 중에 원심분리기 내의 주변온도를 증가시키면 실온에 비해서 효소분리속도를 수배나 증가시켜 준다.
여기에서 기술한 방법과 기구들은 원심력 하에서 복수의 가속 및 감속 단계가 활용되는 다른 방법과 관련하여 조직 검체로부터 회수되는 세포의 생산량을 증가시켜 준다. 여기에서 기술한 방법과 기구들을 사용하여 회수되는 세포의 생산량 증가는 세포외 기질로부터 더 많은 생균 줄기세포가 방출되도록 하는 데에는 부족하다고 언급한 Kurita 등의 발견, Plast. Reconst. Surg., 121 : 1033-1041 (2008)의 관점에서 볼 때 놀랄 만한 일이다.
도 1은 벽 (2) (예컨대, 금속재 벽) 에 의해 분리되어 전형적으로 직경이 20 ~ 40 ㎝ 인 내부 용기 (4) 를 생성하는 내실을 가지고 있는 1개의 원심분리구조에 대한 투시도이다. 전형적으로, 내부 용기 (4) 의 직경은 세포준비에 사용되는 용기규격에 좌우된다. 내부 용기 (4) 내부에는 축 (6) 을 돌리기 위해 모터 (8) 에 의해 구동되는 축 (6) 이 들어 있다. 모터 (8) 는 전형적으로 내부 용기 (4) 아래에 놓여 있다. 제어기 (10) 는 모터 (8) 의 전원을 공급/차단할 수 있으며 아래와 같이 내부 용기 (4) 내부의 온도를 조절하는 데에도 사용할 수 있다. 모터 (8) 는 축 (6) 을 통해서 회전자 (12) 를 돌리는데 이 회전자에는 회전자 암 (14) 과 확고한 연계를 통해서 용기 (16) 를 인수하고 잡을 수 있는 능력을 가진 2개 이상의 (묘사한 바와 같이) 암이 부착된다. 일 실시형태에서, 회전자 암 (14) 은 축 (6) 을 통해 모터 (8) 에 의해 부여되는 원심력에 기초해서 상하로 회전할 수 있으며 특히 속도에 따라서 특정 관성력 (예컨대, 20 ~ 30 g) 이 축 (6) 의 rpm 에 의해 초과된 경우에 수직 위치에서 완전한 90도 위치로 그 위치를 변경한다. 도 5 에서 묘사한 바와 같이 또 다른 구조에서는, 회전자 암 (14) 이 고정각 Θ (예컨대, 1 ~ 90 도 범위의 각도) 로 설정된다. 예를 들면, 각도 Θ는 12 도로 고정할 수 있다. 그러한 실시형태에서는, 용기 (16) 를 탈착식 뚜껑이 부착된 용기 (16) 의 상부가 축 (6) 에 의해 중심 인근으로 방향이 설정되는 반전된 방향으로 회전자 암 (14) 에 부착할 수 있다.
일부 실시형태에서, 내부 용기 (4) 의 온도는 내부 용기 범위, 예를 들면, 26 ~ 42 ℃, 30 ~ 42 ℃, 35 ~ 42 ℃, 35 ~ 40 ℃, 37 ~ 40 ℃ 또는 37 ℃ 의 온도로서 규제될 수 있다. 온도는 알려진 방법, 특히, 폐쇄 루프의 열적 피드백 규정에 의해 규제될 수 있다. 일 실시형태에서, 전기저항 와이어 (도 1에 도시 안 됨) 는 예를 들면 케이블을 통한 전기연결을 통해 내부 용기를 워밍업하기 위해 내부 용기 (4) 주변에 포장해 두거나 안에 매립될 수 있다. 그러한 와이어는 가열패드의 일부분 또는 유동형 중합체 안에 매립될 수 있다. 온도를 일정하게 유지하려면, 제어기 (10) 에 사용가능하도록 연계된 온도 탐침 (18) 은 내부 용기 (4) 내의 온도감지에 사용되고 제어기 (10) 를 통해서 내부 용기 (4) 내의 온도를 조절할 수 있다. 본 범위 이하의 온도에서는 분리과정이 지연되고 42 ℃ 이상의 온도에서는 세포가 파괴될 수 있으므로 복수의 효소를 사용할 때에는 35 ~ 42 ℃ 에서 온도를 유지하는 것이 특히 중요하다.
제어기 (10) 는 예를 들면, 가속 및 감속 단계를 제어하고 모터 (8) 를 기동 및 정지시키며 온도를 통제하도록 프로그래밍할 수 있다. 제어기 (10) 는 전원 (예컨대, 플러그나 케이블을 통해서) 에 연결된다.
제어기 (10) 는 50xg 과 4,000xg 사이의 관성력을 얻기 위해 용기 (16) 를 가속하고 단기간 그 관성력을 유지하며 단기간에 용기 (16) 를 1xg 으로 감속하도록 프로그래밍할 수 있다. 가속/감속 단계의 반복사이클은 5 ~ 180 분 (예컨대, 5 ~ 120 분, 10 ~ 100 분, 20 ~ 60 분, 25 ~ 50 분, 30 ~ 45 분, 약 30 분 또는 약 45 분) 의 시간별로 적용될 수 있다. 예를 들면, 각 가속 단계는 5 ~ 20 초간 수행되며 각 감속 단계는 3 ~ 20 초간 수행될 수 있다. 일 실시형태에서, 각각 최소 3 개의 200xg 의 가속 사이클과 분당 1xg 의 감속 사이클이 30 분간 수행될 수 있다.
도 2는 도 1과 같이 용기 (8) 에 담겨 있는 조직 검체 내의 세포외 기질로부터 세포의 분리를 강화하기 위해 사용할 수 있다. 도 2와 같이 다양한 패턴들이 단속적인 켜기/끄기 그리고 특정 관성력이 장기간에 걸쳐 유지되는 특정 가속도와 같은 방법으로 결합될 수 있다.
도 3a ~ 3e는 용기들을 묘사하고 있는데, 이 용기들은 도 1, 6에서와 같이 용기 (16) 의 예외적인 구조들이다. 도 3a ~ 3e의 용기들은 원심분리 (예컨대, 도 1이나 도 6에 묘사된 원심분리) 용이다. 이 용기들에는 도 1의 원심분리기 (1) 에 의해 전달되는 원심력과 같은 원심력 하에서 용기들이 복수의 가속 및 감속 단계에 놓일 경우에 조직의 세포외 기질로부터 세포의 분리를 도와줄 수 있는 삽입물들이 들어 있다. 도 3a ~ 3e 각각에는, 용기 (300) 는 가늘고 긴 원통형 중앙부 (302), 중앙부와 일체로 형성되는 폐쇄 단부 (304), 내부 루멘 (308) 을 정의하는 중앙부에 의해 완전히 형성되는 개방 단부 (306) 를 포함한다. 폐쇄 단부 (304) 는 실질적으로 평평하거나, 둥글거나, 반구형, 원뿔형 또는 다른 적정한 형태일 수 있다. 일부 실시형태에서, 용기 (300) 는 대략 10 ~ 12 ㎝ 의 길이를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 용기 (300) 는 대략 50 ~ 60 ㎖ 의 체적을 가질 수 있다.
개방 단부 (306) 에는 탈착식 마개 (312) 를 받아들이도록 형성되는 켤레부 (310) (예컨대, 나사진 부분) 가 들어 있다. 켤레부 (310) 에 부착될 경우, 탈착식 마개 (312) 는 실질적으로 용기 (300) 의 내부 루멘 (308) 을 폐쇄하고 밀봉한다. 일부 실행에 있어서, 마개 (312) 는 용기가 반대로 밀봉되도록 나사, 마찰 (예컨대, 스냅식 마개), 클램핑, 자력, 진공 밀봉재 또는 다른 적정 메커니즘에 의해 개방단에 부착할 수 있다.
도 3a 에서, 용기 (300) 에는 반전된 실질적으로 원뿔형인 삽입물 (320) 이 들어 있다. 원뿔형인 삽입물 (320) 은 내부 루멘 (308) 내에서 반전된 오목한 원뿔형태이다. 반전된 실질적으로 원뿔형의 삽입물 (320) 은 가늘고 긴 원통형 중앙부 (302) 와 꼭지점 (324) 근부로부터 폐쇄 단부 (304) 및 베이스 (326) 근부 개방 단부 (308) 로 확장되는 원뿔형 측벽 (322) 과 실질적으로 동축상에 있다.
반전된 실질적으로 원뿔형인 삽입물 (320) 은 생체에 적합한 물질로 구성되고 다공성이다. 생체에 적합한 물질의 무제한 실시예에는 폴리아미드 (예컨대, 나일론); 폴리카프로락톤과 같은 폴리에스테르; 폴리스티렌; 폴리프로필렌; 폴리아크릴레이트; 폴리비닐 화합물; 폴리카보네이트; 폴리에텔에텔케톤 (PEEK) 과 같은 폴리케톤; 폴리테트라플루오로에틸렌 (PTFE, 테플론); 써마녹스; 니트로셀룰로스; 폴리 (오르소에테르); 폴리우레탄; 스텐레스강; 티타늄; 또는 티타니아 (이산화티탄) 등이 포함된다. 삽입물들의 기공 규격은 0.5 ㎜ ~ 5 ㎜ (예컨대, 0.7 ~ 1.5 ㎜, 0.7 ~ 1.2 ㎜, 0.9 ~ 1.1 ㎜, 0.9 ~ 1.5 ㎜, 0.9 ㎜ ~ 2.0 ㎜, 1 ~ 3 ㎜, 2 ~ 4 ㎜, 3 ~ 5 ㎜) 의 범위에 있다. 일부 실시형태에서, 반전된 실질적으로 원뿔형인 측벽 (322) 은 스크린, 격자, 그물망, 네트, 다공판 또는 다른 적정 생체에 적합한 다공성 기질일 수 있다. 일부 실시형태에서, 반전된 실질적으로 원뿔형인 삽입물은 1㎜의 기공을 가진 그물망일 수 있다.
원뿔형인 삽입물 (230) 의 베이스 (322) 는 개방단 (308) 에 있는 가늘고 긴 원통형 부분 (302) 의 직경과 실질적으로 동일한 직경을 가지고 있다. 마찬가지로, 원뿔형인 삽입물 (320) 은 베이스가 개방단 (306) 의 테두리에 닿을 때까지 개방단 (308) 을 통해서 내부 체적 (302) 에 삽입된다. 이제 마개 (312) 가 개방단 (306) 에 제거할 수 있게 고정되고 따라서 원뿔형인 삽입물 (320) 이 내부 루멘 (308) 내에서 실질적으로 중심을 잡고 부착된다. 일부 실시형태에서, 베이스 (326) 에는 개방단 (308) 에 부착하기 위해 사용할 수 있는 플랜지가 들어 있다. 베이스 (326) 는 마개 (312) 의 바닥면에 직접 고정될 수도 있다. 베이스 (326) 는 단부 (304) 에도 직접 고정될 수 있다.
사용시에는, 반전된 실질적으로 원뿔형인 삽입물 (320) 을 용기 (300) 에 삽입할 수 있다. 반전된 실질적으로 원뿔형인 삽입물 (320) 은 수성 유체 내의 조직 조각들의 현탁액을 함유하고 있는 조직 검체로 채워서 기공보다 작은 조직의 유체와 요소들이 원뿔형인 삽입물 (320) 을 통해 통과해서 원통형 측벽 (304) 및 폐쇄단 (306) 에 의해 포집될 수 있다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 단백질 분해 효소들 (예컨대, 유형 I, 유형 Ⅱ 교원질 분해 효소와 같은 복수의 교원질 분해 효소, 서몰리신, 트립신 또는 그 혼합물과 같은 중성 단백질 분해 효소) 을 용기 (300) 에 추가해서 조직 검체의 세포외 기질로부터 세포의 분리를 강화할 수 있다. 예를 들면, 유형 I 교원질 분해 효소, 유형 Ⅱ 교원질 분해 효소 및 디스파제를 사용해서 세포외 기질로부터 세포의 분리를 강화할 수 있다.
일단 적용되면 마개 (312) 는 내부 루멘 (308) 을 밀봉하며 실질적으로 해당 위치에 원뿔형인 삽입물 (320) 을 고정시킨다. 유체와 조직들은 복수의 가속 및 감속 단계에 의해 실질적으로 원뿔형인 삽입물 (320) 의 기공을 통해 몰려나가게 된다. 예를 들면, 실질적으로 원뿔형인 삽입물 (320) 내에 적재되는 조직 검체에 의해 용기 (300) 는 도 1의 원심분리기 (1) 의 회전자 암 (14) 에 부착될 수 있다. 이제 용기 (300) 는 도 1, 2의 설명과 같이 가속 및 감속할 수 있다. 가속 및 감속 사이클을 반복함으로써, 조직 검체는 삽입물의 기공을 통해 다양한 방향으로 몰려나간다. 본 과정은 기계적으로 조직을 파괴하여 세포외 기질로부터 세포의 방출을 강화한다.
도 3b 에서, 용기 (300) 에는 실질적으로 원통형인 삽입물 (340) 이 들어 있다. 실질적으로 원통형인 삽입물 (340) 은 내부 루멘 (308) 내에 원통형으로 형성된다. 원통형 삽입물 (340) 은 폐쇄 단부 (304) 로부터 개방 단부 (306) 로 확장되는 측벽 (344) 과 함께 가늘고 긴 원통형 중앙부 (302) 와 실질적으로 동축상에 있다. 실질적으로 원통형인 삽입물 (340) 은 생체에 적합한 물질로 구성되며 다공성이다. 적정 생체에 적합한 물질과 기공 규격의 실시예들은 위에서 다룬 바 있다.
사용시에, 실질적으로 원통형인 삽입물 (340) 은 용기 (300) 에 삽입할 수 있다. 실질적으로 원통형인 삽입물 (340) 은 수성 유체 내의 조직 조각들의 현탁액을 포함하고 있는 조직 검체로 채워서 기공보다 작은 조직의 유체와 요소들이 원통형인 삽입물 (340) 을 통해 통과해서 가늘고 긴 원통형 중앙부 (302) 와 폐쇄 단부 (304) 에 의해 포집되도록 할 수 있다. 복수의 효소들도 상기와 같이 용기에 첨가할 수 있다. 일단 적용되면 마개 (312) 는 내부 체적 (308) 을 밀봉하며 실질적으로 해당 위치에 원뿔형인 삽입물 (340) 을 고정시킨다. 이제 용기 (300) 는 도 1, 2의 설명과 같이 가속 및 감속할 수 있다. 가속 및 감속 사이클을 반복함으로써, 조직 검체는 삽입물의 기공을 통해 다양한 방향으로 몰려나간다. 본 과정은 기계적으로 조직을 파괴하여 세포외 기질로부터 세포의 방출을 강화한다.
도 3e 에서, 용기 (300) 에는 용기를 상하부로 양분하는 삽입물 (345) 이 들어 있다. 삽입물은 생체에 적합한 물질로 구성되며 다공성이다. 적정 생체에 적합한 물질과 기공 규격의 실시예는 앞에서 다룬 바 있다. 삽입물들은 예를 들면, 고무링을 사용해서 정위치에 고정할 수 있다. 사용시에는, 수성 유체 내에 조직 조각들의 현탁액을 함유하고 있는 조직 검체가 용기의 상하부에 적재되며 복수의 가속 및 감속 단계가 적용되어 세포외 기질로부터 세포의 분리를 강화한다. 복수의 효소는 조직 검체에도 첨가할 수 있다.
도 3c 와 관련하여, 용기 (300) 에는 내부 루멘 (308) 내에 복수의 입자 (350) 가 들어 있다. 펠릿의 직경은 적어도 100 ㎛ 이며 복수의 생체에 적합한 물질로 구성되거나 복수의 생체에 적합한 물질이 도포되어 있다. 생체에 적합한 물질의 비제한적인 예에는 폴리아미드 (예컨대, 나일론); 폴리카프로락톤과 같은 폴리에스테르; 폴리스티렌; 폴리프로필렌; 폴리아크릴레이트; 폴리비닐 화합물; 폴리카보네이트; PEEK와 같은 폴리케톤; PTFE; 써마녹스; 니트로셀룰로스; 폴리(오르소에테르); 폴리우레탄; 스텐레스강; 티타늄; 티타니아(이산화티탄); 및 유리를 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 입자 (350) 에는 다양한 비중, 형태 또는 표면 특징을 가진 입자들이 포함될 수 있다. 일 실시형태에서, 복수의 입자 (350) 에는 부드러운 폴리스티렌 목걸이와 주물도금이 포함된 입자들이 포함될 수 있다.
사용 중에는, 수성 유체 내에 조직 조각들의 현탁액을 함유하고 있는 조직 검체들과 입자 (350) 가 용기 (300) 에 적재되고 마개 (312) 로 밀봉된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 효소를 마개로 밀봉하기 전에 용기에 첨가한다. 이제 용기는 도 1의 원심분리기에 적재되고 복수의 가속 및 감속 단계에 놓이기 되며 결국 입자 (350) 가 교반되어 세포외 기질로부터 세포의 방출을 강화한다.
도 3d 는 용기의 체내 루멘 (308) 에 수직으로 배치되는 삽입물이 포함된 용기 (300) 의 또 다른 실시예를 보여주고 있다. 축 (370) 에는 축 (370) 의 길이방향을 따라서 배치되고 축 (370) 에서부터 루멘 (308) 으로 실질적으로 방사상으로 확장되는 복수의 암 (372) 이 포함된다. 암 (372) 은 도 3d 에서와 같이 다양한 형태와 규격을 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 축 (370) 은 탈착식 뚜껑 (312) 에 고정될 수 있다. 축 (370) 은 용기 또는 탈착식 용기 뚜껑 (312) 에 고정되어 회전가능하다. 예를 들면, 축 (370) 은 마개 (312) 에 고정되어 회전가능하거나 이를 통해 확장되어 축 (370) 이 용기 외부로부터 고정 및 회전함으로써 조직 검체를 교반할 수 있다. 일부 실시형태에서, 축 (370) 은 마개 (312) 에 고정되어 회전가능하며 무게가 편중되어 축 (370) 이 중력이나 원심분리에 의해 회전가능하게 된다. 일부 실시형태에서, 축 (370) 은 마개 (312) 에 고정되어 회전가능하며 복수의 암 (372) 에는 자석이 포함되어 축 (370) 이 용기 외부의 자기장에 자력으로 결합할 수 있다. 용기에 관하여 자기장을 회전함으로써, 축 (370) 은 내부 루멘 (308) 내에서 회전하도록 되어 조직 검체를 교반할 수 있다. 일부 실시형태에서, 축 (370) 은 암 (372) 이 조직 검체를 통해 상하 통과하도록 루멘 내부에서 수직으로 이동할 수 있다. 일부 실시형태에서, 암은 날카로운 블레이드이다.
일 실시형태에서, 수성 유체 내에 조직 조각들의 현탁액을 함유하고 있는 조직 검체들은 용기 (300) 에 적재되고 부착된 축 (370) 을 포함하는 마개 (312) 는 밀봉재 개방단에 고정되어 축 (370) 의 길이방향을 따라서 배치되어 있는 암 (372) 은 내부 루멘 (308) 및 조직 검체로 삽입된다. 하나 이상의 효소는 조직 검체와 함께 첨가될 수도 있다. 이제 용기 (300) 는 여기서 언급한 바와 같이 복수의 가속 및 감속 단계에 놓일 수 있다. 축 (370) 과 관련 암 (372) 은 복수의 가속 및 감속 단계에 놓일 경우 세포외 기질로부터 세포의 분리를 강화한다.
도 4는 1차 용기 (300), 2차 용기 (404) 및 연결장치 (406) 의 용기 조립품 (400) 의 일례를 보여주고 있다. 도 4에 묘사된 실시형태에서, 조립품 (400) 에는 도 3a 의 용기 (404) 의 용기가 포함되어 있다. 일부 실시형태에서, 용기 (300) 는 도 3b ~ 3e 에서 묘사되어 있는 모든 용기 중의 하나일 수 있다. 용기 (404) 에는 가늘고 긴 원통형 중앙부 (408); 중앙부 (408) 와 일체로 형성되는 제 1 단부 (410); 그리고 체내 루멘 (414) 을 정의하면서 중앙부 (408) 와 일체로 형성되는 제 2 개방 단부 (412) 가 포함된다.
일부 실시형태에서, 포트 (432) 는 가늘고 긴 원통형 부분 (408) 의 외부로 방사상으로 확장되어 내부 루멘 (414) 으로부터 외부로 확장되는 유체 통로를 제공할 수 있다. 그러한 포트에는 다공성 삽입물 (434) 도 포함될 수 있다. 일부 실시형태에서, 다공성 삽입물은 대략 0.2μ의 기공을 가질 수 있으며 따라서 공기는 통과하지만 오염물질의 내부 루멘 (414) 으로의 침투는 억제된다.
제 1 단부 (410) 는 좁은 개구부 (416) 로 좁혀지며 좁은 개구부 (416) 에 있는 단부 (410) 로부터 돌출되는 채취부 (418) 를 함유하고 있다. 채취부 (418) 는 유체를 접수 및 저장할 수 있으며 탈착식 플러그 (420) 가 포함되어 채취부 (418) 로부터 제 1 단부 (410) 를 밀봉한다. 탈착식 플러그 (420) 는 원심력, 압력, 효소 또는 물리적 제거에 의한 분리를 통해 유체가 단부 (410) 로부터 채취부로 흘러가도록 해 준다. 일 실시형태에서, 탈착식 플러그는 채취부로의 접근로를 제공하기 위하여 활성화되는 밸브이다. 일부 실시형태에서, 채취부는 제 1 단부에 대하여 부착 또는 제거가 가능하다.
일부 실시형태에서, 채취부 (418) 는 탈착식 플러그 (420) 를 통해서 내부 루멘 (414) 으로부터 분리되는 수성 유체를 포함한다. 예를 들면, 채취부 (418) 에는 세포 인구의 전달, 효험, 내성 또는 기능을 강화하기 위한 살균식염수, 완충제, 세포 배양 매체, 복수의 생물학적으로 활성화된 화합물, 복수의 생물학적으로 불활성인 화합물, 탈염된 골, 기질 또는 다른 재흡수성 비계, 복수의 성장 인자 또는 다른 첨가물들이 들어 있다
제 2 단부에는 켤레부 (예컨대, 나사진 부분) 가 들어 있어서 마개가 용기를 실질적으로 밀봉하도록 부착될 수 있다.
용기 (404) 는 연결장치 (406) 를 가로질러 수평으로 연장되는 제 1, 제 2 개방 단부 (424) 및 다공성 삽입물 (426) 과 함께 튜브형 중앙부 (422) 를 포함하는 연결장치 (406) 를 사용해서 용기 (300) 에 탈착식으로 연결되어 있다. 각 개방단 (424) 에는 켤레부 (예컨대, 나사진 부분) 가 들어 있다. 다공성 삽입물에는 40 ~ 500 ㎛ 규격의 기공이 들어 있으며 연결장치 (406) 를 가로질러 수평으로 확장되므로 다공성 삽입물 (426) 은 실질적으로 내부 체적 308을 내부 체적 (414) 으로부터 분리한다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 다공성 삽입물을 다른 삽입물 위에 배치할 수 있다. 예를 들면, 비교적 대형의 기공규격을 가진 다공성 삽입물은 용기에 보다 가까이 배치할 수 있는 반면에, 비교적 소형의 기공규격을 가진 다공성 삽입물은 용기 (404) 에 보다 가까이 배치할 수 있다. 이와 같이, 용기 (300) 로부터 용기 (404) 로 흘러가는 유체와 입자들은 다공성 삽입물 (426) 을 통과하므로 점차적으로 보다 소형의 기공을 통과할 수 있게 된다.
더욱이 커플링 장치 (406) 에는 연결장치의 내부로부터 유체통로를 제공하기 위하여 튜브형 중앙부 (422) 의 외부로 방사상으로 확장하는 포트 (428) 가 들어 있을 수 있다. 본 포트에는 0.2 ~ 500 ㎛ 의 기공 규격을 가진 다공성 삽입물 (430) 이 들어 있을 수 있다. 일부 실시형태에서, 다공성 삽입물 (430) 은 대략 0.2μ의 기공을 가질 수 있으며 이는 공기가 연결장치 (406) 의 내부로 들어가도록 해 주지만 용기 (300, 404) 또는 조직 검체를 오염시킬 수 있는 박테리아와 입자상 물질을 걸러낸다.
연결장치 켤레부 중 하나는 용기 (300) 의 켤레부에 부착할 수 있고 다른 켤레부는 용기 (404) 의 켤레부에 부착할 수 있다. 용기 (300, 404) 의 개방 단부가 나사형태인 구조에서는, 연결장치 (406) 의 한쪽 끝이 나사형태라서 용기 (300, 404) 가 그 나사부분에 의해 연결장치 (406) 쪽으로 나사지게 만들 수 있다. 일 실시형태에서, 용기 (300, 404) 는 사전조립되어 1차 및 2차 용기에 의해 정의된 내부공간이 적어도 부분적으로 진공하에 있도록 만든다.
사용 중에는, 용기 (300) 는 연결장치 (406) 와 커플이 해제되어 조직 검체, 완충제 (예컨대, 유산 Ringer's) 및 선택적인 효소가 적재될 수 있다. 마개 (예컨대, 마개 (312)) 는 밀봉재 용기 (300) 를 제거하는 데에 사용된다. 용기 (300) 와 그 내부의 조직 검체들은 앞서와 같이 원심분리기 (1) 로 처리할 수 있다. 전술한 바와 같이 용기 (300) 에 담겨 있는 검체를 복수의 가속 및 감속 단계에 놓은 후에, 마개 (312) 를 제거하고 연결장치 (406) 를 용기 (300, 404) 에 부착할 수 있다. 용기 (300) 내의 액체 요소들은 용기 조립품을 도치시키고 부압을 포트 (432) 에 적용해서 용기 (404) 안으로 강제투입할 수 있다. 예를 들면, 튜브의 소규모 조각들을 포트 (432) 와 주사기 (예컨대, Luer 연결에 의해) 를 사용해서 적용되는 흡입부에 부착해서 용기 (404) 내에 부압을 형성하고 따라서 용기 (300) 에 들어 있는 유채 내의 유체와 세포를 다공성 삽입물 426을 통해서 용기 (404) 의 내부 루멘 (414) 으로 투입할 수 있다.
용기 (404) 로의 전달이 끝나면, 용기 (300) 를 연결장치에서 떼어내고 연결장치를 용기 (404) 에서 분리할 수 있다. 마개는 실질적으로 용기 (404) 를 밀봉하기 위하여 켤레부 (420) 에 탈착식으로 부착할 수 있다. 이제 세포외 기질로부터 분리된 세포들은 400 ~ 4000xg 의 힘으로 용기를 원심분리해서 다른 세포 요소로부터 회수할 수 있다. 일 실시형태에서, 세포들은 용기 (404) 의 채취부 (418) 에 모인다.
일부 실시형태에서, 400 ~ 4,000xg 에서의 원심분리는 원심분리기 (1) 를 사용해서 수행되는 2차 프로그램으로서 수행할 수 있다. 예를 들면, 2차 프로그램은 제어기 (10) 로 프로그래밍할 수 있다. 용기 (404) 는 마개가 회전자의 중심방향을 향하고 채취부 (418) 가 외부를 향하는 고정각 구조에서 회전자 암 (14) 으로 삽입할 수 있다. 용기 (404) 는 약 400xg ~ 4,000xg (예컨대, 400 ~ 1,000xg) 의 관성력으로 약 5 ~ 10 분간 원심분리할 수 있다. 그러한 관성력에 의한 원심분리로 인해 채취부 (418) 에서의 세포의 분리와 채취가 가능해진다.
일부 실시형태에서, 자석 목걸이나 항체 또는 항원 결합조직을 포함한 복수의 세포 분리시약은 여기에서 기술한 방법과 기구들과 연계해서 사용할 수 있다. 예를 들면, 특정 세포 유형에 대한 결합 친화성을 가지는 항체는 채취부 내에 모인 세포로부터 형성되는 세포를 회수하는 데에 사용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 그러한 세포 분리시약은 용기 (300) 내에 포함된다. 일부 실시형태에서, 그러한 세포 분리시약은 용기 (404) 내에 포함된다.
일부 실시형태에서, 조직 검체는 세포가 풍부한 기질을 준비하기 위해 원심력 하에서 하나의 가속 및 감속 단계에 놓이게 되며 이후 복수의 가속 및 감속 단계에 놓이게 된다. 예를 들면, 조직채취 용기에 수용되는 조직 검체는 원심분리되어 그 안에 재생 플랫폼을 포함하는 세포가 풍부한 기질을 생산할 수 있다. 재생 플랫폼이란 농축물 내의 줄기세포, 간세포 및 조혈 세포와 같은 재생 세포를 의미한다. 그러한 세포 준비의 실시예는 US 2010/0124563 Al에 나와 있다. 조직 검체에는 조직 검체 전반에 걸쳐서 재생 플랫폼이 포함될 수 있습니다; 그러나 원심분리는 조직 검체가 그 안에 농축된 분량의 재생 플랫폼을 가진 세포가 풍부한 기질을 가지면서 형성되도록 해 준다. 예를 들면, 조직채취 용기 내에서 조직 검체의 원심분리가 끝나면, 3개의 일반 층이 형성된다 (예컨대, 수성 층, 재생 플랫폼을 가진 세포가 풍부한 기질 및 지방질 층). 세포가 풍부한 기질은 일반적으로 지방질 층과 수성 층 사이에 놓인다. 수성 층의 추출이 끝나면, 세포가 풍부한 기질은 세포가 풍부한 기질의 추가 사용을 위해 조직채취 용기 (예컨대, 폐쇄된 시스템을 사용해서) 로부터 추출할 수 있다.
자동화된 조직 처리 장치는 조직 검체의 원심분리에 사용할 수 있다. 예를 들면, 자동화된 조직 처리 장치 내에서 회전하도록 구성되어 있는 제거가능한 회전 기구를 가진 자동화된 조직 처리 장치는 원심력 생성에 사용될 수 있다. 자동화된 조직 처리 장치에는 장치 내의 온도조절용 온도조절장치가 포함될 수 있다.
도 8은 자동화된 조직 처리 장치 (그림 없음) 에 삽입될 수 있는 제거가능한 회전 기구 (500) 의 평면도이다. 조직채취 용기 (502) 는 제거가능한 회전 기구 (500) 에 탈착식으로 삽입되어 잠금 메커니즘 (504) (예컨대, 찰칵 소리를 내는 잠금 메커니즘) 에 의해 정위치에 고정시킬 수 있다. 여기서, 조직채취 용기 (502) 는 공동 (506) 에 끼워진다. 하나의 비제한적인 실시형태에 있어서, 조직채취 용기 (502) 는 공동 (506) 내에 끼워지도록 구성되어 있으며 맞춤식으로 찰칵 소리를 내는 잠금 메커니즘 (504) 에 의해 정위치에 고정된다. 조직채취 용기 (502) 는 조직채취 용기 (502) 의 개구부 (512) 가 중심에서 가장 멀리 있도록 방향설정된다. 세포가 풍부한 기질은 개구부 (512) 근처에 형성되며 및 세포가 풍부한 기질은 세포가 풍부한 기질의 추가 오염 없이 개구부를 통해서 조직채취 용기 (502) 로부터 쉽게 추출할 수 있다.
제거가능한 회전 기구 (500) 는 적어도 2개의 공동 (여기서 506, 508 으로 보여짐) 또는 또 다른 무제한 구조에서 대략 최대 8개의 공동을 가질 수 있다. 각 공동 (506, 508) 은 수평 방향에 있고 공동 (506, 508) 내에 조직채취 용기 (502) 을 삽입하기 위한 탈착식 메커니즘을 가질 수 있다. 탈착식 메커니즘은 잡아채는 메커니즘, Velcro 및 그 조합일 수 있지만 이에 국한되지 않는다. 또 다른 무제한적인 실시형태에서, 제거가능한 회전 기구 (500) 는 가압멸균처리할 수 있는 물질을 가지거나 포함하여 제거가능한 회전 기구 (500) 를 가압멸균처리할 수 있도록 구성할 수 있다.
도 9은 자동화된 조직 처리 장치 (도시 안 됨) 에 삽입될 수 있는 제거가능한 회전 기구 (500) 의 측면도이다. 조직채취 용기 (502) 가 공동 (506) 내에 나타나며 잠금 메커니즘 (504) 에 의해 정위치에 고정된다. 도 8 ~ 9 에 나오는 제거가능한 회전 기구가 크기조정 또는 변경되지 않으며 그 특징은 실례가 되는 목적을 위해 과장이나 왜곡될 수 없다는 점이 인정되고 있다.
자동화된 조직 처리 장치는 제거가능한 회전 기구의 1개 이상의 사전결정된 사양에 의해 특정 제거가능한 회전 기구를 식별하기 위한 메커니즘을 가질 수도 있다. 일 실시형태에서, 제거가능한 회전 기구에는 RFID 태그가 부착될 수 있다. RFID 태그는 자동화된 조직 처리 장치에 의한 식별을 위해 제거가능한 회전 기구가 자동화된 조직 처리 장치 내에 놓이자 마자 스캔할 수 있다. 또 다른 실시형태에서는, 자동화된 조직 처리 장치 내의 제거가능한 회전 기구의 사양을 측정 및 기록함으로써, 가속도, 중량, 풍압계단 및 그 조합과 연관된 동력수요가 그러한 사양자료에 의해 자동화된 조직 처리 장치가 제거가능한 회전 기구를 식별할 수 있도록 소프트웨어 프로그램과 소프트웨어 패키지의 일환으로서 저장될 수 있게 된다.
조직 검체는 자동화된 조직 처리 장치용 1차 조직채취 용기에 수용될 수 있다. 조직 검체에는 수성 유체 내의 조직 조각들의 현탁액이 들어 있을 수 있다. 하나의 무제한 구조에서, 조직 검체는 조직 검체를 1차 조직채취 용기에 넣기 전에 압출될 수 있다. 조직 검체는 독립적으로 약 1 ㎜ ~ 4 ㎜ 또는 독립적으로 약 1.5 ㎜ ~ 3 ㎜ 의 직경을 가지는 오리피스를 통해서 1 ~ 20 회 가량 또는 2 ~ 10 회 압출된다. 가속단계에 접어들기 전에 압출 조직 검체는 조직검체의 동일한 방법이 없는 압출에 비해서 보다 높은 재생 플랫폼 농도를 가지는 세포가 풍부한 기질을 생성한다. 범위에 관련해서 여기에 언급한 바와 같이, "독립적으로"이란 말은 적정 대체 범위를 제공하기 위한 상한과 함께 하한값이 사용된다는 것을 의미한다.
조직 검체는 자동화된 조직 처리 장치를 사용해서 독립적으로 약 200xg ~ 2000xg 또는 최소 400xg 의 범위에 있는 관성력을 얻기 위해 원심분리될 수 있다. 원심분리는 독립적으로 3분 ~ 60분 또는 최소 5분의 범위에 있는 시간 동안 발생할 수 있다. 원심분리가 끝나면, 세포가 풍부한 기질이 형성될 수 있다.
세포가 풍부한 기질은 폐쇄된 시스템 방법에 의해 1차 조직채취 용기로부터 2차 채취 용기로 전달될 수 있다. 그러한 폐쇄된 시스템 방법에는 1차 채취 용기와 2차 채취 용기간의 leur 연결장치, 스파이크 포트, 바늘 또는 이들의 조합이 포함될 수 있다. 전달에 대한 폐쇄된 시스템 방법은 재생 플랫폼을 가지는 세포가 풍부한 기질이 박테리아, 바이러스 등이 조직채취 용기나 세포가 풍부한 기질로 들어가는 것을 막는 것과 같이 조직 검체와 조직채취 용기의 외부에 있는 추가 병원균에 의해 오염되는 것을 막아준다. 폐쇄된 시스템은 상기와 같이 조직 검체를 대상물로 재투여하기 전에 세포가 풍부한 기질상에서 수행되는 추가 단계의 필요성을 감소시킨다. 여기서 사용된 바와 같이, '1차 조직 검체 용기' 및 '2차 조직 검체 용기'의 숫자 표시는 용기의 사용순서를 말한다. 용기는 동일한 유형의 용기 또는 다양한 유형의 용기, 특히, 병이나 원심분리관일 수 있다.
이제 2차 조직채취 용기는 복수의 앞서 말한 바와 같이 복수의 가속 및 감속 단계에 놓일 수 있다. 각각의 가속 및 감속 차례는 최소 약 10xg의 힘이 얻어질 때까지 반복될 수 있다. 대안적으로, 가속 및 감속율은 또 다른 무제한 구조에 있어서 대략 10xg ~ 독립적으로 대략 400xg 또는 독립적으로 대략 20xg~대략 40xg의 범위에 있는 비율로 발생할 수 있다. 하나의 비제한적인 실시형태에 있어서, 수차례의 가속 및 감속은 분당 대략 1 차례~5분동안 대략 1차례 또는 분당 최소 3차례의 범위에서 발생할 수 있다. 또 다른 비제한적인 실시형태에서는, 세포가 풍부한 기질이 수차례의 가속 및 감속 또는 2차례 이상의 가속 및 감속 이후에 구성요소로 분해될 수 있다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 단백질 분해 효소 (예컨대, 유형 I, 유형 Ⅱ 의 교원질 분해 효소와 같은 복수의 교원질 분해 효소, 서몰리신, 트립신 또는 그 혼합물과 같은 중성 단백질 분해 효소)는 2차 조직 용기에 추가될 수 있다. 하나 이상의 단백질 분해 효소는 재조합해서 생산가능하다. 예를 들면, 복수의 교원질 분해 효소는 독립적으로 ㎖당 약 0.5 Wunsch 단위 교원질 분해 효소 ~ ㎖당 약 4.0 Wunsch 단위 교원질 분해 효소 또는 독립적으로 ㎖당 1.0 Wunsch 단위 교원질 분해 효소 ~ ㎖당 약 3.0 Wunsch 단위 교원질 분해 효소의 범위에 있는 분량으로 2차 조직채취 용기에 추가될 수 있다. 단속적인 가속의 차례 및 뒤이은 단백질 분해 효소의 존재에 있어서의 감속은 세포가 풍부한 기질의 재생 플랫폼을 분해할 수 있다.
가속 및 감속 단계가 끝나면, 앞서 언급한 바와 같이 이식이나 주사에 의해 대상물로 재투여될 수 있는 재생 플랫폼을 얻기 위해 세포가 풍부한 기질을 여과 및 세척할 수 있다. 예를 들면, 세포가 풍부한 기질을 대상물로 주사되는 재생 플랫폼에 대해 소수의 추가 단계가 수행되어야 할 주사가능한 재생 플랫폼을 얻기 위해 여과할 수 있다.
본 발명은 발명을 제한하기보다는 다양한 구조를 보다 깊게 설명하는 다음 실시예를 통해 보다 자세히 설명된다.
실시예
실시예 1
신선한 개의 그물막 지방 조직을 난소제거술 후에 폐기되는 조직으로부터 얻었다. 본 조직을 살균가위로 잘게 썬 다음 균일하게 50㎖ 살균 원심분리 관 (대략 2g/관) 에 옮겼다. 디스파제와 함께 박테리아 교원질 분해 효소 I, Ⅱ 의 혼합물을 함유하고 있는 살균 유산 Ringer's를 첨가한 다음 관을 무작위로 진탕 배양기 (60rpm) 또는 고정된 회전자 (TPA, 1xg~200xg~1xg의 힘으로 분당 3 사이클) 내의 가열된 조직 처리 기구에 배치해서 배양하였다. 온도는 37~40℃에서 유지한 상태에서 30 분간 배양/처리하였다.
처리 후에, 분리된 조직 슬러리를 100㎛ 필터를 통해 통과시키고 세포 분획은 TPA에 있어서 10 분간 400xg의 힘으로 원심분리해서 여과된 액체로부터 회수시켰다. 세포 분획은 25㎝2 조직 배양 플라스크에서 도금하고 항균 및 항진균성 DMEM/ 20% (v/v) 소태아혈청 (FBS) 내에서 37 ℃ 에서 2일간 육성하였다. 2일간 배양 후에, 혈구계산기로 부착 세포를 계산하였다. 도 6은 TPA와 진탕 배양기를 사용한 처리 이후에 얻어지는 수많은 부착 세포에 대한 막대 그래프이다. TPA에 의한 조직처리는 진탕 배양기 내에서 분리가 이루어졌을 때보다 2.6배나 높은 결과를 보여주었다.
실시예 2
신선한 인간 지방 지질흡인물은 선택적인 지방흡입술을 받고 있는 환자로부터 동의를 받은 환자를 통해서 얻었다. 살균 스텐레스강 스트레이너를 사용해서 조직을 배수시킨 다음, 1 ㎜ 의 기공 규격을 가진 나일론 그물망으로부터 만들어지는 삽입물이 있거나 (도 3a, 3d 및 3e 참조) 없는 상태에서 50 ㎖ 살균 원심분리관으로 균일하게 (대략 10g/관) 옮겼다. 디스파제와 함께 박테리아 교원질 분해 효소 I, Ⅱ 의 혼합물을 함유하고 있는 살균 유산 Ringer's를 첨가한 다음 관을 무작위로 진탕 배양기 (60rpm) 또는 회전식 버킷 회전자 (1xg~200xg~1xg의 힘으로 분당 3 사이클) 내의 가열된 TPA에 배치하였다. 온도는 37~40℃에서 유지한 상태에서 30 분간 배양/처리하였다.
처리 후에, 분리된 조직 슬러리를 100 ㎛ 필터를 통해 통과시키고 세포 분획은 TPA에 있어서 10 분간 400xg의 힘으로 원심분리해서 여과된 액체로부터 회수시켰다. 세포 분획은 25 ㎠ 조직 배양 플라스크에서 도금하고 항균 및 항진균성 DMEM/ 20% (v/v) FBS 내에서 2일간 육성하였다. 2일간 배양 후에, 혈구계산기로 부착 세포를 계산하였다. 도 7은 TPA와 3개의 다양한 삽입물을 사용한 처리 또는 진탕 배양기를 사용한 처리 이후에 얻어지는 수많은 부착 세포에 대한 막대 그래프이다. 그 결과는 TPA내에서의 처리와 원뿔형 삽입물 (예컨대, 도 3a) 에 의해 얻어지는 세포생산량이 배양기 내에서의 처리로 얻어지는 세포 생산량과 유사하다는 것을 보여주고 있다.
실시예 3
지질흡인물 검체를 선택적인 지방흡입술을 받고 있는 환자로부터 채취하였다. 지질흡인물을 20㏄의 체적을 갖는 복수의 조직채취 용기에 전달하였다. 각 조직채취 용기의 지질흡인물 내용물들을 미세 유체화 바늘을 통해 5회에 걸쳐 압출시켰다. 이제 각 조직채취 용기로부터 얻어진 압출된 지질흡인물을 별도의 조직채취 용기로 이전하였다. 이제 조직채취 용기들을 자동화된 조직 처리 장치 내부의 제거가능한 회전 기구의 공동에 놓았다. 제거가능한 회전 기구는 조직채취 용기의 수평 위치 유지에 사용된 반면에, 자동화된 조직 처리 장치는 조직채취 용기 내용물의 가속도와 원심력에 적용되었다. 원심력은 약 400xg, 약 700xg, 약 1200xg 또는 약 2000xg의 힘으로 30 분간 적용되었다. 2개 조직채취 용기의 내용물을 각각의 원심력 값에 대해 적용하였다.
원심분리가 끝난 후, 재생 플랫폼을 가진 세포가 풍부한 기질을 조직 검체 채취 용기 내의 잔여 조직 검체로부터 분리하였다. 오일 층 체적, 지질흡인물 분획, 수성 분획을 제거한 다음 각 검체에 대해 측정하였다. 지질흡인물 층을 개별적인 50㏄ 원뿔형 원심분리 관에 넣었다.
관리 검체로서, 미처리된 대략 5g, 즉 압출이나 원심분리가 안 된 지질흡인물을 2개의 조직채취 용기 각각에 옮겨놓았다. 용기의 무게를 측정하고 이동된 지질흡인물들의 무게를 기록하였다. 교원질 분해 효소 효소와 디스파제 효소를 가지고 있던 Ringer's lactate를 각 조직채취 용기에 5㎖씩 미처리된 지질흡인물에 추가하였다. 이제, 조직채취 용기를 약 37 ℃ 에서 약 30 분간 약 60rpm의 속도로 진탕 배양기에 넣어서 미처리된 지질흡인물들을 구성요소로 분해하였다. 이제, 구성요소로 분해된 조직 검체를 100㎛ steriflip 필터를 통해 여과시켰다. 이제, 여과된 조직은 10 분간 약 600xg의 힘으로 원심분리해서 재생 세포를 회수한다. 회수된 세포들을 24시간 20% (v/v) 소 태아혈청으로 최소 필수적인 매체 (MEM) 에서 배양시켰다. 혈구계산기로 부착 세포들을 계산하였다.
도 10과 같이, 원심분리 이전에 조직 검체를 압출하면 조직 1g당 보다 많은 세포를 생산할 수 있다. 도 11은 1200xg에서의 원심분리가 조직이 원심분리 전의 압출여부에 상관 없이 세포가 풍부한 기질 내에 세포농도를 증가시키는 기간에 있어서의 첨가물 효과를 가진다는 것을 보여주고 있다.
도 12는 조직 검체의 원심분리기간이 길어질 수록 세포가 풍부한 기질 1g당 더 많은 세포를 생산한다는 것을 보여주고 있다. 도 13은 1200xg의 가속율이 400xg의 가속율 또는 원심분리가 전혀 없는 것에 비해서 세포가 풍부한 기질당 높은 농도의 세포를 생산한다는 것을 보여주고 있다.
실시예 4
신선한 인간 지질흡인물을 2개의 부분표본으로 나누었다. 부분표본 1 ("control 방법") 은 지질흡인물에 기반한 지방 이식을 준비하기 위하여 미용 성형수술 내에 공통적으로 도입된 것과 유사한 조건을 사용하여 처리하였다. 지질흡인물은 200xg에서 2 분간 원심분리하였다. 부분표본 2 ("세포가 풍부한 기질"(CEM) 방법) 은 5회에 걸쳐 2개 주사기 사이의 luer 커플링에 대해 1차 압출에 의해 처리한 다음 1200xg에서 30 분간 압출된 원심분리하였다. 원심분리 후, 양 방법은 상부 오일 층, 중간 오일 조직 층, 하부 수성 층으로 분리된 결과를 가져왔다. 각 부분 표본의 중간 조직 층을 채취하였다. 각 방법에서 채취한 조직 층의 부분이 개별적인 1㏄ 주사기로 주사되고 면역결핍인 암컷 NU/NU 생쥐 (n=3 생쥐/준비) 의 목덜미 부위에 피하투여되었다.
각 방법으로부터 채취한 조직 층의 추가 부분은 100㎛ 필터로 여과된 교원질 분해 효소 I, Ⅱ 및 디스파제의 혼합물에 의해 37 ℃ 에서 처리한 다음 재생 세포를 얻기 위하여 600xg에서 원심분리하였다. 신선한 세포 준비에서의 생균 재생 세포의 수와 24시간 동안 배양에 있어서의 플라스틱 부착 세포의 수를 결정하였다. 이식후 1개월이 지나자 생쥐를 희생시켜서 이식결과를 평가하였다.
CEM 방법에 의한 처리결과, 신선한 준비물의 경우 생균세포의 농도가 2.2배 높아졌고 관리방법에 비해서 플라스틱 부착 세포의 농도는 5.5배 높아졌다. 표 1 참조. 본 세포농축은 CEM 방법을 사용하여 얻어진 세포 준비물이 주사된 생쥐 내의 혈관화와 오일포켓의 부재로 알 수 있듯이 1개월만에 이식의 생존능력을 높여준 것으로 해석되었다.
방법 조직 g당 생존가능 한세포수 조직 g당 부착 세포수
관리 2.82x105 5.35x104
CEM 6.16x105 2.94x105
다른 실시형태
본 발명이 상세한 설명과 연계하여 설명된 반면, 앞서 나온 설명은 발명의 범위를 설명하고 이를 제한하지 않으려는 의도를 가지고 있으며 이는 덧붙인 청구항의 범위에 의해 정의된다. 다른 국면, 이점 및 수정은 다음 청구항의 범위 내에 있다.

Claims (29)

  1. 인간이나 동물의 분리된 신체 조직으로부터 재생 세포들을 회수하는 방법으로서,
    상기 조직을 상기 세포들을 포함하는 그의 성분들로 해리하기에 효과적인 효소와 함께 적어도 하나의 용기 내의 수성 매체 내에 상기 신체 조직의 검체를 상기 용기의 내용물로써 적재하는 단계,
    용기의 원심분리 중에, 상기 용기가 회전자에 고정된 부위를 관통하는 수평의 평면과 회전자의 회전 축선의 수직 방향 사이의 상향 경사 각도로 상기 용기를 위치시키도록 반경방향으로 원심분리기의 회전자에 상기 용기를 닫고 탈착 가능하게 고정시키는 단계, 및
    분당 적어도 1 라운드의 회전 가속과 감속의 속도로 상기 회전 축선 주위의 적어도 2 개의 반복 라운드들의 회전 가속과 감속을 통해 상기 회전자를 원심력에 의해 회전시켜 회전자에 고정된 상기 용기를 회전시킴으로써, 상기 용기의 내용물을 반복적으로 교반하는 단계로서, 각 라운드는 가속 간격 및 감속 간격을 포함하고, 각 라운드는 반복된 순서에서 개입하는 단계 없이 다음 라운드가 뒤따르고, 상기 회수하는 동안에 상기 신체 조직에 대한 상기 효소의 해리 효과를 촉진하기 위한 미리 결정된 시간 동안 상기 용기의 내용물이 반복적인 상충하는 원심력과 중력을 받도록, 상기 회전자의 상기 용기의 상기 경사 각도와 함께 상기 반복적인 교반이 이루어지도록 하는, 상기 교반하는 단계
    를 포함하는, 신체 조직으로부터 세포들을 회수하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 신체 조직은 지방 조직이고, 상기 효소는 단백질 분해 효소, 중성 효소 및 교원질 분해 효소 (collagenase) 의 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 신체 조직으로부터 세포들을 회수하는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 신체 조직은 지질흡인물의 형태인 것을 특징으로 하는, 신체 조직으로부터 세포들을 회수하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 용기를 상기 회전자로부터 디커플링시키거나 그렇지 않으면 반복 라운드들 사이에 상기 용기의 내용물을 교란시킴이 없이, 반복 라운드들의 회전 가속과 감속을 적용하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는, 신체 조직으로부터 세포들을 회수하는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 반복 라운드들 사이에 지연을 개입시킴이 없이, 반복 라운드들의 회전 가속과 감속을 적용하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는, 신체 조직으로부터 세포들을 회수하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    수성 매체 중의 신체 조직의 상기 검체 및 상기 효소의 용적이 상기 내용물의 반복적인 교반동안 부분적으로 채워진 용기에서 상기 내용물의 제한 없는 혼합을 향상시키기 위해 상기 용기의 총 용량 미만으로 적재하는 것을 특징으로 하는, 신체 조직으로부터 세포들을 회수하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 용기의 내용물에 미치는 주된 힘은, 상기 회전자 및 그에 고정된 상기 용기가 다수의 라운드들의 회전 가속과 감속을 겪는 때에 반복적인 교반을 전달하기 위해, 라운드 중의 회전 가속 중에는 원심력이고 라운드 중의 회전 감속 중에는 중력이 되도록, 상기 용기는 상기 회전자에 탈착 가능하게 고정되는 것을 특징으로 하는, 신체 조직으로부터 세포들을 회수하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서,
    분당 다수의 라운드들에 걸쳐 회전 가속과 감속을 적용하는 것을 특징으로 하는, 신체 조직으로부터 세포들을 회수하는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서,
    반복 라운드들의 회전 가속과 감속 내내 상향 경사 각도로 고정된 상기 용기를 유지하기 위해, 탈착식 로킹에 의해 상기 회전자에 상기 용기를 고정시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는, 신체 조직으로부터 세포들을 회수하는 방법.
  10. 제 1 항에 있어서,
    상기 용기가 각 반복 라운드의 회전 가속 간격 중에는 상향의 상기 경사 각도를 향해 피봇할 수 있고 각 반복 라운드의 회전 감속 간격 중에는 상기 경사 각도로부터 하향으로 피봇할 수 있도록, 상기 회전자에 상기 용기를 탈착 가능하게 고정시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는, 신체 조직으로부터 세포들을 회수하는 방법.
  11. 제 1 항에 있어서,
    반복 라운드들의 회전 가속과 감속 중에 서로를 방해하지 않도록, 상기 회전자의 주변부 주위에 이격되게 반경방향으로 상기 회전자에 다수의 용기들을 탈착 가능하게 고정시키는 것을 포함하고, 상기 용기들의 각각은 그 안에 동봉된 수성 매체 중의 상기 효소 및 상기 신체 조직의 검체를 부분적 용량으로 수용하는 것을 특징으로 하는, 신체 조직으로부터 세포들을 회수하는 방법.
  12. 제 1 항에 있어서,
    반복 라운드들의 가속과 감속 동안에 26℃ 내지 42℃ 범위의 온도 제어 환경에 상기 용기를 유지하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는, 신체 조직으로부터 세포들을 회수하는 방법.
  13. 제 1 항에 있어서,
    부가적인 단계들, 즉 상기 용기의 다른 내용물로부터 원하는 재생 세포들 및 상기 재생 세포들을 밀접하게 둘러싸고 있는 잔류물들을 제거하기 위해, 반복 라운드들의 회전 가속과 감속의 중지에 후속하여 상기 용기의 내용물을 여과하는 단계, 상기 원하는 세포들을 둘러싸고 있는 상기 잔류물들을 세척하는 단계, 및 생체에의 임플란트나 주입에서의 후속 사용을 위한 펠릿 형태로, 세척 이후에도 남아있는 상기 원하는 세포들을 그 농도를 위해 부가적인 원심분리를 행하는 단계를 수행하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는, 신체 조직으로부터 세포들을 회수하는 방법.
  14. 인간이나 동물 대상체의 분리된 신체 조직의 검체로부터 재생 세포들을 격리하기 위한 자동화된 조직 처리 장치로서,
    상기 조직 처리 장치는 회전 가능한 회전축을 갖는 원심 분리기,
    상기 회전축 상에, 내부에 둘러싸인 수성 매체에서 조직 검체 및 해리 효소로 이루어진 내용물로 전체 용량 미만으로 적재된 각각의 용기의 탈착 가능한 보유를 위해 구성된 적어도 하나의 로킹 메커니즘,
    원심 분리 동안 용기를 상기 회전축에 보유되는 위치를 통한 수평인 평면과 상기 회전축의 수직 방향 사이의 상향 경사 각도로 상기 용기를 위치시키는, 상기 회전축 상에 장착된 각각의 용기, 그리고
    반복적인 무중단 시작 및 중단 사이클을 통해 원심력 하에서 상기 회전축을 제어 가능하게 회전시켜서 상기 회전축 상에 장착된 각각의 용기가 각각의 용기의 회전 가속 및 감속의 다중 반복 라운드를 발생시키는 회전력으로 적어도 1 분당 1 회의 예정된 속도로 제어하도록 프로그래밍된 모터를 포함하고,
    각 라운드는 회전 가속 간격과 회전 감속 간격으로 구성되며, 이에 의해 각 용기의 내용물은, 조직 검체 및 효소의 억제되지 않는 반복적인 교반을 생성하여 조직 검체로부터의 재생 세포 및 후속 수집을 위한 용기의 기타 내용물의 해리 및 분리를 향상시키기 위해 다수의 반복적 라운드 동안 충돌하는 원심력 및 중력을 받는 것을 특징으로 하는, 자동화된 조직 처리 장치.
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 회전축 상에 회전자를 더 포함하고, 각각의 복수의 로킹 메커니즘은 (i) 고정된 상기 상향 경사 각도 또는 (ii) 상기 회전축을 통한 수직인 평면에서의 피봇 관계 중 하나에서 분리 가능하게 유지되는 각 용기 사이의 간섭을 회피하기 위해 상기 회전자에 대해 이격된 관계로 배치되고,
    각각의 회전 가속 구간 동안 상기 용기가 상기 상향 경사 각도를 향해 피봇 할 수 있게 하고, 상기 다수의 반복적인 라운드 동안 발생하는 각각의 원심력 및 중력 하에서 각각의 회전 감속 구간 동안 상기 상향 경사 각도로부터 하향으로 멀어지는 것을 특징으로 하는, 자동화된 조직 처리 장치.
  16. 제 15 항에 있어서,
    상기 모터는 상기 회전자에 고정된 각 용기의 회전 가속 및 감속의 다중 반복 라운드를 생성하기 위해, 조직 검체 및 상기 용기의 기타 내용물로부터 재생 세포의 해리 및 분리를 추가로 향상시키기 위해, 중단되지 않은 순서로 분당 다중 회의 미리 결정된 속도로, 상기 회전축을 회전시키도록 프로그래밍 되는 것을 특징으로 하는, 자동화된 조직 처리 장치.
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