JP2022522323A - 細胞分離装置および使用方法 - Google Patents

Abstract

細胞分離システムおよび細胞を分離する方法が開示されている。一実施形態では、細胞分離システムは、遠心分離プログラムに関連付けられた複数のロジックを含む非一時的な記憶装置であって、遠心分離プログラムの実行により、生体由来材料から細胞を分離する装置と、電源に電気的に接続された加熱機構と、閉じ込め機構と、閉じ込め機構に着脱可能に結合されたアセンブリとを含み、アセンブリは、生成物リザーバと、生成物リザーバ内に収容された複数の細胞濃縮領域と、消化領域と、廃棄物リザーバと、生成物リザーバに着脱可能に結合されたアクセスチューブを含むセンターコラムとを含む単層ボウルと、取付プレートと、ボウルに結合され、第１のアセンブリが閉じ込め機構に結合されたときに取付プレートの動きを制限するアライメント機構とを備えている。【選択図】図１

Description

本発明は、細胞分離装置およびその使用方法に関する。

細胞療法と組織工学は、損傷したり病気になったりした組織や臓器の修復や回復のための臨床応用に向けて発展している。特に、組織移植片の開発は、心臓および末梢血管の手術、四肢組織修復、歯科用途、および獣医手術を含む手術の発展を促進する。移植片および他の細胞ベースの生成物は、ヒトまたは動物の組織から細胞を単離および/または培養することによって形成することができる。

内皮細胞播種の潜在的な供給源は、微小血管内皮細胞（ＭＶＥＣ）である。ウィリアムズらは研究室において、細胞機能を研究するために、ヒト、イヌ、ウサギ、ネズミ、ウシ、ブタの内皮細胞、特に生きたままのＭＶＥＣの単離と培養の両方の先駆的な研究を行った。ヒトＭＶＥＣは元々、美容脂肪吸引によって吸引された組織である。ヒト脂肪ＭＶＥＣの分離には、細胞の最終用途に応じて２つの異なるプロトコルを使用した。これらのプロトコルは、ヒトや動物の移植片をすぐに播種するための簡単な手術室対応の手順から、ＭＶＥＣを後から培養する場合のより手の込んだ手順まで、分離には様々な手順がある。

内皮細胞は、非血栓形成細胞株を樹立する上で非常に重要である。手術室での人工移植片上の内皮細胞株を生成するための効率的かつ信頼できる方法が依然として必要である。手術室の環境に適合し、無菌バリアを維持し、使いやすく、安定した結果が得られ、かつ安価な機器を用いて、数分から数時間のうちに、透過性マトリックス、スキャフォールド、その他の透過性細胞基材への迅速な細胞接着を実現することが望ましい。

本開示の一実施形態は、以下の方法を含む細胞を分離する方法を開示している。消化領域において、所定量の生体由来材料および所定量の消化培地を攪拌して、消化済生体由来材料を形成するステップ。消化済生体由来材料を、約５００Ｇ～約１０００Ｇの力で約５分～約１０分間遠心分離することにより、複数成分の濃縮細胞と複数成分の廃棄物とに分離するステップ。フィルタの目よりも小さい直径を有することにより、細胞濃縮領域に到達できる濃縮細胞の成分を生成物リザーバに集めるステップ。ボウル内で消化領域から仕切られた廃棄物リザーバにおいて、フィルタの目よりも大きな直径を有し、かつ濃縮細胞と接触しない廃棄物の成分を分離するステップ。および、生成物リザーバから濃縮細胞を取り出すステップ。

本開示の一実施形態は、以下を含む細胞分離システムを開示している。遠心分離プログラムに関連する複数のロジックを含み、遠心分離プログラムの実行により、所定量の生体由来材料から所定量の細胞を分離する非一時的な記憶装置。電源に電気的に結合された加熱機構。加熱機構に近接して設けられた閉じ込め機構。閉じ込め機構に着脱可能に結合されたアセンブリであって、生成物リザーバ、生成物リザーバ内の複数の細胞濃縮領域、消化領域、廃棄物リザーバ、および生成物リザーバに着脱可能に結合されたアクセスチューブを含むセンターコラムを含む単層ボウルと、単層ボウルが着脱可能に結合されている取付プレートと、センターコラムに結合された移動を制限するアライメント機構とを含むアセンブリ。さらに、細胞分離システムは、遠心分離プログラムの第１の状態において、アセンブリが中心軸の周りを第１の方向および第２の方向に交互に回転するように構成され、かつ加熱機構が作動し、遠心分離プログラムの第２の状態において、加熱機構が作動せず、単層ボウルが中心軸の周りを単一方向に回転して、複数の細胞から複数の廃棄物を分離するように構成されている。

本開示の一実施形態は、以下を含む細胞分離システムを開示する。複数の異なる遠心分離プログラムに関連付けられた複数のロジックを含む非一時的な記憶装置。非一時的な記憶装置はプロセッサによって実行された時に、消化領域において所定量の生体由来材料と所定量の消化培地を攪拌して消化済生体由来材料を形成し、消化済生体由来材料を、約５００Ｇ～約１０００Ｇの力で約５分～約１０分間遠心分離することにより、消化済生体由来材料を複数成分の濃縮細胞と複数成分の廃棄物とに分離し、フィルタの目よりも小さい直径を有することにより、細胞濃縮領域に到達できる濃縮細胞の成分を生成物リザーバに集め、ボウル内で消化領域から仕切られた廃棄物リザーバにおいて、フィルタの目よりも大きな直径を有し、かつ濃縮細胞と接触しない廃棄物の成分を分離することで、生成物リザーバから濃縮細胞を取り出す。

本開示の特定の実施形態による細胞分離システム１００の部分等角図である。 本開示の特定の実施形態による単層ボウルの部分分解図である。 本開示の特定の実施形態による単層ボウルの部分上面図である。 本開示の特定の実施形態による単層ボウルの正面図である。 本開示の特定の実施形態による単層ボウルの部分側面図である。 本開示の特定の実施形態による、ボウルを横切ってペレット濃縮領域を通過した単層ボウルの部分断面図である。 本開示の特定の実施形態による、ペレット濃縮領域を通してボウルを垂直に横切った単層ボウルの部分断面図である。 本開示の特定の実施形態による単層ボウルのアセンブリ１０２の部分分解図である。 本開示の特定の実施形態による単層ボウルのアセンブリ１０２の部分等角図である。 本開示の特定の実施形態による取付プレート５０４および遠心分離機アセンブリ１３２の部分分解図である。 本開示の特定の実施形態による、脂肪組織などの生体由来材料から内皮細胞を分離する方法である。

内皮細胞は、合成移植片内に非血栓形成細胞株を樹立するために使用される。したがって、手術室の環境に適合し、無菌バリアを維持することができ、使いやすく、安定した移植の結果が得られ、数分から数時間のうちに透過性マトリックス、スキャフォールド、その他の透過性細胞基材への迅速な細胞接着を実現することが望ましい。

現在、これらの要件を満たすための様々なアプローチがあるが、成功例は限られている。（ｉ）脱細胞化組織材料の使用。（ｉｉ）細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の合成を誘導する培地を用いて組織培養用プラスチック上で細胞を培養する、自己組織化メカニズムの使用。（ｉｉｉ）生分解性の合成ポリマーを使用し、その上に細胞を播種し、生理学的環境を模擬して培養する。（ｉｖ）生理的環境を再現するために、機械的な力を加えて組織細胞を形成し、圧縮する再構成Ｉ型コラーゲンゲルなどのバイオポリマーを使用する。

本開示の実施形態は、脂肪組織からの大量の内皮細胞の分離と、迅速な合成移植片の細胞植え付け（ｃｅｌｌ ｓｏｄｄｉｎｇ）を可能にし、移植片の迅速な植え付け（ｓｏｄｄｉｎｇ）のために、手術室対応機器ですぐに利用できる細胞の自動化および接着を可能にするシステムおよび方法を開示している。本開示の実施形態は、移植のための移植片株に加えて、他の用途を有すると考えられる。

本明細書で説明するシステムおよび方法は、単一の部品（継ぎ目や溶接がない）として形成されていてもよいし、複数の部品として形成されていてもよい単層ボウル（ボウル）を含む細胞分離システムに関するものである。単層ボウルは、生成物リザーバに接続された単一アクセスチューブを収容するセンターコラムを含むさまざまな領域を含み、目的の最終生成物を含む細胞濃縮領域へ直接アクセスできるようにする。ボウルはさらに、ボウルと一体的に形成されるか、または分離可能な構成要素であってもよい複数の内壁によって分離された消化領域および廃棄物リザーバを含む。内壁により、消化領域と廃棄領域の分離が可能になり、ボウルが遠心分離されると、細胞分離プロセスがより迅速に行われ、より純粋な最終生成物が得られる。消化領域と廃棄領域の物理的な分離により、さらに消化領域を直接加熱することができ、細胞分離プロセスをさらにサポートする。単層ボウルは、遠心分離中に重力が細胞を生体由来原料から分離するために、ボウルの中心軸の周りに円周方向に配置された複数の細胞濃縮領域をさらに含む。廃棄物は廃棄物リザーバに集められ、細胞は細胞濃縮領域に収集される。

ボウルは、ボウルの一端から他端まで、ある細胞濃縮領域から他の領域まで延在する生成物リザーバに接続された１以上のフィルタまたはスクリーンを含む。生成物リザーバはセンターコラム内のアクセスチューブに接続されており、濃縮細胞へアクセスできるようにしている。生成物リザーバはさらに、濃縮細胞生成物が廃棄物によって汚染されるのを防ぐスクリーンまたはフィルタを収容する１つ以上のスクリーンホルダを含む。ボウルは、ばねロック機構を介して閉じ込め機構に結合する取付プレートに結合している。アライメント機構は、アセンブリが配置されている取付プレートと係合するようにボウルに結合されている。

本明細書で論じる細胞分離システムを使用する細胞分離の一例では、複数のロジックが非一時的な記憶装置（メモリ）に記憶されており、それは、複数の遠心分離プログラムを含んでいる。複数のプログラムのうちの各プログラムは、培地の種類や生体由来材料の量および／または目標細胞量や目標細胞濃度などの複数の要素に基づいて、命令を出す。プロセッサによって実行されると、各プログラムは、本明細書で説明する複数の状態を経て細胞分離を開始し、分離された細胞の自動の取り出しおよび廃棄物の捕捉および/または除去を行う。プログラムは、温度、時間、力、および所定量の生体由来材料および培地の廃棄物から分離された所定量細胞の取り出しまでのプログラム全体の長さ（時間）を含む、さまざまな面で異なっていてもおよび／または重複してもよい。

細胞分離システムの一例では、複数成分の消化培地および複数成分の生体由来材料が、ボウル、特にボウルの混合および消化領域に配置される。次に、ボウルを攪拌し、中心軸を中心に各方向に回転させて、生体由来材料を分解することで、遠心分離中に細胞を分離できるようにする。ボウルは、加熱機構を通じて攪拌の前および/または攪拌中に加熱されてもよく、加熱機構によって生成された熱により、ボウルと取付プレートおよび/または閉じ込め機構との間のギャップ内の空気が加熱され、循環する。ボウルは約２５℃～約４５℃に加熱されてもよく、攪拌の完了後に加熱機構を停止して、残りの細胞分離が室温（約２０℃～約２５℃）で行われるようにしてもよい。

攪拌後、遠心分離を行う。遠心分離中、ボウルは閉じ込め機構に対して自由に回転し、アライメント機構はボウルと取り付けプレートに結合され、実施形態によってはさらに閉じ込め機構に結合され、ボウルの一部が回転するのを防止する。

遠心分離は、様々な実施形態において、約５００Ｇ～約１０００Ｇの力で、５分～２０分、または１分～１０分、または他の時間間隔に亘って実施されてもよい。細胞は、混合および消化領域で混合物から分離され、重力によってボウルの複数の細胞濃縮領域に押し込まれる。遠心分離後、ボウルの速度が低下し、廃棄物が廃棄物リザーバに集まる。ボウルの速度が低下すると、アクセスチューブを通じて生成物リザーバに真空が生成されることにより、操作中に分離された細胞が収集される。フィルタ/スクリーンの穴よりも直径の小さい細胞と培地はスクリーンを通過して細胞濃縮領域に入るが、フィルタ/スクリーンの穴よりも直径が大きい廃棄物やその他の材料はスクリーンを通過しないようになっている。この廃棄物は廃棄物リザーバに保持されているため、分離された細胞と接触しない。ある実施形態では、遠心分離後、回転を停止してもよく、収集された細胞は生成物リザーバに残される。細胞は、真空を使用してアクセスチューブを通じて取り出される。単層ボウルを使用することにより、熱伝達がより効果的に行われ、システムの効率が向上する。単層ボウルシステムは、細胞分離に関連するコストを削減する。細胞濃縮領域に直接アクセスすることで、より純粋でより濃縮された細胞生成物の捕捉が可能になる。生成物リザーバへのアクセスにより、アセンブリがまだ回転している間に細胞生成物をさらに捕捉することができる。

図１は、本開示の特定の実施形態による細胞分離システム１００の部分等角図である。細胞分離システム１００は、遠心分離機アセンブリ１３２と、ばねロック機構を介して取付プレート１０６に結合された単層ボウル１０４のアセンブリ１０２とを含む。取付プレート１０６は、遠心分離機（図示せず）の駆動軸に連結されている。アライメントロッド１１０（および単一アクセスチューブ１０８）が静止している間、アセンブリ１０２は自由に回転する。攪拌および遠心分離の間、アセンブリ１０２は、図１の座標系に示されており、全体から参照可能な中心軸１２４を中心に、方向１３０Ａまたは方向１３０Ｂのいずれかの方向に回転する。座標系はさらに、中心軸１２４に垂直な第２軸１２６と、中心軸１２４と第２軸１２６の両方に垂直な第３軸１２８を備えている。

一実施形態では、アセンブリ１０２は、中心軸１２４の周りでそれぞれ方向１３０Ａおよび方向１３０Ｂに３６０度未満回転することによって攪拌される。攪拌中および／または遠心分離中にボウル１０４を加熱してもよい。攪拌および遠心分離中に、生体由来材料が分離され、その結果として細胞が生成物リザーバ２０６に濃縮され、廃棄物は廃棄物リザーバ２０２に収集される。一実施形態では、取付プレート１０６は、閉じ込め機構１１２に据え付けられ、着脱可能に結合されており、閉じ込め機構１１２は、加熱ユニット１１４の作動によって生成される熱および熱風を導くように働く。閉じ込め機構１１２はまた、アセンブリ１０２を回転させるように動作する遠心分離機に着脱可能に結合される。閉じ込め機構１１２のアセンブリ１０２への結合により、両者の間に空隙が生じる。この空隙を通り、取付プレート１０６の底部に設けられた複数の開口部（図示せず）を通って熱風が循環してもよい。一実施形態では、単層ボウルのアセンブリ１０２および関連するチューブ類は使い捨て式である。

一実施形態では、加熱ユニット１１４は、少なくとも攪拌中に細胞分離システム１００の温度を上昇させるために使用される。加熱ユニット１１４は、複数の遠心分離プログラムの実行中にベース１１８および細胞分離システム１００が動くのを防止するように構成された複数の脚部１１６を含むベース１１８に結合されている。加熱ユニット１１４は、１２２を介した直接の有線接続によって電力を供給されてもよいし、充電式バッテリー（または電池）のようなポータブル電源で構成されてもよい。加熱ユニット１１４は、閉じ込め機構１１２、ひいては閉じ込め機構１１２に結合されたアセンブリ１０２の温度を上昇させるように構成された複数の加熱要素をさらに含む。閉じ込め機構１１２もまた、ベース１１８に連結されるか、または着脱可能に結合されてもよい。

一実施形態では、アライメントロッド１１０がセンターコラム４０２に結合され、ボウル１０４がばねロック機構によって取付プレート１０６に固定されるため、細胞分離のためのアセンブリ１０２は、閉じ込め機構１１２に対して回転することができる。アセンブリは、閉じ込め機構１１２に着脱可能に結合され、アセンブリ１０２が自由に回転できるようにしている。一実施形態では、細胞分離システム１００は、複数の遠心分離プログラムおよびプロセッサを含む少なくとも１つの記憶装置（図示せず）、ならびにプロセッサを通じた遠心分離プログラムの実行によって起動される複数の制御装置（図示せず）を含んでいてもよい。記憶装置および／または複数の制御装置で、細胞分離システム１００上に配置されていてもよいし、遠隔地に配置され、タブレット、携帯電話、ウェアラブル技術、キオスク、ラップトップコンピュータ、またはデスクトップコンピュータを介してアクセスされてもよい。各遠心分離プログラムは、遠心分離サイクルで使用される複数のパラメータで構成されており、使用する生体由来材料の量や使用する消化酵素の量や種類などの入力に基づいて、手動または動的に自動化された方法で選択することができる。

図２は、本開示の特定の実施形態による単層ボウル１０４の部分分解図２００である。単層ボウル１０４は、単一の継ぎ目のない部品として形成されてもよく、またはボウル１０４内に組み立てられた複数の部品から形成されてもよい。ボウルの「単層」は、少なくとも２つの入れ子式の層があるボウルとは対照的である。

一実施形態では、ボウル１０４は、生成物リザーバ２０６に着脱可能に結合された１以上の細胞濃縮領域２１２を含む。細胞濃縮領域２１２は、滑らかな内部形状で構成されており、遠心分離中に分離された細胞を、流体や固体の除去によって分離および濃縮させる役割を果たしている。ボウル１０４の中央部分は、アライメントロッド１１０および単一アクセスチューブ１０８を収容する。アライメントロッド１１０は、回転シール２１４を介してボウル１０４に結合され、さらに生成物リザーバ２０６に結合される。ボウル１０４は、ボウル１０４と一体的に形成されるか、または分離可能な構成要素である複数の内壁によって混合および消化領域２０４から分離された廃棄物リザーバ２０２をさらに含む。一実施形態では、ボウル１０４は、生成物リザーバ２０６に着脱可能に結合されており、１つ以上のフィルタ２１０を支持する１つ以上のフィルタホルダ２０８をさらに含む。１つ以上のフィルタ２１０は、未消化材料を含む廃棄物が生成物リザーバ２０６に入り、これにより、濃縮された細胞生成物を汚染することを防止する。１つ以上のフィルタ２１０は、５００ミクロンのフィルタサイズと同じ大きさであってもよい。１つ以上のフィルタは、２５０ミクロン～５００ミクロンの範囲のサイズであってもよい。１つ以上のフィルタは、１００ミクロン～２５０ミクロンの範囲のサイズであってもよい。１つまたは複数のフィルタ２０１は、１００ミクロン未満の範囲のサイズであってもよい。１つ以上のフィルタ２０１は、より大きなフィルタサイズからより小さなフィルタサイズまでの範囲の連続したアセンブリで構成されてもよい。一実施形態では、ボウル１０４は、ばね付きロック機構（図示せず）に結合しており、動作中にボウル１０４を取付プレート１０６に固定するように働く１つ以上の脚部２１６をさらに含む。一旦固定されると、ボウル１０４は閉じ込め機構１１２に対して自由に回転することができるが、閉じ込め機構１１２は回転せず、生体由来材料の攪拌（および分解）中に加熱された空気をボウル１０４に向けて誘導および循環させるように少なくとも部分的に働く。

図３Ａ～３Ｃは、本開示の特定の実施形態による単層ボウル１０４の様々な図である。図３Ａは、単層ボウル１０４の部分上面図３００である。ボウル１０４は、ボウル１０４の中心線に沿った少なくとも１つのシーム３０６を含んでいてもよい。細胞濃縮領域２１２および単一アクセスチューブ１０８も示されている。図３Ｂは、本開示の特定の実施形態による単層ボウル１０４の部分正面図３０２である。シーム３０６、細胞濃縮領域２１２、単一アクセスチューブ１０８、およびアライメントロッド１１０も示されている。図３Ｃは、本開示の特定の実施形態による単層ボウル１０４の部分側面図３０４である。細胞濃縮領域２１２、単一アクセスチューブ１０８、および脚部２１６が示されている。

図４Ａは、本開示の特定の実施形態による単層ボウルの部分断面図４００である。ボウル１０４の部分断面図４００は、ペレット濃縮領域２１２を通り、ボウルを横切るようにして図示したものである。生成物リザーバ２０６は、ボウル１０４を横切るようにして、１つのペレット濃縮領域２１２から正反対のペレット濃縮領域２１２まで延びている。フィルタホルダ２０８内のフィルタ２１０は、生成物リザーバ２０６に着脱可能に結合して示されている。

図４Ａは、単一アクセスチューブ１０８を含むセンターコラム（またはキャビティ）４０２をさらに開示する。単一アクセスチューブ１０８は、無菌培地の導入を可能にし、濃縮細胞生成物へのアクセスを可能にするため、操作中でも濃縮細胞生成物の取り出しができるように構成される。単一アクセスチューブ１０８は、回転中に静止したままであり、したがって、アセンブリ１０２の回転中に濃縮細胞生成物へアクセスできるようにする。この構成は、分離された細胞生成物の汚染も低減する。図４Ａは、ボウルの内部のみへアクセスできるように構成され、静止中にボウル１０４の混合および消化領域２０４への原料を導入できるように構成されたアクセスポート４０４をさらに含む。材料は、生体由来材料、培地、消化酵素、または細胞分離をサポートするために必要な他の材料であってもよい。

図４Ｂは、本開示の特定の実施形態による単層ボウル１０４の部分断面図４０６である。部分断面図４０６は、細胞濃縮領域２１２を通り、単層ボウル１０４を垂直に横切って図示したものである。図４Ｂは、廃棄物リザーバ２０２および混合および消化領域２０４を含む図２～３に示される特徴を示す。図４Ｂは、混合および消化領域２０４と廃棄物リザーバ２０２との間に部分的な障壁を形成する内壁４０８である。消化および混合プロセスの間、アセンブリ１０２は、中心軸１２４を中心に方向１３０Ａおよび方向１３０Ｂに回転する。遠心分離中、アセンブリ１０２は、中心軸１２４を中心に方向１３０Ａまたは方向１３０Ｂのいずれかの方向に回転する。細胞は分離され、生成物リザーバ２０６に集められる。ボウルが攪拌または遠心分離されると、廃棄物は内壁４０８上で回転し、廃棄物リザーバ２０２に集められる。

一実施形態では、廃棄物リザーバ２０２は、使用済みの培地および他の液体と同様に、大きくて望ましくない固形物を保持および分離するように構成される。廃棄物リザーバに収集することにより、これらの粒子によるシステムの詰まりを防止する。詰まりを防止するための他の手段は、生成物リザーバ２０６（図４Ａに見られる）の外縁に着脱可能に結合されるフィルタ２１０（フィルタホルダ２０８に保持される）である。図５Ａは、本開示の特定の実施形態による単層ボウルのアセンブリ１０２の部分分解図である。図５Ａは、開口部５０６に挿入されて所定の位置にロックされる脚部２１６によって、単層のボウル１０４を取付プレート５０４のばね付きロック機構にはめ込む様子を示す。図５Ｂは、ロック機構が係合しており、ボウル１０４が取付プレート５０４に結合されたときのアセンブリ５０８を示す。

図６は、本開示の特定の実施形態による取付プレート５０４および遠心分離機アセンブリ１３２の部分分解図６００である。図６は、取付プレート５０４が遠心分離機アセンブリ１３２の閉じ込め機構１１２内に位置しており、そこに取付プレート５０４が着脱可能に結合される場所を示している。図７は、本開示の特定の実施形態による生体由来材料から内皮細胞を分離する方法を示す図である。方法７００は、生細胞の洗浄、分離、濃縮、および除去／採取のための自動化されたメカニズムである。採取された細胞は、移植片に採用されるか、ヘルスケア（例えば、ＦＤＡが承認した移植またはそれ以降の処理）および／またはヘルスケア研究（細胞分離法および細胞誘導体製品の使用を承認するための試験）で使用するために採用される。一実施形態では、方法７００の処理７０２において、生体由来材料が、図１の細胞分離システム１００などの細胞分離システムの単層ボウル１０４の混合および消化領域２０４（図２）に投入される。処理７０４において、複数の培地およびコラゲナーゼ酵素または複数の酵素が、アクセスポート４０４を介してボウル１０４、特に混合および消化領域２０４に投入されてもよい。培地の例では、乳酸加リンゲル液（ＬＲ）、Ｆｌａｒｔｍａｎｓ、注射用水（ＷＦＩ）、またはその他の同様の培地が挙げられる。例によっては、混合および消化領域２０４は、その領域内の生体由来材料および／または培地を投入する前に、約３０℃～約４０℃に予熱されてもよい。例によっては、処理７０２は処理７０４の前に発生してもよく、他の例では、処理７０４は処理７０２の前に発生してもよい。さらに他の例では、処理７０２および処理７０４は、ほぼ同時に行われてもよく、生体由来材料および培地がほぼ同時に混合および消化領域２０４に投入されてもよい。

混合および消化領域２０４が加熱される例では、処理７０２、処理７０４の前、または生体由来材料および／または培地のいずれかまたは両方が混合および消化領域に投入された後に、約３０℃～約４０℃の温度に加熱および維持されてもよい。この加熱は、予熱と呼ばれることがあり、目標温度または温度範囲に応じて、約１０分～約４５分、または１０分未満かかる場合がある。

さらに、処理７０６の方法７００では、処理７０２で投入された生体由来材料は、処理７０４で投入された酵素培地を通じて完全にまたは部分的に消化される。処理７０２に配置された生体由来材料の処理７０６における消化は、混合および消化領域２０４の加熱を通じて、または単層ボウル１０４の攪拌を通じて、またはその両方の組み合わせによって生じてもよい。この消化は、処理７０４で使用される酵素の種類、使用される酵素の数、および／または使用される各酵素の量、および処理７０２で配置された生体由来材料の量に応じて、５分～１時間、１５分～４５分、またはその他の期間にわたって行われてもよい。

さらに処理７０６の方法７００では、処理７０６での攪拌は、中心軸を中心に交互方向にボウルを部分的または完全に回転させることで発生してもよいが、本明細書において説明する遠心分離と同じではなく、また、その力を発生させるものでもない。処理７０６で消化を促進するために採用される攪拌は、中心軸１２４（図１）を中心として異なる方向への全体的または部分的な回転を含んでいてもよく、所定の時間をおいた間隔で発生してもよい。処理７０６での消化は、遠心力が適用されず、培地および生体由来材料が所定の時間または所定数の攪拌サイクルの間、チャンバ内で攪拌される、装置の第１の状態を指してもよい。一例では、混合および消化領域２０４の温度は、処理７０６での消化の間、約３７℃に維持されており、この第１の状態は、使用される酵素の種類、使用された酵素の量、および／または処理７０４で使用された各酵素の量、および処理７０２で配置された生体由来材料の量に基づく所定の期間維持される。本明細書で論じられるシステムは、処理７０６における消化のためのパラメータ、ならびに本明細書で論じられる他の状態、処理、およびフェーズのためのパラメータを含む複数の記憶されたプログラムを含んでいてもよい。

さらに、処理７０８の方法７００では、処理７０６での消化の完了に応じて、それに続き、遠心分離が行われる。本明細書で論じるように、処理７０６での消化の「完了」とは、細胞がまだ生存しているが、処理７０８で遠心分離できるくらいまで生体由来材料が分解されたことにより、消化が進んだ時期を指す。処理７０８でのこの遠心分離は、処理６０６で形成された消化済生体由来材料からの細胞の分離によって特徴付けられる。一実施形態では、処理７０８の構成は、約５分～約１０分の時間の間の、６００Ｇ～１０００Ｇのｇ力を含む。本明細書で言及されているｇ力または「Ｇ」は、体に加えられる重力であり、ここでは、液体が除去され続ける細胞濃縮領域（したがって、流体／廃棄物が減少し、より濃縮された細胞となる）に集められた細胞に加えられる力を生成し、少なくとも処理７０８での遠心分離の間、混合および消化領域２０４から分離されたままになる。

処理７０８での遠心分離は、細胞分離システムの第２の状態を指していてもよい。処理７０８での遠心分離は、さまざまなＲＰＭ速度およびサイクル時間のプログラムを含んでいてもよい。これらのサイクルは、以下で説明するように、ＲＰＭおよび／または処理７１２で停止するまでの期間を増加させることができる。一実施形態では、約５分～約１０分の間、５００Ｇ～１０００Ｇで単一の遠心分離サイクルを採用してもよく、さらに他の例では、最初に付加されるＧ力を増加させ、次に付加される力を減少させる複数の遠心分離サイクルを採用して、以下の処理７１０で詳細に説明する低速回転に導いてもよい。

一実施形態において、処理７０６における消化は、脂肪組織および液体から複数の細胞を分離するため、処理７０８における遠心分離サイクルは、細胞の分離およびそれらの分離された細胞の細胞濃縮領域２１２への移動を強制するように働く。

一実施形態では、処理７０６での消化中に混合および消化領域２０４を予熱するために使用される加熱機構は、処理７０６に続いて処理７０８の開始前に停止され、処理７０８での遠心分離が、室温（約２０℃～約２５℃）および処理７０６で採用される温度との間で進行してもよい。さらに処理７０８において、生成物リザーバ２０６および細胞濃縮領域２１２への細胞の分離中に、処理７０８での所定の時間の遠心分離の後、単一アクセスチューブ１０８（処理７１６）を介して単層ボウル１０４のチャンバに清浄培地を導入してもよい。この培地は、脂肪および他の組織および液体を含む複数の材料を混合および消化領域２０４からさらに移動させ、その後、それらの材料は、量が増加するにつれて混合および消化領域２０４から除去され、廃棄物リザーバ２０２に捕捉される。

例によっては、細胞濃縮領域２１２内の細胞を分離するために、５００Ｇ～８００Ｇの速度が処理７０８で採用されてもよく、他の例では、７００Ｇ～９００Ｇの速度が処理７０８の遠心分離に採用されてもよい。処理７１６の清浄培地は、処理７０８で追加され、ボウル１０４内の総量を増加させて、廃棄物リザーバ２０２への廃棄物の排出を促進してもよい。処理７１６における培地の導入は、回転速度、遠心分離プログラム（サイクル）、およびシステムおよび収集領域の形状に応じて起こってもよい。洗浄媒体が処理７１６で導入される実施形態では、採用される量は、これまでにボウル１０４に導入されたすべての流体の総量の２倍または３倍であってもよい。

処理７１０は、低速回転段階であり、細胞分離装置の第３の状態を指していてもよい。３分～４５分程度のこの段階では、処理７１０においてより小さな遠心力が適用される。一例では、処理７１０で、単層ボウル１０４の回転が所定の速度または速度範囲まで減速され、ボウルの温度は、室温から処理７０６で採用される最高温度の範囲であってよい。処理７１０において、速度（発生する力）や温度などのパラメータを採用して、分離された細胞が細胞濃縮領域２１２に留まる一方で、培地および生体由来材料からの残留液がボウルの内壁を下って廃棄物リザーバ２０２に排出されるようにしてもよい。

処理７１０で付加される遠心力によって細胞が細胞濃縮領域２１２に保持されている間、廃棄物は、廃棄物リザーバ２０２内に全体的または部分的に収集されてもよい。一部の廃棄物は、混合および消化領域２０４に閉じ込められたままになることがあり、そこで分離された細胞から分離される。例によっては、処理７１０の低速回転は反復的であってもよく、例えば、処理７１０における第１の低速回転は処理７０８の平均速度の９０％であってもよく、その後の処理７１０における第２の低速回転は処理７０８の平均速度の８０％であってもよく、その後の低速回転は、所定の期間が終了するまで、または所定の量の流体および／または固体が量および/または光学センサによって決定される廃棄物リザーバ２０２に除去されるまでは、より遅い速度であってもよい。処理７１０の間、大きすぎてフィルタ２１０を通過することができない材料は、分離された細胞がこの材料と接触しないように、廃棄物リザーバ２０２内に保持および分離される。

細胞濃縮領域２１２から生成物リザーバ２０６の中心に細胞を引き込むために真空が採用される。したがって、細胞濃縮領域２１２へ収集された細胞は、それらの収集領域から生成物リザーバ２０６の領域に移動し、処理７１４において、濃縮細胞（分離された細胞）は、真空を利用して、単一アクセスチューブ１０８を通って取り出されてもよい。実施形態によっては、この取り出しは自動化され、処理７１０および処理７１２の完了に応じて行われる。また、実施形態によっては、この取り出しは自動化され、処理７１２の前に行われる。処理７１２および処理７１４は、ボウルが閉じ込め機構１１２に対してもはや回転していないときの細胞分離装置の第４の状態と総称してもよい。

方法７００で説明された処理は、細胞の分離および収集の自動化された動的な方法に関連しており、処理７０２および処理７０４でのボウル１０４の装填は、手動的な介入なしに処理７１２での取り出しおよび収集を通じて進行する。一例では、記憶装置に記憶され、細胞分離装置に結合された非一時的な記憶は、プロセッサによって実行可能な複数のコードを含む。この複数のコードは、さまざまな特性のサンプル用の遠心分離プログラムを含み、各プログラムは、処理７０２および／または処理７０４の流量、ならびに各処理で発生するアクションに応じて、処理７０６、処理７０８、処理７１０、処理７１４、および処理７１６で発生する細胞および／または濃度目標、流量、時間、および力の範囲（回転速度／ＲＰＭ）を含んでいてもよい。各プログラムは、培地および生体由来材料から分離された細胞の取り出しまでの完了までの全体的な時間に関連付けられてもよい。

他の例では、複数のコードには、システムが詰まったのを自動的に検出して分離プロセスをシャットダウンするプログラムが含まれている。次に、プログラムは、システムの培地洗浄を開始するか、アセンブリ１０２を揺り動かして、詰まりが分散し、分離手順が再開されるようにする。

好ましい実施形態を示して説明してきたが、当業者は、本明細書の範囲または教示から逸脱することなく、その変更を行うことができる。本明細書に記載された実施形態は、単なる例示であり、限定的なものではない。本明細書に記載のシステム、装置、およびプロセスの多くの変形および修正が可能であり、それらも本発明の範囲内である。たとえば、さまざまな部品の相対的な寸法、さまざまな部品を構成する材料、およびその他のパラメータを変更することができる。したがって、保護の範囲は本明細書に記載された実施形態に限定されるものではなく、以下の特許請求の範囲によってのみ限定され、その範囲は、特許請求の範囲の主題のすべての均等物を含むものとする。特に明記しない限り、方法クレームのステップは任意の順序で実行することができる。方法クレームのステップの前に（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（１）、（２）、（３）などの識別子を記載することは、ステップの特定の順序を意図するものではなく、また指定するものでもないが、むしろそのようなステップへの後続の参照を簡略化するために使用される。

Claims (20)

1. 細胞を分離する方法であって、
   （ａ）細胞分離システムの消化領域において、所定量の生体由来材料および所定量の消化培地を攪拌することにより、所定量の消化済生体由来材料を形成するステップと、
   （ｂ）前記消化済生体由来材料を、約５００Ｇ～約１０００Ｇの力で約５分～約１０分間遠心分離することにより、前記消化済生体由来材料を複数成分の濃縮細胞および複数成分の廃棄物に分離するステップと、
   （ｃ）フィルタの目よりも小さい直径を有することにより、細胞濃縮領域に到達できる前記濃縮細胞の成分を生成物リザーバに集めるステップと、
   （ｄ）ボウル内で前記消化領域から仕切られた廃棄物リザーバにおいて、前記フィルタの目よりも大きな直径を有し、かつ前記濃縮細胞と接触しない前記廃棄物の成分を分離するステップと、
   （ｅ）前記生成物リザーバから前記濃縮細胞を取り出すステップと、
   を含む方法。
2. 前記ステップ（ａ）が、単層ボウルを、中心軸を中心として各方向に交互に所定の時間回転させるステップを含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記ステップ（ａ）において、前記消化済生体由来材料と複数の前記消化培地をリザーバに投入する前に、前記単層ボウルを約３０℃～約４０℃に加熱するステップをさらに含む、請求項２に記載の方法。
4. 前記ステップ（ａ）の間に、前記単層ボウルを約３０℃～約４０℃に加熱するステップを含む、請求項２に記載の方法。
5. 前記ステップ（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、および（ｅ）が、約２０℃～約２５℃で発生する、請求項１に記載の方法。
6. プロセッサを介して遠心分離プログラムを実行することにより、前記ステップ（ａ）を開始するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
7. 前記遠心分離プログラムが、前記ステップ（ｅ）の後に完了する、請求項６に記載の方法。
8. 複数の遠心分離プログラムが、前記細胞分離システムの非一時的な記憶装置に記憶される、請求項１に記載の方法。
9. 細胞分離システムであって、
   遠心分離プログラムに関連する複数のロジックを含み、前記遠心分離プログラムの実行により、所定量の生体由来材料から所定量の細胞を分離する非一時的な記憶装置と、
   電源に電気的に接続された加熱機構と、
   前記加熱機構に近接して設けられた閉じ込め機構と、
   前記閉じ込め機構に着脱可能に結合されたアセンブリと、
   を含み、
   前記アセンブリは、
   生成物リザーバと、複数の細胞濃縮領域と、消化領域と、廃棄物リザーバと、前記生成物リザーバとに着脱可能に結合されたアクセスチューブを含むセンターコラムを含む単層ボウルと、前記単層ボウルが着脱可能に結合されている取付プレートと、前記閉じ込め機構に結合されたときに前記アクセスチューブの移動を制限する前記センターコラムに結合されたアライメント機構と、
   を含み、
   前記遠心分離プログラムの第１の状態では、前記アセンブリが中心軸の周りを第１の方向および第２の方向に交互に回転するように構成されて前記加熱機構が作動し、
   前記遠心分離プログラムの第２の状態では、前記加熱機構が作動せず、前記単層ボウルが前記中心軸の周りを単一方向に回転して、複数成分の前記細胞から複数成分の廃棄物を分離するように構成されているシステム。
10. 分離された前記細胞が、前記遠心分離プログラムの前記第２の状態で、前記単層ボウルの前記生成物リザーバ内の複数の前記細胞濃縮領域に分離される、請求項９に記載のシステム。
11. 前記システムが第３の状態をさらに含み、前記第３の状態に設定されたとき、前記単層ボウルに形成された前記廃棄物リザーバに前記廃棄物を集めるように構成される、請求項９に記載のシステム。
12. 前記生成物リザーバが、直径２００ミクロン未満の材料のみを前記細胞濃縮領域に通過させる１つ以上のフィルタを含む、請求項９に記載のシステム。
13. 第４の状態に設定されたとき、前記単層ボウルが静止する、請求項９に記載のシステム。
14. 前記アクセスチューブが、遠心分離中に前記生成物リザーバからの濃縮細胞生成物の取り出しを可能にする、請求項９に記載のシステム。
15. 複数の異なる遠心分離プログラムに関連する複数のロジックを含む非一時的な記憶装置を含む細胞分離システムであって、
    前記非一時的な記憶装置はプロセッサによって実行された時に、
    消化領域において所定量の生体由来材料と所定量の消化培地を攪拌して消化済生体由来材料を形成し、
    前記消化済生体由来材料を、約５００Ｇ～約１０００Ｇの力で約５分～約１０分間遠心分離することにより、前記消化済生体由来材料を複数成分の濃縮細胞と複数成分の前記廃棄物に分離し、
    フィルタの目よりも小さい直径を有することにより、細胞濃縮領域に到達できる前記濃縮細胞の成分を生成物リザーバに集め、
    ボウル内で前記消化領域から仕切られた廃棄物リザーバにおいて、前記フィルタの目よりも大きな直径を有し、かつ前記濃縮細胞と接触しない廃棄物の成分を分離し、
    前記生成物リザーバから前記濃縮細胞を取り出すように構成されているシステム。
16. 少なくとも攪拌および遠心分離を行う間に、第１のアセンブリの閉じ込め機構に対する回転を可能にするために、取付プレートに着脱可能に結合されている単層ボウルを含む前記第１のアセンブリを含む、請求項１５に記載のシステム。
17. 前記第１のアセンブリが前記閉じ込め機構に着脱可能に結合されており、加熱機構が前記閉じ込め機構に近接して配置されている、請求項１６に記載のシステム。
18. 少なくとも１つの前記遠心分離プログラムが実行されたときに、攪拌前または攪拌中の少なくとも一方の前記ボウルを約３０℃～約４０℃で加熱するようにさらに構成される、請求項１５に記載のシステム。
19. 細胞生成物が、前記単層ボウルの複数の前記細胞濃縮領域内の複数成分の前記濃縮細胞から前記生成物リザーバへの移送によって集められる、請求項１６に記載のシステム。
20. 前記第１のアセンブリが使い捨てである、請求項１６に記載のシステム。

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