JPH08280376A - 器官消化用ディバイス及び器官からの細胞の分離法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ある器官から生物学的に関心のある細胞を取
り出すための、細胞を最少量の物理的束縛に付す、工業
的利用に適合した方法を提供する。 【解決手段】 ある器官を消化してそれより生物学的に
関心のある細胞又は細胞群を抽出するディバイスにし
て、閉鎖容器（１、２）；その閉鎖容器の中に設けられ
た、器官を入れるための容器（５）にして、その外側に
位置する第一チャンバーとその容器内側に位置する第二
チャンバーを画成するその容器；容器（５）を１つの軸
の回りに回転させるための手段（６）；及び第一チャン
バーから第二チャンバーへと液体を通過させ、かつ第二
チャンバーから第一チャンバーへと器官断片を通過させ
るための、第一チャンバーと第二チャンバーとの間の選
択的連通手段（２３）から成るディバイス。

Description

【発明の詳細な説明】 【発明の属する技術分野】

【０００１】本発明は器官の消化用ディバイス及び器官
から生物学的に関心のある細胞又は細胞群を分離する方
法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ある種特定の器官の全的又は部分的な、
永久的又は一時的な不全を、これら器官の少なくとも生
活機能を、例えば心臓、肺臓及び腎臓によって自然に提
供される給送機能、ガス交換機能及び濾過及び透析によ
る精製機能を果たし得るディバイスで克服する方法は、
今日では、公知である。

【０００３】ある種特定の器官の少なくとも１つの生活
機能が、代謝に不可欠な物質を分泌するものであるその
器官の不全を、前以て合成されるか、又は動物源から分
離された代替物を患者に注射することによって克服する
方法も知られている。これは、例えばインスリンの場合
であって、インスリンは脾臓にある細胞群によって自然
に分泌される。

【０００４】今まさに述べたこれら全ての方法は、しか
し、患者を生き延びさせるけれども、慢性腎不全に苦し
んでいる患者の貧血、或いは糖尿病患者の失明やアテロ
ーム性硬化症のようなある種の、時には患者を無力化す
る疾患に対してそれら患者を保護するには不適当な一時
的緩和手段に過ぎない。

【０００５】腎臓のようなある種の器官の場合、人工の
一時的緩和手段の限られた効率を克服する１つの方法は
器官移植体を使用することから成るものである。器官の
移植は、また、生活機能をどうすれば人工的な手段で再
生できるかその方法が現在知られていない器官、例えば
肝臓の使用が維持できなくなってしまった患者を救う唯
一、可能性のある方法である。しかし、器官の移植は、
ドナーの数が限られていることから、また特に器官を１
つの動物種から他の動物種に移植することを不可能にし
てしまう免疫反応の故に、依然応用面が限られた方法の
ままである。

【０００６】現在活発に行われている研究の主題となっ
ている、ある種特定の器官の不全を克服する第三のルー
トは、生物活性物質を含有するように設計されたディバ
イスでこれら器官の機能を自然に代替させ得るだろうと
言うことにある。現在考案されているこれらの生人工器
官の製造は２つの主たる工程から成る。即ち、これら工
程の第一は、動物のものであるのが好ましいだろうある
１つの器官から、この器官の使用が維持できなくなって
いる患者では最早得られない機能を果たす細胞（例え
ば、肝細胞）又は細胞群（例えば、ランゲルハンス氏
島）を分離することにある。生人工器官製造の第二工程
は、免疫反応を防ぎ、同時に細胞を生かし、レシーバー
生物が求める物質を分泌するのに必要な交換を可能にす
るために、レシーバー生物から細胞を分離しようとす
る、生体になじむ半透過性の材料から造られている包囲
体の中に細胞又は細胞群を封入することにある。

【０００７】本発明はこの製造の第一工程に関するもの
で、その不可欠の本質は、生物学的に関心のある細胞を
生物から効率的に抽出し、同時に生来の分泌能を保持す
る能力の故に、生人工器官の開発に依存する。

【０００８】米国特許第５，０７９，１６０号明細書に
は、ある器官から生物学的に関心のある細胞を、特に膵
臓からランゲルハンス氏島を分離するためのディバイス
と方法が記載されている。

【０００９】このディバイスは、網目が生物学的に関心
のある細胞は通過させるが、大きさが細胞より大きい器
官断片は保持しているように選ばれている格子で下部区
画室と上部区画室とに分けられている容器から形成され
ている消化チャンバーを含む。上部区画室は出口オリフ
ィスを備えている。下部区画室は液体流入用の入口オリ
フィスを備え、かつこの区画室にはその中に入れられた
器官の分解をスピードアップし、またその器官が浸され
ている液体を撹拌すべく意図されたビーズが入ってい
る。その容器は、運動している下部区画室の中にビーズ
を入れ、その区画室に入れられた器官を振盪させる作用
を有する撹拌装置の中に取り付けられるように設計され
ている。

【００１０】消化チャンバーは閉ループの液体循環回路
と開ループの液体循環回路に接続される。この２つの回
路は循環ポンプ、消化チャンバーの下流に配された冷却
装置及び消化チャンバーの上流に配された加熱装置から
成る共通部分を有している。

【００１１】この米国特許明細書に記載されるランゲル
ハンス氏島の分離法は、接合組織を攻撃し、生物学的に
関心のある細胞の解放に必要とされる器官の分解を達成
することができる消化液をその器官に注入することにあ
る。消化液により膨張せしめられた器官は、次に、消化
チャンバーの下部区画室に入れられ、次いで消化液がそ
のチャンバーに満たされる。消化液は閉ループ回路によ
って消化チャンバーの中を連続的に循環せしめられ、そ
の間チャンバーは、その中の器官を運動状態に置き、か
つその中の液体を撹拌するために振盪されている。器官
を運動させ、液体を撹拌するこれらの作用はビーズによ
って増強される。消化液は、それがチャンバーを出て、
解放されているだろう細胞に対する上記作用が消えたら
直ぐに冷却され、そして、最大効率が得られるように、
チャンバーに戻される直前に加熱される。試料はチャン
バーを出た液体から規則的に抜き取られる。生物学的に
関心のある細胞が試料中に観察されると直ぐに、洗浄液
が開ループ循環回路によりチャンバーの中に入れられ、
循環せしめられ、そして格子を通過し得る細胞、細胞群
及び器官断片が採集される。細胞は次いで連続勾配装置
で遠心分離により分離される。

【００１２】今まさにここに述べた装置と方法にはいく
つかの欠点がある。第一は、この方法の装置が、ビーズ
の作用に因り、また器官が分解し始めると直ぐに格子を
部分的に目詰まりさせる原因となるチャンバー中での液
体の循環に起因する圧力束縛に因り、器官を同時に機械
的に束縛してしまうことである。経験が示すところによ
れば、少なくともある種特定の細胞、特にランゲルハン
ス氏島はこの種の束縛に対して非常に敏感であった。更
に、この米国特許明細書に記載される方法は実験室的な
方法であって、工業的利用に適合させることは困難であ
ると思われる。特に、消化チャンバーの開−回路洗浄工
程は、細胞、細胞群及び大きさが格子の網目より小さい
接合組織の断片を消化チャンバーから取り除くために、
洗浄液を比較的大量に必要とする。しかし、採集される
液体は、次に、細胞を精製するために遠心分離にかける
必要があり、一方細胞分離の市場で入手できる装置は容
量が小さく、そのため精製工程が長く、それは工業プロ
セス又は半工業プロセスに許容されるだろうよりもはる
かに長い。

【００１３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の１つの目的
は、器官から生物学的に関心のある細胞を取り出すため
の、細胞を最少量の物理的束縛に付す、工業的利用に適
合した方法を提案することである。

【００１４】［課題を解決するための手段］この目的を
達成するために本発明によれば、少なくとも１つの器官
又は器官の一部をそれより生物学的に関心のある細胞又
は細胞群を抽出するように消化するディバイスにして、
閉鎖容器、及び生物学的消化媒体の作用に付されている
器官の分解を促進するために、閉鎖容器の中に入れられ
た器官自らを少なくとも部分的に回転させるための手段
を含んで成る上記ディバイスが提供される。

【００１５】本発明の第一の態様によれば、閉鎖容器に
入れられた器官を回転させるための手段は、閉鎖容器を
実質的に水平な軸の回りに回転させるために、その閉鎖
容器に連結されていてもよいモーターから成る。

【００１６】本発明の第二の態様によれば、閉鎖容器に
入れられた器官を回転させるための手段は

【００１７】−器官を収容するために閉鎖容器の中に設
けられている容器にして、その外側に位置する第一チャ
ンバーとその容器内部に位置する第二チャンバーを画成
しているその容器；

【００１８】−上記容器を１つの軸の回りに回転させる
ための手段；及び

【００１９】−第一チャンバーから第二チャンバーへと
液体を通過させ、かつ第二チャンバーから第一チャンバ
ーへと器官断片を通過させるための、第一チャンバーと
第二チャンバーとの間の選択的連通手段

【００２０】から成る。

【００２１】このディバイスによって、器官は閉鎖容器
の壁と衝突することも、いかなる種類の衝撃も受けるこ
とがなく、しかし、器官が相当の運動状態に置かれると
その分解が促進される。更に、器官の閉鎖容器内での運
動は消化液を均質化するに足る十分な混合を達成し、そ
のため、本発明によるディバイスでは、その液体を消化
中に閉鎖容器の閉ループ内で循環させることが不可欠で
はなくなる。しかして、細胞又は細胞群が特に循環ポン
プで引き起こされる望ましくない圧力束縛に付されるよ
うなことが回避され得る。

【００２２】本発明の特徴によれば、容器は管状壁によ
り接合された２つの実質的に円形の端部壁を有する、実
質的にドラムの形状をしており、そのドラムは実質的に
水平なその対称軸の回りに回転せしめられる。

【００２３】本発明のもう１つの特徴によれば、選択的
連通手段は、容器の１つの壁の、格子より成る少なくと
も一部分から成る。容器がドラムである場合、その管状
壁は格子より成ることが有利である。

【００２４】本発明の更にもう１つの特徴によれば、本
発明によるディバイスは、次の：

【００２５】−閉鎖容器を少なくとも部分的に包囲して
いるジャケット、

【００２６】−液体を上記ジャケットの中を循環させる
ための手段、及び

【００２７】−上記ジャケットの中に入れられ、循環せ
しめられているその液体の温度を調整するための手段

【００２８】から成る、閉鎖容器中の液体の温度を調整
するための手段を含む。

【００２９】本発明によれば、また、ある器官又は器官
の一部から生物学的に関心のある細胞又は細胞群を分離
するための方法にして、次の：

【００３０】−器官に、生物学的に関心のある細胞を一
体に保持している接合組織を分解することができる消化
液を注入し；

【００３１】−その器官を閉鎖容器の中に入れ、そして
その閉鎖容器に液体を満たし；

【００３２】−その器官を、消化中に器官が分解してし
まうまで、自らの少なくとも部分的な回転運動に付し；

【００３３】−消化が完了したとき閉鎖容器から内容物
を取り出し；そして

【００３４】−その閉鎖容器の内容物から生物学的に関
心のある細胞を分離する

【００３５】工程からなる上記方法が提供される。

【００３６】この発明の１つの特徴によれば、消化液の
器官への注入工程の開始と閉鎖容器から内容物を取り出
す工程の開始との間の経過時間が、予め定められた一定
の期間となる。

【００３７】実際、所定の器官と所定のタイプの消化液
について、その器官は経験的に決めることが可能な実質
的に一定の消化期間の後に短時間に分解することが観察
された。本発明によれば、従って、生物学的に関心のあ
る第一の細胞又は第一の細胞群を接合組織から解放する
時点を決めるために、一定の試料をチャンバーから採取
する必要がない。

【００３８】この発明のもう１つの特徴によれば、閉鎖
容器は重力で空にされる。この配置によって、細胞又は
細胞群がポンプにより引き起こされる望ましくない圧力
束縛に付されることが回避可能となる。

【００３９】本発明の他の特徴及び利点は、続いてなさ
れる説明を読めば明らかになるであろう。

【００４０】

【発明の実施の形態】添付図面を参照して説明すると、
図１に示される消化ディバイスは受け器１よりなる閉鎖
容器から成る。受け器１はストッパー２で漏れ止め密栓
様式で閉じることができる。閉鎖容器は外側との、液体
の導入及び排出を可能にする２つの連通通路を備えてい
る。これら通路の一方は受け器１の頂部に接続されてい
る管３により形成されており、他方の通路は受け器１の
底部に接続されている管４により形成されている。受け
器１は円筒状タンクの形状となっており、ストッパー２
が嵌合するその開口は実質的に垂直な面に位置してい
る。受け器１の縁部は外縁を構成する放射状の表面（ｒ
ａｄｉａｌ ｓｕｒｆａｃｅ）７を有し、ストッパー２
を受け器１に迅速締結機構（図示せず）を有するクリッ
プ９で受け器１に密栓保持する時に、その放射状表面７
に対してストッパー２の、対応する外縁を構成する放射
状表面８が適合するようになっている。ストッパー２に
作られた円周溝１０に設けられたジョイントにより、ク
リップ９が適所にある時に閉鎖容器の漏れ止め密栓状態
が確実に得られるようになる。

【００４１】本発明によれば、消化ディバイスは閉鎖容
器の中に入れられている器官自らを少なくとも部分的に
回転させる手段も含む。図１の態様では、この手段は容
器５から成り、この容器５は閉鎖容器にその外部に設け
られたモーター６により回転状態で駆動させることがで
きるように取り付けられている。

【００４２】この目的のために、受け器１の底部はその
受け器の縦軸を中心とする円形の開口を含み、その縦軸
は開口の外縁から管状シース１１の外方に延在してい
る。管状シース１１は容器５の駆動シャフト１３用のベ
アリング１２を受け器１に取り付けるために用いられる
ものである。ベアリング１２は、一方の端部ではカラー
１４が、他方の端部ではネジ山１５が嵌め合わされてい
る管状スリーブより成る。ベアリング１２の外径はシー
ス１１の内径よりやや小さい。ベアリング１２は受け器
１の内側を経てシース１１に、カラー１４が受け器の底
部に接するようになるまで、入り込み、係合している。
ナット１６で、ベアリング１２のネジの切られた端部
に、そのナットがシース１１の自由端部と接してベアリ
ング１２を受け器１に対して固定するまで、締め付けて
いる。シース１１とベアリング１２との間の漏れ止め密
栓状態はベアリング１２の周面に設けられた円周溝１７
に設けられたジョイントで保証される。

【００４３】ベアリング１２はシャフト１３の支持体と
して役立つもので、その一端は継手部材１８を介してモ
ーター６に接続することができる。ベアリング１２とシ
ャフト１３との間の漏れ止め密栓状態は、ベアリング１
２の端部に作られた皿穴１９に設けられたジョイントで
保証される。このジョイントは、ベアリング１２の端部
にネジで締められたフェルール２０で適所に保持されて
いる。

【００４４】シャフト１３は閉鎖容器の中にストッパー
２の近辺内まで延在している。このシャフト１３は、モ
ーター６によって生み出される回転運動の伝達機能に加
えて、管状側壁２３により接合された２つの実質的に円
形の端部壁２１、２２より成るドラムの形状となってい
る容器５の集成体の用も果たしている。第一の円形壁２
１はシャフト１３にピンで固定されており、そのため、
そのシャフトが閉鎖容器の適所に存するとき、この壁が
受け器１の底部に近接状態となる。他方の円形壁２２
は、側壁２３に入り込み、係合することが可能な着脱自
在のストッパーを形成している。円形壁２２はその中心
にシャフト１３のネジの切られた端部が通る穴を有し、
容器５を蝶ナット２４を用いてシャフトの端部にネジ締
めすることによって密閉することができるようになって
いる。

【００４５】容器５を受け器１から取り出し得るように
するために、シャフト１３はモーター６には軸支、固定
されてはいない。容器５が機能している時、その容器の
軸が移動するのを防ぐために、ストッパー２に、その内
側の面において、管状端部ストップ２５が嵌め合わさ
れ、そのストップ２５に対して容器５の着脱自在の円形
壁２２が接するようになっている。

【００４６】容器５は閉鎖容器の中に２つのチャンバー
を画成している。容器の外側に位置する第一のチャンバ
ーと、消化されるべき１つ若しくは２つ以上の器官又は
器官の一部を受け入れるように意図された、容器の内側
に位置する第二のチャンバーである。選択的連通手段が
液体の第一チャンバーから第二チャンバーへの通過及び
液体と器官断片の第二チャンバーから第一チャンバーへ
の通過を可能にする。図１に示されるこの消化ディバイ
スでは、この選択的連通手段は容器５の管状壁２３を形
成している格子から成る。

【００４７】本発明による消化ディバイスは、また、閉
鎖容器の内容物の温度を制御するための手段も含む。こ
の温度制御手段は閉鎖容器を包囲しているジャケット２
６を含み、そのジャケット２６に、その中で液体の循環
を可能にする入口管２７と出口管２８が嵌め合わされて
いる。液体の温度は、加熱手段又は冷却手段（図示され
ず）により、ある設定温度と閉鎖容器内に設けられた温
度プローブ２９によって提供される情報の関数として調
整される。図示される態様では、温度プローブ２９は閉
鎖容器のストッパー２の中に取り付けられている。

【００４８】この消化ディバイスは次のようにして使用
される。即ち、容器５を受け器１から取り出し、その中
に消化されるべき器官又は器官の一部を入れる。この材
料は器官の接合組織を攻撃し得る酵素より成る、塩水
（例えば、ハンクス液）に溶解された消化溶液を用いて
予め膨張せしめられている。容器５を閉じた後、シャフ
ト１３をモーター６の出力シャフトと連結させるように
ベアリング１２に滑り込ませる。次いで、ストッパー２
を受け器１に嵌入することによって閉鎖容器を閉じ、そ
して受け器１とストッパー２とをクリップ９で一緒に保
持する。（例えば、排液パイプ３０の上に置かれたクラ
ンプで）閉じられた閉鎖容器の下部アクセス管４を用い
て、閉鎖容器に、上部アクセス管３を経由して、前以て
適切な温度にもたらされた塩水を満たす。次に、容器５
を回転させるためにモーター６のスイッチを入れ、同時
に閉鎖容器内の温度をある設定温度と実質的に等しく保
持するためにジャケット２６内に温度制御用液体を入
れ、循環させる。消化が完了したと考えられるとき、モ
ーター６のスイッチを切る。この段階で、容器５には、
主として、その管状壁２３を形成している格子の網目よ
り大きさが小さい器官断片が含まれている。閉鎖容器か
ら内容物を取り出し、そして消化により解放された細胞
又は細胞群を後記される方法で分離する。必要ならば、
均質性を改善するために、消化されるべき器官のタイ
プ、使用される消化液の組成及び容器５が占める閉鎖容
器（１、２）内の空間に依存して、閉鎖容器内に存在す
る液体を連続的に再循環させてもよい。この場合、アク
セス管３、４はポンプを備えるパイプで互いに接続され
る。

【００４９】本発明の他の２つの態様を示す図２及び３
において、同一又は同様の部材を示すために同じ参照数
字が再び使用されている。

【００５０】図２は本発明による消化ディバイスのもう
１つの態様を示すもので、それは固定された閉鎖容器の
内側に設けられた回転容器を含まないと言う点で図１の
ものとは本質的に異なる。ここでは、回転容器は実質的
に水平な軸の回りに回転駆動される閉鎖容器それ自体で
ある。回転ディストリビューター３１が、閉鎖容器の温
度制御用液体のジャケット２６内での循環を可能にす
る。閉鎖容器は、受け器１の開口が水平な面内にある第
一の位置から受け器１の開口が垂直な面内にある第二の
位置（図に示される位置）までその閉鎖容器をピボット
軸支することを可能にする関節型支持体３２の上に載置
されている。第一位置は受け器１に消化されるべき器官
と塩水を満たそうとする位置である。第二位置は消化デ
ィバイスの運転位置である。閉鎖容器がこの第二位置に
あるとき、この閉鎖容器にも塩水を満たすことができ
る。消化が完了したら、この第二位置で閉鎖容器を重力
で空にするのが有利である。そのとき、閉鎖容器の頂部
に見いだされるアクセス管は空気を閉鎖容器に流入させ
るために開けられ、また閉鎖容器の底部に設けられたア
クセス管はレシーバー溜めに接続される。

【００５１】図３は本発明による消化ディバイスの更に
もう１つの態様を示すもので、それは受け器１の開口が
水平面内に設けられていると言う点で図１のものとは本
質的に異なる。容器５は、２つの端部が頂部においてＵ
字開口の形状をなしている、受け器１の内側に固定され
ているベアリング３６、３７に載っている縦の回転軸３
５を含む。その２つの端部の一方において、容器５は受
け器１のふた２に固定されているモーター６で駆動され
る歯車３９と共同して作動すべく意図されている冠歯車
３８を備えている。このディバイスの１つの利点は、こ
のディバイスによれば塩水が満たされた閉鎖容器を、そ
の中に消化されるべき器官を導入する前に、所要温度に
もたらすことが可能になると言うことである。

【００５２】以上ここに正に述べた本発明によるディバ
イスの３つの態様は、次の細胞分離法を実施するのを可
能にする。

【００５３】生物学的に関心のある細胞又は細胞群（例
えば、膵臓のランゲルハンス氏島）を抽出することが望
まれる器官を、必要とされる滅菌条件下でドナー生物か
ら取り出し、次いで０℃よりやや高い温度、例えば約４
℃の温度で貯蔵液体中の処理場所に移す。次いで、この
器官を続いて行われる消化工程のために準備する：即
ち、脂肪とそれを取り囲んでいるだろう異物組織を取り
除く。

【００５４】接合組織中に保持されている生物学的に関
心のある細胞の抽出は、酵素による消化と機械的撹拌と
の併用によって成し遂げられる。まず第一に、器官に、
好ましくは自然にできている器官のチャンネル、即ち管
構造を経由して所定容量の消化液（接合組織の蛋白質を
解重合することができる酵素、典型的にはコラゲナーゼ
が溶解されている塩水より成る液体）を、最適の消化を
促進する温度（約３７℃）で注入する。その器官を同じ
温度の塩水を既に含んでいるか、又は次いでその塩水が
満たされる消化ディバイスの閉鎖容器に入れる。この塩
水は消化液を調製するためい用いられるものと同じであ
ってもよい。全消化期間を通じて、閉鎖容器の内容物の
温度は、この最適水準にその閉鎖容器のジャケット内に
入れられ、循環されている液体によって保たれる。

【００５５】器官を塩水に浸したら直ぐに、消化工程の
終点までその器官をその分解を促進するように撹拌す
る。本発明によれば、器官が付される撹拌は衝突又は何
らかの種類の異物による衝撃のいずれによっても行われ
ず、その撹拌は容器（図１、３）又は閉鎖容器（図２）
の回転によって生まれる器官自らの少なくとも部分的な
回転運動より成る。この回転運動は常に同じ方向の連続
運動であってもよいし、各方向での少なくとも１回のサ
イクルについて１つの方向の運動と次いで行われる反対
方向の運動とが交互に行われるものであってもよいし、
或いは、例えば１つの方向に半回転、次いで反対方向に
半回転する部分的な交互回転運動であってもよい。

【００５６】本発明によれば、器官の消化期間は、器官
が消化液で膨張されるその時から消化チャンバーが空に
されるその時までと設定されるように選ぶのが有利であ
る。初めの観察では、消化液に付された器官の分解は進
行性の現象ではないが、かなり短時間にわたって起こ
る。それは、従って、所定の器官と所定のタイプの消化
（液体の性質、撹拌の様式）にとって、接合組織が十分
に分解されて生物学的に関心のある細胞又は細胞群を消
化液に、それら細胞又は細胞群を攻撃してしまう時間無
しに、解放する終点での最適消化時間を決めるのに十分
な時間である。

【００５７】前記の消化ディバイスの構造のために、閉
鎖容器に含まれる液体を均質化する目的には、この液体
を閉鎖容器の上に環状に巻かれたパイプに設けられたポ
ンプで循環させることは必要でない。図１及び３の態様
では、閉鎖容器中の液体の均質化は、容器の回転とその
中の器官の運動の両者によってもたらされる。第一チャ
ンバーの中まで延在しているフィンも容器５に隣接して
いることができる。図２の態様では、液体は、閉鎖容器
の回転速度を、器官が閉鎖容器の管状壁に投げ付けられ
るが、中途で止まるようにし、それによって例えばその
自重の作用下で壁から剥がれ、閉鎖容器の下部に落下し
て戻り、消化液中に小さな渦巻きを生み出すように選ぶ
ことによって混合することができる。

【００５８】消化期間の終点において、閉鎖容器の内容
物を、好ましくは重力で受け器に取り出し、次いでその
閉鎖容器を塩水で洗浄する。その塩水もこの受け器の中
に集められる。

【００５９】消化液と洗浄液、接合組織と断片及び生物
学的に関心のある細胞及び細胞群の混合物より成るその
受容受け器の内容物を、次に、細胞又は細胞群は通す
が、考えている器官に依存して変化する割合の接合組織
断片は保持する校正済みのスクリーンを通過させる。

【００６０】次に、消化された器官を消化液と洗浄液か
ら分離するために、濾液を遠心分離にかける。その遠心
分離ペレットを貯蔵液体の中に入れ、懸濁させる。

【００６１】最後に、ランゲルハンス氏島を連続密度勾
配装置で遠心分離し、精製する。細胞を連続密度勾配装
置で分離するその原理は、特に米国特許第５，３６８，
５４２号明細書に説明されている。

【００６２】

【実施例】４回の繰返実験において、子ブタの４個の膵
臓（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４）の脾葉の一部分からラ
ンゲルハンス島を分離した。各実験中に、Ｐ１、Ｐ２及
びＰ３については４００ｍＬの、Ｐ４については２００
ｍＬのコラゲナーゼ溶液（３７℃）を膵臓にヴィルズン
グ管経由で注入し、次いでその膵臓から取った脾葉の部
分を図１に示した消化ディバイスの閉鎖容器内の回転容
器５の内部に入れた。コラゲナーゼ溶液は、Ｐ１、Ｐ２
及びＰ３の場合はコラゲナーゼ５００ｍｇをハンクス液
４００ｍＬに溶解、含有するものであり、Ｐ４の場合は
コラゲナーゼ５００ｍｇをハンクス液２００ｍＬに溶
解、含有するものであった［ハンクス液は、特にシグマ
社（Ｓｉｇｍａ）からＨ１３８７なる商品番号で入手で
きるものであった］。

【００６３】使用ディバイスの特徴は次の通りであっ
た：閉鎖容器はガラス製で、その内容積は１Ｌであり、
また内部容器は、その管状壁が辺の長さ３ｍｍの四角の
網目を有する金属格子より成る、その内容積が０．３４
Ｌのものであった。

【００６４】閉鎖容器に３７℃のハンクス液を完全に満
たし、次いでその閉鎖容器に２本のアクセス管３、４を
パイプで接続して閉回路を形成した。閉回路の中にハン
クス達させた後（Ｐ１及びＰ４の場合以外）、その温度
に保持した。総消化時間は５０分に設定し、器官断片を
その総時間の２／３よりやや長い時間閉鎖容器内で撹拌
した。容器の回転速度は４０回転／分に設定した。

【００６５】消化期間の終点で閉鎖容器の内容物を重力
でレシーバー受け器に取り出し、次いでその閉鎖容器を
ハンクス液５００ｍＬで洗浄した。チャンバーに導入し
た脾葉部分は実質的に全て消化された（平均９６％）。

【００６６】

【表１】

【００６７】懸濁状態の消化された膵臓組織から形成さ
れた、レシーバー受け器の内容物（約９００ｍＬ）を次
に２つのスクリーン：即ち、Ｐ１及びＰ２については１
２０ｇでの５分間の第１回遠心分離の後に、網目の大き
さが１．２５ｍｍのスクリーンを、次いで網目の大きさ
が０．８３ｍｍのスクリーンを；Ｐ３及びＰ４について
は遠心分離前に、網目の大きさが１ｍｍのスクリーン
を、次いで網目の大きさが０．６ｍｍのスクリーンを連
続的に通過させた。

【００６８】濾過後、第１回遠心分離から得られたペレ
ットをＰ１及びＰ２については１２０ｇでもう２回、各
回５分間遠心分離された。

【００６９】Ｐ３及びＰ４の濾液は、Ｐ３については１
２０ｇで５分間、Ｐ４については１００ｇで２分間、１
回だけ遠心分離した。

【００７０】最後の遠心分離から得られたペレット（約
１８ｍＬ）を修正ＵＷ溶液［トランスプランテーション
（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）、第５７巻、第３
号、第３４６〜３５４頁（１９９４年２月）に記載され
るウイスコンシン大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ
Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）溶液；ＵＷ溶液はヒドロキシ澱粉
が含まれない点で修正されている］約１４５ｍＬに再懸
濁させ、そしてそのランゲルハンス島をナイコデンツ
（Ｎｙｃｏｄｅｎｚ）連続密度勾配装置［ナイコムド・
ファーマ社（Ｎｙｃｏｍｅｄ Ｐｈａｍａ）が市販する
製品］により２０００回転／分で回転している２９１１
ＣＯＢＥ細胞分離機中で８分間精製した。

【００７１】下記の表２及び３は行われた精製の結果を
示すものである。

【００７２】

【表２】

【００７３】（１）Ｉ．Ｅ．＝直径１５０μｍの理論島
（ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｉｓｌｅｔ）に対応する島
当量（ｉｓｌｅｔ−ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ） （１００
に最も近い値に丸めた数）。

【００７４】

【表３】

【００７５】（１）Ｉ．Ｅ．＝直径１５０μｍの理論島
に対応する島当量（１００に最も近い値に丸めた数）。

【００７６】

【式１】

【００７７】

【式２】

【００７８】

【式３】

【００７９】

【式４】

【００８０】消化収率（５０００島当量／ｇ−膵臓）と
総収率（３６００島当量／ｇ−膵臓）は公になっている
最良の結果［それぞれ５５８０及び３４１０：ケルーコ
ンテＪ（Ｋｅｒｒ−Ｃｏｎｔｅ Ｊ）等のトランスプラ
ンテーション・プロシーディングズ（Ｔｒａｎｓｐｌａ
ｎｔａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ）、１９９
４、２６（２）、６１４−５］に匹敵する。精製収率
（８５％）と分離指数（１．８）は公になっている性能
水準［それぞれ４５％及び約１：ケルーコンテ Ｊ等の
トランスプランテーション・プロシーディングズ、２６
（２）、６１４−５；７４％：チャドウィク ＤＲ（Ｃ
ｈａｄｗｉｃｋ ＤＲ）等のＨｏｒｍ．Ｍｅｔａｂ．Ｒ
ｅｓ．、１９９４、２６（１）、６４］より高い。

【００８１】本発明は以上述べた態様に限定されず、そ
れらに代わる態様も許容するものである。特に、前記の
ディバイスを構成する要素の形状、受け器１用の円筒状
タンク及び容器５用のドラムは限定されるものと考える
べきではない。特に、容器５は容易と思われる通りに直
角角柱形状又は球形形状となすことができるだろう。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は本発明による消化ディバイスの第一の態
様の垂直面に沿った断面図である。

【図２】図２は本発明による消化ディバイスの第二の態
様の垂直面に沿った断面模式図である。

【図３】図３は本発明による消化ディバイスの第三の態
様の垂直面に沿った断面模式図である。

【符号の説明】

１、２ 閉鎖容器 １ 受け器 ２ ストッパー又はふた ３、４ アクセス管 ５ 器５ ６ モーター ７、８ 放射状表面 ９ クリップ １０、１７ 円周溝 １１ 管状シース １２、３６、３７ ベアリング １３ 駆動シャフト １４ カラー １６ ナット １８ 継手部材 １９ 皿穴 ２０ フェルール ２１、２２ 端部壁 ２３ 管状側壁 ２４ 蝶ナット ２５ ストップ ２６ ジャケット ２７ 入口管 ２８ 出口管 ２９ 温度プローブ ３０ 排液パイプ ３１ 回転ディストリビューター ３２ 関節型支持体 ３８ 冠歯車 ３９ 歯車

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 少なくとも１つの器官又は器官の一部
   を、それより生物学的に関心のある細胞又は細胞群を抽
   出するために、消化するディバイスにして、 −閉鎖容器（１、２）、及び −生物学的消化媒体の作用に付されている器官の分解を
   促進するために、該閉鎖容器（１、２）の中に入れられ
   た該器官自らを少なくとも部分的に回転させるための手
   段（６）を含んで成る上記ディバイス。
2. 【請求項２】 閉鎖容器（１、２）の中に入れられた器
   官を回転させるための手段が、該閉鎖容器（１、２）を
   実質的に水平な軸の回りに回転させるために、該閉鎖容
   器（１、２）に連結されていてもよいモーター（６）か
   ら成ることを特徴とする、請求項１に記載のディバイ
   ス。
3. 【請求項３】 閉鎖容器（１、２）の中に入れられた器
   官を回転させるための手段が −器官を収容するために該閉鎖容器（１、２）の中に設
   けられている容器にして、その外側に位置する第一チャ
   ンバーとその容器内部に位置する第二チャンバーを画成
   している該容器（５）； −該容器（５）を１つの軸の回りに回転させるための手
   段（６）；及び −該第一チャンバーから該第二チャンバーへと液体を通
   過させ、かつ該第二チャンバーから該第一チャンバーへ
   と器官断片を通過させるための、該第一チャンバーと該
   第二チャンバーとの間の選択的連通手段（２３）から成
   ることを特徴とする、請求項１に記載のディバイス。
4. 【請求項４】 容器（５）が実質的に水平な対称軸を有
   していることを特徴とする、請求項３に記載のディバイ
   ス。
5. 【請求項５】 容器（５）が、管状壁（２３）が接合さ
   れている２つの実質的に円形の端部壁（２１、２２）を
   有する、実質的にドラムの形状をしていることを特徴と
   する、請求項３及び４のいずれか１項に記載のディバイ
   ス。
6. 【請求項６】 容器（５）を回転させる手段が、該容器
   （５）をその対称軸の回りに回転させるために、該容器
   に連結されていてもよいモーター（６）から成ることを
   特徴とする、請求項３〜５のいずれか１項に記載のディ
   バイス。
7. 【請求項７】 選択的連通手段が、容器（５）の壁（２
   ３）の、格子より成る少なくとも一部分から成ることを
   特徴とする、請求項３〜６のいずれか１項に記載のディ
   バイス。
8. 【請求項８】 容器（５）の管状壁（２３）が格子より
   成ることを特徴とする、請求項３及び７のいずれか１項
   に記載のディバイス。
9. 【請求項９】 閉鎖容器が消化されるべき器官を導入す
   るための、実質的に垂直な面に位置する開口を有する受
   け器（１）から成ることを特徴とする、請求項２〜８の
   いずれか１項に記載のディバイス。
10. 【請求項１０】 閉鎖容器が、消化されるべき器官を導
    入するための、実質的に水平な面に位置する開口を有す
    る受け器（１）から成ることを特徴とする、請求項３〜
    ８のいずれか１項に記載のディバイス。
11. 【請求項１１】 第一チャンバーの中で液体を混合する
    ための手段を含むことを特徴とする、請求項３〜１０の
    いずれか１項に記載のディバイス。
12. 【請求項１２】 第一チャンバーの中で液体を混合する
    手段が、容器（５）の外表面に取り付けられ、第一チャ
    ンバーの中まで延在しているフィンから成ることを特徴
    とする、請求項３及び１１のいずれか１項に記載のディ
    バイス。
13. 【請求項１３】 次の： −閉鎖容器（１、２）を少なくとも部分的に包囲してい
    るジャケット（２６）、 −液体をジャケット（２６）の中に循環させるための手
    段（２６）、及び −ジャケット（２６）の中に入れられ、循環せしめられ
    る該液体の温度を調整するための手段（２９）から成
    る、該閉鎖容器の内容物の温度を制御するための手段
    （２６、２９）を含むことを特徴とする、請求項１〜１
    ２のいずれか１項に記載のディバイス。
14. 【請求項１４】 ある器官又は器官の一部から生物学的
    に関心のある細胞又は細胞群を単離するための方法にし
    て、次の： −該器官に生物学的に関心のある細胞を一体に保持して
    いる接合組織を分解することができる消化液を注入し； −該器官を閉鎖容器（１、２）に入れ、そして該閉鎖容
    器（１、２）に液体を満たし； −該器官を、消化中に該器官が分解してしまうまで、自
    らの少なくとも部分的な回転運動に付し； −消化が完了したとき該閉鎖容器（１、２）から内容物
    を取り出し；そして −該閉鎖容器（１、２）の内容物から生物学的に関心の
    ある細胞を分離する工程からなる上記方法。
15. 【請求項１５】 器官を常に同じ方向に連続回転運動さ
    せることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
16. 【請求項１６】 器官をある時は１つの方向に、またあ
    る時は反対方向に交互に回転運動させることを特徴とす
    る、請求項１４に記載の方法。
17. 【請求項１７】 消化液を閉鎖容器（１、２）へのその
    導入に先立って最適消化温度にもたらし、消化中この温
    度に保持することを特徴とする、請求項１４〜１６のい
    ずれか１項に記載の方法。
18. 【請求項１８】 閉鎖容器（１、２）を空にする工程の
    後に該閉鎖容器を洗浄し、次いで再び空にすることを特
    徴とする、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方
    法。
19. 【請求項１９】 閉鎖容器（１、２）を重力で空にする
    ことを特徴とする、請求項１５〜１８のいずれか１項に
    記載の方法。
20. 【請求項２０】 生物学的に関心のある細胞の分離工程
    が、閉鎖容器（１、２）の内容物を前濾過する工程から
    成ることを特徴とする、請求項１５〜１９のいずれか１
    項に記載の方法。
21. 【請求項２１】 生物学的に関心のある細胞の分離工程
    が、生物学的に関心のある細胞又は細胞群を含有する遠
    心分離ペレットを、生物学的に関心のあるいかなる細胞
    又は細胞群も実質的に含有していない液相から分離する
    ための遠心分離工程から成ることを特徴とする、請求項
    １５〜２０のいずれか１項に記載の方法。
22. 【請求項２２】 生物学的に関心のある細胞の分離工程
    が −遠心分離ペレットを貯蔵液体の中に懸濁させ；そして −得られた懸濁液を、生物学的に関心のある細胞又は細
    胞群を分離するために、連続密度勾配法で遠心分離する
    工程も含むことを特徴とする、請求項２１に記載の方
    法。
23. 【請求項２３】 消化液の器官への注入工程の開始と閉
    鎖容器（１、２）の内容物を取り出す工程の開始との間
    の経過時間が、予め定められた一定の期間であることを
    特徴とする、請求項１５〜２０のいずれか１項に記載の
    方法。