KR100979664B1 - 지방 유래 간세포 및 격자 - Google Patents

Abstract

본 발명은 지방-유래 간세포 및 격자를 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 지방세포 및 적혈구 및 결합조직간세포의 클론집단이 실질적으로 없는 지방-유래 간세포를 제공한다. 상기 세포는 생체 내, 혹은 시험관 내에서 단독으로 혹은 생물학적으로 적합한 조성물과 함께 분화된 조직 및 구성을 생산할 수 있다. 부가적으로, 상기 세포는 확장되고 배양되어 호르몬을 생산할 수 있으며, 다른 세포집단의 증식 및 확장을 지지하기 위한 조절된 배양배지를 제공할 수 있다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 세포가 실질적으로 없고 지방조직으로부터의 세포외 매트릭스 물질을 포함하는 지방-유래 세포격자를 제공한다. 상기 세포격자는 생체 내 혹은 생체 외에서 원기(anlagen) 혹은 성숙한 조직 혹은 구조로까지 세포의 분화 및 증식을 촉진하기 위한 기질로서 사용될 수 있다.

Description

지방 유래 간세포 및 격자{Adipose-derived stem cells and lattices}

발명의 배경

근년에, 주로 골수로부터 얻어지는 중간엽(mesenchymal) 간세포(stem cells)의 동정은 조직 재증식 및 분화의 발전을 일으켰다. 그러한 세포는 골수 및 골막에서 발견되는 다능성(pluripotent) 세포이며, 그것은 다양한 중간엽 혹은 결합조직으로 분화할 수 있다. 예를 들어, 그러한 골수유래 간세포는 5-아자사이티딘과 같은 시약에의 노출로 유발되어 근세포로 발달할 수 있다(Wakitani 등, Muscle Nerve, 18(12), 1417-26(1995)). 그러한 세포는 연골, 지방 및 뼈와 같은 조직의 수복에 유용하고(예를 들어, 미국특허 5,908,784, 5,906,934, 5,827,740, 5,827,735를 참조), 유전자 조작을 통한 적용이 가능하다(예를 들어 5,591,625 참조)고 제안되었다. 그러한 세포의 동정이 조직의 재증식 및 분화의 발전을 유발시키는 반면에, 그러한 세포의 이용은 여러 기술적 장애에 의해서 저지된다. 그런 세포의 이용에 대한 한 단점은 그것이 매우 드물어서(1/2,000,000세포 만큼 적다고 표현) 그것을 획득하고 분리하기 위한 방법은 어렵고 비용이 많이 든다. 물론, 골수 채취는 대개 공여자에게 고통스럽다. 더욱이, 그런 세포는 특이적으로 스크린된 혈청 로트(lots)를 사용하지 않는다면 분화를 유도하지 않고 배양하기 어렵고, 그러한 간세포의 사용에 더 많은 비용과 노동력을 더하게 된다. 그러므로, 다능성 간세포, 특히 비용이 드는 배양물의 전스크린을 할 필요가 없이 배양될 수 있는 세포를 보다 간편하게 얻을 수 있는 원천이 필요하다.

조직공학에서의 다른 접근은 세포가 특별하게-한정된(defined) 배양물에서 성장하여 3차원의 구조를 생산해 낼 수 있다는 것을 보여주었다. 특별한 한정(definition)은 다양한 비세포 격자 또는 매트릭스를 사용하여 세포의 성장과 분화를 지지하고 안내함으로써 이루어진다. 이러한 기술이 아직 초기에 있는 반면, 동물모델 실험은 다양한 비세포 격자 물질를 이용하여 전체 조직을 재생산하는 것이 가능하다는 것을 증명하였다(예, Probst 등, BJU Int., 85(3), 362-7(2000) 참조). 적절한 격자 물질은 종양세포주로 부터 분리된 분비된 세포외 매트릭스 물질(예, Engelbreth-Holm-Swarm 종양 분비 매트릭스-"마트리겔(matrigel)")이다. 이 물질은 유형Ⅳ 콜라겐과 성장인자를 함유하고 세포성장에 탁월한 기질을 제공한다(예, Vukicevic 등, Exp. Cell Res, 202(1), 1-8(1992)). 그러나, 이런 물질은 어떤 세포의 악성 변환을 또한 촉진시키기 때문에(예, Fridman 등, Int. J. Cancer, 51(5), 740-44(1992)), 임상적 적용은 부적당하다. 다른 인공 격자물질이 개발되었지만, 세포 혹은 생체 내 사용 시 환자에게 독성이 있을 수 있다. 따라서, 세포집단의 배양과 증식에 기질로서 사용이 적합한 격자물질의 필요성이 남아있다.

그러므로, 본 발명의 목적은 다능성 간세포, 특히 비용이 드는 배양물의 전 스크린을 할 필요가 없이 배양될 수 있는 세포를 보다 간편하게 얻을 수 있는 원천을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 세포집단의 배양과 증식에 기질로서 사용이 적합한 격자물질을 제공하는 것이다.

본 발명의 간략한 요약

본 발명은 지방-유래 간세포와 격자를 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 지방세포(adipocytes) 및 적혈구가 실질적으로 없는 지방-유래 간세포 및 클론집단의 결합조직 간세포를 제공한다. 상기 세포를 단독으로, 혹은 생물학적으로 적합한 조성물 내에서, 이용되어 생체 내 혹은 시험관 내에서 분화된 조직 또는 구조를 생산해 낼 수 있다. 부가적으로, 상기 세포는 확장되고 배양되어 호르몬을 생산하고 다른 세포집단의 증식과 확장을 뒷받침하기 위한 조절된 배양배지를 생산할 수 있다. 또 다른 측면에서는, 본 발명은 실질적으로 세포가 없는 지방유래 격자를 제공하며, 그것으로는 지방조직으로부터 유래한 세포외 매트릭스 물질이 있다. 상기 격자는 시험관 내 혹은 생체 내에서든 기질로서 작용하여 세포의 원기(anlagen) 혹은 성숙한 조직 혹은 구조로의 증식 및 분화를 촉진할 수 있다.

지방조직이 얼마나 풍부한 지를 고려하면, 본 발명의 세포 및 격자가 다능성 간세포의 준비된 원천임을 알 수 있다. 게다가, 상기 세포는 기스크린된 혈청 로트를 요구하지 않는 배양조건 하에서 미분화된 상태로 배양되어 통과될 수 있기 때문에, 본 발명의 세포는 다른 유형의 간세포보다 상당히 저렴한 비용으로 유지될 수 있다. 부가적인 발명의 특징뿐 아니라 본 발명의 이러한 그리고 다른 잇점들은 함께 첨부된 도면 및 다음의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다.

발명의 상세한 설명

본 발명의 한 측면은 지방유래 간세포에 관한 것이다. 바람직하게는, 간세포는 실질적으로 다른 세포유형(예, 지방세포, 적혈구, 다른 간질세포 등) 및 세포외 매트릭스 물질이 없다; 보다 바람직하게는 상기 간세포는 그러한 다른 세포유형 및 매트릭스 물질이 완전히 없다. 바람직하게는, 본 발명의 세포는 영장류의 지방조직으로부터 유래되고, 보다 바람직하게는 더 고등한 영장류(예, 비비 혹은 유인원)에서 유래된다. 전형적으로, 본 발명의 세포는 여기에 기술된 바와 같은 방법을 사용하여 인간 지방조직에서 유래할 것이다.

본 발명의 세포는 어떤 유형의 간세포일 수도 있은나, 조직공학에서의 사용을 위해 바람직하게는 상기 세포는 중배엽 원기이다. 전형적으로 그런 세포는 단리될 때, 그런 세포는 두 개 혹은 그 이상의 중배엽 혹은 중간엽 발달 표현형을 유지한다(즉, 그것들은 다능성이다). 특히 그러한 세포는 일반적으로 성숙한 지방조직, 뼈, 심장의 다양한 조직(예, 심장막, 심장외막, 심장근육외층, 심장근육층, 심장막, 판막조직 등), 피부 결합조직, 혈관조직(예, 소체, 심내막, 혈관상피 등), 근육조직(골격근, 심장근육, 평활근 등을 포함함), 비뇨생식기 조직(예, 신장, 전신장, 후신관 및 중간신장관, 후신관 게실, 요관, 신우, 집합관, 여성생식구조의 상피(특히 난관, 자궁 및 질)), 흉막 및 복막조직, 혈관, 중배엽 내분비 조직(예, 부신피질 조직), 및 간질세포(예, 골수)와 같은 중배엽 조직으로 발달할 수 있는 능 력을 갖는다. 물론 상기 세포는 성숙한 세포로 발달할 수 있는 능력을 갖고있기 때문에, 적절한 전구세포(예, 전지방세포, 전근육세포, 전골세포 등)로 분화함으로써 그 발달 표현형 능력을 또한 실현할 수 있다. 또한, 배양조건에 따라, 세포는 배아, 태아, 조혈성의, 신경성의 신경통성의 발달 표현형과 같은 발달 표현형을 또한 나타낼 수 있다. 이런 의미에서, 본 발명의 세포는 지방생성, 연골생성, 심장생성, 피부생성, 혈액생성, 혈관생성, 근육생성, 신원발생, 신경생성, 신경통생성, 비뇨생식기생성, 골생성, 심막생성, 복막생성, 흉막생성, 내장생성 및 간질생성 발달 표현형과 같은 발달 표현형을 또한 갖을 수 있다. 그러한 세포가 이러한 발달 표현형을 두가지 이상 보유하는 반면, 바람직하게 그런 세포는 세 개 이상의 발달 표현형을 갖고(예, 4개 이상의 중배엽 혹은 중간엽 발달 표현형), 본 발명의 간세포의 어떤 유형은 분화의 방법을 통해서 어떠한 중배엽 표현형을 얻을 수 있는 힘을 갖는다.

본 발명의 간세포는 어떤 적절한 방법에 의해 지방 조직으로부터 얻을 수 있다. 어떠한 그런 방법에 있어서의 첫 단계는 원천 동물로부터 지방조직의 분리를 요구한다. 동물 내의 지방 간질세포가 살아있는 한, 동물은 살아있는 것이나 죽은 것일 수 있다. 전형적으로, 널리 알려진 외과적 혹은 흡입 지방조직절제술과 같은 프로토콜을 사용하여, 살아있는 공여자로부터 얻는다. 정말로, 지방흡입방법이 매우 보편적이기 때문에, 지방흡입 유출물이 본 발명의 세포가 유래될 수 있는 특히 바람직한 원천이다.

그러나, 얻어진 뒤에 지방조직을 처리하여 나머지 물질로부터 간세포를 분리 하도록 한다. 지방조직으로부터 활용되지 않는 물질(손상된 조직, 혈액, 적혈구 등)을 제거하는 단계인 한 프로토콜에서는 생리학적으로 적합한 식염수 용액(예, 인산완충용액(PBS))으로 지방조직을 세척하고, 그리고 나서 격렬히 교반한 후에, 방치한다. 그러므로, 세척 및 방치 단계는 일반적으로 상등액에 상대적으로 잔해물이 없어질 때까지 반복한다.

남아있는 세포는 일반적으로 다양한 크기의 덩어리로 존재할 것이고, 상기 프로토콜은 세포 자체의 손상을 최소화하는 반면, 총구조를 붕괴시키도록 맞춰진 단계를 이용하여 진행한다. 이런 목적을 이루는 한 방법은 세척된 세포 덩어리를 세포간의 결합을 약화시키거나 파괴시키는 효소로 처리하는 것이다(예, 콜라게나제, 디파아제, 트립신, 등). 그러한 세포처리의 양과 지속시간은 적용되는 조건에 따라 다양할 것이나, 그러한 효소의 사용은 당해 기술분야에서 일반적으로 알려져 있다. 선택적으로, 혹은 그러한 효소의 처리와 연관하여, 기계적 교반, 음파 에너지, 열에너지 등과 같은 다른 처리를 이용하여 셀덩어리를 붕괴시킬 수 있다. 분열이 효소적 방법에 의해 이루어진다면, 적절한 시간 후에 효소를 중화시켜서 세포에의 해로운 영향을 최소화시키는 것이 바람직하다.

상기 붕괴단계는 전형적으로 응집된 세포(일반적으로 리포좀)의 슬러리 혹은 현탁액 및 일반적으로 단리 간질세포(예, 적혈구, 평활근 세포, 내피세포, 섬유아세포, 및 간세포)를 함유하는 액상 분획을 생산한다. 분리공정에서 다음 단계는 응집된 세포를 간질세포에서 분리하는 것이다. 이것은 간질세포를 상등액에 의해 둘러싸인 펠렛으로 모이게 하는 원심분리에 의해 이루어질 수 있다. 그리고 나서 상등액을 버리고 펠렛을 생리학적으로 적합한 액체에 현탁시킨다. 더욱이, 현탁된 세포는 전형적으로 적혈구를 함유하고, 대부분의 프로토콜에서 이것들을 용해시키는 것이 바람직하다. 적혈구를 선택적으로 용해시키는 방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있고, 어떠한 적절한 프로토콜도 이용할 수 있다(예를 들어, 고장 혹은 저장 배지에서 배양)물론, 적혈구가 용해된다면, 남아있는 세포들을 예를 들어, 여과 혹은 원심분리에 의해 용해물로부터 분리해야 한다. 물론 적혈구가 용해되는지 여부에 관계없이 상기 현탁된 세포를 한번 이상 연속적으로 세척하고, 다시 원심분리하고 재현탁하여 더 순수하게 얻을 수 있다. 택일적으로, 상기 세포를 셀 소터(cell sorter)나 세포 크기 및 입자도를 근거로 하여 분리할 수 있으며, 간세포는 상대적으로 작고 비과립상이다. 텔로머라아제(telomerase)의 발현은 간세포의 특이적 마커로서 또한 작용할 수 있다. 그것들은 예를 들어 자성 비드를 사용하거나 일어서 면역조직화학적으로 분리될 수 있다. 본 발명의 세포를 분리하기 위한 어떠한 단계나 방법도 원한다면 손으로 할 수 있다. 택일적으로, 그런 세포를 분리하기 위한 방법을 당해 기술분야에 알려진 많은 적절한 장치로 촉진시킬 수 있다(예를 들어 미국특허 5,786,207을 참조).

최종 분리 및 재현탁 후에, 세포를 배양하고 원한다면 수율을 평가하기 위한 숫자와 생존능력에 대해 평가할 수 있다. 바람직하게는, 분화시키지 않고 표준 세포배양배지(예, 전형적으로 5-15%(예, 10%)혈청(예, 우태아혈청, 말혈청 등)으로 보충된 DMEM)를 사용하여 배양할 수 있다. 바람직하게는, 세포를 발달 표현형으로 남아있는 반면, 분화시키지 않고 그러한 배지에서 적어도 5번 통과(passage)시킬 수 있고, 보다 바람직하게는 발달 표현형을 상실하지 않고 적어도 10번(예, 적어도 15번 혹은 적어도 20번까지) 통과시킬 수 있다. 그러므로, 일반적으로 중간엽 간세포(예를 들어 골수에서 유래된)의 경우에, 본 발명의 세포를 분화를 유도하지 않고 배양하는 것이 특별히 스크린된 혈청 로트 없이 이루어질 수 있다. 생존 가능성과 수율을 측정하는 방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다(예, 트립판 블루 배재방법)

단리한 후에, 간세포를 표현형 동정에 의해 더욱 분리하여, 두 개이상의 상기 언급한 발달 표현형을 갖는 세포를 동정한다. 전형적으로, 간질세포를 약 100세포/cm² 내지 약 100,000세포/cm²(약 500세포/cm², 내지 약 50,000세포/cm², 또는 보다 상세하게 약 1,000세포/cm² 내지 약 20,000세포/cm²)사이와 같은 원하는 밀도로 플레이팅 한다. 더 낮은 밀도로 플레이팅 하는 경우(예, 약 300세포/cm²), 세포를 보다 쉽게 클론으로 단리할 수 있다. 예를 들어, 몇일 후에 그런 농도로 플레이팅된 세포는 집단으로 번성할 것이다.

그런 세포 및 집단은 원한다면 세포 집단 클로닝을 위한 적절한 방법을 이용하여 클론으로 확장될 수 있다. 예를 들어, 번성한 세포의 집단은 생리학적으로 선택되어서 별도의 플레이트(혹은 다중-웰 플레이트의 웰)에 접종할 수 있다. 선택적으로, 세포를 각각의 웰로 단일 세포를 위치시키는 것을 촉진하기 위한 통계적 비율(예를 들어, 약 0.1 내지 1세포/웰 혹은 0.5세포/웰 같은 0.25 내지 0.5세포/웰)로 다중-웰 플레이트에 서브클론할 수 있다. 물론, 세포를 낮은 밀도로 플레이팅하 고 (예, 페트리-디쉬 혹은 다른 적절한 기질) 클로닝 고리(ring)과 같은 장치를 이용하여 다른 세포로부터 분리함으로써 클론할 수 있다. 택일적으로, 방사(irradiation) 원천을 사용 가능한 경우에, 세포를 단일층으로 자라게 하고, 그리고 나서 하나를 감추고 단일층에 있는 나머지 세포를 방사함으로써 얻을 수 있다. 그러고 나면, 살아 남은 세포들은 클론 집단으로 자랄 것이다. 클론 집단의 증식은 어떤 적절한 배양배지에도 확장될 수 있지만, 간세포(본 발명의 간세포 혹은 다른 간세포)를 클로닝 하기 위한 바람직한 배양조건은 간질세포(예, 지방흡입 아스피레이트(aspirate)의 간질 혈관부분에서 유래한 세포)로 조절된(conditioned) 약 2/3F₁₂배지+20%혈청(바람직하게는 우태아혈청) 및 약 1/3 표준 배지이다. 상대적인 비율은 부피로 한정된다.

어떠한 경우에도, 클론이든 아니든, 단리된 세포를 그것들의 발달 표현형이 평가될 수 있는 적절한 지점까지 배양할 수 있다. 언급한 바와 같이, 본 발명의 세포는 적어도 두 개의 상기 언급한 발달 표현형을 갖는다. 그러므로, 주어진 클론에서 유래된 하나이상의 세포를 처리하여 그것이 그러한 발달 표현형을 갖고 있는지의 여부를 확인할 수 있다. 한 유형의 처리는 분화되는 각각의 유형의 성숙한 세포(또는 그것의 전구체)에 대한 노출로써 조절된 배양배지(예, 근육형성의 분화를 유도할 수 있는 근육세포에 대한 노출로써 조절된 배지, 심장 혈관 조직으로의 분화를 유도할 수 있는 심장혈관세포에 대한 노출로써 조절된 배지, 등)에서 본 발명의 세포를 배양하는 것이다. 물론, 분화를 유도하기 위한 한정된 배지를 사용할 있 다. 예를 들어, 지방형성 발달 표현형을 예를 들어, 당질코르티코이드(예, 이소부틸-메틸잔틴, 덱사메타손, 히드로코르티손, 코르티손, 등), 인슐린, cAMP의 세포내 농도를 높이는 화합물(예, 디부티릴-cAMP, 8-CPT-cAMP(8-(4)클로로페닐티오)-아데노신3',5'사이클릭모노포스페이트; 8-브로모-cAMP; 디옥타노일-cAMP, 포르스콜린(forskolin) 등) 및/또는 cAMP의 분해를 억제하는 화합물(예, 메틸 이소부틸잔틴, 테오필린, 카페인, 이도메타신, 등)을 함유하는 지방형성을 촉진하는 배지에 상기 세포를 노출시킴으로써 평가할 수 있다. 그러므로, 약 10^-9M 내지 약 10^-6M 사이의(예를 들어 약 1μM) 덱사메타손과 조합된 약 1μM 및 약 10μM 사이의 인슐린에 간세포를 노출시키면 지방형성의 분화를 유도할 수 있다. 그런 배지는 원한다면 인도메타신(예를 들면, 100μM 내지 200μM)과 같은 다른 시약을 포함할 수 있고, 바람직하게는 상기 배지는 혈청이 없다. 골형성 분화 표현형을 약 10μM 내지 약 50μM의 아스코르베이트-2-포스페이트와 조합한 약 10^-7M 내지 약 10^-9M 사이(예, 약 1μM)의 덱사메타손 및 약 10nM 내지 약 50nM 사이의 β-글리세로포스페이트에 세포를 노출시킴으로써 평가할 수 있고, 상기 배지는 또한 혈청(예, 소혈청, 말혈청 등)을 포함할 수 있다. 근형성 분화를 상기 세포를 바람직하게는 혈청이 풍부한 배지(예, 약 10% 내지 20%의 혈청(소혈청, 말혈청, 혹은 그것들의 혼합)을 포함하는)에서, 약 10μM 내지 100μM의 히드로코르티손에 노출시킴으로써 유도할 수 있다. 연골형성의 분화를 세포를 약 1μM 내지 10μM 사이의 인슐린, 약 1μM 내지 약 10μM 사이의 트랜스페린, 약 1ng/ml 내지 10ng/ml 사이의 전환성장인자(TGF)β 1, 그리고 약 10nM 내지 약 50nM 사이의 아스코르베이트-2-포스페이트(50nM)에 노출시킴으로써 유도할 수 있다. 연골 분화를 위해, 바람직하게는 세포를 고밀도(예를 들어, 약 수백만 세포/ml로 혹은 마이크로매스 배양기술을 사용하여)로 배양하며, 그리고 또한 낮은 양의 혈청(예, 약 1% 내지 약 5%)의 존재 하에서 배양한다. 상기 세포를 또한 발달상 보다 미성숙한 표현형(예, 태아 혹은 배아 표현형)을 갖도록 유도할 수 있다. 그러한 유도는 본 발명의 세포를 태아 및 배아 내의 조건을 닯은 조건에 노출시킴으로써 이루어진다. 예를 들어, 본 발명의 세포 혹은 집단을 태아 혹은 배아로부터 단리된 세포와 함께 혹은 태아 혈청의 존재 하에서 공동배양할 수 있다. 이러한 라인(lines)들과 함께, 세포를 각각의 유형의 성숙한 세포 혹은 그 전구체와 함께 공동배양함으로써 상기 언급한 중배엽 계통(lineage)으로 분화하도록 유도할 수 있다. 그러므로, 예를 들어, 근육생성 분화는 본 발명의 세포를 근육세포 혹은 전구체와 함께 배양함으로써 유도할 수 있고, 비슷한 결과를 여기에 언급한 다른 조직 유형에 관해 이룰 수 있다. 분화를 유도하는 다른 방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있고, 그 중 많은 것을 적절히 이용할 수 있다.

세포를 분화-유도 배지에서 적절한 시간(예, 여러 날 내지 일주 혹은 그 이상)동안 배양한 후에, 세포가 실제로 주어진 유형의 세포의 신체적 질을 획득하였는지 여부를 결정하기 위해 분석할 수 있다. 분화된 간세포는 분화된 세포보다 더 긴 말단소립(telomere)을 갖기 때문에 분화 자체의 측정은 말단소립의 길이이다; 그러므로, 상기 세포를 텔로머라제의 활성의 정도에 대해 측정할 수 있다. 택일적으로, RNA 혹은 단백질을 세포로부터 추출하여 원하는 표현형의 지표인 마커에 대 해 분석할 수 있다(노던 혼성화, rtPCR, 웨스턴 블랏 분석법, 등을 경유하여). 물론, 세포를 면역조직화학적으로 분석하거나 조직-특이적 염색을 이용하여 염색할 수 있다. 그러므로, 예를 들어, 지방생성의 분화를 평가하기 위해, 세포를 지방-특이적 염색제(예, 오일레드 O, 사파린레드, 수단블랙 등)으로 염색하거나, 지방-관련 인자의 존재(예, 유형 Ⅳ 콜라겐, PPAR-γ, 아딥신, 지단백 리파아제, 등)를 조사할 수 있다. 유사하게, 골형성을 상기 세포를 골-특이적 염색제(예, 알칼린포스파타제, 폰 카사(von Kassa))으로 염색함으로써 평가할 수 있고, 골-특이적 마커(예, 오스테오칼신, 오스테오넥틴, 오세테오폰틴, 유형 Ⅰ콜라겐, 골격 형태발생 단백질, cbfa 등)의 존재로 조사할 수 있다. 근육발생을 종전의 형태학적 변화(예, 다핵세포, 신시티아(syncitia) 형성, 등)를 동정함으로써 평가할 수 있고, 혹은 생화학적으로 근육-특이적 인자(예, 미오 D, 미오신 중쇄(heavy chain), NCAM, 등)의 존재에 대해 평가할 수 있다. 연골형성은 연골-특이적 염색제(예, 알시안블루)을 사용하여 세포를 염색함으로써 결정할 수 있고, 혹은 연골-특이적 분자(예, 배지 내에서의 황산화 글리코사미노글리칸 및 프로테오글리칸(예, 케라틴, 콘드로이친 등), 유형 Ⅱ콜라겐, 등)의 발현/생성에 대해 세포를 조사함으로써 결정할 수 있다. 발달 표현형을 평가하는 다른 방법은 당해 기술분야에 알려져 있고, 그것들 중 어느 것이라고 적절하다. 예를 들어, 세포를 크기나 입자도에 따라 구별할 수 있다. 또한, 세포를 사용하여 단일 클론 항체를 생산할 수 있고, 그리고 나서, 그 단일 클론 항체를 이용하여 주어진 세포 유형에 바람직하게 결합하는지 여부를 평가할 수 있다. 항원성의 상호관계가 간세포가 주어진 발달 경로를 따라 분화했다는 것을 확인할 수 있다.

상기 세포가 유일할 수도 있고, 다른 세포로부터 단리될 수도 있는 반면에, 바람직하게는 상기 세포가 세포의 집단 내에 있으며, 본 발명은 본 발명의 세포를 포함하는 한정된 집단을 제공한다. 어떤 구체예에서, 상기 집단은 비균질하다. 그러므로, 예를 들어, 상기 집단은 본 발명의 세포에 인자를 제공하기 위한 지지세포를 포함할 수 있다. 물론, 본 발명의 간세포는 그 자체가 다른 유형의 세포(예를 들어, 신경간세포(NSC), 조혈간세포(HPC, 특히 CD34⁺ 간세포), 배아간세포(ESC) 및 그것들의 혼합과 같은 다른 유형의 간세포와 같은)를 배양하기 위한 지지세포로서 작용할 수 있고, 상기 집단은 그런 세포를 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 집단은 실질적으로 균질하고, 필수적으로 본 발명의 지방유래 간세포를 포함한다.

본 발명의 세포는 무성생식할 수 있기 때문에, 그것들을 함유하는 실질적으로 균질인 집단은 무성생식이 가능하다. 정말로, 본 발명은 또한 중배엽 간세포, 결합조직 간세포, 혹은 그것들의 혼합을 필수적으로 포함하는 어떤 한정된 무성생식 가능한 세포 집단에 관한 것이다. 이런 구체예에서, 상기 세포는 당해 기술분야에서 알려진 방법을 사용하여 지방에서 유래할 수도 있고, 중배엽 혹은 결합세포조직(예, 골수, 근육 등)에서 유래될 수도 있다. 단리 후에, 세포를 여기에 기술한 바와 같이 무성생식으로 확장할 수 있다.

본 발명의 세포(및 세포집단)는 다양한 목적을 위해 사용할 수 있다. 언급한 바와 같이, 다른 세포유형의 증식 및 확장을 지지할 수 있으며, 본 발명은 이것을 수행하기 위한 방법에 관한 것이다. 한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 간세포를 이용하는 배양배지를 조절하는 방법 및 그런 방법으로 생산된 조절된 배지에 관한 것이다. 상기 배지는 원하는 배양배지를 상기 세포가 배양배지를 조절하기에 충분한 조건 하에서 세포에 노출시킴으로써 조절될 수 있다. 전형적으로, 상기 배지는 호르몬, 세포 매트릭스물질 및 다른 인자를 배지에 분비하는 본 발명의 세포의 증식을 지지하기 위해 사용된다. 적절한 기간(예, 하루 혹은 수일) 후에, 분비된 인자를 함유하는 배양배지를 세포로부터 분리할 수 있고, 미래의 사용을 위해 저장할 수 있다.물론, 본 발명의 세포 및 집단은 원한다면, 배지를 조절하는데 연속적으로 다시 사용할 수 있다. 다른 적용(예, 본 발명의 세포를 다른 유형의 세포와 공동배양하기 위해)에 있어, 상기 세포는 조절된 배지 내에 남아 있을 수 있다. 그러므로, 본 발명은 본 방법을 이용하여 얻은 조절된 배지를 제공하면, 그 배지는 본 발명의 세포를 함유할 수 있거나, 원한다면 본 발명의 세포가 실질적으로 없을 수 있다.

상기 조절된 배지는 원하는 세포 유형의 증식과 확장을 지지하는데 사용될 수 있고, 본 발명은 상기 배양된 배지를 이용하여 세포(특히 간세포)를 배양하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 세포가 생존 가능하게 유지되는 조건 하에서 조절된 배지에 원하는 세포를 유지하는 것을 포함한다. 상기 세포는 당해 기술분야에 알려진 방법과 같은, 세포를 배양하는데 적절한 조건 하에서 유지할 수 있다. 바람직하게, 본 발명은 연속적 과정의 세포 유사분열을 허용하여 확장된 집단을 형성토록 한다. 정확한 조건(예, 온도, CO₂ 농도, 교반, 항생제 존재, 등)은 배지의 다른 구성성분과 세포 유형에 의존할 것이다. 그러나, 이러한 파라미터를 최적화하는 것은 당해 기술분야의 통상의 기술에 해당한다. 어떤 구체예에서, 여기에 기술한 바와 같이, 배지를 조절하는데 사용한 지방-유래 세포가 실질적으로 배지에 없는 것이 바람직하다. 그러나, 다른 구체예에서는, 지방-유래 세포가 조절된 배지에 남아서 원하는 세포와 함께 공동배양 하는 것이 바람직하다. 정말로, 본 발명의 지방-유래 세포가 세포내 통신의 세포-표면 매개체를 발현할 수 있기 때문에, 본 발명의 세포 및 원하는 다른 세포를 두 세포유형이 접촉된 상태 하에서 공동배양하는 것이 종종 바람직하다. 이것은 예를 들어, 상기 세포를 비균질 집단의 세포로서 적절한 배양 기질에 접종함으로써 이루어 질 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 지방-유래 세포는 처음에는 가득차게(to confluence) 증식할 수 있으며, 상기 조절된 배지 내에 배양되어야 할 두 번째 원하는 세포에 대한 기질로서 작용할 것이다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 지방-유래세포가 유전적으로 조작되어 예를 들어, 외인적 유전자를 발현하거나 혹은 내인적 유전자의 발현을 억제하도록 할 수 있고, 본 발명은 그러한 세포 및 집단을 유전적으로 조작하는 방법을 제공한다. 이런 방법대로, 상기 세포를 형질전환유전자(transgene)을 포함하는 핵산을 포함하는 유전자 전달 벡터에 노출시켜서, 상기 핵산을 세포 내에서 상기 형질전환유전자가 발현되기에 적절한 조건 하에서 세포 내에 도입시킨다. 형질전환유전자는 일반적으로 발현 카세트이며, 적절한 프로모터에 조작 가능하게 연결된 코딩 폴리뉴클레오 티드를 포함한다. 코딩 폴리뉴클레오티드는 단백질을 암화화 할 수 있거나, 혹은 생물학적으로 활성이 있는 RNA를 암호화할 수 있다(예, 안티센스 RNA 혹은 라이보자임). 그러므로, 예를 들어, 코딩 폴리뉴클레오티드는 독소, 호르몬(펩티드 성장 호르몬, 호르몬 분비인자, 성호르몬, 부신피질자극호르몬, 사이토카인(예, 인터페론, 인터루킨, 림포킨), 등), 세포-표면-결합 세포내 신호전달 부분(예, 세포부착분자, 호르몬 수용체 등), 주어진 분화의 계통 촉진하는 인자 등에 내성을 부여하는 유전자를 암호화 할 수 있다. 물론 주어진 형질전환유전자를 전하기 위해 유전자전환기술을 사용하는 것을 원한다면, 그것의 서열은 알려질 것이다.

발현 카세트 내에서, 상기 코딩 폴리뉴클레오티드를 조작 가능하게 적절한 프로모터에 연결한다. 적절한 프로모터의 예로는 원핵세포 프로모터 및 바이러스 프로모터(예, 레트로바이러스 ITRs, LTRs, 헤르페스바이러스 IEp(예, ICP4-IEp 및 ICP0-IEp)와 같은 즉각적 초기 바이러스 프로모터(IEP), 사아토메갈로바이러스(CMV)IEp, 그리고 라우스 육종바이러스(RSV) 프로모터 및 뮤린류케미아바이러스(Murine Leukemia Virus)와 같은 다른 바이러스 프로모터)가 있다. 다른 적절한 프로모터는 인핸서(예, 토끼 β-글로빈 조절요소), 본질적으로 활성인 프로모터(예, β-액틴 프로모터, 등), 신호특이적 프로모터(예, RU486에 반응하는 프로모터와 같은 유도가능한 프로모터, 등), 조직-특이적 프로모터와 같은 진핵세포 프로모터이다. 미리 한정된 세포의 상황에서 유전자의 발현을 추진하기 위한 적절한 프로모터를 선택하는 것은 당해 기술분야에서 잘 알려져 있다. 상기 발현 카세트는 하나 이상의 코딩 뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 다른 요소(예, 폴리아데닐화 시퀀 스, 막-삽입 신호 혹은 분비 선도를 암호화하는 시퀀스, 리보솜 침입 시퀀스, 전사조절요소(예, 인핸서, 사일렌서, 등), 등)을 원한다면 포함할 수 있다.

형질전환유전자를 함유하는 발현 카세트를 형질전환유전자를 세포에 운반하기에 적절한 유전자 벡터에 혼입하여야 한다. 원하는 목적의 적용에 따라, 어떤 그런 벡터를 적용하여 세포를 유전적으로 조작할 수 있다(예, 플라스미드, 네이키드 DNA, 아데노바이러스와 같은 바이러스, 아데노-결합 바이러스, 헤르페스 바이러스, 렌티바이러스, 파필로마바이러스, 레트로바이러스, 등). 그런 벡터 내에 원하는 발현 카세트를 구성하는 어떠한 방법도 적용할 수 있고, 그 중 많은 것들이 당해 기술분야에 알려져 있다(예, 직접적인 클로닝, 상동 재조합, 등). 물론, 벡터의 선택이 세포에 벡터를 도입하는데 사용되는 방법을 대개 결정할 것이며(예, 프로토플라스트 융합, 인산칼슘 침전, 유전자 건(gene gun), 전기천공법, 바이러스 벡터로 감염, 등), 이것은 일반적으로 당해 기술분야에 알려져 있다.

유전적으로 변화된 세포를 형질변환유전자의 산물을 생산하기 위한 바이오리액터(bioreactor)로서 이용할 수 있다. 다른 구체예에서, 유전적으로 조작된 세포를 형질변환유전자와 그 산물을 동물에 운반하기 위해 사용한다. 예를 들어, 일단 유전적으로 조작된 세포를 형질전환유전자가 생체 내에서 발현되기에 충분한 조건 하에서 동물에 도입시킬 수 있다.

유전적 조작에 대한 유용한 표적으로서 작용하는 것 이외에, 본 발명의 많은 세포와 세포집단은 호르몬을 분비한다(예, 사이토카인, 펩타이드 혹은, 다른(예, 모노부티린) 성장인자, 등). 상기 세포 중 어떤 것들은 초기 단리시 그러한 호르몬 을 분비하고, 다른 세포는 여기에서 논의된 바와 같이 유전적으로 조작되어 호르몬을 분비할 수 있다. 호르몬을 분비하는 본 발명의 세포는 생체 내 혹은 시험관 내 다양한 상황에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 각 세포를 바이오리액터로서 이용하여 주어진 호르몬의 간편한 원천을 공급할 수 있으며, 본 발명은 그런 세포로부터 호르몬을 얻는 방법에 관한 것이다. 본 발명과 일치하여, 상기 세포가 배양 배지에 호르몬을 분비하는 적절한 조건 하에서 상기 세포를 배양한다. 적절한 시간 후에, 바람직하게는 주기적으로, 배지를 수확하고 처리하여 배지로부터 호르몬을 단리시킨다. 어떤 표준적인 방법(예, 겔 혹은 친화성크로마토그래피, 투석, 동결건조, 등)을 사용하여 배지로부터 호르몬을 정제하며, 많은 것들이 당해 기술분야에 알려져 있다.

다른 구체예에서, 호르몬을 분비하는 본 발명의 세포( 및 집단)를 치료제로 이용할 수 있다. 일반적으로, 그런 방법은 세포를 동물의 조직으로 직접, 시험관 내(예, 이식 혹은 접붙이기 전의 이식으로서) 혹은 생체 내에서 세포를 원하는 조직 중 어느 하나에서, 원하는 조직으로 전달시키는 것을 포함한다. 상기 세포를 원하는 조직으로 어떤 적절한 방법에 의해 전달시킬 수 있으며, 그 적절한 방법은 일반적으로 조직의 유형에 따라 다양할 것이다. 예를 들어, 세포를 함유하는 배양배지로 이식물을 침지시킴으로써(혹은 그것을 주입시킴으로써) 세포를 전달시킬 수 있다. 택일적으로, 세포를 조직 내 원하는 부위로 접종시켜 집단을 성립시킬 수 있다. 세포를 카테타, 투관침, 캐뉼라, 스텐트(생체 내로 접종될 수 있는)와 같은 장치를 이용하여 생체내 부위로 전달시킬 수 있다. 이러한 적용을 위해, 상기 세포는 바람직하게 사이토킨 또는 인간성장인자, 섬유아세포 성장인자, 신경 성장인자, 인슐린-양 성장인자, 조혈간세포 성장인자, 섬유아세포 성장인자군, 혈소판-유래 성장인자군, 혈관 및 내피세포 성장인자, TGFb 군(뼈 형태발생인자를 포함하는)과 같은 성장호르몬, 혹은 선천성 질환(예, 디스트로핀)에 특이적인 효소를 분비한다.

하나의 적용에 있어서, 본 발명은 그런 세포를 사용하여 환자 내의 상처의 회복(closure)을 촉진시키는 방법을 제공한다. 본 방법과 일치하여, 본 발명의 호르몬을 분비하는 세포를 세포가 호르몬을 분비하기에 충분한 조건 하에서 상처의 근처로 전달시킨다. 상처의 근처에 호르몬이 존재하면 상처의 회복을 촉진시킨다. 본 방법은 외부(예, 표면) 및 내부의 상처의 회복을 촉진시킨다. 본 발명의 방법이 상처의 회복을 촉진하는데 유용한 상처에는 찰과상, 적출, 블로잉 운드(blowing wound), 화상, 타박상, 탄상, 절창, 개방창, 관통창, 천공창, 자창, 세톤창(seton wound), 자창, 외과적 창상, 피하창, 혹은 접선창이 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 본 방법은 상처의 완전한 치료나 종결을 이룰 필요는 없다; 본 방법이 어느 정도의 상처의 회복을 촉진하는 것은 충분하다. 이런 관점에서, 본 방법은 다친 조직을 치료하기 위한 다른 방법에 부가적으로 혹은 단독으로 사용될 수 있다.

본 방법의 세포가 맥관형성 호르몬을 분비하는 경우에(예, 혈관 성장인자, 혈관 혹은 내피세포 성장인자, 등), 상기 세포를(그것들을 함유하는 집단뿐 아니라) 조직 내 혈관형성을 유도하는데 사용할 수 있다. 그러므로, 본 발명은 그러한 세포를 사용하여 조직 내 혈관신생을 촉진하는 방법을 제공한다. 본 방법과 일치하게, 상기 세포를 세포가 혈관형성 호르몬을 생산하기에 충분한 조건 하에서 원하는 조직에 도입한다. 조직 내에서 상기 호르몬이 존재하면 조직 내 혈관신생이 촉진된다.

본 발명의 간세포는 발달 표현형을 갖기 때문에, 그것을 조직공학에 이용할 수 있다. 이런 관점에서, 본 발명은 본 발명의 세포가 원하는 물질을 생산하기 위해 확장하고 분화하기에 충분한 조건 하에서 본 발명의 세포를 유지하는 것을 포함하는 동물성 물질을 생산하는 방법을 제공한다. 상기 물질은 본 발명의 세포가 분화할 수 있는(여기에 나타낸 바와 같은) 조직 유형을 포함하여 성숙한 조직, 혹은 기관 전체조차도 포함할 수 있다. 전형적으로 그런 물질은 지방, 연골, 심장, 피부결합조직, 혈액 조직, 근육, 신장, 골, 흉막, 내장조직, 혈관조직 등을 포함할 것이다. 보다, 전형적으로, 상기 물질은 이런 조직유형의 결합을 포함할 것이다(즉 하나의 조직유형 이상). 예를 들어, 상기 물질은 모든 혹은 일부분의 동물 기관(예, 심장, 신장) 혹은 사지(예, 다리, 날개, 팔, 손, 발, 등)를 포함할 수 있다. 물론, 상기 세포는 분열하고 분화하여 그런 구조를 생산할 수 있기 때문에, 그것들은 그런 구조의 원기(anlagen)를 형성할 수 있다. 초기에는, 그런 원기를 원하는 성숙한 구조 혹은 기관의 미래의 생산을 위해 냉동 저장할 수 있다.

그러한 구조를 생산하기 위해, 본 발명의 세포 및 집단은 그것들이 확장하고 분열되어 원하는 구조를 형성하기에 충분한 조건 하에서 유지된다. 어떤 적용에 있어서, 이것은 전형적으로 새로운 물질을 원하는 부위에 동물에(예, 생체내) 상기 세포를 전달시킴으로써 이루어진다. 그러므로, 예를 들어, 본 발명은 세포가 그런 조직 내에 이식되는 동물 내에서 조직의 재생산(예, 골, 근육, 연골, 건, 지방 등) 을 촉진시킬 수 있다. 다른 구체예에서, 특히 원기를 생산하기 위해, 세포를 시험관 내에서 조직으로 분화하고 확장하도록 유도할 수 있다. 그런 적용에 있어, 상기 세포를 조직-발달에 도움이 되는 3차원적 구조로의 형성을 촉진시키는 기질에 배양한다. 그러므로, 예를 들어, 상기 세포를 세포외 매트릭스 물질, 합성 폴리머, 사이토카인, 성장인자, 등을 포함하는 것과 같은 생체-적합 격자에 배양하거나 접종할 수 있다. 그런 격자는 조직 유형의 발달을 촉진하기 위해 원하는 모양으로 만들 수 있다. 또한, 적어도 그런 배양의 초기에 그런 배지 및/또는 기질은 적절한 조직 유형이나 구조의 발달을 촉진시키는 인자(예, 성장인자, 사이토카인, 세포외 매트릭스 물질, 등)로 보충된다. 정말로, 어떤 구체예에서, 여기에서 논의된 바와 같이, 각각의 조직 유형의 성숙한 세포로 혹은 그것의 전구체와 함께 상기 세포를 공동배양하거나 상기 세포를 각각의 맞춰진 배지에 노출시키는 것이 바람직하다.

그러한 동물성 물질 및 조직을 생산하기 위한, 본 발명의 지방-유래 세포 및 집단의 사용을 촉진시키기 위해, 본 발명은 본 발명의 세포( 및 집단)와 생물학적으로 적합한 격자를 포함하는 조성물을 제공한다. 전형적으로, 상기 격자는 약 100μm 및 약 300μm 사이의 오더로 공간을 갖는, 망상조직과 같은 섬유소 혹은 스폰지를 갖는 고분자 물질로부터 형성된다. 그러한 구조는 세포가 증식하고 번성하는데 충분한 부위를 제공한다. 바람직하게는, 상기 격자는 시간에 대해 생분해 가능하고, 그리하여 그것이 발달할 때, 동물성 물질로 흡수될 것이다. 그러므로, 적절한 폴리머 격자는 글리콜산, 젖산, 프로필 퓨마레이트, 카프롤락톤, 히알루로난, 히아루론산, 등과 같은 모노머로부터 형성될 수 있다. 다른 격자는 단백질, 다당 류, 폴리히드록시산, 폴리오르토에스테르, 폴리안하이드라이드, 폴리포스파젠, 혹은 합성 폴리머(특히 생분해 가능한 폴리머)를 포함할 수 있다. 물론 그런 격자를 형성하기 위한 적절한 폴리머는 하나 이상의 모노머(예, 지시된 모노머의 조합)를 포함할 수 있다. 또한 상기 격자는 원하는 바와 같이, 성장인자, 사이토카인, 및 형태발생원(예, 레티논산, 아라카도닉 액시드(aracadonic acid), 등)과 같은 호르몬, 원하는 세포 외 매트릭스 분자(예, 피브로넥틴, 라미닌, 콜라겐, 등), 혹은 다른 물질(예, DNA, 바이러스, 다른 세포유형, 등)을 또한 포함할 수 있다.

상기 조성물을 형성하기 위해, 상기 세포를 격자의 틈새로 침투하도록 격자에 도입시킨다. 예를 들어, 상기 매트릭스를 상기 세포를 함유하는 용액 혹은 현탁액에 담글 수 있고, 또는 상기세포를 매트릭스 내로 주입하거나 주사할 수 있다. 특히 바람직한 조성물은 폴리머를 함유하고 또한 현탁액에 분산된 본 발명의 세포를 갖는 현탁액의 교차결합에 의해 형성된 하이드로겔이다. 이런 형성방법은 격자 전체에 걸쳐 흩어지게 하고, 격자내 세포를 분산시키는 것을 촉진시킨다. 물론, 상기 조성물은 또한 원하는 표현형의 성숙한 세포 혹은 그 전구체를 포함하여, 특히 본 발명의 간세포가 상기 격자 내에서 적절히 분화하도록 유도하는 것을 가능케 한다(예, 격자 내에서 그러한 세포를 공동배양하는 것의 효과).

상기 조성물을 적절한 방법으로 이용하여 원하는 조직 유형, 구조, 혹은 원기의 생산 및 증식을 촉진시킬 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물을 3차원 혹은 스테로택틱(sterotactic) 모델링 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 그러므로, 예를 들어, 상기 조성물 내의 한층 혹은 한 부분에는 골형성 분화가 주어진 세포가 존재 할 수 있고, 상기 조성물 내의 다른 층 혹은 부분에는 근육형성 및/또는 연골형성 발달이 주어진 세포가 존재할 수 있다. 서로 병렬상태로 그런 부분을 배치시키면, 다중 조직 유형(예, 사지에서 발견되는 것과 같은 근육에 의해 둘러싼 뼈)을 포함하는 복잡한 구조의 제조와 분화를 촉진시킨다. 원하는 구조의 증식 및 분화를 지시하기 위해, 상기 조성물을 적절하게 바이오리액터, 혹은 인큐베이터에서 생체외에서 배양할 수 있다. 다른 구체예에서, 조직 혹은 구조를 증식시키기를 바라는 부위에 상기 구조를 직접적으로 숙주동물 내에 이식한다. 또 다른 구체예에서, 상기 조성물을 숙주에 이식할 수 있으며(전형적으로 돼지, 비비 등과 같은 동물), 거기에서 사용이 용이해 질 때까지, 증식하고 성숙할 것이다. 그 이후에, 성숙한 구조물(혹은 원기)은 상기 숙주에서 절개되어 상기 숙주에 적절히 이식된다.

조성물에 함유되기에 적절한 격자는 어떠한 적절한 원천(예, 마트리겔)으로부터 유래될 수 있으며, 적절한 격자를 위한 몇몇의 상업적 원천이 존재한다(예, 적절한 폴리글리콜산은 Ethicon, N.J.과 같은 원천으로부터 얻어질 수 있다). 또 다른 적절한 격자는 지방조직의 비세포부분- 즉, 세포가 실질적으로 없는 지방조직 세포외 매트릭스 물질로부터 유래할 수 있고, 본 발명은 그러한 지방-유래 격자를 제공한다. 전형적으로, 그런 지방-유래격자는 프로테오글리칸, 당단백질, 히알루로닌, 피브로넥틴, 콜라겐(유형Ⅰ, 유형 Ⅱ, 유형Ⅲ, 유형 Ⅳ, 유형 Ⅴ, 유형 Ⅵ), 등이 있으며, 그것들은 세포성장을 위한 우수한 기질로서 작용한다. 부가적으로, 그러한 지방유래 격자는 상기 매트릭스에 접종된 세포의 증식을 촉진하기 위해, 호르몬, 바람직하게는, 사이토카인 및 성장인자를 포함할 수 있다.

지방-유래 매트릭스를, 비세포 분획에 존재하는 것을 제외하고는, 상기한 바와 같이 유사하게 지방조직으로부터 단리할 수 있다. 예를 들어, 지방조직 혹은 그 유도체(예, 위에서 논의한 바와 같이 원심분리 후의 세포분획)를 음파 또는 열에너지로 처리할 수 있고/거나 효소적으로 처리되어 매트릭스 물질을 회수할 수 있다. 또한, 바람직하게는, 리파아제, 세제, 프로테아제, 및/또는 기계적 혹은 음파 붕괴(예, 호모게나이저 혹은 소니케이터)로 붕괴한다. 그러나, 분리된 후에, 상기 물질은 점성의 물질로서 동정되지만, 원한다면 이후에 원하는 목적의 사용에 따라 처리할 수 있다.

예를 들어, 원료 매트릭스 물질을 처리하여(예, 투석, 혹은 프로테아제 혹은 산으로 처리, 등) 원하는 격자물질을 생산할 수 있다. 그러므로, 상기 격자를 수화형으로 제조할 수도 있고, 건조하거나 동결건조하여 실질적으로 무수형 혹은 산으로 제조할 수 있다. 그 후에, 상기 산을 세포배양 기질로서의 사용을 위해, 예를 들어 적절한 세포 배양배지에 그것을 현탁함으로써, 재수화할 수도 있다. 이런 관점에서, 상기 지방-유래 격자를 상기한 바와 같은 다른 적절한 격자물질과 함께 혼합할 수 있다. 물론, 본 발명은 지방유래 격자 및 본 발명의 지방-유래 세포 및 또한 다른 세포(특히 다른 유형의 간세포)와 같은 세포 혹은 그 세포의 집단을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

위에서 논의한 바와 같이, 본 발명의 세포, 집단, 격자, 및 조성물을 조직공학 및 재생산에 사용할 수 있다. 그러므로, 본 발명은 이러한 발명의 특징을 통합하는 이식 가능한 구조(예, 이식물)에 관한 것이다. 이식물의 정확한 특징은 그것 이 적용되는 용도에 따라 달라질 것이다. 상기 이식물은 기술한 바와 같이, 성숙한 조직이거나 성숙한 조직을 포함할 수 있고, 또는 미성숙된 조직 혹은 격자를 포함할 수 있다. 그러므로, 예를 들어, 이식물의 한 유형은 골형성 분화를 겪고 있고(혹은 주어진), 선택적으로 상기한 바와 같이 적절한 크기 및 차원의 격자내에 접종된 본 발명의 세포집단을 포함하는 골 이식물일 수 있다. 그런 이식물은 숙주 내에 주입되거나 이식되어 환자내의 성숙한 골조직의 생산 혹은 재생산을 일으킬 수 있다. 다른 유형의 이식물은 원기(여기에 기술된 바와 같은), 예를 들어, 사지 싹, 손가락 싹, 발달 신장, 등이고, 일단 환자에게 이식되면 적절한 구조로 성숙할 것이다.

상기 지방-구조 격자는 세포배양 키트의 일부분으로서 적용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 지방-유래 격자와 수화제(예, 물, 생리학적으로 적합한 식염수, 제조된 세포배양배지, 혈청 혹은 그들의 유도체, 등), 세포배양기질(예, 배양디쉬, 플레이트, 바이얼, 등), 세포배양배지(액제 혹은 산제), 항생제 화합물, 호르몬 등과 같은 하나 이상의 다른 구성성분을 포함하는 키트를 제공한다. 상기 키트가 그런 구성성분을 포함하는 반면, 바람직하게는 그것은 적절한 조합에 따라서, 원하는 세포의 배양 및 성장을 지지하는데 필수적인 모든 구성성분을 포함한다. 물론, 원한다면, 상기 키트는 또한 여기에 기술된 격자에 접종될 수 있는 세포(전형적으로는 얼려진)를 포함할 수 있다.

본 발명의 많은 측면이 조직의 성장과 분화에 관한 것인 반면, 본 발명은 또한 다른 적용을 갖는다. 예를 들어, 상기 지방-유래 격자를 조직의 성장 및 분화를 위한 향상된 격자 및 기질을 개발하는 것에서와 같은 실험적 시약으로 사용할 수 있다. 상기 지방-유래 격자는 또한 미용적으로도 이용되어 예를 들어, 주름, 상처, 피부압박, 등 혹은 조직 확대에도 사용될 수 있다. 그런 적용을 위해, 바람직하게는 상기 격자를 단위 투약형태로 양식화하고 포장할 수 있다. 원한다면, 그것을 담체(예, 글리세린 혹은 알콜과 같은 담체), 향수, 항생제, 착색제, 및 다른 화장품 물건에 일반적으로 적용되는 성분과 혼합할 수도 있다. 상기 기질은 또한 자기유래적으로 혹은 동종이식으로서 이용될 수도 있고, 상처 치료를 촉진하기 위한 연고 혹은 드레싱으로서 사용되거나 사용되거나 포함될 수 있다. 상기 지방-유래 세포는 또한 실험시약으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 그것은 분화의 초기 발생에 책임이 있는 시약을 발견하는 것을 돕는데 이용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 세포를 특정 분화를 유도하기 위한 배지에 노출시켜고, 그리고 나서 유전자의 분화 발현을 분석할 수 있다(예를 들어, 랜덤-프라임드 PCR 또는 전기영동 또는 단백질 또는 RNA, 등).

본 발명의 간세포 혹은 지방-유래 격자를 단리하기 위한 어떤 단계로서, 본 발명은 지방조직으로부터 그런 시약을 단리하기 위한 키트를 제공한다. 상기 키트는 간질세포를 분리하기 위한 수단(예, 여기에 기술된 방법을 통해서) 뿐 아니라 지방 조직을 환자로부터 단리하기 위한 수단(예, 캐뉼라, 바늘, 흡입기 등)을 포함한다. 상기 키트는 예를 들어, 동일한 환자로부터 재도입될수 있는 간질세포의 베드사이드(bedside) 원천으로서 적절하게 이용될 수 있다. 그러므로, 상기 키트는 동일한 공정에서조차 원하는 조직 유형의 재생산을 필요로 하는 환자에 있어서 이 식을 위한 지방-유래 간세포의 단리를 촉진시킬 수 있다. 적절히, 상기 세포를 필요로 하는 환자내에서 분화를 부여하는 배지에 상기 세포를 노출시킬 수 있다. 물론, 시험관 내 조작(예를 들어, 여기에 기술된 바와 같은 클로닝 혹은 분화)을 위한 간세포의 편리한 원천으로서 상기 키트를 사용할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 키트를 여기에 기술한 바와 같이 지방-유래 격자를 분리하기 위해 사용할 수 있다.

실시예

당업자는 앞선 상세한 설명을 읽음으로써 본 발명을 충분히 실시할 수 있는 반면, 다음의 실시예는 그 특징 몇몇을 명백히 하는 것을 도울 것이다. 특히, 다음의 실시예는 성숙한 지방세포가 실질적으로 없는 인간 지방-유래 간세포의 단리, 그런 세포의 클론 집단의 단리, 생체내 혹은 시험관 내에서 그런 세포가 분화하는 능력, 및 다른 유형의 간세포의 성장을 그러한 세포가 지지하는 능력을 증명한다. 상기 실시예는 또한 세포배양에서 적절한 기질로서 작용할 수 있는 세포가 실질적으로 없는 지방-유래 격자의 단리를 또한 증명한다. 물론 이러한 실시예는 순수하게 설명을 목적으로 나타내었기 때문에, 그것들이 본 발명의 영역을 제한적 방법으로 해석하는데 사용되어져서는 안되고, 오히려 본 발명의 앞선 기술에 대해 전체적으로 확장하는 것으로 보아야 한다.

외과수술, 세포배양, 효소적 분해, 조직학, 및 단백질과 폴리뉴클레오티드의 분자적 분석과 같은 이러한 실시예에 이용된 방법은 당해 기술분양의 일반적 기술을 갖은 사람에게 익숙하다. 그렇기 때문에, 그리고 간결성을 위해서, 자세한 실험 내용을 세세하게 설명하지는 않았다.

실시예 1

이 실시예는 성숙한 지방세포가 실질적으로 없는 인간 지방-유래 간세포의 단리를 보여준다.

원료 지방흡입 흡입물을 임의의 외과수술을 받은 환자로부터 얻었다. 지방 흡입 시술 전에, 상기 환자에게 에피네프린을 투여하여 흡입물이 혈액으로 오염되는 것을 최소화하였다. 상기 흡입물에서 모아진 액상 폐기물로부터 모아진 지방 조직 조각들을 분리하였다. 분리된 조직을 중성 인산완충 식염수로 완전히 세척하고, 그리고 나서, 주기적인 교반 하에서, 약 20분 동안 37℃에서 0.075% 콜라게나제로 효소적으로 분해하였다. 상기 분해 후에, 콜라게나제를 중화하고, 상기 슬러리를 약 260g에서 10분 동안 원심분리하였고 다중층의 상등액과 세포 펠렛을 생산하였다. 상기 상등액을 제거하고, 더 이상의 사용을 위해 간직하였고, 상기 펠렛을 적혈구를 용해시키는 용액에 재현탁하고, 약 10분 동안, 약 25℃에서 교반하지 않고, 배양하였다. 배양 후에, 상기 배지를 중화하고, 상기 세포를 다시 약 250g에서 약 10분 동안 원심분리 하였다. 두 번째, 원심분리 후에 상기 세포를 현탁하고 생존 가능성(트립판 블루 제외방법을 이용) 및 세포수를 평가하였다. 그 후에, 상기 세포를 약 1×10⁶세포/100mm디쉬의 밀도로 평판에 도말하였다. 그것을 약 5% CO₂에서 DMEM+우태아혈청(약 10%)에서 37℃로 배양하였다.

상기 세포의 대다수가 부착성이고, 작고, 단핵성이고, 상대적으로 비과립형 이었고, 보이는 지방 방울을 함유하지 않는 섬유아세포양 세포였다. 대다수의 세포가 오일-레드 O 및 본코사에 염색되지 않았다. 상기 세포를 또한 HeLa 세포 및 HN-12 세포를 양의 대조군으로 사용하여, 텔로머라제(telomerase)의 발현에 대해 분석하였다(상업적으로 입수 가능한 TRAP 분석 키트를 사용하여). 인간 음경포피 섬유아세포 및 HN-12 가열된 세포 추출물을 음의 대조군으로 사용하였다. 말단소립의 산물을 12.5% 폴리아크릴아마이드 세포상에 분석하였고 그 신호를 포스포이미지로 결정하였다. 텔로머라제의 활성을 나타내는 말단소립의 사다리 모양이 양의 대조군 뿐만 아니라 지방-유래 간세포에서도 관찰되었다. 음의 대조군에서는 사다리 모양이 관찰되지 않았다.

그러므로, 이러한 세포는 근육세포, 지방세포, 연골세포, 골세포, 혹은 혈액세포 만큼 규명가능하지 않다. 이런 결과는 지방-유래 세포가 인간 간세포에 대해서 앞서 보고된 것과 유사한 텔로머라제 활성을 나타낸다는 는 것을 증명한다.

그리고 나서 이런 세포의 하위집단을 발달 표현형을 평가하기 위해 다음의 배지에 노출시켰다.

지방형성	골형성	근육형성	연골형성
DMEM 10% FBS 0.5mM IBMX 1μM 덱사메타손 10μM 인슐린 200μM 인도메타신 1% ABAM	DMEM 10% FBS 5% 말혈청 0.1μM 덱사메타손 50μM 아스코르베이트-2-포스페이트 10mM β-글리세로포스페이트 1% ABAM	DMEM 10% FBS 5% 말혈청 50μM 히드로코르티손 1% ABAM	DMEM 1% FBS 6.25 μg/ml 인슐린 6.25 μg/ml 트랜스페린 10ng/ml TGFβ1 50nM 아스코르베이트-2-포스페이트 1% ABAM

집단을 수주동안 연골형성 배지에서 고밀도로 배양하였다. 조직배양 및 파라 핀 부분의 조직학적 분석을 H&E, 알시안블루, 톨루덴 블루, 및 Goldner's 트리크롬 염색으로 2, 7, 및 14일째에 행하였다. 면역조직화학을 콘드로이친-4-설페이트 및 케라틴 설페이트 및 유형 Ⅱ 콜라겐에 대한 항체를 사용하여 행하였다. 매트릭스 염색의 질적평가를 또한 행하였다. 상기 결과는 연골세포의 뚜렷한 경계를 갖는 연골성의 원형 결절이 초기 치료 후 48시간에 벌써 형성되었음을 알려주었다. 치료되지 않은 대조군 세포는 연골형성 분화의 아무런 증거도 나타내지 못했다. 이런 결과들은 상기 간세포가 연골형성 발달 표현형을 갖는다는 것을 확신시킨다.

세포집단을 가득 찰 때까지 배양하고, 그리고 나서 수주동안 지방형성 배지에 노출시켰다. 상기 집단을 플레이팅 후 둘째주 및 넷째주에 오일 레드-O 염색 후에 상대적 불투명도의 발색평가를 통해서 평가하였다. 지방형성이 이주째에 진행중이라고 결정되었고, 넷째주에는 더 지전되었다고 결정되었다(각각 1 과 5.3의 상대적 불투명도). 골수-유해 간세포를 양의 대조군으로 사용하였고, 이런 세포들은 매우 적은 지방세포 형성력을 보여주었다(각각 0.7 및 2.8의 상대적 밀도).

세포집단을 가득 찰 때까지 배양하고, 그리고 나서 수주동안 골형성배지에 노출시켰다. 상기 세포집단을 플레이팅 후, 둘째주 및 넷째주에 본카사 염색 후의 상대적 불투명도의 발색 평가를 통해서 평가하였다. 이주째에는 골형성이 진행 중이고 넷째 주에 더 많이 진전되었다고 결정되었다(각각 1.1 및 7.3의 상대적 불투명도). 골수유래 간세포를 양의 대조군으로 사용하였고, 이 세포들은 매우 적은 골혈성력을 보여주었다(각각 0.2 lac 6.6의 상대적 밀도).

세포집단을 가득 찰 때까지 배양하고, 그리고 나서 수주동안 근육형성배지에 노출시켰다. 상기 세포집단을 플레이팅 후, 첫째주, 셋째주, 및 여섯째주에 다중핵 세포 및 근육-특이적 단백질(MyoD al 미오신 중쇄)의 평가를 통해서 조사하였다. 인간 음경포피 섬유아세포 및 골격 근육모세포를 대조군으로 사용하였다. MyoD 및 미오신을 발현하는 세포를 간세포 집단에서, 근육형성 배지에 노출시킨 후에 모든 시점에서 발견하였고, 그런 세포의 비율이 셋째주 및 여섯째 주에 증가하였다. 다중핵 세포를 여섯째주에 관찰하였다. 상대적으로, 섬유아세포에서는 어떤 시점에서도 이런 특징을 전혀 나타내지 않았다.

이런 결과는 성숙한 지방세포가 실질적으로 없는 인간의 지방-유래 다능성 간세포의 단리를 증명한다.

실시예 2

이 실시예는 지방-유래 간세포가 5-아자사이티딘에 반응하여 분화하지 않는다는 것을 보여준다.

실시예 1에서와 동일한 방법을 얻은 지방-유래 간세포를 5-아자사이티딘의 존재 하에서 배양하였다. 골수-유래 간세포와는 대조적으로 이런 시약에의 노출은 근육형성 분화를 유도하지 않았다(상기 Wakitani 등을 참조).

실시예 3

이 실시예는 인간 지방-유래 간세포의 클론 집단의 생성을 보여준다.

실시예 1에 나타낸 공정과 일치하게 단리된 세포를 5,000세포/100mm 디쉬로 플레이트하고, 실시예 1에 나타낸 바와 같이 수일 동안 배양하였다. 수회의 세포 분열 후에 어떤 클론을 클로닝 링으로 찝어서 48웰 플레이트의 웰로 전달시켰다. 이런 웰을 약 80% 내지 90%의 혼잡도에 이를 때까지(약 5%의 CO₂에서 37℃로, 2/3 F₁₂배지+20%우태아혈청 및 실시예 1에서 단리된 세포에 의해 처음으로 조절된 "클로닝 배지"표준배지1/3에서) 수주 동안 배양하였고, 배지를 주마다 2번씩 갈아 주었다. 그 후에, 각 배양물을 35mm 디쉬에서 전달시키고 증식시키고, 그리고 나서 10mm 디쉬에 재전달시키고 가득 찰 때까지 증식시켰다. 이 후에, 하나의 세포 집단을 냉동시키고, 남아있는 클론을 12웰 플레이트에, 1000세포/웰로 플레이트하였다.

상기 세포를 클로닝 배지에서 15패시지 이상 배양하고, 실시예 1에서 나타낸 바와 같이 분화에 대한 조사를 행하였다. 연속적인 수회의 분화 후에 각 클론의 미분화 상태가 실제로 남아 있다.

그리고 나서 상기 클론의 집단을 정립하고, 실시예 1에서 논의한 바와 같이 지방형성, 연골형성, 근육형성, 및 골형성 배지에 노출시켰다. 적어도 하나의 클론이 각각의 배지에 노출되었을 때, 뼈, 지방, 연골, 및 근육으로 분화할 수 있음이 관찰되었고, 대부분의 클론이 적어도 세가지 유형의 조직으로 분화할 수 있었다. 상기 세포의 근육 및 연골로 발달할 수 있는 능력은 이런 지방-유래 간세포의 다능성을 증명한다.

이러한 결과는 지방-유래 간세포가 특별히 미리 스크린된 혈청 로트를 필요로 하지 않고, 많은 패시지(passage) 동안 미분화된 상태로 남아있을 수 있음을 보여준다. 상기 결과는 또한 그런 광범위한 패시지 후에 상기 세포가 다능성을 보유한다는 것을 보여주고, 상기 세포는 단지 선조 세포가 아니라 실제로 간세포(stem cell)임을 보여준다.

실시예 4

이 실시예는 지방-유래 간세포가 다른 유형의 간세포의 배양을 지지할 수 있다는 것을 보여준다

인간 지방-유래 간세포를 96 웰 플레이트에 약 30,000/웰의 밀도로 전달시키고, 일주동안 배양하고, 그리고 나서 방사선을 쪼였다. 그리고 나서 탯줄 혈액에서 단리한 인간 CD34⁺ 조혈간세포를 웰에 접종하였다. MyeloCult H5100 배지에서 공동배양을 유지하였고, 세포 생존 가능성 및 증식을 현미경 관찰로서 각각 조사하였다. 공동배양 2주 후에, 조혈 간세포를 유속세포분석법에 의해 CD34 발현에 대해 평가하였다.

간질세포와 2주간의 공동배양 후에, 상기 조혈 간세포는 둥근 세포의 큰 콜로니를 형성하였다. 유속분석법은 상기 세포의 62%가 CD34⁺를 남긴다는 것을 밝혀냈다. 현미경 관찰에 근거하여, 인간 지방-유래 간질세포가 생존을 유지하고, 탯줄 혈액으로부터 유래된 인간조혈 간세포의 증식을 지지하였다.

이런 결과는 인간 피하지방조직으로부터 유래한 간질세포가 생체외 유지, 성장 및 다른 간질세포로의 분화를 지지할 수 있다는 것을 증명한다.

실시예 5

이 실시예는 지방-유래 간질세포가 생체 내에서 분화할 수 있음을 증명한다.

12마리의 흉선이 없는 마우스를 각각 갖는 4개의 그룹(A-D)에 다음을 함유하 는 수산화인회석/트리칼슘포스페이트 입방체를 피하에 이식하였다. 그룹 A는 실시예 1에 나타낸 바와 같은 골형성 배지로 미리 처리한 지방-유래 간세포를 함유하였다. 그룹 B는 미처리된 지방-유래 간세포를 함유하였다. 그룹 C는 세포를 제외한 골형성 배지를 함유하였다. 그룹 D는 세포를 제외한 비골형성 배지를 함유하였다. 각각의 그룹 내에서, 여섯 마리의 마우스를 3주째에 희생시키고, 남아있는 마우스를 이식 후 8주째에 희생시켰다. 상기 입방체를 추출하고, 고정하고, 석회를 제거하고, 절개하였다. 각 섹션을 H&E, Mallory 골염색, 및 오스테오칼신에 대한 면역염색으로 분석하였다.

오스테오칼신 및 Mallory 뼈 염색에 대한 뼈 모양의 조직의 뚜력한 부위가 그룹 A 및 그룹 B의 섹션에서 관찰되었다. 실질적으로 보다 많은 골조직이 다른 그룹보다 그룹 A 및 그룹 B에서 관찰되었지만(p<0.05 ANOVA), 그룹 A 및 B 사이에서는 골 형성에 있어 뚜렷한 차이가 관찰되지 않았다. 게다가, 골 증식에 대한 질적 증가가 그룹 A 및 B 모두에서 3주 및 8주사이에 관찰되었다. 이러한 결과는 지방-유래 간세포가 생체내에서 분화 가능하다는 것을 증명한다.

실시예 6

이 실시예는 실질적으로 세포가 없는 지방-유래 격자의 단리를 증명한다.

한 프로토콜에서는, 실시예 1에서 보류된 상등액을 세포를 파괴하기 위해 0.05% 트립신 EDTA/100U/ml 데옥시리보뉴클레아제에서 3일 동안 효소적 분해를 시켰다. 매일 상기 잔해물을 식염수에서 세척하고 신선한 효소를 부가하였다. 그 후, 상기 물질을 식염수로 세척하고, 0.05% 콜라게나제 및 약 0.1% 리파아제로 재현탁 시킨 후, 단백질 및 지방을 부분적으로 분해하였다. 이런 배양을 이틀동안 계속하였다.

또 다른 프로토콜에서, 실시예 1에서 보류된 상등액을 어떤 상피세포를 제거하기 위해 배양하였다. 남아있는 세포를 1%NP40, 0.5% 데옥시콜산나트륨, 0.1%SDS, 5mM EDTA, 0.4M NaCl, 50mMTris-HCl(pH8) 및 프로테아제 억제제, 그리고 류펩틴(leupeptin), 키모스타틴(chymostatin), 안티파인(antipain), 및 펩스타틴(pepstatin) A를 각각 10μg/ml를 함유하는 완충액을 이용하여 용해하였다. 최종적으로, 상기 조직을 이가의 양이온이 없이 PBS에서 광범위하게 세척하였다.

양쪽의 제조 프로토콜 후에, 남아 있는 물질을 세척하고 젤리모양의 덩어리로서 동정되었다. 이런 물질의 현미경적 분석은 그것이 세포를 함유하지 않고, 고용량의 콜라겐(유형 Ⅳ와 같은) 및 매우 다양한 성장인자로 구성되어 있다는 것을 밝혀냈다. 이런 물질의 제조는 세포의 증식을 지지하였고, 조직배양에 우수한 기질이라는 것을 증명하였다.

앞서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따르면 다능성 간세포, 특히 비용이 드는 배양물의 전스크린을 할 필요가 없이 배양될 수 있는 세포를 보다 간편하게 얻을 수 있는 원천을 제공할 수 있으며, 세포집단의 배양과 증식에 기질로서 사용이 적합한 격자물질을 제공할 수 있다.

참조에 의한 통합

현재 여기에 철해진 이 문서 혹은 어떤 도면, 서열목록, 혹은 설명에 참조되 거나 언급된 모든 자료(예, 발명자 증명서, 특허출원, 특허, 간행된 발행물, 집적된 수납도서자료 혹은 기록, 실용신안, 월드-와이드-웹 페이지, 등)는 여기에 본 명세서의 부분으로 참조로 통합된다.

해석을 위한 안내

상기 설명은 단지 발명의 어느 한 특정 단면이 아니고, 전체로서 본 발명의 설명에 통합된다. 상기 설명은 본 발명의 "바람직한 구체예"를 설명하며, 그것을 수행하기 위해 발명자에게 알려진 가장 좋은 방법을 포함한다. 물론, 상기 설명을 읽으면, 그것의 바람직한 구체예의 변화가 당업자에게 명백해질 것이다. 본 발명자들은 능숙한 과학자들이 적절하게 그런 변화를 이용할 수 있기를 바라고, 본 발명자들은 여기에 상세하게 기술된 것 이외에도 본 발명이 실시되기를 의도한다. 따라서, 본 발명은 출원 법칙에 의해 허용된 바와 같이 여기에 부착된 청구항에 언급된 주제의 모든 변형 및 동등개념을 포함한다.

상기의 설명과 다음 청구항에서 사용된 바와 같이, 단일 표시체(예, "a", "one")은 은 달리 표시하지 않으면 복수를 포함한다. 단속적인 수치의 범위의 설명은 범위 내에 해당하는 각각의 개별 값을 각각 참조하는 빠른 방법으로 작용하도록 의도하며, 각각의 개별 수치는 별개로 나열된 것처럼 명세서에 통합된다. 부가적으로 다음 용어는 다음과 같이 정의된다.

원기는 특정 성숙한 구조로 발달하는 능력을 갖는 근본적인 구조이다.

발달 표현형은 분화의 공정을 통해서 특정 신체 표현형을 획득하는 세포의 잠재력이다.

호르몬은 접촉하는 동일한 혹은 다른 세포에 있어 표현형의 변화를 유발하는, 세포에 의해 분비되는 물질이다.

간세포는 적어도 두 개의 구별되는 발달 경로와 일치하게 분화하는 능력을 갖는 다능성 세포이다.

특히 청구항에 관하여, 용어 "필수적으로(essentially) 구성되는"은 본 발명의 기본적이고 새로운 특성에 상당히 영향을 주지 않는 나열되지 않은 성분 혹은 단계는 상세하게 설명된 성분 혹은 단계에 부가하여 이용될 수 있다는 것을 가리킨다. 반대로, "포함하는(comprising)", "갖는(having)" 및 "포함하는(including)"과 같은 용어는 어떤 성분 혹은 단계도 설명된 것에 부가하여 존재할 수 있다는 것을 가리킨다. 용어 "구성되는"은 단지 설명된 성분 혹은 단계만이 존재하지만 그 성분 혹은 단계의 균등물이 상세하게 언급된 것들을 대체할 수 있는 가능성을 배척하지 않는다.

Claims (123)

1. 성숙한 지방세포가 없는 포유류의 지방-유래 간세포를 포함하는 한정된 세포집단을 유리하기 위해 지방흡입 유출물을 사용하는 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 한정된 세포집단은 비균질한 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 한정된 세포집단은 신경간세포(NSC), 조혈간세포(HPC), 배아간세포(ESC) 및 그것들의 혼합으로 구성된 세포그룹에서 선택된 간세포를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 한정된 세포집단은 성숙한 지방세포가 없는 포유류의 지방-유래 간세포로 필수적으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 1 항에 있어서, 상기 한정된 세포집단은 균질한 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 1 항에 있어서, 상기 한정된 세포집단은 클론인 것을 특징으로 하는 방법.
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78. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지방 흡입 유출물은 인간으로부터 획득되는 것을 특징으로 하는 방법.
79. 간질세포가 없는 포유류의 지방-유래 간세포를 포함하는 한정된 세포집단.
80. 제 79 항에 있어서, 신경간세포(NSC), 조혈간세포(HPC), 배아간세포(ESC) 및 그것들의 혼합으로 구성된 세포그룹에서 선택된 간세포를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 한정된 세포집단.
81. 제 79 항에 있어서, 상기 한정된 세포집단은 간질세포가 없는 포유류의 지방-유래 간세포로 필수적으로 구성되는 것을 특징으로 하는 한정된 세포집단.
82. 간질세포가 없는 포유류의 지방-유래 간세포를 포함하는 균질한 한정된 세포집단.
83. 제 82 항에 있어서, 클론인 것을 특징으로 하는 한정된 세포집단.
84. 제 79 항 내지 제 83 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지방 유래 간세포는 은 인간으로부터 획득되는 것을 특징으로 하는 한정된 세포집단.
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