CN1352696A - 脂肪来源的干细胞和网格 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了脂肪来源的干细胞和网格。在一个方面,本发明提供了一种基本无脂肪细胞的脂肪来源的干细胞以及红细胞和结缔组织干细胞的克隆群体。该细胞可单独地或在生物学上可兼容的组合物中被用于在体内或体外产生分化的组织和结构。另外,这些细胞可被增殖或培养以产生激素或提供条件培养基,该培养基可用于支持其它细胞群体的生长和增殖。在另一个方面,本发明提供了一种脂肪来源的基本无细胞的网格,该网格含有来自脂肪组织的细胞外基质。该网格可被用作底物以辅助细胞的体内或体外生长和分化成为原基或成熟组织或结构。

Description

脂肪来源的干细胞和网格
                       发明背景
近些年来，主要获自骨髓的间叶细胞样干细胞的鉴别引发了组织再生和分化的进展。这样的细胞为可见于骨髓和骨膜的多能细胞，并且这些细胞能够分化成为各种间叶细胞或结缔组织。例如，这样的来自骨髓的干细胞可经暴露于诸如5-杂氮胞嘧啶这样的试剂而诱导发育成为肌细胞(Wakitani et al.，Muscle Nerve，18(12)，1417-26(1995))。有意见认为这样的细胞可用于组织的修复(例见，美国专利5,908,784，5,906,934，5,827,740，5,827,735)，并且这些细胞还可通过遗传修饰发挥作用(例见，5,591,625)，可被修复的组织的例子如软骨、脂肪组织和骨骼。尽管这些细胞的鉴定已经引发了组织再生和分化的进展，这样的细胞的使用为一些技术障碍所阻碍。使用这些细胞的一个缺点为它们极为少见(低至1/2,000,000细胞)，这造成对其的获得和分离的困难和费用昂贵。当然，骨髓的采集通常对供体是很痛苦的。进一步，这样的细胞在没有诱导分化的情况下难于培养，除非使用经特定检测的血清批号并为这样的干细胞的应用附加进一步的支出和劳动。因此需要多能干细胞的更方便的来源，特别是可在无需对培养材料进行昂贵的预筛选的情况下进行培养的细胞。
在组织工程中的其它进展已经表明细胞可在特殊限定的培养物中生长以产生三维结构。空间限定的获得可通过使用非细胞的网格(lattice)和基质以支持和导引细胞的生长和分化来完成。尽管该技术仍处于初期阶段，在动物模型上进行的实验已经证明有可能使用多种非细胞网格材料以再生完整组织(例见，Probst et al.，BJUInt.，85(3)，362-7(2000))。一种适当的网格材料是分泌的细胞外基质材料，该基质材料分离自肿瘤细胞系(例如，Engelbreth-Holm-Swarm肿瘤分泌的基质-“matrigel”)。该材料含有IV型胶原和生长因子，并且提供一种用于细胞生长的优良底物(例见，Vukicevic et al.，Exp.Cell Res，202(1)，1-8(1992))。但是，由于该物质还能促进一些细胞的恶性转化(例见，Fridman，et al.，Int.J.Cancer，51(5)，740-44(1992))，它还不适合于临床应用。尽管已经开发出了其它的人工网格，这些网格被证明当在体内使用时对细胞或对患者具有毒性。因此，仍然需要在细胞培养和群体生长中适于被用作底物的网格材料。
                     发明概要
本发明提供了脂肪来源的干细胞和网格(lattice)。在一个方面，本发明提供了一种基本无脂肪细胞的脂肪来源的干细胞以及红细胞和结缔组织干细胞的克隆群体。该细胞可单独或在同生物学上可兼容的组合物中被用于在体内或体外产生分化的组织和结构。另外，这些细胞可被增殖或培养以产生激素或提供条件培养基，该培养基可用于支持其它细胞群体的生长和增殖。在另一个方面，本发明提供了一种脂肪来源的基本无细胞的网格，该网格含有来自脂肪组织的细胞外基质材料。该网格可被用作底物以促进细胞的生长和分化成为原基或成熟组织或结构。
考虑到脂肪组织的丰富，本发明的细胞和网格为多能干细胞的一种方便来源。进一步，由于这些细胞可在培养条件下以未分化状态传代培养而无需经预检测的血清批号，与其它类型干细胞相比，本发明的细胞可在相当低的花费下维持。通过附图和以下的详细描述，本发明的这些和其它的优点以及附加的发明特点将十分明显。
                      发明详述
本发明的一个方面涉及到一种脂肪来源的干细胞。在优选的情况下，该干细胞中基本无其它类型的细胞(例如，脂肪细胞、红细胞、其它基质细胞等等)以及细胞外基质材料；在更优选的情况下，该干细胞完全不含上述其它细胞类型和基质材料。在优选的情况下，本发明的细胞来自一种灵长目动物的脂肪组织，在更优选的情况下，本发明的细胞来自一种高等的灵长目动物的脂肪组织(例如，狒狒或猿)。在典型情况下，本发明的细胞来自人类脂肪组织，其获得通过使用诸如本文所述的方法来完成。
尽管本发明的细胞可以为任何类型的干细胞，为用于组织工程，理想的细胞为中胚层来源的细胞。在典型情况下，这些细胞在被分离后保持两种或更多种中胚层或间叶细胞的发育表型(即，它们具有多能性)。特别地，这样的细胞通常具有发育成为间叶组织的能力，间叶组织的例子如成熟的脂肪组织、骨骼、心脏的各种组织(例如，心包膜、心外膜、心外肌膜、心肌、心包膜、瓣膜组织等等)、真皮结缔组织、血液组织(例如，血球、心内膜、血管上皮细胞等等)、肌肉组织(包括骨骼肌、心肌、平滑肌等等)、泌尿生殖器组织(例如，肾脏、前肾、后肾和中肾管、后肾囊、输尿管、肾盂、集合小管、雌性生殖结构上皮(特别是输卵管、子宫和阴道))、胸膜和腹膜组织、内脏、中胚层腺体组织(例如，肾上腺皮质组织)和基质组织(例如，骨髓)。当然，由于细胞能够保持分化成为成熟组织的能力，细胞可以通过分化成为一种适当的前体细胞(例如，前脂肪细胞，前肌细胞，前骨细胞等等)而实现其发育上的表型能力。同时，根据其培养条件这些细胞还可以表现出一些表型，例如胚的、胎的、造血的、神经性的或neuralgiagenic的发育表型。在这一意义上，本发明的细胞可以具有两种或多种发育表型，例如脂肪形成的、软骨形成的、心脏形成的、皮肤形成的、造血的、hemangiogenic、肌形成的、肾形成的、neuralgiagenic、泌尿生殖器形成的、骨形成的、心包膜形成的(pericardiogenic)、腹膜形成的、胸膜形成的、内脏形成的以及基质的发育表型。尽管这些细胞可以保持这些发育表型的两种或更多种，在优选的情况下，这些细胞具有三种或更多种这些发育表型(例如，四种或更多种中胚层或间叶细胞发育表型)，并且本发明的干细胞一些类型具有在分化过程中获得任何间叶细胞发育表型的能力。
本发明的干细胞可通过任何适当的方法从脂肪组织中获得。在这些方法的任何一个中的第一个步骤都需要从动物来源中分离脂肪组织。该动物体可以是活体或死亡动物，只要该动物中的脂肪基质组织是活的就行。在典型情况下，人类脂肪基质细胞可获自活的供体，该获取使用广为接受的方案，如手术或脂肪抽吸。事实上，由于脂肪抽吸很普遍，脂肪抽吸物是用于产生本发明的细胞的一个特别优选来源。
无论如何获得，该脂肪组织均被加工以从该材料的残留物中分离出干细胞。在一个方案中，该脂肪组织以生理盐水溶液洗涤(例如，磷酸缓冲液(PBS))，并且随后剧烈搅拌并放置至澄清，该步骤用于从脂肪组织中除去松散的物质(例如，损伤组织、血液、红血球等等)。因此，该洗涤和澄清步骤通常被重复直至上清相对无残渣。
剩余的细胞通常以大小不同的团块形式存在，该方案进行标准的步骤以降解大的结构，并同时使对细胞本身的损伤降至最低。可达此目的的一种方法为以一种酶处理被洗涤的团块，该酶(例如，胶原酶、分散酶、胰蛋白酶等等)可减弱或破坏细胞间的结合。这些酶处理的量和持续时间根据使用的条件而变化，但这些酶处理的使用在本领域中通常是已知的。在代替这些酶处理的情况下或在同时使用这些酶处理的情况下，细胞团块可使用其它处理来降解，例如，机械搅拌、超声能量、热力等等。如果降解通过酶学方法完成，最好在一个适当的期间后中和这些酶以最小化对细胞的有害效果。
该降解步骤典型地产生聚集细胞的浆状物或悬浮物(通常为脂质体)以及基本上不含基质细胞(例如，红细胞、平滑肌细胞、内皮细胞、纤维原细胞以及干细胞)的流体组分。分离过程的下一步为将聚集细胞从基质细胞中分离。该步骤可通过离心来完成，该步骤使基质细胞成为上清下的沉淀块。随后可弃去上清并在生理适配的液体中悬浮该沉淀块。进一步，被悬浮的细胞典型地包括红细胞，在多数的方案中最好将其裂解。用于选择性裂解红细胞的方法在本领域中是已知的，并且可使用任何适当的方案(例如，在高渗或低渗介质中温育)。当然，如果红细胞被裂解，剩余的细胞应随即从裂解物中分离，例如通过过滤或离心。当然，无论红细胞是否被裂解，悬浮的细胞可经过一次或连续多次的洗涤，再离心和重悬浮以获得更高的纯度。或者，这些细胞可通过使用细胞分选仪或根据细胞的大小和基粒进行分离，干细胞较小并相对无基粒。端粒酶的表达也可作为干细胞的特异性标记。它们可通过免疫组织化学分离，例如，通过淘选或磁力珠。如果需要，用于分离本发明的细胞的任何步骤和程序可手工进行。或者，分离这些细胞的过程可由一种适当的设备辅助，在本领域中已知许多这样的设备(例见，美国专利5,786,207)。
最终的分离和重悬浮之后，这些细胞可进行培养并在需要的情况下分析其数量和活力以估测产量。在需要的情况下，这些细胞可使用标准的细胞培养基进行不分化培养(例如，DEME，在典型情况下添加5-15％(例如10％)的血清(例如，胎牛血清，马血清等等))。在优选的情况下，这些细胞可在这样的培养基中传代至少五次而不分化，同时保持其发育表型，在更优选的情况下，这些细胞可至少传代10次(例如，至少15次或甚至至少20次)而不失去其发育表型。因此，与间叶干细胞的情况相同(例如，来自骨髓细胞)，对本发明的细胞进行培养而不诱导其分化可以在不对血清批号进行特殊筛选的情况下进行。用于测量活力和产量的方法在本领域是已知的(例如，trypan blue exclusion)。
分离之后，通过表型鉴别对这些干细胞进行进一步分离，以将具有两种或两种以上的上述发育表型的细胞鉴别出来。在典型的情况下，以所需的密度将基质细胞铺于平板中，例如约100细胞/cm2至约100,000细胞/cm2(例如约500细胞/cm2至约50,000细胞/cm2，在更特定的情况下，约1,000细胞/cm2至约20,000细胞/cm2)。如果以较低密度铺平板(例如，300细胞/cm2)，这些细胞可更易于克隆化分离。例如，几天之后，在该密度下铺平板的细胞将繁殖成群体。
如果需要，这样的细胞和群体可使用用于克隆细胞群体的适当技术克隆化扩增。例如，一个繁殖的细胞群体可被实际地(physically)挑选并植入一个分离的平板(或一个多孔板的孔内)。在替代情况下，该细胞可在一个统计比率下被亚克隆入一个多孔板以辅助向各孔置入一个单细胞(例如，从约0.1到约1个细胞/孔或甚至约0.25至0.5细胞/孔，例如0.5细胞/孔)。当然，这些细胞可通过在低密度下铺平板(在有盖培养皿或其它适当的底物上)并使用诸如克隆环这样的设备将其同其它细胞分离而被克隆。或者，在有一种照射源的情况下，可通过先使细胞生长成单层，并随后遮住一个细胞而照射其它细胞的方法获得克隆。存活的细胞随后将生长成单层。尽管克隆群体可在任何适当的培养基中进行生产，用于克隆干细胞(例如本发明的干细胞或其它干细胞)的优选培养条件为约2/3的F12培养基+20％血清(在优选的情况下为胎牛血清)以及约1/3的标准培养基，该标准培养基已经以基质细胞(例如，来自脂肪抽吸物的基质血管组分的细胞)条件化，根据体积决定相对的比例。
在任何情况下，无论克隆或非克隆，被分离的细胞可以被培养至适当的程度，在该程度下可估测其发育表型。如所提及，本发明的细胞具有至少两种上述发育表型。这样，来自一个给定克隆的一个或多个细胞可经处理以确认是否其具有这样的发育潜能。处理的一个类型为在培养基中培养本发明的细胞，该培养基已经通过暴露于相应的待分化类型的成熟细胞(其pr precursor)而条件化(例如，通过暴露于肌细胞的而条件化的培养基可诱导肌形成分化，通过暴露于心脏瓣膜细胞的而条件化的培养基可诱导分化成为心脏瓣膜组织，等等)。当然，也可使用用于诱导分化的限定培养基。例如，脂形成发育表型可通过将细胞暴露于辅助脂肪组织发生的培养基而估测，例如，含有糖皮质激素(例如，异丁基-甲基黄嘌呤、地塞米松、氢化可的松、可的松等等)、胰岛素、一种提高细胞内cAMP水平的化合物(例如二丁缩醛-cAMP，8-CPT-cAMP(8-(4)chlorophenylthio)-腺苷3’，5’环单磷酸；8-溴-cAMP；二辛酰基-cAMP，毛喉素等)，和/或一种抑制cAMP降解的化合物(例如，一种磷酸二酯酶抑制剂，如甲基异丁基黄嘌呤、茶碱、咖啡因、消炎痛，及其它类似物)。这样，将干细胞暴露于约1μM到10μM的胰岛素和约10-9到约10-5M的地塞米松可诱导脂形成分化。这样的培养基还可含有其它试剂，例如，如果需要可含有消炎痛(例如，约100μM到约200μM)，并且在优选的情况下应不含血清。骨形成发育表型可通过将细胞暴露于约10-9到约10-7M的地塞米松(例如，约1μM)以及约10μM到约50μM的抗坏血酸-2-磷酸和约10nM到50nM的β-磷酸甘油来诱导，并且该培养基可含有血清(例如，牛血清，马血清等等)。肌形成分化可通过将细胞暴露于约10μM到约100μM的氢化可的松来诱导，在优选的情况下诱导在富含血清的培养基中进行(例如，含有约10％到20％的血清(牛、马或其混合物))。成软骨分化可通过将细胞暴露于约1μM到10μM的胰岛素以及约1μM到10μM的铁传递蛋白、约1ng/ml到10ng/ml的转化生长因子(TGF)β1和约10nM到约50nM的抗坏血酸-2-磷酸(50nM)。对于成软骨分化，在优选的情况下细胞在高密度下(如，约数百万细胞/ml或采用微量培养技术)，并在低含量血清的出现下(例如，从1％到5％)培养。这些细胞还可被诱导以呈现出一种发育上较不成熟的表型(例如，一种胚性或胎性表型)这样的诱导可通过将本发明的细胞暴露于模仿胎儿和胚中的条件下来进行。例如，本发明的细胞或群体可以同分离自胚或胎儿的细胞共培养，或在胎血清存在的情况下培养。沿着这些线路，该细胞可被诱导以分化成为任何上文提及的中胚层细胞谱系，该诱导通过将其同各表型的成熟细胞或其前体共培养来进行。由此，例如，肌形成分化可通过将本发明的细胞同肌细胞或其前体进行培养，并且类似的结果可考虑本文提及的其它组织类型来获得。本领域已知其它用于诱导分化的方法，如果适当可使用其中多数。
细胞在分化诱导培养基中培养一段时间后(例如，几天之一周，或更多)，对该细胞进行分析以确定是否事实上这些细胞已经分化以获得一种给定类型的细胞的实际性质。对实际上的一种测量为端粒的长度，未分化干细胞比分化的细胞具有较长的端粒；由此这些细胞可进行端粒酶水平的分析。或者，可从细胞中抽提RNA或蛋白并对显示所需表型的标记的存在进行分析(经过Northern杂交、rtPCR、Western印迹分析等)。当然，这些细胞可进行免疫组织化学分析或使用组织特异性染料进行染色。这样，例如，为估测脂形成分化，这些细胞可经过脂肪特异性染色(例如，油红0、safarin red、苏丹黑等)进行估测或探针探测以估测脂肪相关因子(IV型胶原、PPAP-γ、adipsin、脂蛋白脂肪酶)的存在。类似地，骨细胞发生的估测可通过以骨骼特异性染剂(例如，碱性磷酸酶、von Kossa等)染色来进行，或者通过探针检测骨骼特异标记的存在(例如，骨钙素、骨粘连蛋白、骨桥蛋白、类型I胶原、成骨蛋白，cbfa等)。肌肉形成的估测可通过鉴定经典形态学变化(多核化细胞、合体细胞(syncitia)的形成)来进行，或对肌肉特异因子(例如，myo D、肌球蛋白重链、NCAM等)的存在进行估测。软骨形成的估测可通过以软骨特异性染剂(例如，alcian blue)染色来进行，或者通过探针检测表达/产生软骨特异分子的细胞(例如，培养基中的硫酸化的粘多糖和蛋白聚糖(例如，角蛋白、软骨素等等)，类型II胶原等)。用于估测发育表型的方法在本领域中是已知的，这些中的任何方法均是适当的。例如，这些细胞可通过大小和基粒进行分选。另外，这些细胞还可被用于产生单克隆抗体，可对这些抗体是否优先地结合一种给定的细胞类型进行估测。抗原的相关性可证实这些干细胞已经沿着一种给定的发育途径进行分化。
尽管该细胞可以是单独的并且同其它细胞分离，在优选的情况下该细胞处于细胞的群体中，并且本发明提供了一种被限定的群体，该群体包括本发明的细胞。在一些实施方案中，该群体为混合形式。由此，例如，本发明可以含有支持细胞，该支持细胞用于向本发明的细胞提供因子。当然，本发明的干细胞本身可作为支持细胞用于培养其它类型的细胞(例如其它类型的干细胞，如神经干细胞(NSC)、造血干细胞(HPC，尤其是CD34+干细胞)、胚性干细胞(ESC)以及上述细胞的混合物)，并且该群体可含有这些细胞。在其它的实施方案中，该群体基本是均质的，主要由本发明的脂肪来源的干细胞组成。
由于本发明的细胞可被克隆，含有这些细胞的基本均质的群体也可被克隆。实际上，本发明还涉及到基本由中胚层干细胞、结缔组织干细胞或它们的混合物组成的细胞群体。在这一实施方案中，这些细胞可以为脂肪来源或来自其它中胚层细胞组织或连接细胞组织(例如，骨髓、肌肉等等)，其产生使用本发明已知的方法。分离之后，这些细胞可如本文所述进行克隆扩增。
本发明的细胞(以及细胞群体)可被应用于多种目的。如所述及，这些细胞可支持其它类型细胞的生长和扩增，并且本发明涉及到用于达到此目的的方法。在一个方面，本发明涉及到一种使用本发明的干细胞来条件化培养基的的方法，还涉及到通过这一方法产生的条件化培养基。该培养基通过将所需的培养基暴露于这些细胞来条件化，该暴露在足以使这些细胞对其进行条件化的条件下进行。在典型情况下，该培养基被用于支持本发明的细胞的生长，本发明的细胞向培养基分泌激素、细胞基质材料以及其它因子。一段适当的时期后(例如，一天或几天)，含有分泌的因子的培养基可以同这些细胞分离并储存备用。当然，本发明的细胞和群体可根据需要被连续重复使用以对培养基进行条件化。在其它的应用中(例如，用于将本发明的细胞同其它细胞类型共培养)，这些细胞可留在条件化的培养基中。由此，本发明提供了使用这一方法获得的一种条件化的培养基，该培养基可根据需要含有本发明的细胞或基本不含本发明的细胞。
该条件化的培养基可被用于支持所需的细胞类型的生长和扩增，并且本发明提供了一种使用条件化培养基培养细胞(特别是干细胞)的方法。该方法涉及到在条件化的培养基中维持一种所需的细胞，该维持在使这些细胞存活的条件下进行。该细胞可在任何适当的培养条件下维持，例如本领域所已知的条件。在理想情况下，该方法使该细胞保持连续回合的有丝分裂以形成被扩增的群体。准确的条件(例如，温度，CO2水平、搅拌、抗生素的存在等等)根据培养基的成分和细胞的类型而决定。然而，对这些参数的最优化在本领域的技术范围内。在一些实施方案中，培养基须基本不含脂肪来源的细胞，这些细胞被用于如本文所述对培养基进行条件化。然而，在其它的实施方案中，脂肪来源的细胞须留在条件化的培养基中并同目的细胞共培养。实际上，由于本发明的脂肪来源细胞可表达细胞间通讯的细胞表面调节剂，本发明的细胞和所需的其它细胞通常需要进行共培养，该共培养在使这两种细胞接触的条件下进行。可通过，例如，在适当的培养底物上将细胞作为异质一的细胞群体来培养来以达到该目的。或者，本发明的脂肪来源的细胞可首先培养至汇合，该培养物可用作第二种所需的细胞的底物以在条件化培养基内进行培养。
在另一个实施方案中，本发明的脂肪来源的细胞可被遗传修饰以表达外源基因或抑制内源基因的表达，并且本发明提供了一种对所述细胞和群体进行遗传修饰的方法。根据这一方法，该细胞被暴露于一种基因转移载体，该载体含有一种核酸，该核酸含有一种转基因，该暴露使该核酸在适于该转基因在该细胞中表达的条件下被转入该细胞。该转基因通常为一种表达框，该框含有一种编码聚核苷酸，该聚核苷酸与一种适当的启动子可操作地连接。该编码的聚核苷酸可编码一种蛋白，或者编码一种生物活性的RNA(例如，反义RNA或核糖体)。由此，例如，该编码的聚核苷酸可以编码一种导致对一种毒素的抗性的基因、一种激素(例如肽生长激素、激素释放因子、性激素、促肾上腺激素、细胞因子(例如，干扰素、白细胞介素、淋巴因子)等)、一种细胞表面结合的细胞内信号转导部分(例如，细胞粘连分子、激素受体等)、一种促进一种给定的分化谱系的因子，等等。当然，在需要使用基因转移技术以送递一种给定的转基因的情况下，其序列应是已知的。
在该表达框内，该编码聚核苷酸被可操作地连接于一种适当的启动子。适当的启动子的例子包括原核启动子和病毒启动子(例如，反转录病毒ITRs、LTRs，立即早期病毒启动子(IEp)，如肝炎病毒IEp(例如，ICP4-IEp和ICPO-IEp)、巨细胞病毒(CMV)IEp以及其它病毒启动子，例如劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子和鼠白血病病毒(MLV)启动子)。其它适当的启动子为真核启动子，例如增强子(例如，兔β-球蛋白调控元件)、组成型活性启动子(例如β-肌动蛋白启动子等)、信号特异性启动子(例如，诱导型启动子，如对RU486反应的启动子等等)，以及组织特异性启动子。选择适于在预先限定的细胞中操纵基因表达的启动子在本领域的技术范围内。如所描述，该表达框可含有多于一种的编码聚核苷酸，并且可以含有其它的元件(例如，多聚腺苷酸序列、编码一种插膜信号或一段分泌导肽的序列、核糖体进入序列、转录调节元件(例如，增强子、沉默子等等)，及其它类似序列)。
含有转基因的该表达框应被引入一种遗传载体，该载体适于向细胞导入转基因。根据所需的最终应用，任何这样的载体均可被用于对细胞进行遗传修饰(例如，质粒、裸露DNA、病毒如腺病毒、腺病毒相关病毒、肝炎病毒、慢病毒(lentivirus)、乳头瘤病毒、反转录病毒)。可以使用任何用于将所需的表达框构建入这样的载体的方法，这些方法中的多种为本领域所已知(例如，直接克隆、同源重组等)。当然，载体的选择将在很大程度上决定所使用的用于将载体引入细胞的方法(例如，通过原生质体融合、磷酸钙沉淀、基因枪、电穿孔、病毒载体感染等等)，这些均在本领域中是已知的。
遗传上改变的细胞可被用作生物反应器，以生产该转基因的产物。在另一个实施方案中，该遗传修饰的细胞被用于向一种动物引入该转基因及其产物。例如，细胞一旦经遗传修饰便被引入动物体，该引入在足以使该转基因在体内表达的条件下进行。
除用作遗传修饰的可用目标外，本发明的许多细胞和群体分泌激素(例如，细胞因子、肽或其它生长因子(例如，单丁酸甘油酯)，等等)。一些细胞在分离之初便在天然状态下分泌这样的激素，其它的细胞可经遗传修饰以分泌激素，如本文所述。本发明的分泌激素的细胞可在多种情况下在体内或体外使用。例如，这样的细胞可被用作生物反应器以提供一种给定的激素的一个方便的来源，并且本发明涉及到一种从这些细胞中获得激素的方法。根据该方法，该细胞在适于它们向培养基中分泌激素的条件下进行培养。在一段适当的时间后，在优选的情况下为定期地，该培养基被收集并加工以从培养基中分离激素。任何标准的方法(例如，凝胶或亲和层析、透析、冷冻干燥等)均可被用于从培养基中纯化激素，许多方法在本领域中是已知的。
在其它的实施方案中，本发明的分泌激素的细胞(和群体)可被用作治疗剂。通常情况下，这样的方法涉及到将这些细胞直接转入所需的组织，体外(例如，作为移植或植入前的移植物)体内均可。这些细胞可通过许多适当的方法转入所需的组织，该方法一般根据组织类型而变化。例如，可通过将一种移植物同含有细胞的培养基洗涤(或对该移植物进行灌输)而将这些细胞转入该移植物。或者，这些细胞可植入组织中的所需位点以创建一个群体。细胞可使用设备转入体内位点，设备的例子如导管、套管针、套管、stents(可同细胞进行培养)等等。对于这些应用，在优选的情况下该细胞分泌一种细胞因子或生长激素，例如人类生长因子、纤维原细胞生长因子、神经生长因子、类胰岛素生长因子、造血干细胞生长因子、纤维原细胞生长因子家族的成员、血小板来源的生长因子家族的成员、血管和内皮细胞生长因子、TGFb家族成员(包括骨骼形态发生因子)或先天失调的特异性酶(例如，distrophin)。
在一种应用中，本发明提供了一种在患者中使用这些细胞促进伤口愈合的方法。根据这些方法，本发明的分泌激素的细胞在足以使该细胞分泌激素的条件下被转入伤口附近。激素在伤口附近的存在促进了伤口的愈合。该方法能促进外部(例如，表面)或内部伤口的愈合。可用本发明的方法促进愈合的的伤口包括擦伤、撕裂伤害、吹伤、烧伤、挫伤、枪伤、割伤、开放伤口、扎伤、刺伤、穿刺性伤口、seton伤、戳伤、手术伤口、皮下伤口或切割伤口，但不限于这些。该方法不需要获得伤口的完全痊愈或愈合；对于该方法，促进任何程度的伤口愈合便已足够。在这一方面，该方法可被单独使用或作为其它用于治疗创伤组织的方法的辅助手段使用。
在本发明的细胞分泌一种成血管激素的情况下(例如，血管生长因子、血管和内皮生长因子等)，它们(以及含有它们的群体)可被用于在组织中诱导血管发生。由此，本发明提供了一种使用这样的细胞在组织中促进新生血管的方法。根据这一方法，该细胞在足以使该细胞产生成血管激素的条件下被引入目的组织。激素在该组织中的存在促进了在该组织中的新生血管化。
由于本发明的干细胞具有一种发育表型，它们可被用于组织工程。在这一方面，本发明提供了一种产生动物物质的方法，该方法包括在足以使本发明的细胞扩增和增殖的的条件下维持这些细胞以形成所需的物质。该物质可包括成熟组织或甚至完整的器官，该组织或器官含有本发明的细胞可发育而成的组织类型(如前所述)。在典型的情况下，该物质包括脂肪组织、软骨组织、心脏、真皮结缔组织、血液组织、肌肉、肾脏、骨髓、胸膜、内脏组织、血管组织，及其它类似组织。在更典型的情况下，该物质含有这些组织类型的组合(即，多于一种组织类型)。例如，该物质可含有一种动物器官(例如，心脏、肾脏)的全部或部分或肢(例如，腿、翅膀、臂、手、脚等等)。当然，由于这些细胞可分裂或分化以产生这样的结构，它们还可形成这些结构的原基。在早期阶段，这样的原基可被低温保存以用于将来产生所需的成熟结构或器官。
为产生这样的结构，本发明的细胞和群体在适于它们扩增并分裂以形成所需结构的条件下维持。在一些应用中，这一维持可通过将它们转入一个动物体(即，体内)，该过程在典型情况下在一旦发现该动物需要该新物质的情况下进行。由此，例如，本发明可在一种动物体内辅助组织的再生(例如，骨髓、肌肉、软骨、腱、脂肪组织等等)，该动物体植入了这些组织。在其它的实施方案中，特别是在建立原基的情况下，这些细胞可被诱导以在体外分化和扩增成为组织。在这样的应用中，这些细胞在底物上培养以辅助形成益于组织发育的三维结构。由此，例如，这些细胞可被培养或植入一种生物上适配的网格，例如含有细胞外基质材料、合成聚合物、细胞因子、生长因子等等的网格。这样的网格可被做成所需要的形状以辅助组织类型的发育。另外，在该培养的至少一个早期阶段，向该培养基和/或底物添加因子以辅助适当组织类型和结构的发育。事实上，在一些实施方案中，需要将这些细胞同相应类型的成熟细胞或其前体进行共培养，或将这些细胞暴露于相应的条件化的培养基，如上文所述。
为辅助本发明的脂肪来源的细胞和群体对产生这样的动物物质和组织的应用，本发明提供了一种组合物，该组合物包括本发明的细胞(和群体)以及生物学上适配的网格。在典型情况下，该网格由多聚材料形成，该网格具有纤维以作为网丝或海绵，该材料典型地具有约100μm到约300μm的空间。这样的结构提供了充足的区域以供细胞生长和繁殖。在理想的情况下，该网格为可长期被生物降解的，这样可使其在发育时被被吸收成为动物物质。因此，适当的聚合物网格可由一些单体形成，例如羟基乙酸、乳酸、反丁烯二酸丙酯、己内酯、hyaluronan、透明质酸及其它类似的物质。其它的网格可以含有蛋白、多糖、多羟基酸、聚原酸酯(polyorthoester)、聚合酐、聚膦腈或合成多聚物(特别是可生物降解的多聚物)。当然，一种适于形成网格的多聚物可含有多于一种的单体(例如，所示单体的组合)。另外，根据需要该网格还可含有激素，例如生长因子、细胞因子以及成形素(例如，视黄酸、aracadonic acid等)，还可含有所需的细胞外基质分子(例如纤连蛋白、层粘连蛋白、胶原等等)或其它材料(例如DNA、病毒、其它细胞类型等等)。
为形成该组合物，这些细胞被引入该网格以使其渗入其内部空间。例如，该基质可被浸入一种含有该细胞的溶液或悬浮液，或者将该细胞灌输入或注射入该基质。一种特别优选的组合物为一种水凝胶，该凝胶由含有多聚物的悬浮物交联而成，该悬浮物还含有散布其中的本发明的细胞。这一形成方法使得细胞散布于整个网格，这样可辅助该细胞对网格更均匀地渗透。当然，该组合物还可含有一种所需类型的成熟细胞或其前体，这样特别可以加强本发明的干细胞的诱导，以在网格中进行适当的分化(例如，作为在网格中对这些细胞进行共培养的效果)。
该组合物可以任何适当的方式应用以辅助所需的组织类型、结构或原基的生长和产生。例如，该组合物可以使用三维或立体模型技术进行构建。由此，例如，该组合物中的一个层面或区域可由被引发成骨分化的细胞占据，而该组合物中的另一个层面或区域可由被引发进行成肌肉分化和/或成软骨发育的细胞占据。将这些区域互相并列放置可辅助包括多组织类型的复杂结构(例如，由肌肉环绕的骨骼，例如肢)的成型和分化。如果适当，为引导所需的结构的生长和分化，该组合物可在一种生物反应器或孵育器中进行来自体内培养。在另一个实施方案中，该结构可被直接植入宿主体内的需要生长该组织或结构的位置。在另一个实施方案中，该组合物可被移植入一个宿主(在典型情况下为一种动物，例如猪、狒狒等)，在其中这些细胞可生长和成熟直至可以使用。其后，在适当时候该成熟结构(或原基)被从宿主体内切割取出并植入宿主。
适于包括入组合物中的网格可来自任何适当的来源(例如基质胶(matrixgel))并且有适当的网格的商业来源(例如，适当的聚乙醇酸，其可获自诸如Ethicon，N.J.这样的来源)。另一种适当的网格可来自脂肪组织的非细胞部分一即，基本不含细胞的脂肪组织细胞外基质，并且本发明提供了这样的脂肪来源的网格。在典型情况下，这样的脂肪来源的网格含有蛋白，例如蛋白聚糖、糖蛋白、hyaluronin、纤连蛋白、胶原(类型I、II、III、IV、V、VI等等)以及其它类似物，这些蛋白可作为细胞生长的优良底物。另外，这些脂肪来源的网格可含有激素以辅助植入该基质的细胞的生长，在优选的情况下该激素为细胞因子和生长因子。
该脂肪来源的基质可从脂肪组织中分离，除该基质存在于非细胞组分外，该分离同上文所描述类似。例如，可对脂肪组织或其衍生物(例如，上文所述的离心后的细胞的一个组分)应用超声或热力和/或酶学处理以回收基质材料。另外，在理想情况下，该脂肪组织的细胞组分被破碎，例如通过脂肪酶、去污剂、蛋白酶处理和/或机械或超声破碎(例如，使用搅拌器或超声仪)。无论如何分离，该材料一开始为一种粘性物质，但该物质可根据最终目的的需要被随后进行处理。例如，原始材料可被处理(例如，透析或以蛋白酶或酸等处理)，以产生一种所需的网格材料。由此，该网格可被制备成一种水合形式或被干燥或冻干成为基本无水的形式或粉末。其后，该粉末可被重新水化以用作细胞培养底物，例如通过在适当的细胞培养基中悬浮该粉末。在这一方面，该脂肪来源的晶格可同其它适当的网格材料混合，例如上文所述。当然，本发明涉及到一些组合物，它们含有脂肪来源的网格和细胞或细胞的群体，例如本发明的脂肪来源的细胞和其它细胞(特别是其它类型的干细胞)。
如上文讨论，本发明的这些细胞、群体、网格和组合物可被用于组织工程和再生。这样，本发明涉及到一种可植入的结构(即，一种移植物)，该移植物含有发明的这些特征的任意部分。该移植物的准确性质根据其所应用而变化。如所描述，该组合物可以是或含有成熟组织或其可含有非成熟组织或网格。由此，例如，移植物的一种类型可以为骨骼移植物，该移植物含有本发明的细胞的一个群体，该群体正进行(或引发)成骨分化，该移植物根据情况被植入一个大小和空间结构适当的网格，如上文所描述。这样的一种移植物可被注射入或移植入一个宿主以促进患者体内的成熟骨骼组织的产生或再生。类似的移植物可被用于促进患者体内的肌肉、脂肪组织、软骨组织、腱等等的再生。其它的类型的移植物为原基(如本文所述)，例如，肢原基、趾原基、发育的肾等等，这些原基一旦被移植入患者将成熟成为适当的结构。
该脂肪来源的网格可方便地被用作一种细胞试剂盒的一部分。因此，本发明提供了一种试剂盒，该试剂盒含有脂肪来源的网格和一种或多种其它组份，例如水化试剂(例如，水、生理适配的盐溶液、被制备的细胞培养基、血清或其衍生物，等等)、细胞培养物品(例如，培养盘、平板、瓶等)、细胞培养基(液体或粉末)、抗生素化合物、激素及其它类似物。尽管该试剂盒可含有任意这样的成分，在优选的情况下该试剂盒含有支持所需的适当组合的细胞类型的培养和生长所必需的所有组分。当然，如果需要，该试剂盒还可含有细胞(在典型情况下为冷冻的细胞)，该细胞可如本文所述被植入网格。
尽管本发明的许多方面涉及到组织生长和分化，该发明还具有其它的应用。例如，该脂肪来源的网格可被用作一种实验试剂，例如在发育改善网格和底物中用于组织生长和分化。该脂肪来源的的网格还可以被应用于化妆品，例如用于隐藏皱纹、伤疤、皮肤凹陷等等，或用于组织增加。对于这些应用，在优选的情况下该网格被风格化并以单位剂量形式包装。如果需要，该网格可同载体(例如，诸如甘油或酒精这样的溶剂)、香水、抗生素、着色剂和其它常用于化妆品的成分混合。该物质还可被自体使用或作为同源移植物使用，并且该物质可被用作或被包含于药膏或敷料中，以辅助伤口的痊愈。该脂肪来源的细胞还可被用作实验试剂。例如，它们可被使用辅助发现感应发育的早期事件的试剂。例如，本发明的细胞可暴露于一种培养基，该培养基用于诱导一种特定的发育谱系并进行基因的分化表达的分析(例如，通过随机引物PCR或电泳或蛋白或RNA等)。
作为用于分离本发明的干细胞或脂肪来源的网格的任何步骤，本发明提供了一种试剂盒以从脂肪组织中分离这样的试剂。该试剂盒可包括一种用于从患者体内分离脂肪组织的装置(例如套管、针头或吸出器等)，以及一种用于分离基质细胞的手段(例如，通过本文所述的方法)。该试剂盒可被应用，例如，作为干细胞的bedside来源，在适当情况下该来源可随后被重新引入同样的个体。由此，该试剂盒可以在甚至相同的程序中辅助该脂肪来源的干细胞的分离以植入一名患者，该患者需要一种所需的组织类型的再生。在此方面，该试剂盒还可以含有一种培养基以用于细胞的分化，例如本文所列出的培养基。如果适当，该细胞可被暴露于该培养基以起始其在患者中的所需分化。当然，该试剂盒可被用作用于体外操作(例如，如本文所述的克隆和分化)的干细胞的方便来源。在另一个实施方案中，该试剂盒可被应用于分离一种脂肪来源的网格，如本文所述。
                       实施例
尽管本领域中的技术人员在阅读过以上的详细描述的情况下完全能够实践本发明，以下的实施例将有助于阐明本发明的一些特征。特别地，这些实施例阐示了基本无成熟的脂肪细胞的人类脂肪来源的干细胞的分离，这些细胞的克隆群体的分离，这些细胞在体内和体外分化的能力，以及这些细胞支持其它类型的干细胞生长的能力。这些实施例还阐示了一种基本无细胞的脂肪来源的网格的分离，该网格可用作细胞培养的一种适当的底物。当然，由于这些实施例纯粹为阐释性目的而存在，它们不能被用于以限制性的方式解释本发明的范围，而应整体被视作在上文的本发明的描述上的扩展。
在这些实施例中应用的方法，例如手术、细胞培养、酶学消化、组织学以及蛋白和聚核苷酸的分子分析，它们对于本领域中的普通技术人员均是熟悉的。由此，并且出于简洁目的，实验的细节不详细引用。
                      实施例1
该实施例阐述了基本无成熟的脂肪细胞的人类脂肪来源的干细胞的分离。
粗脂肪抽吸物来自接受了选择性手术的患者.在脂肪抽吸过程之前，患者被给予肾上腺素以将血液对抽吸物的污染降至最低。该抽吸物被滤过以将结合的脂肪组织碎片同结合的脂肪废物分开。用中性的磷酸盐缓冲液彻底漂洗该抽吸物，并且随后用0.075％w/v的胶原酶在37℃下经20分钟的间歇搅拌以进行酶法分解。消化之后，中和该胶原酶并在260g下对浆状物离心10分钟，该离心产生多层的上清和细胞沉淀。倒出上清并保留以备进一步使用，在红血球裂解液中重悬浮细胞沉淀，并在25℃下不经搅拌温育10分钟。温育之后，中和该培养基，并且将该细胞在250g下再离心10分钟。第二次离心之后，悬浮这些细胞，分析其存活程度(使用锥虫蓝排阻法)及细胞数。此后，将这细胞铺平板，其密度为约1×106细胞/100mm盘。它们在37℃下在DMEM+胎牛血清(大约10％)中在大约5％CO2中培养。
大部分细胞为粘附的、小的、单核的、相对无颗粒性的、纤维原细胞样的细胞，这些细胞不含有可见的脂滴。大部分的细胞的油红O和von Kossa染色为阴性。还可检测这些细胞的端粒酶的表达(使用可购得的TRAP分析试剂盒)，该检测使用HeLa细胞和HN-12细胞作为阳性参照。人类的包皮纤维原细胞和HN-12加热细胞抽提物被用作阴性参照。端粒(Telomeric)产物被溶于(resolved onto)12.5％聚丙烯酰胺槽中，并通过磷成像检测信号。在脂肪来源的干细胞和阳性参照中观察到了反映端粒酶活性的端粒条带。在阴性参照中未观察到条带。
由此，这些细胞不能被鉴定为肌肉细胞、脂肪细胞、软骨细胞、骨细胞、或血液细胞。这些结果表明脂肪来源的细胞表达的端粒酶活性类似于先前报道的人类干细胞。
这些细胞的亚群体随后被暴露于以下的培养基，以估测其发育表型：
脂肪形成 骨形成 肌形成 软骨形成
DMEM10％ FBS0.5mM IBMX1μM地塞米松10μM胰岛素200μM消炎痛1％ABAM DMEM10％ FBS5％马血清0.1μM地塞米松50μM抗坏血酸-2-磷酸10mM β甘油磷酸1％ABAM DMEM10％ FBS5％马血清50μM氢化可的松1％ABAM  DMEM10％ FBS6.25μg/ml胰岛素6.25μg/ml铁传递蛋白10ng/ml TGFβ150μM抗坏血酸-2-磷酸1％ABAM
一个群体以高密度在软骨形成培养基中培养几周。以H & E，alcianblue，toludene blue以及Goldner’s三色染色2，7，14天对该组织培养物和石蜡切片进行组织学分析。使用抗软骨素-4-硫酸和角蛋白和II型胶原的抗体来进行免疫组织化学。还进行了对基质染色的定性测定。其结果表明早至在开始处理后的48小时便形成具有软骨膜细胞的独特边缘的软骨球状结节。未处理的细胞不表现出成软骨分化。这些结果证实这些干细胞具有软骨发育表型。
一个群体被培养直至接近汇合并且随后被暴露于脂肪形成培养基几周。在铺平板后第二周和第四周，该群体以油红O染色后对其相对混浊度进行比色测定。在第二周检测到脂肪形成正在进行，并且在第四周脂肪形成程度已经很深(相对混浊度分别为1和5.3)。骨髓来源的干细胞被用作阳性参照，并且这些细胞表现出略微低的脂肪生成潜能(相对密度分别为0.7和2.8)。
一个群体被培养直至接近汇合，并且随后被暴露于骨形成培养基几周。在铺平板后第二周和第四周，该群体以von Kossa染色后对其相对混浊度进行比色测定。在第二周检测到骨形成正在进行，并且在第四周骨形成程度已经很深(相对混浊度分别为1.1和7.3)。骨髓来源的干细胞被用作阳性参照，并且这些细胞表现出略微低的骨生成潜能(相对密度分别为0.2和6.6)。
一个群体被培养直至接近汇合并且随后被暴露于肌形成培养基几周。在铺平板后第一、三周和第六周，该群体通过对多核细胞和肌特异性蛋白(MyoD和肌浆球蛋白重链)的测定而检测。人类包皮纤维原细胞以及骨骼纤维原细胞被用作参照。暴露于肌形成的培养基后的各个时间点在干细胞群体中均可见表达MyoD和肌浆球蛋白的细胞，并且这些细胞的比例在第3和6周有所增加。在第六周观察到了多核细胞。与之相比，纤维原细胞在任何时间点均不表现这些特性。
这些结果表明对人类脂肪来源的多能干细胞的分离基本不含成熟的脂肪细胞。
                      实施例2
该实施例表明脂肪来源的干细胞不受5-杂氮胞嘧啶影响而进行分化。
根据实施例1而获得的脂肪来源的干细胞在存在5-杂氮胞嘧啶的情况下培养。与骨髓来源的干细胞相反，暴露于该试剂并不诱导肌肉分化(见上文提及的Wakitani等人的文献)。
                       实施例3
该实施例表明了人类脂肪来源的干细胞的克隆群体的产生。
根据实施例1的描述而获得的脂肪来源的干细胞以约5,000个细胞/100mm盘的密度铺平板，并如实施例1所示培养几天。几个轮次的细胞分裂后，以克隆环挑选几个克隆并转至一个48孔平板的孔中。将这些细胞培养几周，每周换两次培养基，直至细胞达到80％到90％的融合(在37℃下、约5％的CO2中，在“克隆培养基”中，该培养基含2/3的F12培养基+20％胎牛血清和1/3的标准培养基，该培养基首先由在实施例1中分离的细胞进行条件化)。此后，各培养物被转入35mm的盘子并在其中生长，随后转至100mm的盘子中并生长至接近汇合。随后，将一个细胞群体冷冻，将剩下的群体铺于12孔平板中，每孔1000个细胞。
这些细胞在克隆培养基中被培养传代15次以上，并且如实施例1所示检测其分化。连续轮次的分化后，各克隆保持了未分化状态。
随后建立这些克隆的群体，并暴露于实施例1中讨论的脂肪、软骨、肌和骨培养基。至少一个克隆被观察到到暴露于相应培养基时可以分别分化成骨、脂肪、软骨和肌，多数克隆可以分化成至少三种组织。这些细胞的这种发育成为肌和软骨的能力进一步表明了这些脂肪来源的干细胞的多能性。
这些细胞表明脂肪来源的干细胞传代多次仍可保持一种未分化状态，而无需对血清批号进行预筛选。这些结果还表明在如此广泛的传代之后还可保持多能性，这表明这些细胞确实是干细胞而非只是已定向的祖细胞。
                       实施例4
该实施例表明了人类脂肪来源的干细胞可以支持其它类型干细胞的生长。
人类脂肪来源的干细胞以约30,000个/孔的密度转至96孔板，培养一周并随后进行照射。分离自脐带血的人类CD34+造血干细胞随后被加入孔中。在Myelocult H5100培养基中维持共培养，并且通过显微镜观察监测细胞的存活和繁殖。两周的共培养后，通过流式细胞仪估测造血干细胞的CD34表达。
同基质细胞进行两周的共培养后，这些造血干细胞形成圆形细胞的大克隆。流式分析揭示62％的细胞保持CD34+。根据显微镜观察，脂肪来源的基质细胞维持了存活，并且支持来自脐带血人类造血干细胞的生长。
这些结果表明，来至人类皮下脂肪组织的基质细胞能够支持其它干细胞的非体内维系、生长和分化。
                         实施例5
该实施例表明了脂肪来源的干细胞可以在体内分化。
四组(A-D)小鼠的皮下被移植了羟磷灰石/磷酸三钙立方块，每组有12只无胸腺的小鼠，该立方块含有以下物质：A组含有脂肪来源的干细胞，这些干细胞以实施例1描述的骨形成培养基预处理过；B组含有未处理过的脂肪来源的干细胞；C组含有骨形成培养基但无细胞；D组含非骨骼形培养基并且不含细胞。在各组中，在第三周杀死6只小鼠，其余的小鼠在移植后的第8周杀死。该立方块被抽提出、固定、脱钙并切片。各切片经H & E染色、Mallory骨骼染色和免疫染色对骨钙素进行染色。
在来自A和B组的切片中观察到通过骨钙素和Mallory骨染色进行的骨样组织染色所形成的独特区域。在A和B组中观察到的骨样组织远多于在其它组中的(p＜0.05 ANOVA)，但在A和B组间无显著差异。进一步，在三到四周间在A和B组中均注意到骨骼生长的定性的增加。这些结果表明该脂肪来源的干细胞可在体内分化。
                      实施例6
该实施例表明了脂肪来源的网格的分离基本不含细胞。
在一个方案中，以0.05％的胰蛋白酶EDTA/100U/ml脱氧核糖核酸酶对从实施例1回收的上清进行酶法消化3天以破坏细胞。每天均在盐水中漂洗碎片并加入新鲜的酶.此后，在盐水中漂洗该物质并重悬浮于0.05％的胶原酶和0.1％的脂肪酶中，以部分消化存在的蛋白和脂肪。该温浴连续进行两天。
在另一个实施方案中，在EDTA中温育从实施例1回收的上清以除去任何上皮细胞。使用一种溶液裂解剩余的细胞，该溶液含有1％的NP40、0.5％的脱氧胆酸钠、0.1％的SDS、5mM EDTA、0.4M NaCl、50mM Tris-HCl(pH8)和蛋白酶抑制剂，以及亮抑酶肽、胰凝乳蛋白酶抑制剂、抗痛素和抑肽素各10μg/ml。最后，在不含二价阳离子的PBS中对该组织进行充分冲洗。
在这两个准备方案之后，剩下的物质经洗涤并被鉴定为凝胶状物质。对这些物质进行的显微镜分析表明它不含细胞，并且该物质由大量的胶原(可能为IV型)以及很多种生长因子组成。这些材料的制备支持了细胞的生长，这表明它是一种细胞培养的优良底物。
                     参考引文
本文件或图表所提及或引述的所有来源(例如，发明者证书、专利申请、专利、印刷出版物、资源库查询号码或记录、实用新型、万维网页及其它类似来源)、序列表或同时一起填报的声明均在此引入并通过这样的参考而成为该说明书的一部分。
                    解释的说明
上文作为整体是本发明的完整描述，而不仅仅是该发明的某一方面的特定元素。该叙述描述了本发明的“优选的实施方案”，这包括发明者已知的实施本发明的最佳模型。当然，在阅读过上文描述的基础上，对那些优选的实施方案的变化对于本领域的普通技术人员将是很明显的。本发明者希望技术人员在适当时使用这样的变化，并且本发明者预计本发明可以本文具体描述以外的方式实施。因此，根据适用法律的允许，本发明包括附上的权利要求的所有修改方案和等价方案。
如上文描述和下文的权利要求，除非特别指出，单数的标示(例如“一个”或“一种”)包括复数的情况。不连续范围的数值的列举被用作为速记手段，意指在此范围内的每一个单独的数值，并且每一个单独的数值均如同其被各自列出一样而被包括入本说明，另外，以下术语被如下定义：
原基为一种原初的结构，它具有发育成为一种具体成熟结构的能力。
发育表型为细胞的一种通过分化过程获得一种特定的实际表型的潜能。
激素为任何由细胞分泌并且在接触时导致相同的细胞或另一细胞的表型变化的物质。
干细胞为一种多能细胞，该细胞具有根据至少两种发育途径分化的能力。
特定地对于权利要求，术语“基本由.....组成”表明除具体列举的成分或步骤外，未列出的成分或步骤只要不在实际上影响本发明的基本和新特征便也可被应用。相反，诸如“含有”“具有”和“包括”这样的术语表明除被列举的以外还可存在任何成分或步骤。术语“由.....组成”表明仅存在被列举的成分或步骤，但并不排除这些成分或步骤的等价物可以替代这些具体列举的成分或步骤的可能性。

Claims (79)

1.一种哺乳动物的脂肪来源的干细胞，该细胞基本不含成熟的脂肪细胞。
2.权利要求1的细胞，该细胞可在DEME+约10％胎牛血清中传代至少15次而不分化。
3.权利要求2的细胞，该细胞具有两种或更多种发育表型，这些表型选自由脂肪形成的、软骨形成的、心脏形成的、皮肤形成的、造血的、hemangiogenic、肌形成的、肾形成的、神经形成的、neuralgiagenic、泌尿生殖器形成的、骨形成的、心包形成的、腹膜形成的、胸膜形成的、内脏形成的以及基质的发育表型组成的群体。
4.权利要求1-3中任意之一的细胞，该细胞为人类细胞。
5.权利要求1-4中任意之一的细胞，该细胞在遗传上经修饰。
6.权利要求1-5中任意之一的细胞，该细胞具有结合于细胞表面的细胞间信号转导部分。
7.权利要求1-5中任意之一的细胞，该细胞分泌一种激素。
8.权利要求7的细胞，其中该激素选自由细胞因子和生长因子组成的激素群体。
9.一种限定的细胞群体，该群体含有权利要求1-8中任意之一的细胞。
10.权利要求9的限定细胞群体，该群体为异质的。
11.权利要求9或10的限定细胞群体，该群体进一步含有一种干细胞，该干细胞选自由神经干细胞(NSC)、造血干细胞(HPC)、胚性干细胞(ESC)及它们的混合物组成的群体。
12.权利要求9的限定细胞群体，该群体基本由权利要求1-8中任意之一的细胞组成.
13.权利要求9或12的限定细胞群体，该群体基本是均质的。
14.权利要求13的限定细胞群体，该群体为克隆群体。
15.一种限定的细胞群体，该群体基本由中胚层细胞(MHC)、结缔组织细胞(CTSC)或其混合物组成，其中该群体为克隆群体。
16.权利要求15的群体，所述干细胞具有选自以下群体的两种或更多种发育表性，该群体由脂肪形成的、软骨形成的、心脏形成的、皮肤形成的、造血的、hemangiogenic、肌形成的、肾形成的、neuralgiagenic、泌尿生殖器形成的、骨形成的、心包膜形成的、腹膜形成的、胸膜形成的、内脏形成的以及基质的发育表型组成。
17.一种脂肪来源的网格，该网格含有脂肪组织的细胞外基质物质，该物质基本不含细胞。
18.权利要求17的脂肪来源的网格，该网格含有一种人类蛋白、蛋白聚糖、糖蛋白、hyaluronin或纤连蛋白分子。
19.权利要求17或18的脂肪来源的网格，该网格含有一种胶原，该胶原选自由类型I、II、III、IV、V、VI胶原组成的群体。
20.权利要求17-19的任意之一的脂肪来源的网格，该网格含有一种激素。
21.权利要求20的脂肪来源的网格，其中该激素选自由细胞因子和生长因子组成的激素群体。
22.权利要求17-21的任意之一的脂肪来源的网格，该网格基本无水。
23.权利要求17-22的任意之一的脂肪来源的网格，该网格为冻干的。
24.权利要求17-21的任意之一的脂肪来源的网格，该网格为水化的。
25.一种试剂盒，该试剂盒含有权利要求17-24的任意之一的脂肪来源的网格和一种或多种组分，该组分选自由水化试剂、细胞培养底物、细胞培养基、抗生素化合物以及激素组成的群体。
26.一种组合物，该组合物含有一种细胞以及权利要求17-24的任意之一的脂肪来源的网格。
27.一种组合物，该组合物含有权利要求1-8任意之一的细胞和一种生物学上适配的网格。
28.一种组合物，该组合物含有权利要求9-16任意之一的群体和一种生物学上适配的网格。
29.权利要求27或28的组合物，其中该网格含有聚合物材料。
30.权利要求29的组合物，其中该聚合物材料由聚合物纤维作为网丝或海绵而形成。
31.权利要求29或30的组合物，其中该聚合物材料含有的单体选自由羟基乙酸、乳酸、反丁烯二酸丙酯、己内酯、hyaluronan、透明质酸及它们的组合组成的群体。
32.权利要求29-31任意之一的组合物，其中该聚合物材料含有蛋白、多糖、多羟基酸、聚原酸酯、聚合酐、聚膦腈、合成多聚物或它们的组合。
33.权利要求29-32任意之一的组合物，其中该聚合物材料为一种水凝胶，该凝胶由多聚物悬浮物交联而成，该悬浮物还含有散布其中的细胞。
34.权利要求29-33任意之一的组合物，其中该网格进一步含有一种激素，该激素选自由细胞因子和生长因子组成的激素群体。
35.权利要求29-34任意之一的组合物，其中该网格为 17-24的任意之一的脂肪来源的网格。
36.一种获得遗传上修饰的细胞的方法，该方法包括将 1-8任意之一的细胞暴露于一种基因转移载体，该载体含有一种核酸，该核酸包括一种转基因，由此该核酸在可使该转基因在细胞中表达的的条件下被引入该细胞。
37.权利要求36的方法，其中该转基因编码一种蛋白，该蛋白导致对一种毒素的抗性。
38.一种向动物体内传递一种转基因的方法，该方法包括(a)根据权利要求36或37获得一种遗传上修饰的细胞，以及(b)向该动物体引入该细胞，这样使该转基因在体内表达。
39.一种使权利要求1-8任意之一的细胞分化的方法，该方法包括在一种形态发生培养基中，在足以使该细胞分化的条件下培养该细胞。
40.权利要求39的方法，其中该培养基为一种脂肪形成的、软骨形成的、心脏形成的、皮肤形成的、造血的、hemangiogenic、肌形成的、肾形成的、neuralgiagenic、泌尿生殖器形成的、骨形成的、心包膜形成的、腹膜形成的、胸膜形成的、内脏形成的以及基质的形成的培养基。
41.权利要求39或40的方法，其中该形态发生培养基为一种脂肪形成培养基，并且监测该细胞以鉴定脂肪形成分化。
42.权利要求39或40的方法，其中该形态发生培养基为一种软骨形成培养基，并且监测该细胞以鉴定软骨形成分化。
43.权利要求39或40的方法，其中该形态发生培养基为一种胚性或胎性培养基，并且监测该细胞以鉴定胚性或胎性分化。
44.权利要求39或40的方法，其中该形态发生培养基为一种肌形成培养基，并且监测该细胞以鉴定肌分化。
45.权利要求39或40的方法，其中该形态发生培养基为一种骨形成培养基，并且监测该细胞以鉴定骨分化。
46.权利要求39或40的方法，其中该形态发生培养基为一种基质发生培养基，并且监测该细胞以鉴定基质或造血分化。
47.权利要求39-46任意之一的方法，其中该细胞在体外分化。
48.权利要求39-46任意之一的方法，其中该细胞在体内分化。
49.一种产生激素的方法，包括(a)在一培养基中培养权利要求7或8的细胞，该培养在足以使细胞向培养基中分泌激素的条件下进行，以及(b)从培养基中分离激素。
50.一种在患者体内促进伤口的愈合的方法，该方法包括将权利要求7或8的细胞在足以使该细胞产生激素的条件下引入伤口附近，由此该激素的存在促进了该伤口的愈合。
51.一种促进组织内的新血管形成的方法，该方法包括将权利要求7或8的细胞在足以使该细胞产生激素的条件下引入该组织，由此该激素的存在促进了组织内的新血管形成。
52.权利要求51的方法，其中该组织在动物体内。
53.权利要求51或52的方法，其中该组织为一种移植物。
54.权利要求49-53任意之一的方法，其中该激素为一种生长因子，该因子选自由人类生长因子、神经生长因子、血管和内皮细胞生长因子以及TGFβ超家族的成员组成的群体。
55.一种使培养基条件化的方法，该方法包括将权利要求1-7任意之一的细胞在足以使该细胞对培养基进行条件化的条件下暴露于一种细胞培养基。
56.权利要求55的方法，其中该培养基在被条件化后同细胞分离。
57.权利要求36-56任意之一的方法，其中该细胞属于 9-16任意之一的细胞群体。
58.一种条件化培养基，该培养基根据权利要求55或56的方法产生。
59.权利要求58的条件化培养基，该培养基基本不含 1-7任意之一的细胞。
60.一种培养干细胞的方法，该方法包括在使该干细胞保持存活的条件下，在权利要求58或59的条件化培养基中维持干细胞。
61.权利要求60的方法，其进一步包含使干细胞进行连续轮次的有丝分裂，以形成该干细胞的扩增群体。
62.权利要求60或61的方法，其中该培养基基本不含 1-7任意之一的脂肪来源的细胞。
63.权利要求60-62的任意之一方法，其中该培养基含有权利要求1-7任意之一的脂肪来源细胞。
64.权利要求63的方法，其中一种干细胞同一种脂肪来源的细胞接触。
65.权利要求60-64的任意之一方法，其中该干细胞为一种造血干细胞。
66.一种产生动物物质的方法，该方法包括使权利要求18-26的任意之一的组合物在足以使该组合物中的细胞进行扩增和分化以形成该物质的条件下维持。
67.权利要求66的方法，其中该物质含有一种组织类型，该组织选自由脂肪组织、软骨组织、心脏、真皮结缔组织、血液组织、肌肉、肾脏、骨骼、胸膜、内脏组织及其组合所组成的群体。
68.权利要求66或67的方法，其中该物质含有多于一种的组织类型。
69.权利要求66-68的任意之一方法，其中该组织至少含有一种动物器官的一部分。
70.权利要求66-68的任意之一方法，其中该物质至少含有一种动物肢的一部分。
71.权利要求66-70的任意之一方法，其中该组合物在体外维持。
72.权利要求66-70的任意之一方法，其中该组合物被引入动物体并且在体内维持。
73.一种移植物，该移植物含有权利要求1-7任意之一的细胞。
74.一种移植物，该移植物含有权利要求8-13任意之一的群体。
75.一种移植物，该移植物含有权利要求14-16任意之一的脂肪来源的网格。
76.一种移植物，该移植物含有权利要求17-26任意之一的组合物。
77.一种用于从脂肪组织分离干细胞的试剂盒，该试剂盒包括一种用于从患者体内分离脂肪组织的装置以及一种从脂肪组织的残余中分离干细胞的装置。
78.权利要求77的试剂盒，该试剂盒进一步含有一种培养基用于干细胞的分化。
79.权利要求78的试剂盒，其中该培养基选自由脂肪形成的、软骨形成的、心脏形成的、皮肤形成的、造血的、hemangiogenic、肌形成的、肾形成的、neuralgiagenic、泌尿生殖器形成的、骨形成的、心包膜形成的、腹膜形成的、胸膜形成的、内脏形成的以及基质形成的培养基组成的群体。
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