TW202221113A - 細胞層片小片、收容細胞層片小片的注射器、細胞層片小片的製造方法及其使用方法 - Google Patents
細胞層片小片、收容細胞層片小片的注射器、細胞層片小片的製造方法及其使用方法 Download PDFInfo
- Publication number
- TW202221113A TW202221113A TW110132555A TW110132555A TW202221113A TW 202221113 A TW202221113 A TW 202221113A TW 110132555 A TW110132555 A TW 110132555A TW 110132555 A TW110132555 A TW 110132555A TW 202221113 A TW202221113 A TW 202221113A
- Authority
- TW
- Taiwan
- Prior art keywords
- cell layer
- cell
- cells
- present
- microsheet
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
Abstract
提供適合微創治療的細胞層片小片。本發明提供一種細胞層片小片,其是由細胞培養物形成的細胞層片小片,且能夠通過注射針。另外,本發明提供一種由細胞培養物形成的細胞層片小片的製造方法,所述製造方法包括:在具有刺激響應性聚合物被固定化、且形成有小區塊的面的器材的所述面上培養細胞而獲得所述細胞層片小片。
Description
本發明是有關於一種細胞層片小片、收容該細胞層片小片的注射器、該細胞層片小片的製造方法及其使用方法。
有關於變形性關節病等運動系統疾病的處置,有利用組織再生工學技術生成軟骨組織的治療方法。該治療中,可將所培養的軟骨細胞或基於軟骨細胞而製作的軟骨組織移植至患部。迄今為止已提出有多種移植材料。
例如下述專利文獻1中記載:「一種移植用材料,其是向規定的移植部位移植的移植用材料,其中對於從體組織獲取的與所述規定的移植部位同種的組織構造物,維持該組織構造物的形狀而實施抗原性抑制處理,並於所獲得的細胞保持載體上保持對應於所述規定的移植部位的細胞。」(請求項1)。
[現有技術文獻]
[專利文獻]
[專利文獻1]日本專利特開2003-180819號公報
[發明所欲解決之課題]
於使用移植材料的治療中,有時不得不採用藉由切開而使患部露出從而在直視下進行移植的創傷性高的方法。
因此,本發明的主要目的在於提供一種適合微創治療的細胞層片小片。
[解決課題之手段]
即,本發明提供一種細胞層片小片,其是由細胞培養物形成的細胞層片小片,且能夠通過注射針。
所述注射針可為18 G(gauge)或比其細的注射針。
所述細胞層片小片的面積可為20 mm
2以下。
所述細胞層片小片可用於修復軟骨組織。
所述細胞可衍生自軟骨組織。
所述軟骨組織可為多指(趾)症動物的軟骨組織。
所述細胞可衍生自幹細胞。
所述幹細胞可包括富潛能幹細胞(pluripotent stem cell)、胚胎幹細胞(embryonic stem cell)或體性幹細胞(somatic stem cell)。
所述幹細胞可包括誘導性富潛能幹細胞(induced pluripotent stem cell,iPS細胞)。
另外,本發明亦提供一種注射器,收容所述細胞層片小片。
另外,本發明亦提供一種由細胞培養物形成的細胞層片小片的製造方法,所述製造方法包括:在具有刺激響應性聚合物被固定化、且形成有小區塊的面的器材的所述面上培養細胞而獲得所述細胞層片小片。
所述小區塊的面積可為20 mm
2以下。
另外,本發明亦提供一種將所述細胞片小片對動物注射給藥的方法。
[發明的效果]
根據本發明,提供一種適合微創治療的細胞層片小片。
1.細胞層片小片
本發明的細胞層片小片能夠通過注射針。細胞層片小片是否能夠通過注射針可使用含有該細胞層片小片的液體來確認。具體而言,可在包括注射針及柱塞(plunger)的注射器的內部填充含有該細胞層片小片的液體,並按壓柱塞,根據該細胞層片小片是否自該注射針射出來確認。自該注射針射出的細胞層片小片可確認為能夠通過注射針。
所述液體可由所屬技術領域中具有通常知識者適宜製備,可較佳地以該液體中的細胞層片小片具有高細胞存活率的方法製備。該液體中的細胞層片小片的細胞存活率較佳為80%以上。即,本發明的細胞層片小片通過所述注射針之前的細胞存活率較佳為80%以上。本發明的細胞層片小片的細胞存活率可藉由台盼藍分析(trypan blue assay)來測定。
本發明的細胞層片小片能夠通過注射針,由此可用於藉由注射進行的治療。於使用現有的細胞層片來進行治療的情況下,大多情況下藉由外科處置而使患部露出,對該露出的患部施用所述細胞層片。此種現有的治療的創傷性高,給患者造成大的負擔。另一方面,藉由注射給藥本發明的細胞層片小片而進行的治療與所述現有的治療相比創傷性低,可減輕患者的負擔。即,本發明的細胞層片小片適合微創治療。
所述注射針較佳為粗度為18 G或比其細。即,所述注射針較佳為外徑為1.2 mm以下。本發明的細胞層片小片於通過注射針時,注射針越細越容易受到損傷。因此,所述注射針較佳為粗度為23 G或比其粗。即,所述注射針較佳為外徑為0.6 mm以上。
本發明的細胞層片小片較佳為剛剛通過注射針後的細胞存活率不會比通過該注射針前的細胞存活率大幅下降。通過注射針前與剛剛通過後的細胞存活率之差例如可為10百分點以下。另外,本發明的細胞層片小片通過注射針前與通過了24小時後的細胞存活率之差例如可為10百分點以下。本發明的細胞層片小片於通過注射針前後,細胞存活率之差越小,越不易受到注射所帶來的影響。此種細胞層片小片更適合藉由注射進行的給藥。
本發明的細胞層片小片在剛剛通過注射針後的細胞存活率較佳為80%以上。另外,本發明的細胞層片小片通過注射針24小時後的細胞存活率較佳為80%以上。
本發明的細胞層片小片是片形狀的小片,具體而言,是作為二維面具有廣度、與面的廣度相比厚度小的小片。
細胞層片小片的面積越小越容易通過注射針。因此,本發明的細胞層片小片的面積較佳為20 mm
2以下,更佳為15 mm
2以下,進而佳為10 mm
2以下。另一方面,若該面積過小,則有時難以將細胞培養物形成為片形狀。因此,該面積較佳為0.02 mm
2以上。
如後所述,本發明的細胞層片小片是藉由在器材上培養細胞而形成,並藉由自該器材剝離而回收。該細胞層片小片有時具有收縮性。該情況下,該細胞層片小片在存在於器材上的狀態及自器材剝離後的狀態下,表觀面積可不同。於細胞層片小片具有收縮性的情況下,自器材剝離後的狀態下的細胞層片小片的面積可在置於平面上的狀態下測定。
另外,具有收縮性的細胞層片小片在自器材剝離後,有時會收縮而呈塊之類的形狀。即便於該情況下,本發明的細胞層片小片亦可藉由展開配置於平面上而確認到為片形狀。例如,藉由細胞的三維培養而形成的球狀體(spheroid)為塊狀,但不會呈片形狀,因此與本發明的細胞層片小片有區別。即,本發明的細胞層片小片不含球狀體。
本發明的一種實施方式,所述細胞層片小片較佳為可用於修復軟骨組織。軟骨組織修復用的現有的細胞層片大多藉由創傷性高的外科處置來施用。另一方面,本發明的軟骨組織修復用細胞層片小片能夠藉由注射來給藥,因此,相較於現有的細胞層片,能夠進行創傷性更低的治療。
本發明中,所謂軟骨組織的修復,包括:治療具有炎症及/或損傷的軟骨組織、強化軟骨組織、填補軟骨組織的缺損部分、以及再生軟骨組織,但並不限定於該些。另外,本發明的細胞層片小片亦可用於預防與軟骨組織相關的疾病。本發明的細胞層片小片可藉由注射來給藥至例如具有疾病的軟骨組織或骨組織。作為適合使用本發明的細胞層片小片的疾病的例子,例如可列舉關節炎、關節病、軟骨損傷、骨軟骨損傷、半月板損傷、及/或椎間盤變性,但並不限定於該些。
本發明的細胞層片小片由細胞的培養物形成。用於形成細胞層片小片的細胞較佳為動物的細胞。該動物更佳為哺乳動物,進而更佳為靈長類動物,特佳為人。
本發明的一種實施方式,用於形成細胞層片小片的細胞可衍生自軟骨組織。即,本發明的細胞層片小片可由軟骨組織由來細胞的培養物形成。藉此,本發明的細胞層片小片可更適合軟骨組織的修復。
所述衍生自軟骨組織的細胞例如可為藉由將軟骨組織中所含的細胞自軟骨組織分離而獲得的多個細胞。例如,該軟骨組織衍生的細胞可為藉由以下方式所回收的多個細胞:利用酵素對軟骨組織進行處理,藉此使軟骨組織中的細胞自軟骨組織游離,並且藉由離心分離而將游離的細胞回收。
本發明中,所述軟骨組織可為多指(趾)症動物的軟骨組織,或者亦可為多肢症動物的軟骨組織。本發明中所謂「多指(趾)症動物」,是指多指症及/或多趾症動物(具有剩餘指及/或剩餘趾的動物)。該動物較佳為哺乳動物,更佳為靈長類動物,進而更佳為人。該軟骨組織可自例如剩餘指(趾)的切除術等時所獲得的組織中採取。該組織例如可為利用侖琴射線(roentgen)進行拍攝時不顯白的部分,即烏黑地顯現的部分。多指(趾)症可為末關節骨型、中關節骨型、或基關節骨型的任一種。剩餘指(趾)可為任一指(趾),例如可為拇指或小指。於進行採取的剩餘指(趾)為疣狀且小型的情況下,所採取的皮下組織均可使用。於該動物為人的情況下,為了實現更有效率的培養,該人的年齡可較佳為5歲以下,更佳為3歲以下,進而佳為2歲以下,進而更佳為1歲以下。
作為所述酵素處理中可使用的酵素的例子,可列舉:膠原酶(collagenase)、酪蛋白酶(caseinase)、梭菌蛋白酶(clostripain)、胰蛋白酶(trypsin)、玻尿酸酶(hyaluronidase)、彈性蛋白酶(elastase)、鏈黴蛋白酶(pronase)及分散酶(dispase)。可較佳地使用該些酵素的組合。較佳的酵素的組合的例子例如為膠原酶、酪蛋白酶、梭菌蛋白酶及胰蛋白酶的組合。作為包含該組合的酵素製劑,例如可列舉膠原酶I型、膠原酶II型、膠原酶III型、膠原酶IV型及膠原酶V型(均能購自富士軟片和光純藥股份有限公司),但並不限定於該些。另外,較佳的酵素的組合的其他例子例如為膠原酶與分散酶或嗜熱菌蛋白酶(thermolysin)的組合。作為包含該組合的酵素製劑,例如可列舉釋放酶(Liberase)(能購自羅氏診斷(Roche Diagnostics)股份有限公司),但並不限定於此。另外,根據組織的狀態,亦可藉由多種酵素階段性地進行酵素處理。例如,亦可藉由利用膠原酶、酪蛋白酶、梭菌蛋白酶及胰蛋白酶依序進行處理而進行分離。酵素處理的條件可根據所使用的酵素的種類及/或軟骨組織的狀態,由所屬技術領域中具有通常知識者適宜確定。酵素處理可以例如30℃~50℃、較佳為33℃~45℃、35℃~40℃,進行例如1小時~12小時、較佳為2小時~5小時。於酵素處理的溫度過高的情況下,會產生細胞改質、活細胞減少、增殖能力降低、不能分離等問題。另外,於酵素處理溫度過低的情況下,可能會存在未達成充分的酵素活性,細胞無法分離的情況。於酵素處理時,藉由施加物理性刺激,可高效率地完成細胞回收。
所述酵素反應可藉由以下方式來停止,即,藉由清洗而對正在接受酵素處理的關節軟骨的細胞懸浮液進行稀釋。於酵素反應停止後,該細胞懸浮液可藉由離心分離而分為細胞塊與上清液。關於釋放酶,可藉由兩次以上的洗滌來使酵素反應停止。該離心分離可在可以更多地收集小於25 μm、尤其20 μm以下、且15 μm以上的細胞的條件下進行。為了更多地聚集此種細胞,該離心分離可以例如1000 rpm以上、1500 rpm以上、或2000 rpm以上,進行例如5分鐘以上、7分鐘以上、或10分鐘以上。
所述軟骨組織衍生的細胞可藉由所謂的外生長(outgrowth)法來獲得。外生長法可包括:將所採取的軟骨組織細切的步驟;將細切的軟骨組織片與少量的培養基一起播種於培養皿中進行培養的步驟。藉由該培養而自該軟骨組織片生成增殖的細胞。該生成的細胞藉由酵素處理及離心分離而被回收。該回收的細胞可用於製造本發明的細胞層片小片。
所述將軟骨組織細切的步驟例如可於濕潤狀態下進行。該步驟例如可藉由以下方式來進行:於50 ml離心沈降管中放入組織片與少量的培養基,利用梅岑鮑姆剪刀(Metzenbaum Scissors)(超剪切、碳化鎢、長18 cm、彎曲(SuperCut Tungsten Carbide 18cm Long Curve))(世界精密儀器(World Precision Instruments)公司)進行切碎。較佳為獲得盡可能小的軟骨組織片。另外,用以對細切的軟骨組織片進行培養的培養基可由所屬技術領域中具有通常知識者適宜選擇,較佳為杜氏培養基(Dulbecco's Modified Eagle Medium,DMEM)/F12+20%胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)+抗生物質(antibiotics)(以下亦稱為AB)。於培養開始後確認到細胞貼壁於培養皿後,可較佳地將培養基更換為DMEM/F12+20%FBS+AB+抗壞血酸(ascorbic acid)(以下亦稱為AA)。於培養基自培養開始時起包含抗壞血酸的情況下,會阻礙細胞對培養皿的黏附。另外,所述培養可在一般的培養條件下進行,例如可在37℃、5%二氧化碳(CO
2)的培養器(incubator)內進行。培養可進行至達成近匯合(subconfluent)為止。另外,培養中所生成的細胞的回收中可使用的酵素製劑例如可包含胰蛋白酶及乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)。離心分離可如上所述般進行。
本發明中,所述軟骨組織衍生的細胞可較佳地包含間葉系幹細胞。所述軟骨組織衍生的細胞亦可除間葉系幹細胞以外更包含軟骨組織中所含的細胞。即,本發明中,所述軟骨組織衍生的細胞可為包含間葉系幹細胞在內的多種細胞的集群。作為間葉系幹細胞以外的細胞的例子,例如可列舉軟骨細胞及軟骨芽細胞,但並不限定於該些。
本發明的另一實施方式中,用於形成細胞層片小片的細胞可衍生自幹細胞。該幹細胞可包括富潛能幹細胞、胚胎幹細胞或體性幹細胞,例如亦可包括iPS細胞。
該實施方式中,例如藉由在培養基中培養富潛能幹細胞(特別是iPS細胞)而使其分化,獲得軟骨細胞或軟骨樣細胞,藉由在例如溫度響應性聚合物被固定化的面上進一步培養該軟骨細胞或軟骨樣細胞,從而可獲得本發明的細胞層片小片。例如,藉由將富潛能幹細胞(特別是iPS細胞)播種於溫度響應性聚合物被固定化的器材上,使其分化為軟骨細胞或軟骨樣細胞並進行培養,亦可獲得本發明的細胞層片小片。
本發明的細胞層片小片可藉由下述3.中敘述的本發明的製造方法來製造。因此,關於本發明的細胞層片小片的製造方法,請參照下述3.。
2.收容細胞層片小片的注射器
本發明亦提供一種收容細胞層片小片的注射器。該細胞層片小片的特徵如所述1.中所述。本發明的注射器可收容含有該細胞層片小片的液體。本發明的注射器較佳為收容含有該細胞層片小片的注射劑的醫療用注射器。
本發明的注射器包括注射針及柱塞。該注射針的粗度可由所屬技術領域中具有通常知識者適宜選擇,可為所述1.中敘述的粗度的注射針。
3.細胞層片小片的製造方法
本發明亦提供一種細胞層片小片的製造方法。該製造方法包括:在具有刺激響應性聚合物被固定化、且形成有小區塊的面的器材的該面上培養細胞而獲得該細胞層片小片。由本發明的製造方法提供的細胞層片小片較佳為用於修復軟骨組織。即,本發明的製造方法較佳為軟骨組織修復用細胞層片小片的製造方法。
本發明的製造方法中培養的細胞可為所述1.中敘述的軟骨組織衍生的細胞,或者亦可為幹細胞衍生的細胞。例如,培養中所使用的原料細胞可為所述軟骨組織衍生細胞,該軟骨組織衍生細胞可為於包含FBS的DMEM/F12中,培養軟骨組織中的細胞至少兩天而獲得的細胞。
本發明的製造方法中,細胞可在具有刺激響應性聚合物被固定化的面的器材的該面上培養。藉由在包含具有刺激響應性聚合物被固定化的面的器材中加入培養基培養細胞,可於培養後使該面上的培養物(即細胞層片小片)不受損傷地自該器材剝離。所述刺激響應性聚合物例如可為溫度響應性聚合物、pH響應性聚合物或光響應性聚合物,更具體而言,可為分別藉由溫度刺激(例如溫度變化)、pH刺激(例如pH變化)或光刺激(例如光照射)而使性質(例如水合力)變化的聚合物。該性質的變化例如可為促進所述培養物自所述器材的剝離般的性質變化。
本發明的一種實施方式,所述刺激響應性聚合物為溫度響應性聚合物。於在包含具有溫度響應性聚合物被固定化的面的器材的培養基中培養所述細胞的情況下,例如,於培養後,將培養基的溫度設為該溫度響應性聚合物的上限臨界溶液溫度以上或下限臨界溶液溫度以下,藉此該面自疏水性變化為親水性,結果,細胞層片小片與該器材之間的剝離變得容易。再者,本發明的製造方法中的培養較佳為二維培養(亦稱為平面培養)。
於在所述培養後將細胞層片小片自所述器材剝離的情況下,不需要利用例如分散酶及胰蛋白酶等蛋白質分解酵素來進行處理。藉由利用所述溫度響應性聚合物的特性,當使培養基的溫度發生變化時,所述細胞層片小片可自所述器材剝離。因此,藉由本發明的製造方法所製造的所述細胞層片小片具有可不會受到該酵素造成的損傷地自所述器材剝離的優點。
利用蛋白質分解酵素來進行的處理有時造成細胞-細胞間的細胞間橋體(desmosome)結構及細胞-器材間的基底膜樣蛋白質的分解,結果,細胞培養物中的細胞各自分開。另一方面,藉由本發明的製造方法而獲得的細胞層片小片可藉由使培養基的溫度發生變化而自器材剝離,而不利用蛋白質分解酵素進行處理。結果,可保持所述細胞間橋體結構,且可減少細胞層片小片的缺損。另外,於藉由使培養基的溫度發生變化而將藉由本發明的製造方法而獲得的細胞層片小片自器材剝離的情況下,所述基底膜樣蛋白質亦未受酵素破壞。因此,於治療時可更良好地作用於患部組織,可實施效率佳的治療。
已知作為蛋白質分解酵素的分散酶可在將所述細胞間橋體結構保持10%~60%的狀態下使細胞層片剝離,但會破壞所述基底膜樣蛋白質的大部分,因而所獲得的細胞培養物的強度弱。藉由本發明的製造方法而製造的細胞層片小片可在所述細胞間橋體結構及所述基底膜樣蛋白質均殘存80%以上的狀態下自器材剝離。
本發明中使用的溫度響應性聚合物的上限臨界溶液溫度或下限臨界溶液溫度較佳為0℃~80℃,更佳為20℃~50℃,進而更佳為25℃~45℃。於上限臨界溶液溫度或下限臨界溶液溫度過高的情況下,細胞會滅絕。於上限臨界溶液溫度或下限臨界溶液溫度過低的情況下,細胞增殖速度下降或細胞會滅絕。
本發明的製造方法中,溫度響應性聚合物可為均聚物(homopolymer)或共聚物(copolymer)的任一種。該聚合物例如可為(甲基)丙烯醯胺化合物、N-(或N,N-二)烷基取代(甲基)丙烯醯胺衍生物、或乙烯基醚衍生物的均聚物,或者可為該些單體的共聚物。
所述(甲基)丙烯醯胺化合物例如可為丙烯醯胺或甲基丙烯醯胺。
所述N-烷基取代(甲基)丙烯醯胺衍生物例如可為:N-乙基丙烯醯胺(均聚物的下限臨界溶液溫度為72℃)、N-正丙基丙烯醯胺(均聚物的下限臨界溶液溫度為21℃)、N-正丙基甲基丙烯醯胺(均聚物的下限臨界溶液溫度為27℃)、N-異丙基丙烯醯胺(均聚物的下限臨界溶液溫度為32℃)、N-異丙基甲基丙烯醯胺(均聚物的下限臨界溶液溫度為43℃)、N-環丙基丙烯醯胺(均聚物的下限臨界溶液溫度為45℃)、N-環丙基甲基丙烯醯胺(均聚物的下限臨界溶液溫度為60℃)、N-乙氧基乙基丙烯醯胺(均聚物的下限臨界溶液溫度為約35℃)、N-乙氧基乙基甲基丙烯醯胺(均聚物的下限臨界溶液溫度為約45℃)、N-四氫糠基丙烯醯胺(均聚物的下限臨界溶液溫度為約28℃)、或N-四氫糠基甲基丙烯醯胺(均聚物的下限臨界溶液溫度為約35℃)。
所述N,N-二烷基取代(甲基)丙烯醯胺衍生物例如可為N,N-二甲基(甲基)丙烯醯胺、N,N-乙基甲基丙烯醯胺(均聚物的下限臨界溶液溫度為56℃)、或N,N-二乙基丙烯醯胺(均聚物的下限臨界溶液溫度為32℃)。
所述乙烯基醚衍生物例如可為甲基乙烯基醚(均聚物的下限臨界溶液溫度為35℃)。
本發明中,作為溫度響應性聚合物,亦可使用與所述單體以外的單體的共聚物,亦可使用將聚合物彼此接枝聚合或共聚而成者、或者聚合物或共聚物的混合物。另外,亦可以不損及聚合物本來的性質的範圍進行交聯。
為了選擇具有更適合於本發明的培養或剝離的臨界溶液溫度的溫度響應性聚合物、或者為了調節器材與培養物之間的相互作用、或者為了調整器材的面的親水性或疏水性,所述聚合物可適宜選擇。
較佳的實施方式中,所述溫度響應性聚合物為聚(N-異丙基丙烯醯胺)。
本發明的製造方法中,在器材的面上固定化的溫度響應性聚合物的量較佳為0.3 μg/cm
2~5.0 μg/cm
2,更佳為0.3 μg/cm
2~4.8 μg/cm
2。藉由溫度響應性聚合物的固定化量處於該範圍內,可進行所述更有效率的培養。於該固定化量為該範圍以外的情況下,會存在不形成細胞層片小片或細胞層片小片無法有效率地製造的情況。另外,藉由該固定化量處於該範圍內,所述細胞層片小片可更容易地自器材剝離。
本發明的製造方法中,器材的形態並無特別限制,例如可列舉培養皿(dish)、多孔板(multiplate)、培養瓶、細胞插件(cell insert)等。
將溫度響應性聚合物固定化於器材的面上的方法例如可利用日本專利特開平2-211865號公報中記載的方法來進行。即,可利用使器材與所述溫度響應性聚合物藉由化學性反應進行結合的方法、或者藉由物理性相互作用進行結合的方法來進行該固定化。該些方法亦可併用。
所述藉由化學性反應進行結合的方法中,例如可進行電子束(electron beam,EB)照射、γ射線照射、紫外線照射、可見光照射、發光二極體(light emitting diode,LED)照射、電漿處理、或電暈處理。或者,亦可藉由自由基反應、陰離子自由基反應、陽離子自由基反應等一般所使用的有機反應而將溫度響應性聚合物固定化於器材。另外,亦可將採用水不溶性聚合物鏈段(segment)與溫度響應性聚合物鏈段結合的結構的嵌段共聚物作為溫度響應性聚合物部分而被覆於器材表面。亦可藉由物理吸附或疏水性(hydrophobic)加以固定化。
所述藉由物理性相互作用進行結合的方法中,可將溫度響應性聚合物或者該聚合物與任意的介質的混合物塗佈於器材。
本發明的製造方法中,細胞在具有形成有小區塊的面的器材的該面上培養。藉由在形成有小區塊的面上培養細胞,可將細胞的培養物形成為片形狀的小片。該小區塊的面積較佳為20 mm
2以下,更佳為15 mm
2以下,進而更佳為10 mm
2以下。另一方面,若該面積過小,則有時難以將細胞的培養物形成為片形狀。因此,該面積較佳為0.02 mm
2以上。
具有所述溫度響應性聚合物被固定化、且形成有所述小區塊的面的器材可使用能夠市售獲取的器材,例如可使用在培養面設置有網格壁(grid wall)的溫度響應性培養皿即萊普塞爾(RepCell)(賽爾希德(Cell Seed)股份有限公司)。
本發明的製造方法中的培養中使用的培養基可為細胞培養、尤其是哺乳類細胞的培養中可使用的培養基,例如DMEM/F12(Dulbecco's Modified Eagle Medium:營養混合物(Nutrient Mixture)F-12)等。該培養基可包含添加因子。作為添加因子,例如可列舉細胞生長因子、激素(hormone)、結合蛋白質、細胞黏附因子、及脂質(lipid)以及其他成分等。
作為所述細胞生長因子,例如可列舉:TGF-β、b-FGF、IGF、EGF(Epidermal Growth Factor:表皮生長因子)、BMP(Bone morphogenetic protein(骨成形性蛋白質):骨生長因子)、纖維母細胞生長因子受體3(Fibroblast growth factor receptor 3,FGFR-3)、捲曲相關蛋白(Frizzled-related protein,FRZB)、軟骨衍生形成蛋白-1(cartilage-derived morphogenetic protein-1,CDMP-1)、生長分化因子5(Growth differentiation factor 5,GDF-5)、G-CSF(Granulocyte Colony Stimulating Factor:顆粒性白血球群落刺激因子)、LIF(Leukemia Inhibitory Factor:白血病抑制因子)、介白素(interleukin)、PDGF(Platelet-Derived Growth Factor:血小板衍生生長因子)、神經生長因子(Nerve Growth Factor,NGF)、活化素(activin)A等TGF(Transforming Growth Factor:轉形生長因子)家族;Wnt家族、特別是Wnt-3a(無翅型MMTV整合位點家族成員3A(Wingless-type MMTV integration site family,member 3A))等,但並不限定於該些。TGF家族中有TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3。
作為所述激素,可列舉:胰島素(insulin)、轉鐵蛋白(transferrin)、地塞米松(dexamethasone)、雌二醇(estradiol)、泌乳素(prolactin)、升糖素(glucagon)、甲狀腺素(thyroxine)、生長激素(growth hormone)、FSH(Follicle Stimulating Hormone:卵泡刺激激素)、LH(Luteinizing Hormone:促黃體激素)、糖皮質素(glucocorticoid)、及前列腺素(prostaglandin)等,但並不限定於該些。
作為所述細胞黏附因子,可列舉:膠原蛋白、膠原蛋白樣肽(collagen-like peptide)、纖網蛋白(Fibronectin)、層連結蛋白(laminin)、及玻連蛋白(vitronectin),但並不限定於該些。作為膠原蛋白樣肽,例如可列舉將膠原蛋白中的含RGD序列的區域連結的重組肽等。作為此種重組肽,例如可列舉細胞巢(cellnest)(富士軟片(Fujifilm)股份有限公司)。
作為所述脂質,可列舉磷脂質及不飽和脂肪酸等,但並不限定於該些。
作為可添加於培養基中的所述其他成分,可列舉:抗壞血酸、血清、胰島素轉鐵蛋白亞硒酸鹽(insulin transferrin selenite,ITS)、轉鐵蛋白、亞硒酸鈉、丙酮酸(pyruvic acid)、脯胺酸(proline)、蛋白(albumen)、脂蛋白(lipoprotein)、細胞藍蛋白(ceruloplasmin)等,但並不限定於該些。作為該血清,可列舉胎牛血清(FBS)及人血清,但並不限定於該些。本發明的製造方法中,所述培養基較佳為包含FBS的培養基,尤其可為包含FBS的DMEM/F12。為了實現更有效率的培養,FBS的含有比例較佳為相對於培養基的合計容量而為1容量%~30容量%,較佳為10容量%~30容量%,更佳為12容量%~28容量%,進而更佳為15容量%~25容量%。
另外,本發明的製造方法中,培養基亦可為無血清培養基。ITS等添加因子可代替血清的功能,故藉由在培養基中包含該添加因子,可在無血清培養基中進行本發明的製造方法中的培養。另外,藉由使用無血清培養基,可回避向人給藥時使用生物原料資源的風險。
於製造軟骨組織修復用細胞層片小片的情況下,為了實現更佳的細胞增殖,本發明中使用的培養基較佳的是,可相對於培養基體積而以例如0.01 mg/mL~1 mg/mL、較佳為0.05 mg/mL~0.5 mg/mL、更佳為0.07 mg/mL~0.3 mg/mL的含有比例包含抗壞血酸。抗壞血酸,可促進源自所培養的細胞的關節軟骨特異性基質的產生、及/或使細胞層片小片的表型表達更適於軟骨組織修復。即,抗壞血酸可有助於利用透明軟骨(hyaline cartilage)來再生關節軟骨的損傷部位。於抗壞血酸濃度過高的情況下,會妨礙所培養的細胞對器材的黏附。於抗壞血酸濃度過低的情況下,會有無法發揮其效果的情況。
較佳的實施方式中,本發明的細胞層片小片是在培養基中培養細胞而獲得,較佳為在含有FBS及/或抗壞血酸的培養基中培養細胞而獲得,例如可為在含有FBS及/或抗壞血酸的DMEM/F12中培養細胞而獲得。
本發明的製造方法中,細胞在器材上的培養期間可根據培養物的狀態、例如表型表達狀態等來適宜選擇,例如可為10天~20天,較佳為11天~18天,更佳為12天~16天。藉由該培養期間,細胞層片小片可成為更適於軟骨修復者。
本發明的製造方法中所獲得的細胞層片小片的特徵如所述1.中所述。另外,本發明的製造方法中所培養的細胞及其製備方法如所述1.中所述。
4.細胞層片小片的使用方法
本發明亦提供一種藉由注射來對動物給藥細胞層片小片的方法。該細胞層片小片為所述1.中敘述者。本發明的方法中,亦可使用所述2.中敘述的收容細胞層片小片的注射器,對動物給藥該細胞層片小片。該動物更佳為哺乳動物,進而更佳為靈長類動物,特佳為人。
本發明的方法可為用於修復軟骨組織的方法。本發明的方法能夠藉由注射來給藥所述細胞層片小片,因此能夠進行創傷性低的治療。本發明的方法中,所謂軟骨組織的修復,包括:治療具有炎症及/或損傷的軟骨組織、強化軟骨組織、填補軟骨組織的缺損部分、以及再生軟骨組織,但並不限定於該些。另外,本發明亦可為用於預防與軟骨組織相關的疾病的方法。本發明的方法中,細胞層片小片可藉由注射來給藥至例如具有疾病的軟骨組織或骨組織。作為適合使用本發明的方法的疾病的例子,例如可列舉關節炎、關節病、軟骨損傷、骨軟骨損傷、半月板損傷、及/或椎間盤變性,但並不限定於該些。
[實施例]
以下,基於實施例來更詳細地說明本發明,但本發明並不限定於該些實施例。
<試驗例1>
(細胞層片小片的製備)
對於在培養面設有3 mm×3 mm的網格壁的溫度響應性培養皿(萊普塞爾(RepCell),賽爾希德(Cell Seed)股份有限公司)及溫度響應性培養插件(阿普塞爾(UpCell)(註冊商標)插件,賽爾希德(Cell Seed)股份有限公司),分別以1×10
4個/cm
2的密度播種自多指症患者的軟骨組織中分離出的軟骨細胞。將該軟骨細胞培養兩週。將各培養器材在室溫下靜置30分鐘以上後,自所述溫度響應性培養皿回收實施例的細胞層片小片(M組),自所述溫度響應性培養插件回收比較例的細胞層片(S組)。該細胞層片(S組)是關節軟骨治療中使用的現有的細胞層片。
(細胞層片小片的評價)
按照以下項目來評價細胞層片小片(M組)及細胞層片(S組)。
・細胞數及細胞存活率的測定
・利用酵素結合免疫吸附分析法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA法)的體液因子分泌量的測定(黑色素瘤抑制活性(melanoma inhibitory activity,MIA)及TGF-β1)
・利用即時定量聚合酶連鎖反應(Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction,qPCR)對軟骨相關基因表達的定量分析(COL1A1、COL2A1、COL10A1、ACAN、SOX9、RUNX2及MMP3)
・細胞表面標記的分析(分化群(Cluster of Differentiation,CD)29、CD31、CD44、CD45、CD73、CD81、CD90及CD105)
・組織切片的評價(蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)、番紅(Safranin)O及甲苯胺藍(Toluidine blue)染色)
將各評價結果示於圖1~圖5中。
如圖1所示,細胞層片小片(M組)與細胞層片(S組)的細胞數及細胞存活率未見顯著差異。如圖2所示,細胞層片小片(M組)與細胞層片(S組)的體液因子的分泌量未見顯著差異。如圖3所示,細胞層片小片(M組)與細胞層片(S組)的軟骨相關基因的表達量除了COL2A1以外,未見顯著差異。細胞層片小片(M組)中,COL2A1的表達量較細胞層片(S組)更低。認為其原因之一或許在於,細胞層片小片(M組)利用平面培養皿而非插件進行培養。如圖4所示,細胞層片小片(M組)與細胞層片(S組)的細胞表面標記未見顯著差異。如圖5所示,細胞層片小片(M組)與細胞層片(S組)中均可見軟骨細胞的重層化,但番紅O及甲苯胺藍染色性均不足。
(驗證注射給藥所產生的影響)
為了驗證注射給藥對細胞存活率所產生的影響,進行以下試驗:將所述細胞層片小片(M組)分為以下四組,比較剛剛注射後、4小時後、24小時後的細胞存活率。
・未注射對照(control)組
・18 G針組
・23 G針組
・注射筒(syringe)組(無注射針,僅注射筒)
培養兩週,在室溫下靜置30分鐘以上後,自所述溫度響應性培養皿回收所述細胞層片小片(M組)。將該細胞層片小片(M組)懸浮於3 mL的培養基中。關於注射給藥組,緩慢地抽吸至5 mL注射筒後,使其在18 G針、23 G針或注射筒中通過。細胞存活率是藉由台盼藍染色法分析,在注射後0小時(剛剛注射給藥後)、4小時、24小時進行測定。此外,所述細胞層片(S組)的細胞存活率是在自所述溫度響應性培養插件剝離後0小時(剛剛剝離後)及24小時進行測定。
將細胞存活率的測定結果示於圖6中。
所述試驗中,細胞層片小片(M組)能夠通過18 G及23 G的注射針。如圖6所示,於全部的四組中,各時間下細胞存活率全部為90%以上。細胞存活率有隨著時間經過而減少的傾向,但各時間中四組之間未見顯著差異(剛剛給藥後:p=0.748、4小時後:p=0.987、24小時後:p=0.994)。根據該結果可確認到,本發明的細胞層片小片不易受到注射給藥所產生的影響。
<試驗例2>
進行以下試驗:比較本發明的細胞層片小片與現有的細胞層片,驗證該細胞層片小片對非外傷性膝關節炎模型的關節軟骨治療效果。
將多指症衍生軟骨細胞分別播種於現有的溫度響應性培養皿及在培養面設置有3 mm×3 mm的網格壁的溫度響應性培養皿(萊普塞爾(RepCell),賽爾希德(Cell Seed)股份有限公司),製作比較例的細胞層片與實施例的細胞層片小片。測定細胞數及細胞存活率、細胞表面標記表達、COL2A1/COL1A1表達比、以及體液因子分泌量,對片特性進行比較。
關節炎模型是在F344/NJcl-rnu/rnu(8週齡18隻)的右膝,關節內給藥一碘乙酸(monoiodoacetic acid,MIA)0.2 mg/30 μL,對照組6隻是在右膝,關節內給藥鹽水(saline)30 μL。
隨機分為給藥MIA後不移植組(A組)、給藥MIA後細胞層片移植組(B組)、給藥MIA後細胞層片小片移植組(C組)(各組n=6),在給藥MIA後4週,B組向右膝移植細胞層片,C組將細胞層片小片懸浮於鹽水30 μL,並利用23 G針注射給藥至右膝關節內。在給藥MIA後8週,進行組織學評價(國際骨關節炎研究學會(Osteoarthritis Research Society International,OARSI)評分(score))。
結果,細胞層片與細胞層片小片的片特性評價項目並無顯著差異,片的有效性評價中使用的COL2A1/COL1A1表達比及黑色素瘤抑制活性、TGF-β1、ESM1、MCP-1、DKK-1、MMP-13、MMP-3分泌量亦無顯著差異。
股骨側的OARSI評分為A組11.0±3.0、B組3.0±2.0、C組3.2±1.8,A組-B組、A組-C組顯著改善(P<0.01),B組-C組無顯著差異。
根據該結果暗示,現有的細胞層片與本發明的細胞層片小片的片特性同等,能夠更低創傷地移植的本發明的細胞層片小片有可能具有與現有的細胞層片同等的關節軟骨治療效果。
無
圖1是表示細胞數及細胞存活率的測定結果的圖表。
圖2是表示體液因子分泌量的測定結果的圖表。
圖3是表示軟骨相關基因表達的定量分析結果的圖表。
圖4是表示細胞表面標記的分析結果的圖表。
圖5是表示組織切片的評價結果的照片。
圖6是表示注射給藥後的細胞存活率的測定結果的圖表。
Claims (13)
- 一種細胞層片小片,其是由細胞的培養物形成的細胞層片小片,且 能夠通過注射針。
- 如請求項1所述的細胞層片小片,其中所述注射針是18 G或比其細的注射針。
- 如請求項1或請求項2所述的細胞層片小片,其中所述細胞層片小片的面積為20 mm 2以下。
- 如請求項1至請求項3中任一項所述的細胞層片小片,其中所述細胞層片小片用於修復軟骨組織。
- 如請求項1至請求項4中任一項所述的細胞層片小片,其中所述細胞衍生自軟骨組織。
- 如請求項5所述的細胞層片小片,其中所述軟骨組織為多指(趾)症動物的軟骨組織。
- 如請求項1至請求項4中任一項所述的細胞層片小片,其中所述細胞衍生自幹細胞。
- 如請求項7所述的細胞層片小片,其中所述幹細胞包括富潛能幹細胞、胚胎幹細胞或體性幹細胞。
- 如請求項7所述的細胞層片小片,其中所述幹細胞包括誘導性富潛能幹細胞。
- 一種注射器,收容如請求項1至請求項9中任一項所述的細胞層片小片。
- 一種細胞層片小片的製造方法,所述細胞層片小片由細胞的培養物形成,所述製造方法包括: 在具有刺激響應性聚合物被固定化、且形成有小區塊的面的器材的所述面上培養細胞而獲得所述細胞層片小片。
- 如請求項11所述的製造方法,其中所述小區塊的面積為20 mm 2以下。
- 一種細胞層片小片的使用方法,其藉由注射如請求項1至請求項9中任一項所述的細胞層片小片來對動物給藥。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
TW109130289 | 2020-09-03 | ||
TW109130289 | 2020-09-03 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
TW202221113A true TW202221113A (zh) | 2022-06-01 |
Family
ID=83062448
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
TW110132555A TW202221113A (zh) | 2020-09-03 | 2021-09-02 | 細胞層片小片、收容細胞層片小片的注射器、細胞層片小片的製造方法及其使用方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
TW (1) | TW202221113A (zh) |
-
2021
- 2021-09-02 TW TW110132555A patent/TW202221113A/zh unknown
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2306335C2 (ru) | Стволовые клетки и решетки, полученные из жировой ткани | |
JP4336821B2 (ja) | 哺乳動物の骨髄細胞または臍帯血由来細胞と脂肪組織を利用した心筋細胞の誘導 | |
RU2527182C2 (ru) | Способ индукции миграции стволовых клеток жировой ткани | |
AU2016382166B2 (en) | A method for preparing 3D cartilage organoid block | |
KR20070001108A (ko) | 각막 윤부로부터 유도된 미분화 줄기 세포를 가진 조직시스템 | |
US20050014255A1 (en) | Stem cells for clinical and commercial uses | |
KR20080097226A (ko) | 결막 조직 시스템 | |
KR20140006033A (ko) | 모색이 제어된 이식용 재생 모낭 원기의 제조방법, 당해 이식용 재생 모낭 원기를 포함하는 조성물 및 그의 이식방법 | |
JP7058397B2 (ja) | 組織再生培養細胞シート、製造方法及びその利用方法 | |
EP2144639B1 (en) | New stem cell line and its application | |
KR101098073B1 (ko) | 이식용 연골세포의 제법 | |
KR101389851B1 (ko) | 신경능선줄기세포의 배양방법 및 그 용도 | |
KR101503939B1 (ko) | 연골 세포 조제 방법 | |
JP2013511314A (ja) | 神経組織再生のための移植片組成物と、その製造および使用法 | |
Day | Epithelial stem cells and tissue engineered intestine | |
Nazbar et al. | Molecular imprinting as a simple way for the long-term maintenance of the stemness and proliferation potential of adipose-derived stem cells: an in vitro study | |
US20220064592A1 (en) | Cell microsheet, syringe containing the cell microsheet, and production and use of the cell microsheet | |
KR101674253B1 (ko) | 트랜스웰 및 케모카인을 이용한 줄기세포의 분리 방법 | |
TW202221113A (zh) | 細胞層片小片、收容細胞層片小片的注射器、細胞層片小片的製造方法及其使用方法 | |
EP4119656A1 (en) | Cell culture, method for evaluating cell culture, method for producing cell culture, and marker for use in evaluation of chondroid tissue formation property | |
RU2342164C2 (ru) | Эквивалент кожи и способ его получения | |
JP2022550911A (ja) | 軟骨形成ヒト間葉系幹細胞(msc)シート | |
WO2018225703A1 (ja) | 分化誘導細胞の調製方法 | |
JP2006000059A (ja) | 細胞外基質を用いた動物細胞の増殖及び分化促進方法 | |
KR20040082068A (ko) | 동종 이식에 사용하기 위한 분화된 지방 세포 |