WO2021182633A1

WO2021182633A1 - 細胞培養物、細胞培養物の評価方法、細胞培養物の製造方法、及び軟骨様組織形成特性評価用マーカー

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Publication number: WO2021182633A1
Application number: PCT/JP2021/010208
Authority: WO
Inventors: 佐藤　正人; 匠高橋; 祐加川口; 千香子佐藤; 智志角田; 千春遠山; 丹丹宋; 道秀宮沢
Original assignee: 学校法人東海大学; 株式会社セルシード
Priority date: 2020-03-13
Filing date: 2021-03-12
Publication date: 2021-09-16
Also published as: CA3175280A1; IL296192A; EP4119656A1; TW202200782A; EP4119656A4; US20230118035A1; AU2021235796A1; CN115698260A; JPWO2021182633A1

Abstract

軟骨修復のための使用に適した細胞培養物を提供すること。　本発明は、ＣＤ１６６、ＣＤ１６５、ＣＤ９９、ＧＤ２、ＳＴＲＯ－１、ＣＤ１０８、ＣＤ１６４、ＣＤ６、ＣＤ１０６、及びＣＤ１０７ｂからなる群から選ばれる少なくとも一つの細胞表面マーカーの発現強度が、各細胞表面マーカーについての閾値以下であり、且つ／又は、ＣＤ２６、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ４４、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ２０１、ＥＧＦＲ、ＣＤ１４６、ＣＤ１４０ａ、及びＣＤ９０からなる群から選ばれる少なくとも一つの細胞表面マーカーの発現強度が、各細胞表面マーカーについての閾値以上である細胞集団を含む、軟骨様組織形成特性を有する細胞培養物を提供する。

Description

細胞培養物、細胞培養物の評価方法、細胞培養物の製造方法、及び軟骨様組織形成特性評価用マーカー

　本技術は、細胞培養物、細胞培養物の評価方法、細胞培養物の製造方法、及び軟骨様組織形成特性評価用マーカーに関する。より詳細には、本技術は、特定の細胞表面マーカーを発現している細胞集団を含む細胞培養物、特定の細胞表面マーカーに基づく細胞培養物の評価方法、特定の細胞表面マーカーを発現している細胞集団を含む細胞培養物の製造方法、及び、軟骨様組織形成特性評価のために用いられる特定の細胞表面マーカーに関する。

　変形性関節症などの運動器疾患の処置に関して、組織再生工学技術を利用した軟骨組織の治療が行われている。この治療において、培養した軟骨細胞又は軟骨細胞に基づき作られた軟骨組織が患部に移植されうる。これまでに種々の移植材料が提案されている。

　例えば下記特許文献１は、「所定の移植部位へ移植する移植用材料であって、体組織から入手した前記所定の移植部位と同種の組織構造物に該組織構造物の形状を維持したまま抗原性抑制処理を施して得た細胞保持担体に、前記所定の移植部位に応じた細胞が保持された移植用材料。」（請求項１）を記載する。

特開２００３－１８０８１９号公報

　本発明は、軟骨修復に適した細胞培養物、特には硝子軟骨修復に適した細胞培養物を提供することを主目的とする。

　本発明者らは、特定の特徴を有する細胞培養物が、軟骨修復、特には硝子軟骨修復に適していることを見出した。

　すなわち、本発明は、ＣＤ１６６、ＣＤ１６５、ＣＤ９９、ＧＤ２、ＳＴＲＯ－１、ＣＤ１０８、ＣＤ１６４、ＣＤ６、ＣＤ１０６、及びＣＤ１０７ｂからなる群から選ばれる少なくとも一つの細胞表面マーカーの発現強度が、各細胞表面マーカーについての閾値以下であり、且つ／又は
　ＣＤ２６、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ４４、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ２０１、ＥＧＦＲ、ＣＤ１４６、ＣＤ１４０ａ、及びＣＤ９０からなる群から選ばれる少なくとも一つの細胞表面マーカーの発現強度が、各細胞表面マーカーについての閾値以上である
　細胞集団を含む、
　軟骨様組織形成特性を有する細胞培養物を提供する。

　また、本発明は、細胞培養物の評価方法であって、
　細胞培養物に含まれる細胞集団について、
　ＣＤ１６６、ＣＤ１６５、ＣＤ９９、ＧＤ２、ＳＴＲＯ－１、ＣＤ１０８、ＣＤ１６４、ＣＤ６、ＣＤ１０６、及びＣＤ１０７ｂからなる群から選ばれる少なくとも一つの細胞表面マーカーの発現強度が、表面マーカーそれぞれについての閾値以下であるか、及び／又は
　ＣＤ２６、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ４４、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ２０１、ＥＧＦＲ、ＣＤ１４６、ＣＤ１４０ａ、及びＣＤ９０からなる群から選ばれる少なくとも一つの細胞表面マーカーの発現強度が、表面マーカーそれぞれについての閾値以上であるか
　を判定する判定工程を含む、
　前記評価方法も提供する。

　また、本発明は、
　細胞を培養して細胞培養物を得る培養工程を含み、
　前記培養工程において、
　前記細胞培養物に含まれる細胞集団に関して、
　ＣＤ１６６、ＣＤ１６５、ＣＤ９９、ＧＤ２、ＳＴＲＯ－１、ＣＤ１０８、ＣＤ１６４、ＣＤ６、ＣＤ１０６、及びＣＤ１０７ｂからなる群から選ばれる少なくとも一つの細胞表面マーカーの発現強度が、細胞表面マーカーそれぞれについての閾値以下であり、且つ／又は
　ＣＤ２６、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ４４、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ２０１、ＥＧＦＲ、ＣＤ１４６、ＣＤ１４０ａ、及びＣＤ９０からなる群から選ばれる少なくとも一つの細胞表面マーカーの発現強度が、細胞表面マーカーそれぞれについての閾値以上である
　となるように培養が行われる、
　軟骨様組織形成特性を有する細胞培養物の製造方法も提供する。

　また、本発明は、
　ＣＤ１６６、ＣＤ１６５、ＣＤ９９、ＧＤ２、ＳＴＲＯ－１、ＣＤ１０８、ＣＤ１６４、ＣＤ６、ＣＤ１０６、及びＣＤ１０７ｂからなる群から選ばれる少なくとも一つの細胞表面マーカー、及び／又は、
　ＣＤ２６、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ４４、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ２０１、ＥＧＦＲ、ＣＤ１４６、ＣＤ１４０ａ、及びＣＤ９０からなる群から選ばれる少なくとも一つの細胞表面マーカー
　を含む軟骨様組織形成特性評価用マーカーも提供する。

　本発明により、軟骨修復、特には硝子軟骨修復のための使用に適した細胞培養物が提供される。また、本発明により、細胞培養物の軟骨修復能、特には硝子軟骨修復能を評価することも可能となる。

実験のフロー図である。 COL2A1とCOL1A1との遺伝子発現比を示すグラフである。染色結果を示す図である。

１．細胞培養物

　本発明は、軟骨様組織形成特性を有する細胞培養物、より特には硝子軟骨様組織形成特性を有する細胞培養物、を提供する。前記細胞培養物に含まれる細胞集団は、ＣＤ１６６、ＣＤ１６５、ＣＤ９９、ＧＤ２、ＳＴＲＯ－１、ＣＤ１０８、ＣＤ１６４、ＣＤ６、ＣＤ１０６、及びＣＤ１０７ｂからなる群から選ばれる少なくとも一つの細胞表面マーカーの発現強度が、各細胞表面マーカーについての閾値以下であり、且つ／又は、ＣＤ２６、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ４４、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ２０１、ＥＧＦＲ、ＣＤ１４６、ＣＤ１４０ａ、及びＣＤ９０からなる群から選ばれる少なくとも一つの細胞表面マーカーの発現強度が、各細胞表面マーカーについての閾値以上であってよい。これらの細胞表面マーカーが所定の閾値以上又は閾値以下であることによって、前記細胞培養物は軟骨修復に適しており、より特には膝軟骨修復に適している。

　本発明の細胞培養物は、軟骨様組織を形成する特性を有し、特には硝子軟骨様組織を形成する特性を有する。本発明の細胞培養物は、例えばヒト生体に移植されたときに、より特にはヒト生体の膝の関節軟骨部分に移植されたときに、軟骨様組織、特には硝子軟骨様組織を形成する特性を有する。本明細書内において「軟骨様組織」とは、軟骨組織（特には膝関節軟骨組織）と同等又は同様の成分及び／又は機能を有する組織であってよく、例えば硝子軟骨組織と同様に２型コラーゲンを発現している組織をいう。

　本発明において、好ましくは、前記細胞表面マーカーのうち、少なくともＣＤ９９及び／又はＧＤ２の発現強度が、これら細胞表面マーカーそれぞれについての閾値以下である。ＣＤ９９及び／又はＧＤ２の発現強度が所定の閾値以下であることによって、細胞培養物が特に良好な軟骨様組織形成特性、特には硝子軟骨様組織形成特性を発揮することができる。
　また、本発明において、好ましくは、前記細胞表面マーカーのうち、少なくともＣＤ２６及び／又はＣＤ７３の発現強度が、これら細胞表面マーカーそれぞれについての閾値以上である。ＣＤ２６及び／又はＣＤ７３の発現強度が所定の閾値以上であることによって、細胞培養物が特に良好な軟骨様組織形成特性、特には硝子軟骨様組織形成特性を発揮することができる。
　特に好ましくは、前記細胞表面マーカーのうち、少なくともＣＤ９９及び／又はＧＤ２の発現強度が、これら細胞表面マーカーそれぞれについての閾値以下であり、且つ、前記細胞表面マーカーのうち、少なくともＣＤ２６及び／又はＣＤ７３の発現強度が、これら細胞表面マーカーそれぞれについての閾値以上である。これら４つの細胞表面が前記閾値に関する基準を満たすことで、細胞培養物が特に良好な軟骨様組織形成特性、特には硝子軟骨様組織形成特性を発揮することができる。

　また、本発明において、好ましくは、前記細胞表面マーカーのうち、少なくともＣＤ２６、ＣＤ７３、及びＣＤ４４のうちのいずれか１つ、２つ、又は３つの発現強度が、これら細胞表面マーカーそれぞれについての閾値以上である。ＣＤ２６、ＣＤ７３、及びＣＤ４４のうちのいずれか１つ、２つ、又は３つの発現強度が所定の閾値以上であることによって、細胞培養物が特に良好な軟骨様組織形成特性、特には硝子軟骨様組織形成特性を発揮することができる。
　特に好ましくは、前記細胞表面マーカーのうち、少なくともＣＤ９９及び／又はＧＤ２の発現強度が、これら細胞表面マーカーそれぞれについての閾値以下であり、且つ、前記細胞表面マーカーのうち、少なくともＣＤ２６、ＣＤ７３、及びＣＤ４４のうちのいずれか一つ、２つ、又は３つの発現強度が、これら細胞表面マーカーそれぞれについての閾値以上である。これら４つの細胞表面が前記閾値に関する基準を満たすことで、細胞培養物が特に良好な軟骨様組織形成特性、特には硝子軟骨様組織形成特性を発揮することができる。

　本発明の一つの好ましい実施態様において、前記細胞表面マーカーのうち、少なくともＣＤ４４の発現強度が、この細胞表面マーカーについての閾値以上である。ＣＤ４４の発現強度が所定の閾値以上であることによって、細胞培養物が特に良好な軟骨様組織形成特性、特には硝子軟骨様組織形成特性を発揮することができる。
　特に好ましくは、前記細胞表面マーカーのうち、少なくともＣＤ９９及び／又はＧＤ２の発現強度が、これら細胞表面マーカーそれぞれについての閾値以下であり、且つ、前記細胞表面マーカーのうち、少なくともＣＤ４４の発現強度が、この細胞表面マーカーについての閾値以上である。これら３つの細胞表面が前記閾値に関する基準を満たすことで、細胞培養物が特に良好な軟骨様組織形成特性、特には硝子軟骨様組織形成特性を発揮することができる。

　本発明において、細胞表面マーカーの発現強度は、細胞集団をフローサイトメトリーにより解析して測定される標準化平均蛍光強度（ｎＭＦＩ、normalized Mean Fluorescence Intensity）であってよい。当該標準化平均蛍光強度が、これら細胞表面マーカーに基づく軟骨様組織形成特性、特には硝子軟骨様組織形成特性の評価にとって適している。標準化平均蛍光強度は、後述の「５．実施例」において記載された測定方法により測定されてよい。

　本発明の細胞培養物は、好ましくは、当該細胞培養物に含まれる細胞集団をフローサイトメトリーにより解析したときに測定される標準化平均蛍光強度が、以下の条件１～１０の少なくとも一つを満たし、且つ／又は、以下の条件１１～２０の少なくとも一つを満たす。
　条件１：ＰＥを結合した抗ＣＤ１６６抗体により前記細胞集団を標識したときに、当該ＰＥに由来する標準化平均蛍光強度が２４０以下であり、より好ましくは２２０以下であり、さらにより好ましくは２００以下である、
　条件２：ＢＢ７００を結合した抗ＣＤ１６５抗体により前記細胞集団を標識したときに、当該ＢＢ７００に由来する標準化平均蛍光強度が１３２以下であり、より好ましくは１２０以下であり、さらにより好ましくは１１０以下である、
　条件３：ＦＩＴＣを結合した抗ＣＤ９９抗体により前記細胞集団を標識したときに、当該ＦＩＴＣに由来する標準化平均蛍光強度が１．９以下であり、より好ましくは１．８以下であり、さらにより好ましくは１．６以下である、
　条件４：ＢＢ７００を結合した抗ＧＤ２抗体により前記細胞集団を標識したときに、当該ＢＢ７００に由来する標準化平均蛍光強度が３．６以下であり、より好ましくは３．３以下であり、さらにより好ましくは３．０以下である、
　条件５：ＦＩＴＣを結合した抗ＳＴＲＯ－１抗体により前記細胞集団を標識したときに、当該ＦＩＴＣに由来する標準化平均蛍光強度が１．４以下であり、より好ましくは１．３以下であり、さらにより好ましくは１．２以下である、
　条件６：ＰＥを結合した抗ＣＤ１０８抗体により前記細胞集団を標識したときに、当該ＰＥに由来する標準化平均蛍光強度が１．９以下であり、より好ましくは１．８以下であり、さらにより好ましくは１．６以下である、
　条件７：ＰＥを結合した抗ＣＤ１６４抗体により前記細胞集団を標識したときに、当該ＰＥに由来する標準化平均蛍光強度が３．０以下であり、より好ましくは２．８以下であり、さらにより好ましくは２．５以下である、
　条件８：ＦＩＴＣを結合した抗ＣＤ６抗体により前記細胞集団を標識したときに、当該ＦＩＴＣに由来する標準化平均蛍光強度が１．４以下であり、より好ましくは１．３以下であり、さらにより好ましくは１．２以下である、
　条件９：ＦＩＴＣを結合した抗ＣＤ１０６抗体により前記細胞集団を標識したときに、当該ＦＩＴＣに由来する標準化平均蛍光強度が２．４以下であり、より好ましくは２．２以下であり、さらにより好ましくは２．０以下である、
　条件１０：ＦＩＴＣを結合した抗ＣＤ１０７ｂ抗体により前記細胞集団を標識したときに、当該ＦＩＴＣに由来する標準化平均蛍光強度が２．０以下であり、より好ましくは１．９以下であり、さらにより好ましくは１．７以下である、
　条件１１：ＦＩＴＣを結合した抗ＣＤ２６抗体により前記細胞集団を標識したときに、当該ＦＩＴＣに由来する標準化平均蛍光強度が２．３以上であり、より好ましくは２．６以上であり、さらにより好ましくは２．９以上である、
　条件１２：ＦＩＴＣを結合した抗ＣＤ７３抗体により前記細胞集団を標識したときに、当該ＦＩＴＣに由来する標準化平均蛍光強度が４７以上であり、より好ましくは５３以上であり、さらにより好ましくは５９以上である、
　条件１３：ＰＥを結合した抗ＣＤ１０５抗体により前記細胞集団を標識したときに、当該ＰＥに由来する標準化平均蛍光強度が２１以上であり、より好ましくは２４以上であり、さらにより好ましくは２７以上である、
　条件１４：ＦＩＴＣを結合した抗ＣＤ４４抗体により前記細胞集団を標識したときに、当該ＦＩＴＣに由来する標準化平均蛍光強度が１２８以上であり、より好ましくは１４５以上であり、さらにより好ましくは１６０以上である、
　条件１５：ＡＰＣを結合した抗ＣＤ１２０ａ抗体により前記細胞集団を標識したときに、当該ＡＰＣに由来する標準化平均蛍光強度が２４以上であり、より好ましくは２７以上であり、さらにより好ましくは３０以上である、
　条件１６：ＰＥを結合した抗ＣＤ２０１抗体により前記細胞集団を標識したときに、当該ＰＥに由来する標準化平均蛍光強度が１８以上であり、より好ましくは２０以上であり、さらにより好ましくは２３以上である、
　条件１７：ＰＥを結合した抗ＥＧＦＲ抗体により前記細胞集団を標識したときに、当該ＰＥに由来する標準化平均蛍光強度が３．２以上であり、より好ましくは３．６以上であり、さらにより好ましくは４．０以上である、
　条件１８：ＦＩＴＣを結合した抗ＣＤ１４６抗体により前記細胞集団を標識したときに、当該ＦＩＴＣに由来する標準化平均蛍光強度が１．６以上であり、より好ましくは１．８以上であり、さらにより好ましくは２．０以上である、
　条件１９：ＰＥを結合した抗ＣＤ１４０ａ抗体により前記細胞集団を標識したときに、当該ＰＥに由来する標準化平均蛍光強度が５．６以上であり、より好ましくは６．４以上であり、さらにより好ましくは７．０以上である、
　条件２０：ＡＰＣを結合した抗ＣＤ９０抗体により前記細胞集団を標識したときに、当該ＡＰＣに由来する標準化平均蛍光強度が８００以上であり、より好ましくは９００以上であり、さらにより好ましくは１０００以上である。
　これらの条件のいずれか一つ又は複数を満たすことによって、本発明の細胞培養物は、より好ましい軟骨様組織形成特性、特には硝子軟骨様組織形成特性を有する。

　特に好ましくは、前記細胞集団をフローサイトメトリーにより解析したときに測定される標準化平均蛍光強度が、前記条件３及び／又は４を満たし、且つ／又は、前記条件１１及び／又は１２を満たす。さらにより好ましくは、前記細胞集団をフローサイトメトリーにより解析したときに測定される標準化平均蛍光強度が、前記条件３及び４を満たし、且つ、前記条件１１及び／又は１２を満たす。これら４つの条件のうちの１つ、２つ、３つ、又は４つ全てを満たすことが、特には４つ全てを満たすことが、本発明の細胞培養物に特に良好な軟骨様組織形成特性、特には硝子軟骨様組織形成特性をもたらす。

　本発明の一つの実施態様において、前記細胞集団をフローサイトメトリーにより解析したときに測定される標準化平均蛍光強度が、前記条件３及び／又は４を満たし、且つ／又は、前記条件１１、１２及び１４のうちの１つ、２つ、又は３つを満たす。さらにより好ましくは、前記細胞集団をフローサイトメトリーにより解析したときに測定される標準化平均蛍光強度が、前記条件３及び４を満たし、且つ、前記条件１１、１２、及び１４を満たす。これら５つの条件のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つ全てを満たすことが、特には４つ全てを満たすことが、本発明の細胞培養物に特に良好な軟骨様組織形成特性、特には硝子軟骨様組織形成特性をもたらす。

　本発明の一つの実施態様において、前記細胞集団をフローサイトメトリーにより解析したときに測定される標準化平均蛍光強度が、前記条件３及び／又は４を満たし、且つ／又は、前記条件１４を満たす。さらにより好ましくは、前記細胞集団をフローサイトメトリーにより解析したときに測定される標準化平均蛍光強度が、前記条件３及び４を満たし、且つ、前記条件１４を満たす。これら３つの条件のうちの１つ、２つ、又は３つ全てを満たすことが、本発明の細胞培養物に特に良好な軟骨様組織形成特性、特には硝子軟骨様組織形成特性をもたらす。

（細胞培養物の形状）

　本発明の一つの実施態様に従い、前記細胞培養物は固形状であってよい。例えば、当該細胞培養物に含まれる細胞集団は、任意の形状へと組織化されていてよい。固形状である前記細胞培養物の形状は、例えばシート状、粒状、繊維状（糸状）、又は網状（メッシュ状）であってよい。
　本発明の他の実施態様に従い、前記細胞培養物は固形状でなくてよく、例えば流動可能であってよい。固形状でない前記細胞培養物は、例えば流動状、液状、又はゾル状であってよい。

　本発明の細胞培養物は、好ましくはシート状である。シート状である細胞培養物は、軟骨組織修復、特には硝子軟骨組織修復のために特に適している。前記細胞培養物がシート状である場合、シート状細胞培養物の厚みは、例えば４μｍ～５ｍｍ、特には４μｍ～３ｍｍ、より特には４μｍ～１ｍｍであってよい。シート状細胞培養物は、１枚のシート状細胞培養物であってよく、又は、複数枚（例えば２枚～１０枚、特には２枚～８枚、より特には２枚～５枚）のシート状細胞培養物の積層物であってもよい。
　より特には、シート状細胞培養物の厚みは、例えば４μｍ～１００μｍであり、好ましくは４μｍ～７０μｍであり、より好ましくは４μｍ～５０μｍでありうる。
　本発明のシート状細胞培養物は、細胞の増殖過程で細胞が自然に重層化したものでありうる。本発明のシート状細胞培養物は、別々に製造された２又はそれより多いシート状細胞培養物を人為的に積層化し培養を継続したものでなくてもよい。

（軟骨組織に由来する細胞培養物）

　本発明の一つの実施態様において、前記細胞培養物は、軟骨組織に由来するものであってよい。すなわち、前記細胞培養物は、軟骨組織由来の細胞の培養物であってよく、特には前記細胞培養物を得るための培養に用いられた原料細胞が、軟骨組織由来細胞であってよい。前記細胞培養物は、生体外での人工的な培養により得られるものであるので、天然物でない。当該軟骨組織由来の細胞は、例えば、軟骨組織に含まれる細胞を軟骨基質から分離することにより得られる複数の細胞でありうる。例えば、当該軟骨組織由来の細胞は、軟骨組織を酵素で処理することによって、軟骨組織中の細胞を軟骨基質から遊離させ、そして、遊離した細胞を遠心分離によって回収することにより回収された複数の細胞でありうる。

　前記細胞培養物は、好ましくは、滑膜に由来するものでない。すなわち、前記細胞培養物は、好ましくは、滑膜由来の細胞を含まない。前記細胞培養物は、好ましくは、滑膜由来の細胞の培養物から形成されたものでなく、滑膜細胞の培養物から形成されたものでもない。本発明の細胞培養物は、好ましくは、軟骨組織由来の細胞のみの培養物であってよく、特には硝子軟骨組織由来の細胞のみの培養物であってよい。

　本発明において、前記軟骨組織由来の細胞は、多指症の動物の軟骨組織に由来するものであってよく、又は、多肢症の動物の軟骨組織に由来するものであってもよい。当該動物は、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくは霊長類の動物であり、さらにより好ましくはヒトでありうる。当該軟骨組織は例えば余剰指の切除術などの際に得られる組織から採取されうる。当該組織は例えば、レントゲンで撮影した際に白く写らない部分であり、すなわち、黒く抜けたように写る部分でありうる。多指症は、末節骨型、中節骨型、又は基節骨型のいずれでもよい。余剰指は、いずれの指であってもよく、例えば親指又は小指でありうる。採取する余剰指（肢）がイボ状で小型の場合は採取した皮下組織すべてが用いられうる。当該動物がヒトである場合、当該ヒトの年齢に限定はないが、例えば５歳以下、３歳以下、又は２歳以下でありうる。

　前記酵素処理において用いられる酵素の例として、コラゲナーゼ、カゼイナーゼ、クロストリパイン、トリプシン、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼ、プロナーゼ、及びディスパーゼを挙げることができる。好ましくは、これら酵素の組合せが用いられうる。好ましい酵素の組合せの例は例えば、コラゲナーゼ、カゼイナーゼ、クロストリパイン、及びトリプシンの組合せである。この組合せを含む酵素製剤として例えば、コラゲナーゼタイプＩ、コラゲナーゼタイプＩＩ、コラゲナーゼタイプＩＩＩ、コラゲナーゼタイプＩＶ、及びコラゲナーゼタイプＶ（いずれも富士フイルム和光純薬株式会社から入手可能）を挙げることができるが、これらに限定されない。また、好ましい酵素の組合せの他の例は例えば、コラゲナーゼとディスパーゼ又はサーモリシンとの組合せである。この組合せを含む酵素製剤として例えばリベラーゼ（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社から入手可能）を挙げることができるが、これに限定されない。また、組織の状態によっては、複数種の酵素によって段階的に酵素処理が行われてもよい。例えば、コラゲナーゼ、カゼイナーゼ、クロストリパイン及びトリプシンによってこの順に処理することで単離が行われてもよい。酵素処理の条件は、用いられる酵素の種類及び／又は軟骨組織の状態によって当業者により適宜定められうる。酵素処理は、例えば３０～５０℃、好ましくは３３～４５℃、３５～４０℃で、例えば１～１２時間、好ましくは２～５時間行われうる。酵素処理の温度が高すぎる場合、細胞の変性、生細胞の減少、増殖能の低下、単離不能などの問題が起こりうる。また、酵素処理温度が低すぎる場合、十分な酵素活性が達成されず、細胞の単離が出来ない場合がありうる。酵素処理の際、物理的刺激を加えることで高効率に細胞回収を成し得る。

　上記酵素反応は、関節軟骨が酵素処理されている細胞懸濁液を、洗浄により希釈することで停止されうる。酵素反応停止後、当該細胞懸濁液が遠心分離により細胞塊と上清とに分けられうる。リベラーゼに関しては、二回以上の洗いにより酵素反応を停止させうる。当該遠心分離は、前記遠心分離は、２５μｍ未満、特には２０μｍ以下、１５μｍ以上の細胞をより多く集められる条件で行われうる。そのような細胞をより多く集める為に、当該遠心分離は、例えば１０００ｒｐｍ以上、１５００ｒｐｍ以上、又は２０００ｒｐｍ以上で、例えば５分間以上、７分間以上、又は１０分間以上行われうる。

　前記軟骨組織由来の細胞は、いわゆるアウトグロース法により得られてもよい。アウトグロース法は、採取された軟骨組織を細かく切る工程、細かく切られた軟骨組織片を少量の培地と共に培養皿に播種し、培養する工程を含みうる。当該培養によって、当該軟骨組織片から、増殖した細胞が生成される。当該生成された細胞が、酵素処理及び遠心分離によって回収される。当該回収された細胞が、本発明の細胞シートの製造に用いられうる。

　前記軟骨組織を細かく切る工程は、例えば湿潤状態で行われうる。当該工程は、例えば、50ml遠沈管に組織片と少量の培地を入れてMetzenbaum Scissors, SuperCut Tungsten Carbide 18cm Long Curve（World Precision Instruments社）によって切り刻むことで行われうる。可能な限り小さい軟骨組織片を得ることが好ましい。また、細かく切られた軟骨組織片を培養するための培地は、当業者により適宜選択されうるが、好ましくはDMEM/F12+20%FBS+抗生物質（以下ABともいう）でありうる。培養開始後に培養皿への細胞の接着が確認された後、好ましくはDMEM/F12+20%FBS+AB+アスコルビン酸（以下AAともいう）に培地が交換されうる。培地がアスコルビン酸を培養開始時から含む場合、細胞の培養皿への接着が阻害されうる。また、前記培養は一般的な培養条件で行われてよく、例えば37℃、５％ＣＯ２のインキュベータ内で行われうる。培養は、サブコンフルエントが達成されるまで行われうる。また、培養において生成された細胞の回収において用いられる酵素製剤は、例えばトリプシン及びEDTAを含むものでありうる。遠心分離は、上記で述べたとおりに行われうる。

　本発明において、前記軟骨組織由来の細胞は、好ましくは間葉系幹細胞を含みうる。前記軟骨組織由来の細胞は、間葉系幹細胞に加えて、軟骨組織に含まれる細胞をさらに含みうる。すなわち、本発明において、前記軟骨組織由来の細胞は、間葉系幹細胞を含む複数種類の細胞の集団でありうる。間葉系幹細胞以外の細胞の例として、例えば軟骨細胞及び軟骨芽細胞を挙げることができるがこれらに限定されない。本発明の細胞培養物は、前記軟骨組織由来の細胞の培養物から形成されていることにより、軟骨の修復により適している。

（幹細胞に由来する細胞培養物）

　本発明の他の実施態様において、前記細胞培養物は、幹細胞に由来するものであってよい。前記幹細胞は、多能性幹細胞、胚性幹細胞、又は体性幹細胞を含んでよく、例えばｉＰＳ細胞を含んでもよい。

　この実施態様において、例えば多能性幹細胞（特にはｉＰＳ細胞）を培地中で培養することによって分化させて軟骨細胞又は軟骨様細胞が得られ、当該軟骨細胞又は軟骨様細胞を例えば刺激応答性ポリマーが固定化された面上でさらに培養することによって、本発明の細胞培養物が得られる。例えば多能性幹細胞（特にはｉＰＳ細胞）を刺激応答性ポリマーが固定化された基材上に播種し、軟骨細胞又は軟骨様細胞に分化させて培養することによっても、本発明の細胞培養物が得られる。

（細胞培養物の用途）

　本発明の細胞培養物は、軟骨組織の修復のために用いられるものであってよく、より好ましくは膝軟骨組織の修復のために用いられるものであってよく、さらにより好ましくは膝の硝子軟骨組織の修復のために用いられるものであってよい。本発明の細胞培養物は、軟骨様組織形成特性を有し、特に硝子軟骨様組織形成特性を有するので、前記修復のために適している。

　本発明において、軟骨組織の修復とは、炎症及び／又は損傷を有する軟骨組織を治療すること、軟骨組織を補強すること、軟骨組織の欠損部分を補うこと、及び軟骨組織を再生することを包含するが、これらに限定されない。また、本発明の細胞培養物は、軟骨組織に関する疾患を予防する為に用いられてもよい。本発明の細胞培養物は例えば疾患を有する軟骨組織又は骨組織に施与されうる。本発明の細胞培養物が適用される疾患の例としては、例えば関節炎、関節症、軟骨損傷、骨軟骨損傷、半月板損傷、及び／又は椎間板変性を挙げられるがこれらに限定されない。

　本発明の細胞培養物は、より特には軟骨組織の外科的な処置、特には外科的な治療、に適している。本発明の細胞培養物による軟骨の修復は、例えば、修復が必要な軟骨部分を外科的処置により露出させ、当該露出した部分に前記細胞培養物を施与することによって行われうる。
　例えばシート状の本発明の細胞培養物が、当該露出した部分に施与されてよい。施与されるべきシート状細胞培養物の数及び大きさは、例えば処置されるべき部分の状態又は疾患の種類などを考慮して、当業者により適宜定められうる。また、本発明のシート状細胞培養物は、好ましくは、当該シート状細胞培養物の施与の前に、軟骨下骨から出血が確認されるように軟骨下骨が処理されうる。当該処理は当業者に既知の方法により行われてよく、例えばマイクロフラクチャー又はドリリングにより行われてよい。当該処理が行われることで、本発明のシート状細胞培養物による軟骨の修復がより促進される。
　本発明のシート状細胞培養物を患部へ施与する際に、生体内で使用可能な接着剤による接合又は縫合が行われてもよい。又は、当該接合又は縫合を行うことなく、当該シート状細胞培養物を単に患部に付着させるだけでもよい。

　本発明の細胞培養物がシート状細胞培養物である場合、前記シート状細胞培養物の全ての面に基質を有しうる。好ましくは、前記基質はフィブロネクチンを含みうる。細胞を基材上で培養する場合、通常は、細胞と基材との間に基質が産生され、基材と反対側、すなわち基材と接さない部分には基質は産生されない。本発明のシート状細胞培養物は、基材と接する面だけではなく、基材と接さない面においても基質が生産されたものでありうる。本発明のシート状細胞培養物は、シート状細胞培養物の全ての面に基質を有することで、軟骨修復により適したものとなりうる。

　本発明のシート状細胞培養物は好ましくは、培養時に形成される細胞‐多孔膜間の基底膜様タンパク質が、例えばディスパーゼ及びトリプシンなどのタンパク質分解酵素などの酵素による破壊を受けていないものでありうる。すなわち、本発明のシート状細胞培養物は、細胞－多孔膜間の基底膜様タンパク質を有しうる。特には、本発明のシート状細胞培養物は、細胞－多孔膜間の基底膜様タンパク質を当該シート状細胞培養物の１つの面に又は当該シート状細胞培養物の両面に有しうる。当該基底膜様タンパク質をシート状細胞培養物が有することで、シート状細胞培養物がより良い軟骨修復能を発揮しうる。

　本発明のシート状細胞培養物は好ましくは、細胞密度が、１００×１０^５～１００×１０^８個／ｃｍ^３、より好ましくは１００×１０⁶～１００×１０⁷個／ｃｍ^３、より好ましくは１００×１０^６～５００×１０⁶個／ｃｍ^３、さらにより好ましくは２００×１０⁶～３００×１０⁶個／ｃｍ^３でありうる。　

　本発明の細胞培養物は好ましくは、人工的な足場成分を含まない。すなわち、本発明の細胞培養物は、前記培養物中の細胞及び当該細胞から産生された成分（並びに、細胞シートに付着している培地成分）のみからなるものでありうる。本発明の細胞培養物は好ましくは、人工的な足場成分を含まない状態で患者に移植されうる。

　本発明の細胞培養物は、以下２．で述べる本発明の製造方法により製造されうる。そのため、本発明の細胞培養物の製造方法については、以下２．を参照されたい。

２．細胞培養物の製造方法

　本発明は、軟骨様組織形成特性を有する細胞培養物の製造方法も提供する。前記製造方法は、細胞を培養して細胞培養物を得る培養工程を含む。前記製造方法はさらに、前記細胞培養物に含まれる細胞集団に関して細胞表面マーカーの発現強度を解析する解析工程、及び、前記解析工程において得られた発現強度に基づき、前記細胞培養物が軟骨様組織形成特性を有するかを判定する判定工程を含みうる。以下で各工程について説明する。

２－１．培養工程

　前記培養工程において、前記細胞培養物に含まれる細胞集団に関して、
　ＣＤ１６６、ＣＤ１６５、ＣＤ９９、ＧＤ２、ＳＴＲＯ－１、ＣＤ１０８、ＣＤ１６４、ＣＤ６、ＣＤ１０６、及びＣＤ１０７ｂからなる群から選ばれる少なくとも一つの細胞表面マーカーの発現強度が、細胞表面マーカーそれぞれについての閾値以下であり、且つ／又は
　ＣＤ２６、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ４４、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ２０１、ＥＧＦＲ、ＣＤ１４６、ＣＤ１４０ａ、及びＣＤ９０からなる群から選ばれる少なくとも一つの細胞表面マーカーの発現強度が、細胞表面マーカーそれぞれについての閾値以上である
　となるように培養が行われてよい。
　前記培養工程によって得られた細胞培養物は、優れた軟骨様組織形成特性、特には硝子軟骨様組織形成特性を有する。当該細胞培養物は、例えばヒト生体内に移植されたときに、特にはヒト生体内の膝軟骨部分に移植されたときに、軟骨様組織、特には硝子軟骨様組織を形成することができる。すなわち、当該細胞培養物は、軟骨修復作用、特には硝子軟骨修復作用を発揮することができる。そして当該細胞培養物は、軟骨組織と同様の機能を発揮する。

　前記培養工程において培養される細胞は、上記１．において述べた軟骨組織由来の細胞であってよく、又は、幹細胞由来の細胞であってもよい。例えば、培養に用いられる原料細胞は、前記軟骨組織由来細胞であってよく、当該軟骨組織由来細胞は、ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２中で、軟骨組織中の細胞を少なくとも２日培養して得られた細胞であってよい。
　本発明の好ましい実施態様において、前記細胞培養物を得るための培養に用いられた原料細胞は、軟骨組織中の細胞を培地中で培養してコンフルエントにする第一培養工程、及び、前記第一培養工程においてコンフルエントとなった細胞集団を互いから解離する解離工程、前記解離工程において解離された細胞集団をさらに、前記培地と同じ新鮮培地中で培養する第二培養工程を含む原料細胞調製方法によって調製されたものであってよい。この原料細胞調製方法により調製された原料細胞が、軟骨修復適性を有する組織培養物の製造のために適している。

　前記培養工程において、細胞は、好ましくは刺激応答性ポリマーが固定化された面を有する基材を含む培地中で細胞を培養されてよく、例えば刺激応答性ポリマーが固定化された面を有する多孔膜の当該面上で細胞が培養されてよい。刺激応答性ポリマーが固定された面を有する基材（特には多孔膜）を含む培地中で細胞を培養することによって、軟骨様組織形成特性を有する細胞培養物を得ることができ、且つ、当該細胞培養物を損傷することなく当該基材から剥離することもできる。前記刺激応答性ポリマーは、例えば温度応答性ポリマー、ｐＨ応答性ポリマー、又は光応答性ポリマーであってよく、より具体的にはそれぞれ温度刺激（例えば温度変化）、ｐＨ刺激（例えばｐＨ変化）、又は光刺激（例えば光照射）によって性質（例えば水和力）を変化させるポリマーであってよい。当該性質の変化は、例えば、前記培養物の前記基材からの剥離を促進するような性質変化であってよい。
　例えば、刺激応答性ポリマーが固定化された面上に細胞を播種し、当該ポリマーの水和力が弱い温度域にある培養液中で細胞を培養して細胞培養物が形成される。そして、細胞培養物の形成後、当該培養液をポリマーの水和力が強い状態となる温度に変化させることで、当該面からの細胞培養物の剥離が促進される。例えば、前記培養が行われる温度域（すなわち水和力が弱い温度域）は、例えば３３℃～４０℃でありうる。前記剥離のための温度（すなわち水和力が強い温度域）は、前記温度域より低い温度であり、例えば３１℃以下でありうる。
　本技術の一つの実施態様において、前記刺激応答性ポリマーは温度応答性ポリマーである。温度応答性ポリマーが固定化された面を有する基材を含む培地中で前記細胞が培養される場合、例えば、培養後に、培地の温度を当該温度応答性ポリマーの上限臨界溶解温度以上又は下限臨界溶解温度以下とすることで、当該面が疎水性から親水性に変化し、その結果、培養物と多孔膜との間の剥離が容易になる。なお、本発明の製造方法における培養は、例えば二次元培養（平面培養ともよばれる）であってよく、又は、三次元培養であってもよい（例えば浮遊培養やペレット培養など）。

　前記培養工程において前記多孔膜を用いる場合、前記細胞は、前記多孔膜の上側の培地と接し、且つ、前記多孔膜の下側の培地と前記多孔膜の孔を介して接していてよい。このような状態で培養を行うことで、より軟骨修復に適した細胞が得られうる。

　前記培養工程後に細胞培養物を前記基材から剥離する場合、例えばディスパーゼ及びトリプシンなどのタンパク質分解酵素による処理が不要である。上記温度応答性ポリマーの特性を利用し、培地の温度を変化させることで、前記細胞培養物は、前記基材から剥離されうる。そのため、本発明の製造方法により製造された前記細胞培養物、当該酵素による損傷を受けずに前記基材から剥離できるという利点を有する。
　タンパク質分解酵素による処理は、細胞－細胞間のデスモソーム構造及び細胞－基材間の基底膜様タンパク質の分解をもたらし、その結果、細胞培養物中の細胞が個々に分かれていることがある。一方、本発明の製造方法により得られた細胞培養物は、タンパク質分解酵素により処理を行わずに、培地の温度を変化させることによって基材から剥離されうる。その結果、上記デスモソーム構造が保持され、且つ、細胞培養物の欠陥を少なくすることができる。また、本発明の製造方法により得られた細胞培養物を培地の温度を変化させることによって基材から剥離した場合は、上記基底膜様タンパク質も酵素により破壊されていない。そのため、移植時において患部組織とより良好に接着することができ、効率良い治療を実施することができる。
　タンパク質分解酵素であるディスパーゼは、上記デスモソーム構造を１０～６０％保持した状態で細胞シートを剥離させることができることで知られているが、上記基底膜様タンパク質を殆ど破壊してしまうため、得られる細胞培養物の強度は弱い。
　本発明の製造方法により製造された細胞培養物は、上記デスモソーム構造及び上記基底膜様タンパク質をいずれも８０％以上残存した状態で基材から剥離されうる。

　本発明において用いられる温度応答性ポリマーの上限臨界溶液温度又は下限臨界溶液温度は、好ましくは０℃～８０℃、より好ましくは２０℃～５０℃、さらにより好ましくは２５～４５℃でありうる。上限臨界溶液温度又は下限臨界溶液温度が高すぎる場合、細胞が死滅しうる。上限臨界溶液温度又は下限臨界溶液温度が高すぎる場合、細胞増殖速度が低下するか又は細胞が死滅しうる。

　本発明の製造方法において、温度応答性ポリマーは、ホモポリマー又はコポリマーのいずれであってもよい。当該ポリマーは例えば、（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ－（若しくはＮ，Ｎ－ジ）アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体、若しくはビニルエーテル誘導体の単独重合体であってよく、又は、これらモノマーの共重合体でありうる。
　前記（メタ）アクリルアミド化合物は例えば、アクリルアミド又はメタクリルアミドでありうる。
　前記Ｎ－アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体は例えば、Ｎ－エチルアクリルアミド（単独重合体の下限臨界溶液温度７２℃）、Ｎ－ｎ－プロピルアクリルアミド（同２１℃）、Ｎ－ｎ－プロピルメタクリルアミド（同２７℃）、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド（同３２℃）、Ｎ－イソプロピルメタクリルアミド（同４３℃）、Ｎ－シクロプロピルアクリルアミド（同４５℃）、Ｎ－シクロプロピルメタクリルアミド（同６０℃）、Ｎ－エトキシエチルアクリルアミド（同約３５℃）、Ｎ－エトキシエチルメタクリルアミド（同約４５℃）、Ｎ－テトラヒドロフルフリルアクリルアミド（同約２８℃）、又はＮ－テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド（同約３５℃）でありうる。
　前記Ｎ，Ｎ－ジアルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体は例えば、Ｎ，Ｎ－ジメチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ－エチルメチルアクリルアミド（単独重合体の下限臨界溶液温度５６℃）、又はＮ，Ｎ－ジエチルアクリルアミド（同３２℃）でありうる。
　前記ビニルエーテル誘導体は例えば、メチルビニルエーテル（単独重合体の下限臨界溶液温度３５℃）でありうる。
　本発明において、温度応答性ポリマーとして、上記モノマー以外のモノマーとの共重合体が用いられてもよく、重合体同士をグラフト重合若しくは共重合したもの、又は重合体若しくは共重合体の混合物を用いてもよい。また、重合体本来の性質を損なわない範囲で架橋が行われてもよい。
　本発明における培養又は剥離により適した臨界溶解温度を有する温度応答性ポリマーを選択するために、又は、多孔膜と培養物との間の相互作用を調節するために、又は、多孔膜の面の親水性又は疎水性を調整するために、上記ポリマーが適宜選択されうる。
　好ましい実施態様において、前記温度応答性ポリマーは、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）である。

　本発明の製造方法において、膜の面に固定化される温度応答性ポリマーの量は好ましくは０．３～５．０μｇ／ｃｍ^２であり、より好ましくは０．３～４．８μｇ／ｃｍ^２でありうる。また、膜の面に固定化される温度応答性ポリマーの量は、当該膜が多孔膜である場合、特には当該膜が多孔膜であり且つセルカルチャーインサートを用いて培養が行われる場合、好ましくは０．３～１．５μｇ／ｃｍ^２でありうる。また、当該膜が多孔膜でない場合は、膜の面に固定化される温度応答性ポリマーの量は、好ましくは１～２μｇ／ｃｍ^２でありうる。温度応答性ポリマーの固定化量がこの範囲内にあることによって、前記より効率的な培養が行われうる。当該固定化量がこの範囲外にある場合、細胞培養物が形成されず又は細胞培養物が効率的に製造されない場合がありうる。また、当該固定化量がこの範囲内にあることで、前記細胞培養物がより容易に膜から剥離されうる。

　本発明の製造方法において、好ましくは、前記基材は多孔膜であり、前記培養工程において、前記細胞は、前記多孔膜の上側の培地と接し、且つ、前記多孔膜の下側の培地と前記多孔膜の孔を介して接している。このような状態で培養を行うことで、より効率的に培養が行われうる。

　本発明の製造方法において、膜、特には多孔膜の材料は例えば、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリスチレン、又はポリテトラフルオロエチレンでありうる。これらのうち特にＰＥＴが好ましい。ＰＥＴの多孔膜を用いることによって、本発明の細胞培養物がより効率的に作成されうる。

　温度応答性ポリマーを多孔膜に面に固定化する方法は、例えば特開平２－２１１８６５号公報に記載された方法により行われうる。すなわち、多孔膜と上記温度応答性ポリマーとを化学的な反応によって結合させる方法、又は、物理的な相互作用によって結合させる方法により、当該固定化が行われうる。これらの方法は併用されてもよい。
　前記化学的な反応によって結合させる方法において、例えば電子線照射（ＥＢ）、γ線照射、紫外線照射、可視光照射、LED照射、プラズマ処理、又はコロナ処理が行われうる。あるいは、ラジカル反応、アニオンラジカル反応、カチオンラジカル反応等の一般に用いられる有機反応により温度応答性ポリマーが多孔膜に固定化されてもよい。また、水不溶性ポリマーセグメントと温度応答性ポリマーセグメントが結合した構造をとるブロックコポリマーを基材表面に温度応答性ポリマー分として被覆してもよい。物理吸着やハイドロフォビックによる固定化をさせてもよい。
　前記物理的な相互作用によって結合させる方法において、温度応答性ポリマー又は当該ポリマーと任意の媒体との混合物が多孔膜に塗布されうる。

　本発明の製造方法における培養において用いられる培地は、細胞培養、特には哺乳類細胞の培養に用いられうる培地、例えばＤＭＥＭ／Ｆ１２（Dulbecco's Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12）などでありうる。当該培地は添加因子を含みうる。添加因子としては、例えば細胞成長因子、ホルモン、結合タンパク質、細胞接着因子、及び脂質並びにその他の成分などを挙げることができる。

　前記細胞成長因子としては、例えばＴＧＦ‐β、ｂ‐ＦＧＦ、ＩＧＦ、ＥＧＦ（ＥｐｉｄｅｒｍａｌＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒ：上皮成長因子）、ＢＭＰ（Ｂｏｎｅｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎ：骨成長因子）、Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ３（ＦＧＦＲ－３）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－ｒｅｌａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＦＲＺＢ）、ＣＤＭＰ‐１、Ｇｒｏｗｔｈ　ｄｉｆｆｅｒｅｔｉａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ５（ＧＤＦ‐５）、Ｇ‐ＣＳＦ（ＧｒａｎｕｌｏｃｙｃｙｔｅＣｏｌｏｎｙＳｉｔｉｍｕｌａｔｉｎｇＦａｃｔｏｒ：顆粒球コロニー刺激因子）、ＬＩＦ（ＬｅｕｋｅｍｉａＩｎｈｉｂｉｔｏｒｙＦａｃｔｏｒ：白血球阻害因子）、インターロイキン、ＰＤＧＦ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ‐ＤｅｒｉｖｅｄＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒ：血小板由来成長因子）、ＮＧＦ（ＮｅｒｖｅＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒ）、アクチビンＡなどのＴＧＦ（ＴｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒ：トランスフォーミング成長因子）ファミリー、Ｗｎｔファミリー、特にＷｎｔ－３ａ（Ｗｉｎｇｌｅｓｓ‐ｔｙｐｅＭＭＴＶｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎｓｉｔｅｆａｍｉｌｙ, ｍｅｍｂｅｒ３Ａ）などが挙げられるがこれらに限定されない。ＴＧＦファミリーには、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３がある。

　前記ホルモンとしては、インスリン、トランスフェリン、デキサメサゾン、エストラジオール、プロラクチン、グルカゴン、サイロキシン、成長ホルモン、ＦＳＨ（ＦｏｌｌｉｃｌｅＳｔｉｍｕｌａｔｉｏｎｇＨｏｒｍｏｎｅ：卵胞刺激ホルモン）、ＬＨ（ＬｅｕｔｅｎｉｚｉｎｇＨｏｒｍｏｎｅ：黄体形成ホルモン）、グルココルチノイド、及びプロスタグランチンなどが挙げられるがこれらに限定されない。

　前記細胞接着因子としては、コラーゲン、コラーゲン様ペプチド、フィブロネクチン、ラミニン、及びビトロネクチンが挙げられるがこれらに限定されない。コラーゲン様ペプチドとしては、例えばコラーゲン中のＲＧＤ配列含有領域を連結した組み換えペプチドなどを挙げることができる。そのような組み換えペプチドとして、例えばｃｅｌｌｎｅｓｔ（富士フイルム社）を挙げることができる。

　前記脂質としては、リン脂質及び不飽和脂肪酸などが挙げられるがこれらに限定されない。

　培地に添加されうる上記その他の成分としては、アスコルビン酸、血清、インスリントランスフェリン亜セレン酸塩（ＩＴＳ）、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、ピルビン酸、プロリン、アルブミン、リポタンパク質、セルトプラスミンなどを挙げることができるが、これらに限定されない。当該血清としては、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及びヒト血清を挙げることができるが、これらに限定されない。本発明の製造方法において、前記培地は、好ましくはＦＢＳを含む培地であり、特にはＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２でありうる。ＦＢＳの含有割合は、より効率的な培養の為に、好ましくは培地の合計容量に対して１～３０容量％、好ましくは１０～３０容量％、より好ましくは１２～２８容量％、さらにより好ましくは１５～２５容量％でありうる。
　また、本発明の製造方法において培地は無血清培地であってもよい。ＩＴＳなどの添加因子は、血清の機能を代替することができるので、当該添加因子を培地に含めることで、無血清培地において本発明の製造方法における培養が行われうる。また、無血清培地を用いることで、ヒトへの移植に際して生物原料資源を用いることのリスクが回避されうる。

　好ましくは、本発明において用いられる培地は、より良い細胞増殖の為に、アスコルビン酸を、培地体積に対して例えば０．０１～１ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．０５～０．５ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは０．０７～０．３ｍｇ／ｍＬの含有割合で含みうる。アスコルビン酸によって、培養されている細胞からの関節軟骨特異的な基質の産生が促進され、及び／又は、細胞培養物の形質発現が軟骨修復により適したものとなりうる。すなわち、アスコルビン酸は、関節軟骨の損傷部位を硝子軟骨により再生することに寄与しうる。アスコルビン酸濃度が高すぎる場合は、培養されている細胞の多孔膜への接着が妨げられうる。アスコルビン酸濃度が低すぎる場合は、その効果が奏されない場合がありうる。
　好ましい実施態様において、本発明の細胞培養物は、培地中で細胞を培養して得られたものであり、好ましくはＦＢＳ及び／又はアスコルビン酸を含む培地中で細胞を培養して得られたものであり、例えばＦＢＳ及び／又はアスコルビン酸を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２中で細胞を培養して得られたものであってよい。

　本発明の製造方法において、細胞の膜上での培養期間は、培養物の状態、例えば形質発現状態など、によって適宜選択されてよいが、例えば１０～２０日間、好ましくは１１～１８日間、より好ましくは１２～１６日間でありうる。当該培養期間によって、細胞培養物が、軟骨修復により適したものとなりうる。

　前記培養において、前記細胞集団は、前記多孔膜の上側の培地と接し、且つ、前記多孔膜の下側の培地と前記多孔膜の孔を介して接した状態で行われうる。当該状態で培養を行うことによって、接着タンパク質が、細胞シートの多孔膜への接着面だけでなく、当該接着面の反対側の面、前記上側の培地と接している面においても産生されうる。本発明の細胞シートは、細胞シートの両面に基質を有することで、軟骨修復により適したものとなりうる。
　前記状態における培養のために、例えばセルインサート（セルカルチャーインサートとも呼ばれる）又は同様の構造体を有する培養容器が用いられうる。例えば、多孔膜部分に刺激応答性ポリマー（例えば温度応答性ポリマー）を固定化したセルインサートを有する培養容器が、本発明の製造方法において用いられうる。当該多孔膜の刺激応答性ポリマー（例えば温度応答性ポリマー）を固定化した面上で前記細胞集団の培養が行われうる。
　当該刺激応答性ポリマーの固定化は当業者に既知の方法によって行われてよく、例えば、特開平2-211865号公報に記載の方法により行われてよい。また、刺激応答性ポリマーが固定化されるセルインサートは市販入手可能なものが用いられてよく、例えば、Thermo Scientific（商標）Nunc（商標）CCインサート＃140660、BD Falcon セルカルチャーインサート＃353090、＃353490、353102、＃353091、＃353092、＃353093が用いられうる。

　本発明の製造方法において、培養容器は当業者により適宜選択されてよく、例えばディッシュ、マルチウェルプレート、及びフラスコ、並びにこれらに類似する形態の容器を挙げることができるが、これらに限定されない。

　本発明の製造方法において得られる細胞培養物の特徴は上記１．で述べたとおりである。また、前記培養工程において培養される細胞及びその調製方法は、上記１．で述べたとおりである。

２－２．解析工程

　本発明の製造方法は、好ましくは、前記細胞培養物に含まれる細胞集団の細胞表面マーカーの発現強度を解析する解析工程を含む。好ましくは、前記解析において、
　ＣＤ１６６、ＣＤ１６５、ＣＤ９９、ＧＤ２、ＳＴＲＯ－１、ＣＤ１０８、ＣＤ１６４、ＣＤ６、ＣＤ１０６、及びＣＤ１０７ｂからなる群から選ばれる少なくとも一つの細胞表面マーカーの発現強度、及び／又は、
　ＣＤ２６、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ４４、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ２０１、ＥＧＦＲ、ＣＤ１４６、ＣＤ１４０ａ、及びＣＤ９０からなる群から選ばれる少なくとも一つの細胞表面マーカーの発現強度
　が測定される。当該測定は、好ましくは、フローサイトメトリーにより行われる。当該フローサイトメトリーによる測定は、後述の「５．実施例」において説明したとおりに行われてよい。

　本発明の一つの実施態様において、前記解析工程において、少なくともＣＤ９９及び／又はＧＤ２の発現強度が測定され、且つ／又は、少なくともＣＤ２６及び／又はＣＤ７３の発現強度が測定される。これら４つの細胞表面マーカーは、軟骨様組織形成特性、特には硝子軟骨様組織形成特性を評価するために特に適している。

　本発明の他の実施態様において、前記解析工程において、少なくともＣＤ９９及び／又はＧＤ２の発現強度が測定され、且つ／又は、少なくともＣＤ２６、ＣＤ７３、及びＣＤ４４のうちの１つ、２つ、又は３つの発現強度が測定される。これら５つの細胞表面マーカーは、軟骨様組織形成特性、特には硝子軟骨様組織形成特性を評価するために特に適している。

　本発明のさらに他の実施態様において、前記解析工程において、少なくともＣＤ９９及び／又はＧＤ２の発現強度が測定され、且つ／又は、少なくともＣＤ４４の発現強度が測定される。これら３つの細胞表面マーカーは、軟骨様組織形成特性、特には硝子軟骨様組織形成特性を評価するために特に適している。

２－３．判定工程

　好ましくは、本発明の製造方法は、前記解析工程において得られた細胞表面マーカーの発現強度に基づき、前記細胞培養物が軟骨様組織形成特性を有するか（特には硝子軟骨様組織形成特性を有するか）を判定する判定工程を含みうる。
　前記判定工程において、前記解析工程において得られた細胞表面マーカーの発現強度に基づき、前記細胞培養物が軟骨組織の修復、特には硝子軟骨組織の修復、より特には膝硝子軟骨組織の修復に適しているかが判定されてもよい。
　前記判定工程において、好ましくは前記細胞培養物に含まれる細胞集団について、
　ＣＤ１６６、ＣＤ１６５、ＣＤ９９、ＧＤ２、ＳＴＲＯ－１、ＣＤ１０８、ＣＤ１６４、ＣＤ６、ＣＤ１０６、及びＣＤ１０７ｂからなる群から選ばれる少なくとも一つの細胞表面マーカーの発現強度が、表面マーカーそれぞれについての閾値以下であるか、及び／又は
　ＣＤ２６、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ４４、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ２０１、ＥＧＦＲ、ＣＤ１４６、ＣＤ１４０ａ、及びＣＤ９０からなる群から選ばれる少なくとも一つの細胞表面マーカーの発現強度が、表面マーカーそれぞれについての閾値以上であるか
　が判定される。

　特に好ましくは、前記判定工程において、当該細胞培養物に含まれる細胞集団をフローサイトメトリーにより解析したときに測定される標準化平均蛍光強度が、上記１．において述べた条件１～１０の少なくとも一つを満たし、且つ／又は、上記１．において述べた条件１１～２０の少なくとも一つを満たす場合に、前記細胞培養物が軟骨様組織形成特性を有すると判定されてよく、例えば硝子軟骨様組織形成特性を有すると判定されてもよい。
　また、前記判定工程において、当該細胞培養物に含まれる細胞集団をフローサイトメトリーにより解析したときに測定される標準化平均蛍光強度が、上記１．において述べた条件１～１０の少なくとも一つを満たし、且つ／又は、上記１．において述べた条件１１～２０の少なくとも一つを満たす場合に、前記細胞培養物が軟骨組織の修復、特には硝子軟骨組織の修復、より特には膝硝子軟骨組織の修復に適していると判定されてもよい。

　前記判定工程において、軟骨修復に適していると判定された細胞培養物が、ヒトへの移植のために用いられてよい。すなわち、前記判定工程において、当該細胞培養物に含まれる細胞集団をフローサイトメトリーにより解析したときに測定される標準化平均蛍光強度が、上記１．において述べた条件１～１０の少なくとも一つを満たし、且つ／又は、上記１．において述べた条件１１～２０の少なくとも一つを満たす場合に、ヒトの膝への移植のために用いられてよいと判定されてもよい。

３．評価方法

　本発明は、細胞培養物の評価方法も提供する。前記評価方法は、細胞培養物に含まれる細胞集団の細胞表面マーカーの発現強度に基づき、軟骨様組織形成特性を有するか（特には硝子軟骨様組織形成特性を有するか）を判定する判定工程を含みうる。
　また、前記判定工程において、上記２．において説明した解析工程において得られた細胞表面マーカーの発現強度に基づき、前記細胞培養物が軟骨組織の修復、特には硝子軟骨組織の修復、より特には膝硝子軟骨組織の修復に適しているかが判定されてもよい。
　前記判定工程は、上記２．において説明した判定工程と同じであってよい。例えば、前記判定は、例えば上記２．で挙げた特定の細胞表面マーカーの発現強度、特には標準化平均強度が、各細胞表面マーカーについて定められた条件を満たすかに基づき行われてよい。
　また、前記評価方法は、前記細胞集団をフローサイトメトリーにより解析する解析工程をさらに含みうる。前記判定工程における判定は、前記解析工程における解析結果に基づき行われうる。前記解析工程は、上記２．において説明した解析工程と同じであってよい。

　上記特定の細胞表面マーカーの発現強度は、細胞培養物が軟骨様組織形成特性を有するか（特には硝子軟骨様組織形成特性を有するか）を判定するための指標として有効である。そのため、本発明の評価方法によって、軟骨修復適性、特には硝子軟骨修復適性の適切な評価が可能である。
　また、本発明の評価方法では、細胞表面マーカーの発現強度に基づき軟骨修復に適しているかが判定されるので、細胞培養物を軟骨様組織へと誘導培養することなく軟骨修復適性を判定することができる。そのため、軟骨修復適性のために要する時間を削減することができる。さらには、本発明の評価方法は短時間で行うことができるので、軟骨修復用細胞培養物の製造における工程の一つとして組み込むことが可能とあり、これにより軟骨修復適性を有する細胞培養物をより確実に製造することができる。また、本発明の評価方法は、実際に細胞培養物を軟骨様組織へと誘導培養して軟骨修復適性を評価する場合と比べて、より安価に軟骨修復適性を評価することもできる。

４．軟骨様組織形成特性評価用マーカー

　本発明は、軟骨様組織形成特性評価用マーカーを提供する。前記マーカーは、
　ＣＤ１６６、ＣＤ１６５、ＣＤ９９、ＧＤ２、ＳＴＲＯ－１、ＣＤ１０８、ＣＤ１６４、ＣＤ６、ＣＤ１０６、及びＣＤ１０７ｂからなる群から選ばれる少なくとも一つの細胞表面マーカー、及び／又は、
　ＣＤ２６、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ４４、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ２０１、ＥＧＦＲ、ＣＤ１４６、ＣＤ１４０ａ、及びＣＤ９０からなる群から選ばれる少なくとも一つの細胞表面マーカーを含む。
　これらの細胞表面マーカーは、細胞培養物の軟骨様組織形成特性を評価するために適している。

　本発明の一つの実施態様において、本発明の軟骨様組織形成特性評価用マーカーは、ＣＤ９９及び／又はＧＤ２を含み、且つ／又は、ＣＤ２６及び／又はＣＤ７３を含む。これらの細胞表面マーカーは、細胞培養物の軟骨様組織形成特性の評価のための特に適している。

　本発明の他の実施態様において、本発明の軟骨様組織形成特性評価用マーカーは、ＣＤ９９及び／又はＧＤ２を含み、且つ／又は、ＣＤ２６、ＣＤ７３、及びＣＤ４４のうちの１つ、２つ、又は３つを含む。これらの細胞表面マーカーは、細胞培養物の軟骨様組織形成特性の評価のための特に適している。

　本発明のさらに他の実施態様において、本発明の軟骨様組織形成特性評価用マーカーは、ＣＤ９９及び／又はＧＤ２を含み、且つ／又は、ＣＤ４４を含む。これらの細胞表面マーカーは、細胞培養物の軟骨様組織形成特性の評価のための特に適している。

　これらの細胞表面マーカーに関して、例えば上記２．及び３．において述べたとおりの解析工程及び判定工程を行うことで、細胞培養物の軟骨様組織形成特性を評価することができる。

　また、本発明は、軟骨修復適性評価用マーカーも提供する。前記マーカーは、上記で軟骨様組織形成特性評価用マーカーに関して述べた細胞表面マーカーを含む。

　以下に、本発明を実施例に基づいてさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものでない。

５．実施例１

　特定の細胞表面マーカーを特定の発現強度で発現する細胞集団を含む細胞培養物が軟骨様組織形成特性を有することを、以下で説明するとおりにして確認した。

　すなわち、図１のステップ１において、複数のシート状細胞培養物を作成した。次に、ステップ２において、当該複数のシート状細胞培養物について、細胞表面マーカーの発現解析を行った。当該発現解析のために、シート状細胞培養物は、細胞単離され、抗体染色され、そして、ＦＡＣＳ解析に付された。また、ステップ３において、軟骨様組織形成特性を評価した。当該評価のために、シート状細胞培養物の三次元培養、そして、ＣＯＬ２Ａ１及びＣＯＬ１Ａ１の発現量比の解析を行った。次に、ステップ４において、ステップ２及びステップ３の結果を用いて相関解析を行った。当該相関解析によって、特定の細胞表面マーカーを特定の発現強度で発現する細胞集団を含む細胞培養物が軟骨様組織形成特性を有することを確認した。
　以下で、上記ステップ１～４の詳細を説明する。

５－１．ステップ１：細胞培養物の作成
　軟骨組織片（多指症手術時の廃棄組織由来軟骨）を合計で１６種類用意した。これら軟骨組織片のそれぞれに酵素処理（Collagenase Type-1/Worthington CLS-1又はLiberase MNP-S/Roche）を行って、各軟骨組織片から軟骨細胞を単離した。単離した軟骨細胞をせせるカルチャーインサート（UpCell（登録商標）インサート、株式会社セルシード）へ播種した。播種した日を０日とし、３～４日毎に培地交換を行った。播種後、１０～２１日で、各軟骨組織片中の軟骨細胞に由来するシート状細胞培養物が得られた。

５－２．ステップ２：細胞表面マーカーの発現解析
　ステップ１において得られた１６種のシート状細胞培養物それぞれを、PBSで洗浄し、Accutase（Becton Dickinson社）を室温にて15分間反応させた。当該反応後、各シート状細胞培養物を回収し、Accutaseを除去した。当該除去後、0.25mg/ml Collagenase P（Roche）を37℃で30分間反応させて、各シート状細胞培養物中の細胞を分散させた。分散した細胞をPBSで洗浄し、0.2% FBS/5mM EDTA/PBSに懸濁して、懸濁液を得た。各シート状細胞培養物から得られた細胞集団を含む懸濁液について、２４２種の細胞表面マーカーそれぞれに対する抗体をそれぞれ添加し、氷上で30分間反応させた。すなわち、各シート状細胞培養物について、２４２の抗体含有懸濁液が得られた。以下表１では、これら２４２種のうち、後述のステップ４において相関が認められた細胞表面マーカーに対する抗体を示す。

　以下表１において、「蛍光色素」は、各抗体を標識している蛍光色素である。「標的表面抗原」は各抗体の標的とする細胞表面抗原である。「抗体製造者」及び「抗体製造番号」は、各抗体の製造者及び製造番号（カタログ番号）である。抗体製造者に関して、ＢＤはBecton Dickinson社であり、ＳＣはSANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY社であり、ＢＬはBioLegend社である。

　前記氷上での反応後、0.2% FBS/5mM EDTA/PBSにて各細胞集団を洗浄し、フローサイトメーター（BD FACSVerse、Becton Dickinson社）にて各蛍光強度を測定した。解析は、解析ソフトウェアFlowjo（Becton Dickinson社）を用いて実施し、FSC及びSSCによってsingle cell及び生細胞集団をゲートし、その集団内の各蛍光標識抗体に対する蛍光強度の中央値を求め、未染色のサンプルの蛍光強度中央値によって標準化（normalize）した。

５－３．ステップ３（軟骨様組織形成特性の評価）
　以下表２に示される組成を有する基本培地を調製した。

　前記基本培地に対して、以下表３に示される濃度で、ピルビン酸ナトリウム、デキサメタゾン、Ｌ－プロリン、インスリン-トランスフェリン-亜セレン酸塩、及びＴＧＦ－β１を補って、誘導培地を得た。

　得られた誘導培地を入れた低接着6well plateへ、各シート状細胞培養物を球状になるように丸めて入れ、5%CO2、37℃の条件下で7日間培養した。球状組織を回収し、そして、当該球状組織からRNAを抽出し、当該RNAからcDNAを合成した。得られたcDNAから、qPCR法を用いて、COL2A1とCOL1A1との遺伝子発現比を求めた。１６種のシート状細胞培養物それぞれの遺伝子発現比を、図２に示す。なお、図２において、ドナーＩＤ１１（横軸における１１）のシート状細胞培養物のCOL2A1とCOL1A1との遺伝子発現比が１として示されており、その他のシート状細胞培養物の同遺伝子発現比が、ドナーＩＤ１１のシート状細胞培養物の前記遺伝子発現比に対する相対値として示されている。

５－４．ステップ４（相関解析）
　ドナーＩＤ１１のシート状細胞培養物の前記遺伝子発現比は、軟骨様組織形成特性（特には硝子軟骨様組織形成特性）を有することが示されている、全人工関節置換術廃棄組織由来軟骨から作成されるシート状細胞培養物（以下「ＴＫＡ由来シート状細胞培養物」という）（Sato M et al., Combined surgery and chondrocyte cell-sheet transplantation improves clinical and structural outcomes in knee osteoarthritis., NPJ Regen Med, 4, 4, 2019.）と同じであり、すなわち軟骨組織形成特性を有する細胞培養物の基準として利用できる。そこで、ドナーＩＤ１１のCOL2A1/COL1A1遺伝子発現比以上のCOL2A1/COL1A1遺伝子発現比を有するシート状細胞培養物を、軟骨様組織形成特性を有すると判定することができる。

　２４２種類の細胞表面マーカーについてCOL2A1/COL1A1遺伝子発現比との相関の有無を、ピアソンの積率相関分析により検討したところ、表１に示される２０種類の細胞表面マーカーがCOL2A1/COL1A1遺伝子発現比と正又は負の相関を有することが分かった。
　具体的には、ＣＤ１６６、ＣＤ１６５、ＣＤ９９、ＧＤ２、ＳＴＲＯ－１、ＣＤ１０８、ＣＤ１６４、ＣＤ６、ＣＤ１０６、及びＣＤ１０７ｂが、COL2A1/COL1A1遺伝子発現比と負の相関を有することが分かった。従って、これら表面マーカーの発現強度が、閾値以下である細胞集団を含む細胞培養物は、軟骨様組織形成特性を有するものとして利用することができ、軟骨修復に適していることが分かる。
　また、ＣＤ２６、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ４４、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ２０１、ＥＧＦＲ、ＣＤ１４６、ＣＤ１４０ａ、及びＣＤ９０が、COL2A1/COL1A1遺伝子発現比と正の相関を有することが分かった。従って、これら表面マーカーの発現強度が、閾値以上である細胞集団を含む細胞培養物は、軟骨様組織形成特性を有するものとして利用することができ、軟骨修復に適していることが分かる。

　さらに、COL2A1/COL1A1遺伝子発現比と負の相関を有する１０種類の細胞表面マーカーのうち、ＣＤ９９及びＧＤ２が、より強い負の相関を有し（ＣＤ９９：ｒ＝－０．４３０、ＧＤ２：ｒ＝－０．３９７）、且つ、陰性対照と明確な差を有することが分かった。そのため、少なくともＣＤ９９及び／又はＧＤ２の発現強度がこれら細胞表面マーカーそれぞれについての閾値以下である細胞集団を含む細胞培養物は、優れた軟骨様組織形成特性を有するものとして利用することができ、軟骨修復（特には硝子軟骨修復）に特に適していることが分かる。
　また、COL2A1/COL1A1遺伝子発現比と正の相関を有する１０種類の細胞表面マーカーのうち、ＣＤ２６及びＣＤ７３が、より強い正の相関を有し（ＣＤ２６：ｒ＝０．４８５、ＣＤ７３：ｒ＝０．４５６）、且つ、陰性対照と明確な差を有することが分かった。そのため、少なくともＣＤ２６及び／又はＣＤ７３の発現強度が、これら細胞表面マーカーそれぞれについての閾値以上である細胞集団を含む細胞培養物は、優れた軟骨様組織形成特性を有するものとして利用することができ、軟骨修復（特には硝子軟骨修復）に特に適していることが分かる。

　また、COL2A1/COL1A1遺伝子発現比と正又は負の相関を有する上記２０種類の細胞表面マーカーに関して、ＴＫＡ由来シート状細胞培養物のCOL2A1/COL1A1遺伝子発現比以上のCOL2A1/COL1A1遺伝子発現比を有するシート状細胞培養物のうち、COL2A1/COL1A1遺伝子発現比が最も低いシート状細胞培養物のｎＭＦＩを以下の表４に示す。

　例えば正の相関を有する細胞表面マーカーＣＤ２６に関して、ＴＫＡ由来シート状細胞培養物のCOL2A1/COL1A1遺伝子発現比以上のCOL2A1/COL1A1遺伝子発現比を有するシート状細胞培養物のうちCOL2A1/COL1A1遺伝子発現比が最も低いシート状細胞培養物のｎＭＦＩは、上記表４に示されるとおり２．９であった。
　そのため、ＦＩＴＣを結合した抗ＣＤ２６抗体によりシート状細胞培養物中の細胞集団を標識したときに、当該ＦＩＴＣに由来する標準化平均蛍光強度が例えば２．３以上であり、より好ましくは２．６以上であり、さらにより好ましくは２．９以上である場合に、当該シート状細胞培養物は、軟骨様組織形成特性を有するものとして利用することができ、軟骨修復に適していると考えられる。

　同様に、ＰＥを結合した抗ＣＤ１６６抗体によりシート状細胞培養物中の細胞集団を標識したときに、当該ＰＥに由来する標準化平均蛍光強度が例えば２４０以下であり、より好ましくは２２０以下であり、さらにより好ましくは２００以下である場合に、当該シート状細胞培養物は、軟骨様組織形成特性を有するものとして利用することができ、軟骨修復に適していると考えられる。

　同様に、ＢＢ７００を結合した抗ＣＤ１６５抗体によりシート状細胞培養物中の細胞集団を標識したときに、当該ＢＢ７００に由来する標準化平均蛍光強度が１３２以下であり、より好ましくは１２０以下であり、さらにより好ましくは１１０以下である場合に、当該シート状細胞培養物は、軟骨様組織形成特性を有するものとして利用することができ、軟骨修復に適していると考えられる。

　同様に、ＦＩＴＣを結合した抗ＣＤ９９抗体によりシート状細胞培養物中の細胞集団を標識したときに、当該ＦＩＴＣに由来する標準化平均蛍光強度が１．９以下であり、より好ましくは１．８以下であり、さらにより好ましくは１．６以下である場合に、当該シート状細胞培養物は、軟骨様組織形成特性を有するものとして利用することができ、軟骨修復に適していると考えられる。

　同様に、ＢＢ７００を結合した抗ＧＤ２抗体によりシート状細胞培養物中の細胞集団を標識したときに、当該ＢＢ７００に由来する標準化平均蛍光強度が３．６以下であり、より好ましくは３．３以下であり、さらにより好ましくは３．０以下である場合に、当該シート状細胞培養物は、軟骨様組織形成特性を有するものとして利用することができ、軟骨修復に適していると考えられる。

　同様に、ＦＩＴＣを結合した抗ＳＴＲＯ－１抗体によりシート状細胞培養物中の細胞集団を標識したときに、当該ＦＩＴＣに由来する標準化平均蛍光強度が１．４以下であり、より好ましくは１．３以下であり、さらにより好ましくは１．２以下である場合に、当該シート状細胞培養物は、軟骨様組織形成特性を有するものとして利用することができ、軟骨修復に適していると考えられる。

　同様に、ＰＥを結合した抗ＣＤ１０８抗体によりシート状細胞培養物中の細胞集団を標識したときに、当該ＰＥに由来する標準化平均蛍光強度が１．９以下であり、より好ましくは１．８以下であり、さらにより好ましくは１．６以下である場合に、当該シート状細胞培養物は、軟骨様組織形成特性を有するものとして利用することができ、軟骨修復に適していると考えられる。

　同様に、ＰＥを結合した抗ＣＤ１６４抗体によりシート状細胞培養物中の細胞集団を標識したときに、当該ＰＥに由来する標準化平均蛍光強度が３．０以下であり、より好ましくは２．８以下であり、さらにより好ましくは２．５以下である場合に、当該シート状細胞培養物は、軟骨様組織形成特性を有するものとして利用することができ、軟骨修復に適していると考えられる。

　同様に、ＦＩＴＣを結合した抗ＣＤ６抗体によりシート状細胞培養物中の細胞集団を標識したときに、当該ＦＩＴＣに由来する標準化平均蛍光強度が１．４以下であり、より好ましくは１．３以下であり、さらにより好ましくは１．２以下である場合に、当該シート状細胞培養物は、軟骨様組織形成特性を有するものとして利用することができ、軟骨修復に適していると考えられる。

　同様に、ＦＩＴＣを結合した抗ＣＤ１０６抗体によりシート状細胞培養物中の細胞集団を標識したときに、当該ＦＩＴＣに由来する標準化平均蛍光強度が２．４以下であり、より好ましくは２．２以下であり、さらにより好ましくは２．０以下である場合に、当該シート状細胞培養物は、軟骨様組織形成特性を有するものとして利用することができ、軟骨修復に適していると考えられる。

　同様に、ＦＩＴＣを結合した抗ＣＤ１０７ｂ抗体によりシート状細胞培養物中の細胞集団を標識したときに、当該ＦＩＴＣに由来する標準化平均蛍光強度が２．０以下であり、より好ましくは１．９以下であり、さらにより好ましくは１．７以下である場合に、当該シート状細胞培養物は、軟骨様組織形成特性を有するものとして利用することができ、軟骨修復に適していると考えられる。

　同様に、ＦＩＴＣを結合した抗ＣＤ７３抗体によりシート状細胞培養物中の細胞集団を標識したときに、当該ＦＩＴＣに由来する標準化平均蛍光強度が４７以上であり、より好ましくは５３以上であり、さらにより好ましくは５９以上である場合に、当該シート状細胞培養物は、軟骨様組織形成特性を有するものとして利用することができ、軟骨修復に適していると考えられる。

　同様に、ＰＥを結合した抗ＣＤ１０５抗体によりシート状細胞培養物中の細胞集団を標識したときに、当該ＰＥに由来する標準化平均蛍光強度が２１以上であり、より好ましくは２４以上であり、さらにより好ましくは２７以上である場合に、当該シート状細胞培養物は、軟骨様組織形成特性を有するものとして利用することができ、軟骨修復に適していると考えられる。

　同様に、ＦＩＴＣを結合した抗ＣＤ４４抗体によりシート状細胞培養物中の細胞集団を標識したときに、当該ＦＩＴＣに由来する標準化平均蛍光強度が１２８以上であり、より好ましくは１４５以上であり、さらにより好ましくは１６０以上である場合に、当該シート状細胞培養物は、軟骨様組織形成特性を有するものとして利用することができ、軟骨修復に適していると考えられる。

　同様に、ＡＰＣを結合した抗ＣＤ１２０ａ抗体によりシート状細胞培養物中の細胞集団を標識したときに、当該ＡＰＣに由来する標準化平均蛍光強度が２４以上であり、より好ましくは２７以上であり、さらにより好ましくは３０以上である場合に、当該シート状細胞培養物は、軟骨様組織形成特性を有するものとして利用することができ、軟骨修復に適していると考えられる。

　同様に、ＰＥを結合した抗ＣＤ２０１抗体によりシート状細胞培養物中の細胞集団を標識したときに、当該ＰＥに由来する標準化平均蛍光強度が１８以上であり、より好ましくは２０以上であり、さらにより好ましくは２３以上である場合に、当該シート状細胞培養物は、軟骨様組織形成特性を有するものとして利用することができ、軟骨修復に適していると考えられる。

　同様に、ＰＥを結合した抗ＥＧＦＲ抗体によりシート状細胞培養物中の細胞集団を標識したときに、当該ＰＥに由来する標準化平均蛍光強度が３．２以上であり、より好ましくは３．６以上であり、さらにより好ましくは４．０以上である場合に、当該シート状細胞培養物は、軟骨様組織形成特性を有するものとして利用することができ、軟骨修復に適していると考えられる。

　同様に、ＦＩＴＣを結合した抗ＣＤ１４６抗体によりシート状細胞培養物中の細胞集団を標識したときに、当該ＦＩＴＣに由来する標準化平均蛍光強度が１．６以上であり、より好ましくは１．８以上であり、さらにより好ましくは２．０以上である場合に、当該シート状細胞培養物は、軟骨様組織形成特性を有するものとして利用することができ、軟骨修復に適していると考えられる。

　同様に、ＰＥを結合した抗ＣＤ１４０ａ抗体によりシート状細胞培養物中の細胞集団を標識したときに、当該ＰＥに由来する標準化平均蛍光強度が５．６以上であり、より好ましくは６．４以上であり、さらにより好ましくは７．０以上である場合に、当該シート状細胞培養物は、軟骨様組織形成特性を有するものとして利用することができ、軟骨修復に適していると考えられる。

　同様に、ＡＰＣを結合した抗ＣＤ９０抗体によりシート状細胞培養物中の細胞集団を標識したときに、当該ＡＰＣに由来する標準化平均蛍光強度が８００以上であり、より好ましくは９００以上であり、さらにより好ましくは１０００以上である場合に、当該シート状細胞培養物は、軟骨様組織形成特性を有するものとして利用することができ、軟骨修復に適していると考えられる。

６．実施例２

　上記「５．実施例１」において言及された細胞表面マーカーのうちＣＤ４４について、軟骨様組織形成特性を評価するために有用であることを、以下で説明するとおりにして確認した。

　すなわち、ステップ２－１において、複数のシート状細胞培養物を作成した。次に、ステップ２－２において、当該複数のシート状細胞培養物について、ＣＤ４４の発現解析を行った。加えて、ステップ２－３において、複数のシート状細胞培養について、三次元培養を行い、そして、染色処理を行うことで軟骨様組織形成特性を確認した。
　以下で、これらのステップの詳細及び得られた結果について説明する。

６－１．細胞培養物の作成（ステップ２－１）
　上記「５．実施例１」のステップ１において説明したとおりの手順により、３種類の軟骨組織片のそれぞれから、各軟骨組織片中の軟骨細胞に由来するシート状細胞培養物を得た。得られた３つのシート状細胞培養物を以下でそれぞれ「試料Ｎｏ．１」、「試料Ｎｏ．２」、及び「試料Ｎｏ．３」ともいう。

６－２．ＣＤ４４の発現解析（ステップ２－２）
　ステップ２－１において得られた３種のシート状細胞培養物それぞれについて、以下の細胞分散処理及びＦＣＭ測定によりＣＤ４４の発現の程度を解析した。

（１）細胞分散処理

＜試薬＞
20%FBS DMEM-F12/AB/AA（以下「AA(+)培地」ともいう）
DPBS(-)（gibco：14190-250)
Liberase^TM TL Research Grade（sigma：54010200001)（以下「Liberase TL」ともいう
注射水（富士フイルム和光純薬：161-08247）
5.0g/l-Trypsin/5.3mmol/l-EDTA Solution（ナカライテスク：35556-44)（以下「Trypsin/EDTA」ともいう）
0.4% Trypan Blue Stain (Invitrogen, T10282)
STEM-CELLBANKER (ZENOAQ RESOURCE, CB045)（以下「cell banker」ともいう）

＜手順＞

<0.65 Units/mL Liberase TL調製>
1.Liberase TLに注射水 2 mLを添加し、混合する(以下、得られた混合物を「13 Units/mL Liberase TL」ともいう)
2.50 mLチューブにAA(+)培地 5.7 mL入れる
3.13 Units/mL Liberase TL 300 μLを添加し、混合する(以下、得られた混合物を「0.65 Units/mL Liberase TL」ともいう)

<細胞分散>
1.14日間培養した細胞シートを適量数用意する
2.6well-plateにDPBS(+)を3 ml/wellずつ分注する
3.温度応答性インサート(CellSeed：CS6301)を2.に移す
4.Trypsin/EDTA 10 mLを50 mLチューブに入れ、37℃に加温する
5.インサートの培地を除去し、DPBS(-) 2 mL/wellでwash
6.シートを剥離し、4のチューブに入れる（4 sheet/tubeまで可)
7.37℃のwater bathに入れ、incubate 30min (適宜チューブを振る)
8.AA(+)培地  10 mL添加し、酵素処理を止める
9.350 ×g  5 min  at  25℃で遠心する
10.上清を除去
11.0.65 Units/mL Liberase TL 3 mLを入れる
12.37℃のwater bathに入れ、incubate 30min(適宜チューブを振る)
以下13.～16.は、細胞の塊がなくなった時点で、17.へ
13.細胞の塊が残っていたら、0.65 Units/mL Liberase TL 1 mLを入れる
14.37℃のwater bathに入れ、incubate 15 min(適宜チューブを振る)
15.細胞の塊が残っていたら、0.65 Units/mL Liberase TL 1 mLを入れる
16.37℃のwater bathに入れ、incubate 15 min～ (適宜チューブを振る。細胞の塊がなくなるまで。)
17.細胞の塊がなくなったら、残りの0.65 Units/mL Liberase TL を入れる
18.40 μmセルストレイナーを通し、新しい50 mLチューブに回収する
19.AA(+)培地 5 mLで 50 mLチューブを共洗いし、18.の40 μmセルストレイナーを通し、50 mLチューブに回収する
20.350 ×g  5 min  at  25℃で遠心する
21.上清を除去する
22.AA(+)培地に懸濁する
23.細胞数をカウントする
24.350×g  5 min  at  25℃で遠心する
25.上清を除去する
→以下のFCM測定を行う
→すぐにFCM測定しないときは以下の方法で保存する
26.cell bankerに懸濁する
27.クライオチューブに分注する
28.-80℃凍結保存する
29.翌日以降、-150℃に移す、保存する

（２）FCM測定

＜試薬＞
DPBS(-)（gibco：14190-250)
0.4% Trypan Blue Stain (Invitrogen, T10282)

＜抗体＞
NEG.CTRL IgG1(mouse)-FITC 100t CE（Beckman&Coulter:A07795）（以下「IgG1-FITC」ともいう）
MOUSE IgG1-APC, 100t CE（Beckman&Coulter:IM2475）（以下「IgG1-APC」ともいう）
Hu CD44 FITC G44-26 100Tst(BD Pharmingen:559596) （以下「CD44-FITC」ともいう）

＜手順＞
1.細胞懸濁液を生細胞：１×10⁵～2×10⁵cells/1.5 mL tubeに2本分注する
2.PBS(-) 1 mLを添加し、懸濁する
3.350 ×g  3min at 4℃で遠心する
4.上清を除去する
5.PBS(-) 1 mLを添加し、懸濁する
6.350 ×g  3min at 4℃で遠心する
7.上清を除去する
8.PBS(-)　50μLを添加して懸濁する
9.抗体　5 μL/tube ずつ添加し、懸濁する
チューブ１：IgG1-FITC・IgG1-APC
チューブ2：CD44-FITC
10.遮光し4℃で30～60分インキュベートする
11.PBS(-) 1 mLを添加し、懸濁する
12.350 ×g  3min at 4℃で遠心する
13.上清を除去する
14.PBS(-) 0.3 mLを添加し、懸濁する
15.セルストレイナーつき5 mLチューブに添加する
16.BD FACSVerseで測定及び解析する

　当該測定及び解析は、BD FACSuite Software Application（Becton Dickinson社）を用いて行われた。具体的には、10000カウントとし、コントロール(IgG1-FITC)を1％としたときのCD44の％を求めた。ここで、「CD44の％」は、コントロールを１％としたときの、抗CD44抗体により染色された細胞の割合を意味する。なお、オーバーレイした状態でヒストグラムの範囲を、コントロール(IgG1-FITC)が１％になるように設定しており、このときのカウント(イベント)の数値は95～104の範囲である。

６－３．三次元培養及び染色処理（ステップ２－３）
　ステップ２－１において得られた３種のシート状細胞培養物それぞれについて、以下の三次元培養処理及び染色処理を行った。

（１）三次元培養処理
　上記「５．実施例１」のステップ３において説明したとおりの誘導培地を入れた低接着6well plateへ、各シート状細胞培養物を球状になるように丸めて入れ、5%CO2、37℃の条件下で7日間培養した。当該培養後、当該球状組織を回収した。

（２）染色処理
　当該球状組織に対して、以下のサフラニンＯ染色処理を行った。

＜試薬＞
マイヤーヘマトキシリン溶液（富士フイルム和光純薬, 131-09665）
0.08% Fast Green（調製試薬）
1% 酢酸水（調製試薬）
0.1% サフラニンO（武藤化学, 42262）
100% エタノール（富士フイルム和光純薬, 054-00461）
キシレン（富士フイルム和光純薬, 241-00096）
マリノール 750cps（武藤化学, 20091）

＜1%酢酸調製手順＞
1.酢酸と精製水を1:99となるように染色バットにて混ぜ合わせる

＜染色手順＞
1.スライドガラスを10分間水洗する。
2.顕微鏡で染まり具合を確認しながら、ヘマトキシリンで染色（約10秒間）。
3.スライドガラスを5分間水洗する。
4.0.08% Fast Greenに5分間浸ける。
5.1% 酢酸水に10秒間浸ける。
6.0.1% サフラニンOに5分間浸ける。
7.100% エタノール入りバットを3つ用意し、１バット約10秒間揺らしながら浸す操作を３回行う
8.キシレン入りバットを3つ用意し、１バット約10秒間揺らしながら浸す操作を３回行う。
9.カバーガラスにマリノールを2滴ほど乗せ、キシレンを混ぜ合わせる。
10.ゆっくりスライドを被せる。
11.顕微鏡で観察し、撮影する。

６－４．結果及び考察
　上記ステップ２－２において得られた発現解析の結果を以下の表５に示す。以下の表５において単位は％である。試料Ｎｏ．２及び試料Ｎｏ．３のシート状細胞培養物のＣＤ４４の発現は、試料Ｎｏ．１における発現よりも強い。

　また、上記ステップ２－３において得られた染色結果を図３に示す。

　図３に示されるとおり、試料Ｎｏ．２及びＮｏ．３の球状組織は、試料Ｎｏ．１の球状組織よりも、サフラニンＯによってより強く染色されている。球状組織におけるサフラニンＯによる染色の程度がより強いことは、軟骨様組織形成特性に優れていることを示す。そのため、図３に示される結果から、試料Ｎｏ．２及びＮｏ．３のシート状細胞培養物は、試料Ｎｏ．１よりも軟骨様組織形成特性に優れている。

　表３に示される結果と図３に示される結果より、シート状細胞培養物におけるＣＤ４４の発現がより強いほど軟骨様組織形成特性に優れていることが分かる。また、ＣＤ４４は、シート状細胞培養物の軟骨様組織形成特性を評価するための指標として有用であることも確認できる。
　特に、上記「６－２．ＣＤ４４の発現解析（ステップ２－２）」において説明した測定及び解析手法の観点から、コントロール(IgG1-FITC)を1％としたときのCD44の％が、好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上である場合に、当該シート状細胞培養物は、特に優れた軟骨様組織形成特性を有するものとして利用することができ、軟骨修復に適していると考えられる。

６－５．ＣＯＬ２及びＣＯＬ１の発現量比に基づく評価

　シート状細胞培養物のＣＤ４４の発現の程度が高い場合に当該シート状細胞培養物の軟骨様組織形成特性が優れていることは、以下のとおり、ＣＯＬ２とＣＯＬ１との遺伝子発現比及び染色処理からも確認できる。

　まず、上記「５．実施例１」のステップ１において説明したとおりの手順により、１種類の軟骨組織片から、当該軟骨組織片中の軟骨細胞に由来するシート状細胞培養物を得た。

　得られたシート状細胞培養物は、ＣＯＬ２がほとんど発現しておらず且つＣＯＬ１の発現の程度が大きかった。すなわち、当該シート状細胞培養物は、２型コラーゲン陰性であり且つ１型コラーゲン陽性であった。このようなシート状細胞培養物は、国際公開第２０１８／１５４８１３号において記載されたとおり、優れた軟骨様組織形成特性を有する。

　当該シート状細胞培養物について、上記ステップ２－２に記載したとおりにＣＤ４４の発現解析を行った。その結果、当該シート状細胞培養物におけるＣＤ４４の発現は９４．９５であり、試料Ｎｏ．２及びＮｏ．３と同程度であった。

　以上の結果より、シート状細胞培養物のＣＤ４４の発現の程度が高い場合に当該シート状細胞培養物の軟骨様組織形成特性が優れていることが確認できた。

Claims

　ＣＤ１６６、ＣＤ１６５、ＣＤ９９、ＧＤ２、ＳＴＲＯ－１、ＣＤ１０８、ＣＤ１６４、ＣＤ６、ＣＤ１０６、及びＣＤ１０７ｂからなる群から選ばれる少なくとも一つの細胞表面マーカーの発現強度が、各細胞表面マーカーについての閾値以下であり、且つ／又は
　ＣＤ２６、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ４４、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ２０１、ＥＧＦＲ、ＣＤ１４６、ＣＤ１４０ａ、及びＣＤ９０からなる群から選ばれる少なくとも一つの細胞表面マーカーの発現強度が、各細胞表面マーカーについての閾値以上である
　細胞集団を含む、
　軟骨様組織形成特性を有する細胞培養物。
　前記細胞表面マーカーのうち、少なくともＣＤ９９及び／又はＧＤ２の発現強度が、これら細胞表面マーカーそれぞれについての閾値以下であり、且つ／又は、
　前記細胞表面マーカーのうち、少なくともＣＤ２６、ＣＤ７３、及びＣＤ４４のうちのいずれか１つ、２つ、又は３つの発現強度が、これら細胞表面マーカーそれぞれについての閾値以上である、
　請求項１に記載の細胞培養物。
　前記発現強度が、前記細胞集団をフローサイトメトリーにより解析して測定される標準化平均蛍光強度である、請求項１又は２に記載の細胞培養物。
　前記細胞集団をフローサイトメトリーにより解析したときに測定される標準化平均蛍光強度が、以下の条件１～１０の少なくとも一つを満たし、且つ／又は、以下の条件１１～２０の少なくとも一つを満たす、請求項１～３のいずれか一項に記載の細胞培養物。
　条件１：ＰＥを結合した抗ＣＤ１６６抗体により前記細胞集団を標識したときに、当該ＰＥに由来する標準化平均蛍光強度が２４０以下である、
　条件２：ＢＢ７００を結合した抗ＣＤ１６５抗体により前記細胞集団を標識したときに、当該ＢＢ７００に由来する標準化平均蛍光強度が１３２以下である、
　条件３：ＦＩＴＣを結合した抗ＣＤ９９抗体により前記細胞集団を標識したときに、当該ＦＩＴＣに由来する標準化平均蛍光強度が１．９以下である、
　条件４：ＢＢ７００を結合した抗ＧＤ２抗体により前記細胞集団を標識したときに、当該ＢＢ７００に由来する標準化平均蛍光強度が３．６以下である、
　条件５：ＦＩＴＣを結合した抗ＳＴＲＯ－１抗体により前記細胞集団を標識したときに、当該ＦＩＴＣに由来する標準化平均蛍光強度が１．４以下である、
　条件６：ＰＥを結合した抗ＣＤ１０８抗体により前記細胞集団を標識したときに、当該ＰＥに由来する標準化平均蛍光強度が１．９以下である、
　条件７：ＰＥを結合した抗ＣＤ１６４抗体により前記細胞集団を標識したときに、当該ＰＥに由来する標準化平均蛍光強度が３．０以下である、
　条件８：ＦＩＴＣを結合した抗ＣＤ６抗体により前記細胞集団を標識したときに、当該ＦＩＴＣに由来する標準化平均蛍光強度が１．４以下である、
　条件９：ＦＩＴＣを結合した抗ＣＤ１０６抗体により前記細胞集団を標識したときに、当該ＦＩＴＣに由来する標準化平均蛍光強度が２．４以下である、
　条件１０：ＦＩＴＣを結合した抗ＣＤ１０７ｂ抗体により前記細胞集団を標識したときに、当該ＦＩＴＣに由来する標準化平均蛍光強度が２．０以下である、
　条件１１：ＦＩＴＣを結合した抗ＣＤ２６抗体により前記細胞集団を標識したときに、当該ＦＩＴＣに由来する標準化平均蛍光強度が２．３以上である、
　条件１２：ＦＩＴＣを結合した抗ＣＤ７３抗体により前記細胞集団を標識したときに、当該ＦＩＴＣに由来する標準化平均蛍光強度が４７以上である、
　条件１３：ＰＥを結合した抗ＣＤ１０５抗体により前記細胞集団を標識したときに、当該ＰＥに由来する標準化平均蛍光強度が２１以上である、
　条件１４：ＦＩＴＣを結合した抗ＣＤ４４抗体により前記細胞集団を標識したときに、当該ＦＩＴＣに由来する標準化平均蛍光強度が１２８以上である、
　条件１５：ＡＰＣを結合した抗ＣＤ１２０ａ抗体により前記細胞集団を標識したときに、当該ＡＰＣに由来する標準化平均蛍光強度が２４以上である、
　条件１６：ＰＥを結合した抗ＣＤ２０１抗体により前記細胞集団を標識したときに、当該ＰＥに由来する標準化平均蛍光強度が１８以上である、
　条件１７：ＰＥを結合した抗ＥＧＦＲ抗体により前記細胞集団を標識したときに、当該ＰＥに由来する標準化平均蛍光強度が３．２以上である、
　条件１８：ＦＩＴＣを結合した抗ＣＤ１４６抗体により前記細胞集団を標識したときに、当該ＦＩＴＣに由来する標準化平均蛍光強度が１．６以上である、
　条件１９：ＰＥを結合した抗ＣＤ１４０ａ抗体により前記細胞集団を標識したときに、当該ＰＥに由来する標準化平均蛍光強度が５．６以上である、
　条件２０：ＡＰＣを結合した抗ＣＤ９０抗体により前記細胞集団を標識したときに、当該ＡＰＣに由来する標準化平均蛍光強度が８００以上である。
　前記細胞集団をフローサイトメトリーにより解析したときに測定される標準化平均蛍光強度が、前記条件３及び／又は４を満たし、且つ／又は、前記条件１１、１２、及び１４のうちの１つ、２つ、又は３つを満たす、請求項４に記載の細胞培養物。
　前記細胞培養物がシート状である、請求項１～５のいずれか一項に記載の細胞培養物。
　前記細胞培養物が、軟骨組織に由来するものである、請求項１～６のいずれか一項に記載の細胞培養物。
　前記細胞培養物が、滑膜に由来するものでない、請求項１～７のいずれか一項に記載の細胞培養物。
　前記細胞培養物が、幹細胞に由来するものである、請求項１～６のいずれか一項に記載の細胞培養物。
　前記幹細胞が、多能性幹細胞、胚性幹細胞、又は体性幹細胞を含む、請求項９に記載の細胞培養物。
　前記細胞培養物が、軟骨組織の修復のために用いられるものである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の細胞培養物。
　前記細胞培養物が、膝軟骨組織の修復のために用いられるものである、請求項１～１１のいずれか一項に記載の培養物。
　前記細胞培養物が、硝子軟骨様組織形成特性を有する、請求項１～１２のいずれか一項に記載の細胞培養物。
　前記細胞培養物が、刺激応答性ポリマーが固定化された面を有する基材を含む培地中で細胞を培養することによって得られたものである、請求項１～１３のいずれか一項に記載の細胞培養物。
　前記細胞培養物が、刺激応答性ポリマーが固定化された面を有する多孔膜の当該面上で細胞を培養して得られたものである、請求項１～１３のいずれか一項に記載の細胞培養物。
　前記細胞培養物が、培地中で細胞を培養して得られたものである、請求項１～１５のいずれか一項に記載の細胞培養物。
　前記細胞培養物を得るための培養に用いられた原料細胞が、軟骨組織由来細胞であり、
　前記軟骨組織由来細胞が、ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２中で、軟骨組織中の細胞を少なくとも２日培養して得られた細胞である、
　請求項１～１６のいずれか一項に記載の細胞培養物。
　前記細胞培養物を得るための培養に用いられた原料細胞が、
　軟骨組織中の細胞を培地中で培養してコンフルエントにする第一培養工程、及び、
　前記第一培養工程においてコンフルエントとなった細胞集団を互いから解離する解離工程、
　前記解離工程において解離された細胞集団をさらに、前記培地と同じ新鮮培地中で培養する第二培養工程
　を含む原料細胞調製方法によって調製されたものである、
　請求項１～１７のいずれか一項に記載の培養物。
　細胞培養物の評価方法であって、
　細胞培養物に含まれる細胞集団について、
　ＣＤ１６６、ＣＤ１６５、ＣＤ９９、ＧＤ２、ＳＴＲＯ－１、ＣＤ１０８、ＣＤ１６４、ＣＤ６、ＣＤ１０６、及びＣＤ１０７ｂからなる群から選ばれる少なくとも一つの細胞表面マーカーの発現強度が、表面マーカーそれぞれについての閾値以下であるか、及び／又は
　ＣＤ２６、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ４４、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ２０１、ＥＧＦＲ、ＣＤ１４６、ＣＤ１４０ａ、及びＣＤ９０からなる群から選ばれる少なくとも一つの細胞表面マーカーの発現強度が、表面マーカーそれぞれについての閾値以上であるか
　を判定する判定工程を含む、
　前記評価方法。
　前記細胞集団をフローサイトメトリーにより解析する解析工程をさらに含み、
　前記判定工程における判定が、前記解析工程における解析結果に基づき行われる、
　請求項１９に記載の評価方法。
　前記判定工程において、
　ＣＤ１６６、ＣＤ１６５、ＣＤ９９、ＧＤ２、ＳＴＲＯ－１、ＣＤ１０８、ＣＤ１６４、ＣＤ６、ＣＤ１０６、及びＣＤ１０７ｂからなる群から選ばれる少なくとも一つの細胞表面マーカーの発現強度が、表面マーカーそれぞれについての閾値以下であり、且つ／又は
　ＣＤ２６、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ４４、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ２０１、ＥＧＦＲ、ＣＤ１４６、ＣＤ１４０ａ、及びＣＤ９０からなる群から選ばれる少なくとも一つの細胞表面マーカーの発現強度が、細胞表面マーカーそれぞれについての閾値以上である
　場合に、前記シート状細胞培養物が軟骨様組織形成特性を有すると判定する、
　請求項１９又は２０に記載の評価方法。
　細胞を培養して細胞培養物を得る培養工程を含み、
　前記培養工程において、
　前記細胞培養物に含まれる細胞集団に関して、
　ＣＤ１６６、ＣＤ１６５、ＣＤ９９、ＧＤ２、ＳＴＲＯ－１、ＣＤ１０８、ＣＤ１６４、ＣＤ６、ＣＤ１０６、及びＣＤ１０７ｂからなる群から選ばれる少なくとも一つの細胞表面マーカーの発現強度が、細胞表面マーカーそれぞれについての閾値以下であり、且つ／又は
　ＣＤ２６、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ４４、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ２０１、ＥＧＦＲ、ＣＤ１４６、ＣＤ１４０ａ、及びＣＤ９０からなる群から選ばれる少なくとも一つの細胞表面マーカーの発現強度が、細胞表面マーカーそれぞれについての閾値以上である
　となるように培養が行われる、
　軟骨様組織形成特性を有する細胞培養物の製造方法。
　前記細胞培養物に含まれる細胞集団をフローサイトメトリーにより解析する解析工程、及び
　前記解析工程において、
　ＣＤ１６６、ＣＤ１６５、ＣＤ９９、ＧＤ２、ＳＴＲＯ－１、ＣＤ１０８、ＣＤ１６４、ＣＤ６、ＣＤ１０６、及びＣＤ１０７ｂからなる群から選ばれる少なくとも一つの細胞表面マーカーの発現強度が、表面マーカーそれぞれについての閾値以下であり、且つ／又は
　ＣＤ２６、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ４４、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ２０１、ＥＧＦＲ、ＣＤ１４６、ＣＤ１４０ａ、及びＣＤ９０からなる群から選ばれる少なくとも一つの細胞表面マーカーの発現強度が、表面マーカーそれぞれについての閾値以上である
　場合に、前記細胞培養物が軟骨様組織形成特性を有すると判定する判定工程、
　をさらに含む、請求項２２に記載の製造方法。
　ＣＤ１６６、ＣＤ１６５、ＣＤ９９、ＧＤ２、ＳＴＲＯ－１、ＣＤ１０８、ＣＤ１６４、ＣＤ６、ＣＤ１０６、及びＣＤ１０７ｂからなる群から選ばれる少なくとも一つの細胞表面マーカー、及び／又は、
　ＣＤ２６、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ４４、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ２０１、ＥＧＦＲ、ＣＤ１４６、ＣＤ１４０ａ、及びＣＤ９０からなる群から選ばれる少なくとも一つの細胞表面マーカー
　を含む軟骨様組織形成特性評価用マーカー。