JP2011067175A - 間葉系幹細胞の培養方法 - Google Patents
間葉系幹細胞の培養方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2011067175A JP2011067175A JP2009222981A JP2009222981A JP2011067175A JP 2011067175 A JP2011067175 A JP 2011067175A JP 2009222981 A JP2009222981 A JP 2009222981A JP 2009222981 A JP2009222981 A JP 2009222981A JP 2011067175 A JP2011067175 A JP 2011067175A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- culture
- mesenchymal stem
- stem cells
- cells
- specific gravity
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
- C12N5/0663—Bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/50—Soluble polymers, e.g. polyethyleneglycol [PEG]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
【解決手段】骨髄液、臍帯血、末梢血、滑膜及び羊膜の一者以上を、容器内に満たされた37℃において比重が1.06〜1.10g/mlである水を主成分とする液体培地に播種し、その容器の天井面で、37±2℃の温度で培養を行うことによって間葉系幹細胞を培養する。その液体培地の比重は、ポリビニルピロリドンで被覆したシリカ微細粉末,ショ糖とエピクロロヒドリンとの水溶性共重合体,トリヨード芳香環を含む水溶性化合物から選ばれる少なくとも一つを用いて調節されていることが好ましい。
【選択図】なし
Description
初代培養にて得られた間葉系幹細胞は増殖・分裂を繰り返すことにより一定数以上に到達するが、その過程においては一様に細胞の老化現象が見られる。老化が進むと細胞の組織への分化能が低下していくことが知られている。移植細胞の分化能が低いと、組織再生能力が低下してしまい、治療効果が低下してしまう。初期に得られた細胞数が少ないと、余計に増殖・分裂させる必要があるため、一定数以上に到達した際に余計に老化が進んでしまい、リスクとなってしまう。
また、老化により、増殖能力が低下することも知られている。初代培養で得られた細胞数が少ないことで、余計に増殖分裂させなくてはいけないにも拘らず、更に増殖能力が低下すると培養期間がかなり長期化してしまう。将来的に細胞移植による治療を成り立たせるためには、コストにも考慮する必要がある。培養期間が長くなると、治療に掛かるコストが嵩むことになってしまう。
また、初代培養の効率を向上させると、患者から採取する骨髄の量を減らすことができ、患者への侵襲や負担の軽減につながるばかりでなく、細胞が多く得られるため、治療に余った細胞を凍結保存し、将来の疾患に備えることが可能になる。
また、接着阻害因子となる血球細胞を多量に含んだり、間葉系幹細胞の存在量が少ない等の理由により培養が困難とされている顎骨骨髄や臍帯血や末梢血由来の間葉系幹細胞の培養に有用となる。顎骨骨髄からの培養は歯科完結型の間葉系幹細胞治療に大きな意義を持ち、また、多くの場合、医療廃棄物として廃棄されている臍帯血を宝の山に変えることが可能となる。
<骨髄液の準備>
5歳雌HBDイヌ腸骨より吸引して骨髄を採取した。採取した骨髄中の白血球(WBC)濃度、及び白血球(RBC)濃度を自動血球計数器 (商品名:MEK-5150セルタック 日本光電社製)を用いて測定したところ、採取した骨髄中の白血球(WBC)数は12.92×104 cells/μl、赤血球(RBC)数は556×104 cells/μlであった。WBC数は、間葉系幹細胞を含む母集団として、骨髄由来の有核細胞(NC)数として初代培養時の播種に用いた。また、本発明に係る初代培養法によって得られた細胞の骨分化能をアリザリンレッドS染色にて確認したところ、赤く染色した。
Percoll PLUS(商品名、GEヘルスケア社製)を用いてその比重を表1に示す値に調整したαMEM培地(いずれの培地も1%ペニシリンストレプトマイシン、10%ウシ胎児血清含有、アスコルビン酸ナトリウム50μg/ml添加)を培養には用いた。なお、Percoll PLUSを含まない通常のαMEM培地(いずれの培地も1%ペニシリンストレプトマイシン、10%ウシ胎児血清含有、アスコルビン酸ナトリウム50μg/ml添加)をコントロール培養液とした。
手順1:上記の如く調整した培養液で満たされた培養フラスコ(商品名:Lab-Tekスライドフラスコ ナルジェ ヌンク インターナショナル株式会社、培養面積10cm2)中に、有核細胞500×104 cellsの骨髄を播種し、培養フラスコの通常培養に使用される面を天井側にして37℃の温度にて静置培養した。
手順2:培養開始から3日間の静置培養の後、培養フラスコ中の培地を除去した。培養フラスコを逆さまにした後(天井面を下面にして通常に培養に使用される面を床側にした後)コントロール培養液を2ml加えて更に2日間培養した。その後、培養液をすべて除去し、10mlのリン酸緩衝液にて培養面を5回洗浄した。十分な洗浄の後、培養面への接着細胞を1mlのトリプシン-EDTAで剥離し、その数をコールターカウンター(商品名:Z1S型 ベックマンコールター社)を用いて計測した。結果を表1に纏めて示す。
なお、手順1においてコントロール培養液を用い、培養フラスコの通常培養に使用される面を床側にして37℃の温度にて静置培養した後に手順2を施したものをコントロール培養とした。
また、本発明に係る培養法によって得られた細胞を骨,軟骨,脂肪分化培養したところ、骨分化能はアリザリンレッドS染色、軟骨分化能はアルシアンブルー染色、脂肪分化能はオイルレッド-O染色にてそれぞれ確認され、本発明方法によって間葉系幹細胞が確実に得られていたことが確認できた。
<骨髄液の準備>
5歳雌HBDイヌ下顎大臼歯根分岐部下の顎骨より吸引して骨髄を採取した。採取した骨髄中の白血球(WBC)濃度、及び赤血球(RBC)濃度を自動血球計数機(商品名:MEK-5150セルタック 日本光電社製)を用いて測定したところ、採取した骨髄中のWBC数は64×102 cells/μl、RBC数は423×104 cells/μlであった。WBC数は、間葉系幹細胞を含む母集団として、骨髄由来の有核細胞(NC)数として初代培養時の播種に用いた。
Percoll PLUS (商品名、GEヘルスケア社製)を用いてその比重を1.075に調製したαMEM培地(1%ペニシリンストレプトマイシン、10%ウシ胎児血清含有、アスコルビン酸ナトリウム50μg/ml添加)を培養には用いた。なお、Percoll PLUSを含まない通常のαMEM培地(1%ペニシリンストレプトマイシン、10%ウシ胎児血清含有、アスコルビン酸ナトリウム50μg/ml添加)をコントロール培養液とした。
手順1:上記の如く調製した培養液約20mlで満たされた培養フラスコ(商品名:Lab-Tekスライドフラスコ ナルジェ ヌンク インターナショナル株式会社、培養面積10cm2)中に、有核細胞100×104 cellsの骨髄を播種し、培養フラスコの培養面を天井側にして37℃の温度にて静置培養した。
手順2:培養開始から7日間の静置培養の後、培養フラスコ中の培地を除去した。培養フラスコを逆さまにした後(培養面を床側にした後)コントロール培養液で通常の培養を行った(培養液約2ml)。その後、1週間に3回の培地交換を実施して通常の方法で継続培養した。培養容器の培養面が接着細胞の増殖によりコンフルエントに達したとき、培養液をすべて除去し、0.4mlのトリプシン-EDTAで剥離して継代培養を継続した。各継代時、コールターカウンター(商品名:Z1S型 ベックマンコールター社製)を用いて細胞数を計測したところ初代培養では培養フラスコ1個当たり33.7×104 個、更にこれを継代培養して3継代後には培養フラスコ1個当たり4×107 個の間葉系細胞を得ることができた。
比重を調製していないコントロール培養液約20mlで満たされた培養フラスコ(商品名:Lab-Tekスライドフラスコ ナルジェ ヌンク インターナショナル株式会社、培養面積10cm2)中に、有核細胞100×104 cellsの骨髄を播種し、培養フラスコの培養面を天井側にして37℃の温度にて静置培養した。しかしながら、コントロール培養からは増殖良好な間葉系幹細胞を得ることができなかった。
Claims (2)
- 骨髄液、臍帯血、末梢血、滑膜及び羊膜の一者以上を、容器内に満たされた37℃において比重が1.06〜1.10g/mlである水を主成分とする液体培地に播種し、その容器の天井面で、37±2℃の温度で培養を行うことを特徴とする間葉系幹細胞の培養方法。
- 液体培地の比重が、ポリビニルピロリドンで被覆したシリカ微細粉末,ショ糖とエピクロロヒドリンとの水溶性共重合体,トリヨード芳香環を含む水溶性化合物から選ばれる少なくとも一つを用いて調節されている請求項1に記載の間葉系幹細胞の培養方法。
Priority Applications (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2009222981A JP5678360B2 (ja) | 2009-09-28 | 2009-09-28 | 間葉系幹細胞の培養方法 |
EP10010934.7A EP2308964B1 (en) | 2009-09-28 | 2010-09-27 | Culturing method of mesenchymal stem cell |
US12/892,223 US8039256B2 (en) | 2009-09-28 | 2010-09-28 | Culturing method of mesenchymal stem cell |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2009222981A JP5678360B2 (ja) | 2009-09-28 | 2009-09-28 | 間葉系幹細胞の培養方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2011067175A true JP2011067175A (ja) | 2011-04-07 |
JP5678360B2 JP5678360B2 (ja) | 2015-03-04 |
Family
ID=43086858
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2009222981A Active JP5678360B2 (ja) | 2009-09-28 | 2009-09-28 | 間葉系幹細胞の培養方法 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US8039256B2 (ja) |
EP (1) | EP2308964B1 (ja) |
JP (1) | JP5678360B2 (ja) |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2015137419A1 (ja) * | 2014-03-11 | 2015-09-17 | 北海道公立大学法人札幌医科大学 | 間葉系幹細胞の賦活化剤、賦活化された間葉系幹細胞およびその製造方法 |
WO2016042965A1 (ja) * | 2014-09-17 | 2016-03-24 | 国立大学法人山口大学 | 間葉系幹細胞の活性評価方法、間葉系幹細胞の培養方法、肝機能障害用治療剤の製造方法、および肝機能障害用治療剤 |
JP2017526619A (ja) * | 2014-06-10 | 2017-09-14 | メゾブラスト・インターナショナル・エスアーエールエル | 免疫疾患の治療 |
WO2018030448A1 (ja) * | 2016-08-12 | 2018-02-15 | 国立大学法人山口大学 | 細胞培養用培地、及び細胞培養方法 |
WO2022250035A1 (ja) | 2021-05-28 | 2022-12-01 | ダイセン・メンブレン・システムズ株式会社 | 細胞外小胞の分離精製方法 |
Families Citing this family (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8372437B2 (en) | 2006-08-17 | 2013-02-12 | Mimedx Group, Inc. | Placental tissue grafts |
EP2542666A4 (en) * | 2010-03-02 | 2014-05-07 | Univ Singapore | CULTURE ADDITIVES FOR PROMOTING A STEM CELL PROGRAMMING AND DIFFERENTIATION REACTION |
SG192862A1 (en) | 2011-03-11 | 2013-09-30 | Univ Singapore | Pericyte progenitors from peripheral blood |
US11744858B2 (en) * | 2015-03-18 | 2023-09-05 | Foundation For Biomedical Research And Innovation At Kobe | Medicine for treatment and/or prevention of ischemic diseases, method for improving angiogenesis-promoting activity of cells, or method for producing medicine |
US10384207B2 (en) | 2015-07-21 | 2019-08-20 | Neuro Probe Incorporated | Assay apparatus and methods |
CN107306936B (zh) * | 2017-04-10 | 2021-03-02 | 澳门大学 | 一种常温条件下保存运输干细胞的方法及其所使用的基质 |
GB202113674D0 (en) | 2021-09-24 | 2021-11-10 | Reflection Therapeutics Ltd | Targeted cell therapies |
GB202113673D0 (en) | 2021-09-24 | 2021-11-10 | Reflection Therapeutics Ltd | Targeted cell therapies |
CN114317423B (zh) * | 2021-12-16 | 2023-11-17 | 北京唐颐惠康生物医学技术有限公司 | 一种间充质干细胞培养基和基于doe实验设计的培养基优化方法 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2004129549A (ja) * | 2002-10-09 | 2004-04-30 | Yasuo Kitagawa | 脂肪由来細胞群からの間葉系幹細胞の選択的増殖方法 |
JP2006129734A (ja) * | 2004-11-02 | 2006-05-25 | Olympus Corp | 間葉系幹細胞の培養方法 |
JP2006217845A (ja) * | 2005-02-09 | 2006-08-24 | Hitachi Medical Corp | 付着性細胞の培養方法および培養装置 |
JP2007175008A (ja) * | 2005-12-28 | 2007-07-12 | Hiroshima Univ | 幹細胞の培養方法 |
JP2008188021A (ja) * | 2003-11-04 | 2008-08-21 | Biomaster Inc | 脂肪組織から幹細胞を調製するための方法およびシステム |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU5743601A (en) | 2000-04-28 | 2001-11-12 | Childrens Medical Center | Isolation of mesenchymal stem cells and use thereof |
US20020045260A1 (en) * | 2000-10-17 | 2002-04-18 | Shih-Chieh Hung | Method of isolating mesenchymal stem cells |
EP1377406A2 (en) | 2000-12-08 | 2004-01-07 | Surface Technologies Ltd. | Method of manufacturing electrical contact surface having micropores |
WO2004044555A2 (en) * | 2002-11-12 | 2004-05-27 | Becton, Dickinson And Company | Diagnosis of sepsis or sirs using biomarker profiles |
JP4160842B2 (ja) | 2003-02-24 | 2008-10-08 | 裕之 本多 | 細胞培養方法 |
-
2009
- 2009-09-28 JP JP2009222981A patent/JP5678360B2/ja active Active
-
2010
- 2010-09-27 EP EP10010934.7A patent/EP2308964B1/en active Active
- 2010-09-28 US US12/892,223 patent/US8039256B2/en active Active
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2004129549A (ja) * | 2002-10-09 | 2004-04-30 | Yasuo Kitagawa | 脂肪由来細胞群からの間葉系幹細胞の選択的増殖方法 |
JP2008188021A (ja) * | 2003-11-04 | 2008-08-21 | Biomaster Inc | 脂肪組織から幹細胞を調製するための方法およびシステム |
JP2006129734A (ja) * | 2004-11-02 | 2006-05-25 | Olympus Corp | 間葉系幹細胞の培養方法 |
JP2006217845A (ja) * | 2005-02-09 | 2006-08-24 | Hitachi Medical Corp | 付着性細胞の培養方法および培養装置 |
JP2007175008A (ja) * | 2005-12-28 | 2007-07-12 | Hiroshima Univ | 幹細胞の培養方法 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
"FEBS letters", 2007, VOL.581, PP.4645-4650, JPN6014011253, ISSN: 0002952723 * |
"医学のあゆみ", 2009.08.22, VOL.230, NO.8, PP.554-555, JPN6014011252, ISSN: 0002952722 * |
"日本農芸化学会大会講演要旨集", 2003, P.7, #2A03A12, JPN6014011254, ISSN: 0002952724 * |
"現代医療", 2000, VOL.32, NO.11, PP.2581-2588, JPN6014011255, ISSN: 0002952725 * |
Cited By (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPWO2015137419A1 (ja) * | 2014-03-11 | 2017-04-06 | 北海道公立大学法人 札幌医科大学 | 間葉系幹細胞の賦活化剤、賦活化された間葉系幹細胞およびその製造方法 |
WO2015137419A1 (ja) * | 2014-03-11 | 2015-09-17 | 北海道公立大学法人札幌医科大学 | 間葉系幹細胞の賦活化剤、賦活化された間葉系幹細胞およびその製造方法 |
US10512660B2 (en) | 2014-03-11 | 2019-12-24 | Sapporo Medical University | Activator for mesenchymal stem cells, activated mesenchymal stem cells, and method for producing same |
JP2021028337A (ja) * | 2014-06-10 | 2021-02-25 | メゾブラスト・インターナショナル・エスアーエールエル | 免疫疾患の治療 |
JP2017526619A (ja) * | 2014-06-10 | 2017-09-14 | メゾブラスト・インターナショナル・エスアーエールエル | 免疫疾患の治療 |
JP7009594B2 (ja) | 2014-06-10 | 2022-02-10 | メゾブラスト・インターナショナル・エスアーエールエル | 免疫疾患の治療 |
JP2022040254A (ja) * | 2014-06-10 | 2022-03-10 | メゾブラスト・インターナショナル・エスアーエールエル | 免疫疾患の治療 |
JP7279212B2 (ja) | 2014-06-10 | 2023-05-22 | メゾブラスト・インターナショナル・エスアーエールエル | 免疫疾患の治療 |
JP2016059322A (ja) * | 2014-09-17 | 2016-04-25 | 国立大学法人山口大学 | 間葉系幹細胞の活性評価方法、間葉系幹細胞の培養方法、肝機能障害用治療剤の製造方法、および肝機能障害用治療剤 |
US10744159B2 (en) | 2014-09-17 | 2020-08-18 | Yamaguchi University | Method for evaluating mesenchymal stem cell activity, method for culturing mesenchymal stem cells, method for producing therapeutic agent for liver dysfunction, and therapeutic agent for liver dysfunction |
WO2016042965A1 (ja) * | 2014-09-17 | 2016-03-24 | 国立大学法人山口大学 | 間葉系幹細胞の活性評価方法、間葉系幹細胞の培養方法、肝機能障害用治療剤の製造方法、および肝機能障害用治療剤 |
WO2018030448A1 (ja) * | 2016-08-12 | 2018-02-15 | 国立大学法人山口大学 | 細胞培養用培地、及び細胞培養方法 |
JP2018023343A (ja) * | 2016-08-12 | 2018-02-15 | 国立大学法人山口大学 | 細胞培養用培地、及び細胞培養方法 |
WO2022250035A1 (ja) | 2021-05-28 | 2022-12-01 | ダイセン・メンブレン・システムズ株式会社 | 細胞外小胞の分離精製方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP2308964A1 (en) | 2011-04-13 |
US8039256B2 (en) | 2011-10-18 |
US20110076770A1 (en) | 2011-03-31 |
JP5678360B2 (ja) | 2015-03-04 |
EP2308964B1 (en) | 2013-11-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5678360B2 (ja) | 間葉系幹細胞の培養方法 | |
US5965436A (en) | Method of isolating mesenchymal stem cells associated with isolated megakaryocytes by isolating megakaryocytes | |
CN110551684B (zh) | 一种人脐带间充质干细胞制备方法 | |
EP1845154A1 (en) | Multipotent stem cells derived from placenta tissue and cellular therapeutic agents comprising the same | |
US6200606B1 (en) | Isolation of precursor cells from hematopoietic and nonhematopoietic tissues and their use in vivo bone and cartilage regeneration | |
KR101211913B1 (ko) | 양막유래 중간엽 줄기세포 배양을 위한 배지조성물 및 이를 이용한 양막유래 중간엽 줄기세포의 배양방법 | |
JP4336821B2 (ja) | 哺乳動物の骨髄細胞または臍帯血由来細胞と脂肪組織を利用した心筋細胞の誘導 | |
KR100871984B1 (ko) | 태반 조직 유래 다능성 줄기세포 및 이를 함유하는세포치료제 | |
WO1998020731A9 (en) | Msc-megakaryocyte precursor composition and method of isolating mscs associated with isolated megakaryocytes by isolating megakaryocytes | |
KR20110106855A (ko) | 골 치유를 위한 조직 유래된 줄기 세포와 결합된 동종이식편 | |
US20050059152A1 (en) | In vitro culture of mesenchymal stem cells (MSC) and a process for the preparation thereof for therapeutic use | |
CZ200649A3 (cs) | Zpusob pestování lidských mezenchymových kmenových bunek, zejména pro lécbu nehojících se fraktur, a bioreaktor k provádení tohoto zpusobu | |
JPWO2020027163A1 (ja) | 歯髄由来細胞の製造方法 | |
MX2011000993A (es) | Metodo para separar celulas madre activas de celulas madre humanas y celulas madre altamente activas separadas por el mismo. | |
JP2006109757A (ja) | 骨髄由来間葉系幹細胞の培養方法 | |
CN114480261B (zh) | 一种脐带来源骨骼干细胞的提取分离方法 | |
EP4119656A1 (en) | Cell culture, method for evaluating cell culture, method for producing cell culture, and marker for use in evaluation of chondroid tissue formation property | |
CN111893092A (zh) | 一种人脐带来源的间充质干细胞及其制备方法 | |
JP4646600B2 (ja) | 間葉系幹細胞の培養方法 | |
JP2006149375A (ja) | 体液由来幹細胞の分離方法および培養方法 | |
JP2007175008A (ja) | 幹細胞の培養方法 | |
JP2023163708A (ja) | 間葉系幹細胞の単離方法 | |
JP4859078B1 (ja) | 新規間葉系幹細胞 | |
CN115725498A (zh) | 一种人胎盘组织源蜕膜间充质干细胞的简易制备方法 | |
CN114015641A (zh) | 猪血小板裂解液培养基及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20120924 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20121019 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20121102 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20140318 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140516 |
|
RD03 | Notification of appointment of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423 Effective date: 20140812 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20141202 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20141217 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5678360 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313117 |
|
S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |