JP2016059322A - 間葉系幹細胞の活性評価方法、間葉系幹細胞の培養方法、肝機能障害用治療剤の製造方法、および肝機能障害用治療剤 - Google Patents
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Abstract
【効果】 測定されたAK4の量から間葉系幹細胞の活性の程度を評価することができ、例えば間葉系幹細胞のミトコンドリア活性の程度が高い場合には、当該間葉系幹細胞を治療剤として用いるのに好適であると評価することができ、他方、間葉系幹細胞のミトコンドリア活性が低く老化が進んでいない場合には、継代培養するのに適した間葉系幹細胞であると評価することができる。
【選択図】 図1
Description
間葉系幹細胞は骨髄液、臍帯血、末梢血等に含まれており、骨、軟骨、脂肪、心臓、神経、肝臓などの多種類の細胞へ分化可能な多分化能を有する細胞である。しかしながら間葉系幹細胞は、例えば骨髄液中にはその存在率が0.05%程度であり直接臨床に使用するには大量に採取する必要があり、生体への負担が大きいことから、生体組織から採取した間葉系幹細胞を継代培養して用いることが望ましい。
採取した骨髄液について初代培養、継代培養を行って目的とする量まで間葉系幹細胞を増殖させることは、従来既に公知である(特許文献1)。
特許文献1にも記載されているように、間葉系幹細胞は培養を重ねるに従って活性が低下する(老化する)ことが知られている。また、継代培養はひとつの容器で培養された間葉系幹細胞を複数の容器に分割して培養することを繰り返すため各容器により培養状態が異なり、最終的に培養された間葉系幹細胞を集めても、中には老化したもの、死滅したものが含まれており、臨床に十分必要な質や量が得られない可能性があった。
本発明はそのような事情に鑑み、培養された間葉系幹細胞の活性の程度を評価する評価方法を提供するものであり、またその評価方法を用いた間葉系幹細胞の培養方法と、さらに肝機能障害用治療剤の製造方法と、肝機能障害用治療剤とを提供するものである。
また請求項3の発明は、間葉系幹細胞の培養方法に関するもので、骨髄液、臍帯血、末梢血等の間葉系幹細胞を含む対象液を採取する採取工程と、採取された上記対象液から間葉系幹細胞を分離する分離工程と、分離された上記間葉系幹細胞を細胞培養する培養工程と、細胞培養された間葉系幹細胞の一部をサンプリングするサンプリング工程と、サンプリングされた上記間葉系幹細胞内のアデニレートキナーゼ4の量を測定する測定工程と、測定されたアデニレートキナーゼ4の量から間葉系幹細胞の活性の程度を判定する判定工程とを有することを特徴とするものである。
請求項10の発明は、肝機能障害用治療剤の製造方法に関するもので、骨髄液を採取する採取工程と、採取された上記骨髄液から間葉系幹細胞を含む液体を分離する分離工程と、分離された上記液体の間葉系幹細胞を細胞培養する培養工程と、細胞培養された間葉系幹細胞をサンプリングするサンプリング工程と、サンプリングされた上記間葉系幹細胞内のアデニレートキナーゼ4の量を測定する測定工程と、測定されたアデニレートキナーゼ4の量から間葉系幹細胞の活性の程度を判定する判定工程とを有することを特徴とするものである。
さらに請求項11の発明は、肝機能障害用治療剤に関するもので、液体を分離する分離工程と、分離された上記液体の間葉系幹細胞を細胞培養する培養工程と、細胞培養された間葉系幹細胞をサンプリングするサンプリング工程と、サンプリングされた上記間葉系幹細胞内のアデニレートキナーゼ4の量を測定する測定工程と、測定されたアデニレートキナーゼ4の量から間葉系幹細胞の活性の程度を判定する判定工程とを含む工程により製造されることを特徴とするものである。
これとは逆に、間葉系幹細胞のミトコンドリア活性の程度が高い場合には、老化という観点からはそれが進んでいるので、継代培養に用いるには好ましくないと評価することができ、他方、間葉系幹細胞のミトコンドリア活性が低く老化が進んでいない場合には、継代培養するのに適した間葉系幹細胞であると評価することができる。
アデニレートキナーゼは、生体が増殖、分化、運動、代謝などの機能を正常に発揮するために必要な細胞内アデニンヌクレオチドの恒常性維持に重要な役割を担っており、以下の可逆的反応を触媒する酵素である。
2ADP(アデノシン2リン酸)⇔ATP(アデノシン3リン酸)+AMP(アデノシンリン酸)
近年、AK1、AK2、AK3についてはそれらの機能が徐々に明らかになってきているが、AK4の機能についてはよく知られていない。
図1は骨髄液から採取したヒト間葉系幹細胞を酸素1%の条件下で細胞培養した場合と、酸素20%の条件下で細胞培養した場合とのそれぞれについて、マイクロアレイ解析によりAK4の量(発現量)を測定した結果を示すものである。
同図から明らかなように、酸素20%の条件下で細胞培養した間葉系幹細胞におけるAK4の量は1(arbitrary unit以下a.u.と略す)であるのに対し、酸素1%の条件下で細胞培養した間葉系幹細胞におけるAK4の量は1.50(a.u.)であった。間葉系幹細胞は、酸素20%の条件下の方が酸素1%の条件下よりもミトコンドリア活性が高いことはよく知られており、このことから、AK4の量が多い場合は、ミトコンドリア活性が低く、間葉系幹細胞の活性(幹細胞活性)が高いことが理解できる。また、AK4の量が少ない場合は、ミトコンドリア活性が高く、間葉系幹細胞の活性(幹細胞活性)が低いことが理解できる。
上記AK4の量は、ウエスタンブロッティングで評価できる。また市販されているフラックスアナライザー(例えばSeahorseBioscience社製XFe96)によって推測することができる。
第1に、間葉系幹細胞の活性が高い方が治療剤としての効果が高いので、活性の高い間葉系幹細胞を選定してこれを治療剤として用いることができ、或は当該治療剤の製造方法として用いることができる。
具体的には、肝機能障害者から骨髄液を採取する場合、骨髄液から液体(単核球成分)を分離する分離工程と、分離された上記液体の間葉系幹細胞を細胞培養する培養工程と、細胞培養された間葉系幹細胞をサンプリングするサンプリング工程と、サンプリングされた上記間葉系幹細胞内のAK4の量を測定する測定工程と、測定されたAK4の量から間葉系幹細胞の活性の程度を判定する判定工程とを含む工程とにより、測定されたAK4の量が多い場合には当該間葉系幹細胞の活性の程度が高いので、当該間葉系幹細胞を肝機能障害用治療剤として用いることができる。また、上記工程を肝機能障害用治療剤の製造方法として用いることができる。
具体的には、骨髄液、臍帯血、末梢血等の間葉系幹細胞を含む対象液を採取する場合、上記対象液を採取する採取工程と、採取された上記対象液から間葉系幹細胞を分離する分離工程と、分離された上記間葉系幹細胞を細胞培養する培養工程と、細胞培養された間葉系幹細胞の一部をサンプリングするサンプリング工程と、サンプリングされた上記間葉系幹細胞内のAK4の量を測定する測定工程と、測定されたAK4の量から間葉系幹細胞の活性の程度を判定する判定工程とにより、測定されたAK4の量が少ない場合には当該間葉系幹細胞のミトコンドリア活性の程度が高いので継代培養には用いず、他方、AK4の量が多い間葉系幹細胞はそのミトコンドリア活性の程度が低いので、これを継代培養に用いることができる。
この場合、ひとつの容器で培養された間葉系幹細胞を複数の容器に分割して培養する継代培養を所要回繰り返した際に、各容器毎の培養状態を可及的に均質かつ良質に保つために、AK4の量が多く、かつ、AK4の量が揃った複数の間葉系幹細胞を選択してもよい。これにより、臨床に充分必要な量の等質で良質な間葉系幹細胞を得ることが可能となる。
つまり継代培養をする際に、必ずしもAK4の量が最も多い間葉系幹細胞を選択するのではなく、間葉系幹細胞の老化が進んだAK4の量が最も少ない間葉系幹細胞と最も多い間葉系幹細胞との間の、継代培養の回数を考慮した最適なAK4の量を有する間葉系幹細胞を選択することが可能である。
上記継代培養をする際のAK4の量は、細胞培養の期間及び継代培養の回数により、どの時点で活性の高いものがよいか、活性の低いものがよいかの判断することができる。
(1)骨髄細胞より調整した間葉系幹細胞に培養液を加え全量を30mLとし、フラスコ3本にそれぞれ10mLずつ藩種しインキュベータ内で培養を開始する(培養工程:図2参照)。
つまり本実施例では、採取した間葉系幹細胞を培養条件の異なるフラスコ3本による3つの群に分けて、細胞培養している。
(2)培地は2〜3日ごとに全量交換する(培地交換工程)。
(1)初代培養工程における3本のフラスコから間葉系幹細胞をそれぞれ1万個ずつサンプリングする(サンプリング工程)。
(2)サンプリングされたそれぞれの細胞内のAK4の量を測定する(測定工程)。AK4の量は、上述したようにフラックスアナライザーによって推定することができる。またはウエスタンブロッティングやmRNAの発現解析で正確に測定できる。
(3)測定されたAK4の量が所定のしきい値α以上であるか否かを確認する(判定工程)。このしきい値αとして、例えば図1の1.1a.u.という値を採用することができる。この値以上であれば、初代培養された間葉系幹細胞のミトコンドリア活性が低く老化が進んでいないので、継代培養するのに適した間葉系幹細胞であると評価することができる。
他方、測定されたAK4の量が所定のしきい値α未満の場合には、当該間葉系幹細胞のミトコンドリア活性の程度が高いと推測されるので、継代培養には用いない。
図2では、3本のフラスコに分けられた間葉系幹細胞のうち、左右の間葉系幹細胞におけるAK4の量はそれぞれ上記しきい値α以上であるので、これらについて継代培養を行い(◎印参照)、中央のフラスコの間葉系幹細胞におけるAK4の量は上記しきい値α未満であるので、これについては継代培養を行なわない(×印参照)。但し、継代培養を行わない中央のフラスコの間葉系幹細胞は、この時点では廃棄することなく、インキュベータ内で引き続き培養を継続する。
他方、継代培養することとした左右の間葉系幹細胞については、それぞれ3本のフラスコに藩種しインキュベータ内で細胞培養する。つまり本実施例では、初代培養された間葉系幹細胞を6つの群に分けて、第1回目の継代培養が行われる。
(1)上記6本の各フラスコから間葉系幹細胞をそれぞれ1万個ずつサンプリングする(サンプリング工程)。
(2)サンプリングされた細胞内のAK4の量を測定する(測定工程)。
(3)測定されたAK4の量が上述したしきい値α以上の場合には、サンプリングされたフラスコの細胞をさらに3本のフラスコに藩種しインキュベータ内で第2回目の継代培養を行う。
図2に示す場合では、第1回目の継代培養の際に6つの群に分けられた間葉系幹細胞のうち、◎印が付された4つの群における間葉系幹細胞のAK4の量は上記しきい値α以上となっているので、これら4つの群については第2回目の継代培養を行う。×印が付された残りの2つの群における間葉系幹細胞のAK4の量は上記しきい値α未満であるので、これについては継代培養を行なわない。但し、継代培養を行わない2つの群の間葉系幹細胞については、この時点では廃棄することなく、引き続きインキュベータ内で培養を継続する。
他方、継代培養することとした4つの群における間葉系幹細胞については、各群の間葉系幹細胞をそれぞれ3本のフラスコに藩種しインキュベータ内で細胞培養する。つまり合計12本の群に分けて第2回目の継代培養が行われる。
(1)上記12本のフラスコから間葉系細胞をそれぞれ1万個ずつサンプリングする。また、継代培養を行わなかった他の3本のフラスコについても同様に間葉系幹細胞をそれぞれ1万個ずつサンプリングする。
(2)サンプリングされた細胞内のAK4の量を確認する。
(3)測定されたAK4の量が所定のしきい値β以下の場合に、例えばしきい値β=1.4a.u.以下の場合には、これらの間葉系幹細胞についてはフラスコの細胞洗浄分離を行い、薬剤及び生理食塩水を加え全量200mLの細胞懸濁液を調整して、これを治療剤として用いることができる。
他方、測定されたAK4の量がしきい値βを超えるような場合には、間葉系幹細胞のミトコンドリア活性の程度が低く増殖能が低下するため治療剤として用いてもその効果が期待できないので、そのような間葉系幹細胞は廃棄する。しかしながら条件によっては、例えば治療剤の総量が不足するような場合には、ミトコンドリア活性の程度が低い間葉系幹細胞であってもこれを廃棄するよりは治療剤として用いることが望ましい。
また、上記AK4の量のしきい値α、βの数値は一例であって、治療剤として使用される箇所や継代培養の必要な回数など、必要とされる条件に応じて適宜最適な値に変更・調整できることは勿論である。
Claims (11)
- 骨髄液、臍帯血、末梢血等の間葉系幹細胞を含む対象液を採取する採取工程と、採取された上記対象液から間葉系幹細胞を分離する分離工程と、分離された上記間葉系幹細胞内のアデニレートキナーゼ4の量を測定する測定工程と、測定されたアデニレートキナーゼ4の量から間葉系幹細胞の活性の程度を判定する判定工程とを有することを特徴とする間葉系幹細胞の活性評価方法。
- 上記間葉系幹細胞は、骨髄液から採取されて細胞培養された間葉系幹細胞であることを特徴とする請求項1記載の間葉系幹細胞の活性評価方法。
- 骨髄液、臍帯血、末梢血等の間葉系幹細胞を含む対象液を採取する採取工程と、採取された上記対象液から間葉系幹細胞を分離する分離工程と、分離された上記間葉系幹細胞を細胞培養する培養工程と、細胞培養された間葉系幹細胞の一部をサンプリングするサンプリング工程と、サンプリングされた上記間葉系幹細胞内のアデニレートキナーゼ4の量を測定する測定工程と、測定されたアデニレートキナーゼ4の量から間葉系幹細胞の活性の程度を判定する判定工程とを有することを特徴とする間葉系幹細胞の培養方法。
- 上記培養工程は、上記間葉系幹細胞を複数の群に分けてそれぞれ細胞培養するようになっており、またサンプリング工程は、複数の群に分けられた間葉系幹細胞の一部をそれぞれサンプリングするようになっていることを特徴とする請求項3に記載の間葉系幹細胞の培養方法。
- 上記判定工程において測定されたアデニレートキナーゼ4の量が所定のしきい値α以上の場合に、サンプリングされた間葉系幹細胞を継代培養する継代培養工程を有することを特徴とする請求項3又は請求項4に記載の間葉系幹細胞の培養方法。
- 上記判定工程において測定されたアデニレートキナーゼ4の量が所定のしきい値α未満の場合に、サンプリングされた間葉系幹細胞の群を継代培養しないことを特徴とする請求項3又は請求項4に記載の間葉系幹細胞の培養方法。
- 上記判定工程において測定されたアデニレートキナーゼ4の量が所定のしきい値β以下の場合に、サンプリングされた間葉系幹細胞を治療剤とすることを特徴とする請求項3又は請求項4に記載の間葉系幹細胞の培養方法。
- 上記継代培養工程によって継代培養された間葉系幹細胞について、該間葉系幹細胞の一部をサンプリングするサンプリング工程と、該サンプリング工程によってサンプリングされた上記間葉系幹細胞内のアデニレートキナーゼ4の量を測定する測定工程と、該測定工程によって測定されたアデニレートキナーゼ4の量から間葉系幹細胞の活性の程度を判定する判定工程と、該判定工程において測定されたアデニレートキナーゼ4の量が所定のしきい値以上の場合に、サンプリングされた間葉系幹細胞を継代培養する継代培養工程とが設けられており、これらの工程が1回以上繰り返されることを特徴とする請求項5に記載の間葉系幹細胞の培養方法。
- 上記継代培養工程は、上記間葉系幹細胞を複数の群に分けてそれぞれ継代培養するようになっていることを特徴とする請求項5又は請求項8に記載の間葉系幹細胞の培養方法。
- 骨髄液を採取する採取工程と、採取された上記骨髄液から間葉系幹細胞を含む液体を分離する分離工程と、分離された上記液体の間葉系幹細胞を細胞培養する培養工程と、細胞培養された間葉系幹細胞をサンプリングするサンプリング工程と、サンプリングされた上記間葉系幹細胞内のアデニレートキナーゼ4の量を測定する測定工程と、測定されたアデニレートキナーゼ4の量から間葉系幹細胞の活性の程度を判定する判定工程とを有することを特徴とする肝機能障害用治療剤の製造方法。
- 液体を分離する分離工程と、分離された上記液体の間葉系幹細胞を細胞培養する培養工程と、細胞培養された間葉系幹細胞をサンプリングするサンプリング工程と、サンプリングされた上記間葉系幹細胞内のアデニレートキナーゼ4の量を測定する測定工程と、測定されたアデニレートキナーゼ4の量から間葉系幹細胞の活性の程度を判定する判定工程とを含む工程により製造されることを特徴とする肝機能障害用治療剤。
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